一種密碼子優(yōu)化的內(nèi)切葡聚糖酶及其制備方法和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種密碼子優(yōu)化的內(nèi)切葡聚糖酶，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本發(fā)明還提供了密碼子優(yōu)化的內(nèi)切葡聚糖酶的制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明里氏木霉的密碼子偏好優(yōu)化了來源于黑曲霉中的eng1基因，改造后的基因序列與野生型黑曲霉的eng1基因序列（Genebank收錄號為AF331518）同源性為95.5%。密碼子偏好優(yōu)化后的eng1表現(xiàn)出較高酶活，本發(fā)明核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示密碼子優(yōu)化的內(nèi)切葡聚糖酶由全基因合成，并連接到里氏木霉纖維二糖水解酶1啟動子下。采用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法將合成的內(nèi)切葡聚糖酶基因轉(zhuǎn)化到里氏木霉中，獲得重組菌。
【專利說明】
一種密碼子優(yōu)化的內(nèi)切葡聚糖酶及其制備方法和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種密碼子優(yōu)化的內(nèi)切葡聚糖酶(endoglucanase)及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]傳統(tǒng)牛仔布是用靛藍(lán)染料染色的經(jīng)紗和未染色的瑋紗交叉編織而成的。返舊外觀是衡量牛仔布品質(zhì)的一個重要指標(biāo)。最初人們采用浮石洗滌除去牛仔布表面的靛藍(lán)染料，即在牛仔布洗水中加入浮石，使浮石與牛仔布打磨，洗后牛仔布布面呈現(xiàn)陳舊的感覺。內(nèi)切葡聚糖酶是纖維素酶的組分之一，可以用在牛仔布生物整理上，內(nèi)切葡聚糖酶水洗與傳統(tǒng)的石洗相比，減少了浮石洗滌設(shè)備的磨損，改善了廢水的質(zhì)量，使用過的廢水易回收處理，且反應(yīng)條件溫和減少了能耗，用酶水洗后也不需要用大量的水去除牛仔布表面污物。內(nèi)切葡聚糖酶進(jìn)行牛仔布生物整理的過程中，內(nèi)切葡聚糖酶將織物表面暴露的微纖維絨毛進(jìn)行酶解，再經(jīng)過機(jī)械揉搓后洗去表面突出的微纖維以及吸附的靛藍(lán)染料。里氏木霉具有高效外分泌酶蛋白的優(yōu)點(diǎn)，常被用來構(gòu)建基因工程菌表達(dá)同源或異源的酶蛋白基因。目前外切葡聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶和葡萄糖苷酶均在里氏木霉中得到有效表達(dá)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種密碼子優(yōu)化的內(nèi)切葡聚糖酶，其核苷酸序列如基因序列表SEQ ID NO:1所示。
[0004]本發(fā)明通過以下技術(shù)方案解決上述技術(shù)問題，
一種密碼子優(yōu)化的內(nèi)切葡聚糖酶的制備方法，其步驟包括，
(I)將里氏木霉基因組重組菌株劃線于PDA平板，28 °C培養(yǎng)5天；
(2 )接種到液體種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h ；
(3)按接種量10%轉(zhuǎn)接至50mL發(fā)酵培養(yǎng)基產(chǎn)酶，在28 °C條件下發(fā)酵120h獲得發(fā)酵液，將發(fā)酵液離心，離心后的上清液為密碼子優(yōu)化的內(nèi)切葡聚糖酶溶液液。
[0005]作為優(yōu)化，所述里氏木霉基因組重組菌株的制備方法，其步驟包括，
(1)在PDA平板上培養(yǎng)里氏木霉5天，用無菌水收集里氏木霉孢子，接種到Y(jié)H)液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)12小時；
(2)收集孢子，用無菌生理鹽水洗滌兩次，再用第一緩沖液洗兩次，重懸于第二緩沖液中酶解2小時，獲得的酶解液；
(3)將步驟(2)獲得的酶解液同IM山梨醇溶液等體積混合，離心收集菌體，用I M山梨醇溶液洗滌一次，最后重懸于I M山梨醇溶液中，獲得的懸浮液；
(4)取200yL步驟(3)獲得的懸浮液加入5yL的P18PEGH質(zhì)?；旌?，再加入30yL的PEG6000溶液，冰浴15min后加ImL的PEG6000溶液，室溫放置半小時；
(5)加入ImL的IM山梨醇溶液后，涂布潮霉素PDA平板，在30°C條件下進(jìn)行培養(yǎng)，將培養(yǎng)的里氏木霉基因組重組菌株轉(zhuǎn)接PDA平板，保存重組菌株。
[0006]作為優(yōu)化，所述P18PEGH質(zhì)粒的制備方法，其步驟包括，
(1)以里氏木霉基因組為模板克隆纖維二糖水解酶I啟動子:上游引物:5-GCAAGCTTTTCTGGAGACGGCTTGTT-3，下游引物:5- CGGGTACCCCAAGTGTTGCCATCGTA-3，PCR反應(yīng)條件為95°C 5 min；95°C 50 s，70°C 2 min 5 8，29個循環(huán)；721: 5 min；
(2)從質(zhì)粒pDESTR(Genbank:AB218275.1)中擴(kuò)增潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶的基因表達(dá)盒:上游引物:5-CAGAGCTCGGGACGTTAACTGATATTGAAGG-3，下游引物:5_TCGAATTCAACTGGTTCCCGGTCGGC-3，PCR反應(yīng)條件為95 °C 下5 min ; 95 °C 下50s，70 °C 下2minl5s，29 個循環(huán)；72°C 下 5min;
(3)P18EG質(zhì)粒制備:將engl基因和PUC18載體分別進(jìn)行KpnI和SacI雙酶切，酶切體系為:分別選取40yL的engl基因或40yL的PUC18載體，第一 10\13時€64爰沖液541^，恥111和33(31各lyL，加純水補(bǔ)至50yL，在溫度37°C的條件下酶切25min，將酶切產(chǎn)物移到85°C水浴中滅活2min；
再以0.9%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的瓊脂糖凝膠電泳分別回收engl基因片段和PUC18載體片段并用連接酶進(jìn)行連接，連接反應(yīng)體系:engl基因片段4yL，HJC18載體片段2yL，T4連接酶0.5yL，buff er緩沖液2yL，加純水補(bǔ)至20yL，16 °C下連接8h ；
然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)方法為:在40 yL大腸桿菌感受態(tài)(杭州寶賽生物科技有限公司，大腸桿菌DH5a感受態(tài))中加入6 yL連接產(chǎn)物，輕輕吹勻后冰浴15 min;再在42°C的水浴中熱激88 S，然后迅速放在冰浴中5 min;之后，加Al mL的LB液體培養(yǎng)基，輕輕吹勻后在37°C下90 rpm的搖床上培養(yǎng)I h;將反應(yīng)物8000 r/min離心I min，棄去850 μ?上清液，保留150 μ?培養(yǎng)液，重懸離心后的大腸桿菌細(xì)胞，涂布抗性LB平板;將LB平板放入37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)15 h，挑取大腸桿菌轉(zhuǎn)化子至5 ml含抗生素的LB液體培養(yǎng)基，于37°C下190 r/min條件振蕩培養(yǎng)15 h，提取質(zhì)粒，該質(zhì)粒即為P18EG質(zhì)粒；保存大腸桿菌轉(zhuǎn)化子和P18EG質(zhì)粒；
(4)P18PEG質(zhì)粒制備:將纖維二糖水解酶I啟動子和P18EG質(zhì)粒分別進(jìn)行Hindm和KpnI雙酶切，酶切體系為:分別選取40yL的纖維二糖水解酶I啟動子或40yL的P18EG質(zhì)粒，第一 10\131^€64爰沖液541^，財11(1111和恥111各141^，加純水補(bǔ)至5(^1^，在溫度37°(:的條件下酶切20min，將酶切產(chǎn)物移到85°C水浴中滅活2 min；
以0.9%的瓊脂糖凝膠電泳分別回收纖維二糖水解酶I啟動子片段和P18EG質(zhì)粒片段并進(jìn)行連接，連接反應(yīng)體系:纖維二糖水解酶I啟動子基因4yL，P18EG質(zhì)粒片段2yL，T4連接酶0.541^，1311打64爰沖液241^，加純水補(bǔ)至2(^1^，于16°(:下連接811，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)，再提取質(zhì)粒，該質(zhì)粒即為P18PEG質(zhì)粒，保存大腸桿菌轉(zhuǎn)化子和P18PEG質(zhì)粒；
(5)P18PEGH質(zhì)粒制備:將潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶的基因表達(dá)盒和P18PEG質(zhì)粒分別進(jìn)行SacI和EcoRI雙酶切，酶切體系為:分別選取40yL的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶的基因表達(dá)盒或40yL的P18PEG質(zhì)粒，第二 10 X buf fer緩沖液5yL，SacI和EcoRI各IyL，加純水補(bǔ)至50yL;在溫度37°C的條件下酶切20min，將酶切產(chǎn)物移到85°C水浴中滅活2 min；
以0.9%的瓊脂糖凝膠電泳分別回收潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶的基因表達(dá)盒片段和P18PEG質(zhì)粒片段并進(jìn)行連接，連接反應(yīng)體系:潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶的基因表達(dá)盒片段4yL，P18PEG質(zhì)粒片段2yL，T4連接酶0.5yL，buffer緩沖液2yL，加純水補(bǔ)至20yL，于16 °C下連接8h，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)，再提取質(zhì)粒，該質(zhì)粒即為P18PEGH質(zhì)粒，保存大腸桿菌轉(zhuǎn)化子和P18PEGH質(zhì)粒。
[0007]作為優(yōu)化，所述里氏木霉基因組提取方法，其步驟包括，
(1)將里氏木霉在PDA培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)5天；
(2)再接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)2天，
(3)離心收集菌體，生理鹽水洗滌3次后，液氮研磨，
(4)將研磨組織中加入預(yù)熱CTAB提取液，震蕩混勻；
(5)升溫至64°C并保溫I小時，期間每隔10分鐘混勻；
(6 )再加入PCI溶液混勻后，離心，
(7)取上層水相加入0.5倍體積預(yù)冷異丙醇，混勾，4°C放置25min，離心5min；
(8)使用70%的乙醇洗沉淀兩次，用含RNase的TE緩沖液溶解后溫水浴30min，獲得里氏木霉基因組。
[0008]本發(fā)明解決的另一個問題是密碼子優(yōu)化的內(nèi)切葡聚糖酶的應(yīng)用，用于牛仔褲的返舊處理。
[0009]本發(fā)明里氏木霉(Trichoderma reesei)的密碼子偏好優(yōu)化了來源于黑曲霉中的engl基因，改造后的基因序列與野生型黑曲霉的engl基因序列(Genebank收錄號為AF331518)同源性為95.5%。密碼子偏好優(yōu)化后的engl表現(xiàn)出較高酶活，本發(fā)明核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示密碼子優(yōu)化的內(nèi)切葡聚糖酶由全基因合成，并連接到里氏木霉纖維二糖水解酶I啟動子下。采用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法將合成的內(nèi)切葡聚糖酶基因轉(zhuǎn)化到里氏木霉中，獲得重組菌。
[0010]作為優(yōu)化，本發(fā)明中，里氏木霉購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心;CICC保藏號為13052 ,ATCC保藏號為56765 ；
作為優(yōu)化，本發(fā)明中，PDA培養(yǎng)基配方為:馬鈴薯去皮，稱200g切碎，加水800ml煮沸半個小時，紗布過濾，再加20g葡萄糖和18g瓊脂，補(bǔ)充水至1000mL，高壓蒸121°C滅菌20分鐘；
作為優(yōu)化，本發(fā)明中，誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為:羧甲基纖維素鈉10g/L，乳糖10g/L，酵母粉18g/L;
作為優(yōu)化，本發(fā)明中，CTAB提取液配方為:2%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的CTAB，100m mol/L的Tris-HCl，pH 8.0,20m mol/L的EDTA,1.4mol/L的NaCl;
作為優(yōu)化，本發(fā)明中，PCI溶液配方為:等體積比的苯酚、氯仿和異戊醇混合液；
作為優(yōu)化，本發(fā)明中，含RNase的TE緩沖液配方為:10m mol/L的Tris-Hcl，pH 8.0,1mmol/L的EDTA;
作為優(yōu)化，本發(fā)明中，上游引物:5-GCAAGCTTTTCTGGAGACGGCTTGTT-3和下游引物:5-CGGGTACCCCAAGTGTTGCCATCGTA-3均購自生工生物工程(上海)股份有限公司；
作為優(yōu)化，本發(fā)明中，質(zhì)粒pDESTR:Genbank收錄號為AB218275.1，購自杭州寶賽生物科技有限公司；
作為優(yōu)化，本發(fā)明中，上游引物:5-CAGAGCTCGGGACGTTAACTGATATTGAAGG-3和下游引物:5-TCGAATTCAACTGGTTCCCGGTCGGC-3均購自生工生物工程(上海)股份有限公司；
作為優(yōu)化，本發(fā)明中，engl基因購自生工生物工程(上海)股份有限公司；
作為優(yōu)化，本發(fā)明中，PUC18載體購自生工生物工程(上海)股份有限公司； 作為優(yōu)化，本發(fā)明中，第一10 Xbuffer緩沖液配方為:10m M的Tris-HCl，pH 8.0，10mM的MgCl2，IM的KCl，lg/L的BSA;
作為優(yōu)化，本發(fā)明中，Kpnl和Sacl購自富酶泰斯生物技術(shù)(深圳)有限公司；
作為優(yōu)化，本發(fā)明中，T4連接酶即T4 DNA Ligase，購自寶生物工程(大連)有限公司；作為優(yōu)化，本發(fā)明中，buffer緩沖液配方為:660mM的Tri s-HCl，pH7.6，66mM的氯化鎂，10mM的DTT，ImM的ATP;
作為優(yōu)化，本發(fā)明中，大腸桿菌感受態(tài)即大腸桿菌DH5a感受態(tài)，購自杭州寶賽生物科技有限公司；
作為優(yōu)化，本發(fā)明中，Hindm和KpnI均購自富酶泰斯生物技術(shù)(深圳)有限公司；
作為優(yōu)化，本發(fā)明中，SacI和EcoRI均購自富酶泰斯生物技術(shù)(深圳)有限公司；
作為優(yōu)化，本發(fā)明中，第二10Xbuffer緩沖液配方為:500m M的Tris-HCl，pH 7.5,100mM的MgCl2，IM的NaCl，lg/L的BSA;
作為優(yōu)化，本發(fā)明中，Yro液體培養(yǎng)基配方為:葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母膏1g/
L；
作為優(yōu)化，本發(fā)明中，第一緩沖液配方為:10 m M的磷酸鈉緩沖液，pH=6，1.0 M的MgSO4;
作為優(yōu)化，本發(fā)明中，第二緩沖液配方為:10 m M的磷酸鈉緩沖液，pH=6，含10g/L蝸牛酶；
作為優(yōu)化，本發(fā)明中，PEG6000溶液配方為:20%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的PEG6000，20mM的CaCl2，1mM的Tris HCl，pH=7.5;
作為優(yōu)化，本發(fā)明中，潮霉素即潮霉素B(Hygr0mycin B)，購自生工生物工程(上海)股份有限公司；
作為優(yōu)化，本發(fā)明中，潮霉素TOA平板配方為:在TOA培養(yǎng)基上添加I M的山梨醇，125 μg/mL的潮霉素；
作為優(yōu)化，本發(fā)明中，液體種子培養(yǎng)基配方為:葡萄糖16 g/L，酵母粉20 g/L, (NH4)2SO4 2.0 g/L，KH2P04 5 g/L,MgSO4 0.6 g/L,CaC12 1.0 g/L；
作為優(yōu)化，本發(fā)明中，發(fā)酵培養(yǎng)基配方為:乳糖16 g/L，微晶纖維素20 g/L酵母粉20g/L, (NH4)2SO4 4.0 g/L，KH2P04 5 g/L,MgSO4 0.8 g/L,CaCl2 1.0 g/L,FeSO4 0.003 g/L,MnSO4 0.001 g/L，ZnS04 0.001 g/L,CoCl2 0.002 g/L。
【附圖說明】
[0011]圖1為本發(fā)明實(shí)施例3中使用密碼子優(yōu)化的內(nèi)切葡聚糖酶返舊處理牛仔褲圖片。
【具體實(shí)施方式】
[0012]實(shí)施例1:內(nèi)切葡聚糖酶基因的獲得
采用化學(xué)全合成的方法，合成優(yōu)化后的內(nèi)切葡聚糖酶engl基因序列如SEQ ID NO:1所不O
[0013]實(shí)施例2:重組菌株的構(gòu)建及產(chǎn)酶里氏木霉基因組提取方法，其步驟包括， (1)將里氏木霉在PDA培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)5天；
(2)再接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)2天，
(3)離心收集菌體，生理鹽水洗滌3次后，液氮研磨，
(4)將研磨組織中加入預(yù)熱CTAB提取液，震蕩混勻；
(5)升溫至64°C并保溫I小時，期間每隔10分鐘混勻；
(6 )再加入PCI溶液混勻后，離心，
(7)取上層水相加入0.5倍體積預(yù)冷異丙醇，混勾，4°C放置25min，離心5min；
(8)使用70%的乙醇洗沉淀兩次，用含RNase的TE緩沖液溶解后溫水浴30min，獲得里氏木霉基因組。
[0014]一種內(nèi)切葡聚糖酶engl基因重組載體P18PEGH質(zhì)粒的制備方法，其步驟包括，
(1)以里氏木霉基因組為模板克隆纖維二糖水解酶I啟動子:上游引物:5-GCAAGCTTTTCTGGAGACGGCTTGTT-3，下游引物:5- CGGGTACCCCAAGTGTTGCCATCGTA-3，PCR反應(yīng)條件為95°C 5 min；95°C 50 s，70°C 2 min 5 8，29個循環(huán)；721: 5 min；
(2)從質(zhì)粒pDESTR(Genbank:AB218275.1)中擴(kuò)增潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶的基因表達(dá)盒:上游引物:5-CAGAGCTCGGGACGTTAACTGATATTGAAGG-3，下游引物:5_TCGAATTCAACTGGTTCCCGGTCGGC-3，PCR反應(yīng)條件為95 °C 下5 min ; 95 °C 下50s，70 °C 下2minl5s，29 個循環(huán)；72°C 下 5min;
(3)P18EG質(zhì)粒制備:將engl基因和PUC18載體分別進(jìn)行KpnI和SacI雙酶切，酶切體系為:分別選取40yL的engl基因或40yL的PUC18載體，第一 10\13時€64爰沖液541^，恥111和33(31各lyL，加純水補(bǔ)至50yL，在溫度37°C的條件下酶切25min，將酶切產(chǎn)物移到85°C水浴中滅活2min；
再以0.9%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的瓊脂糖凝膠電泳分別回收engl基因片段和PUC18載體片段并用連接酶進(jìn)行連接，連接反應(yīng)體系:engl基因片段4yL，HJC18載體片段2yL，T4連接酶0.5yL，buff er緩沖液2yL，加純水補(bǔ)至20yL，16 °C下連接8h ；
然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)方法為:在40 yL大腸桿菌感受態(tài)(杭州寶賽生物科技有限公司，大腸桿菌DH5a感受態(tài))中加入6 yL連接產(chǎn)物，輕輕吹勻后冰浴15 min;再在42°C的水浴中熱激88 S，然后迅速放在冰浴中5 min;之后，加Al mL的LB液體培養(yǎng)基，輕輕吹勻后在37°C下90 rpm的搖床上培養(yǎng)I h;將反應(yīng)物8000 r/min離心I min，棄去850 μ?上清液，保留150 μ?培養(yǎng)液，重懸離心后的大腸桿菌細(xì)胞，涂布抗性LB平板;將LB平板放入37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)15 h，挑取大腸桿菌轉(zhuǎn)化子至5 ml含抗生素的LB液體培養(yǎng)基，于37°C下190 r/min條件振蕩培養(yǎng)15 h，提取質(zhì)粒，該質(zhì)粒即為P18EG質(zhì)粒；保存大腸桿菌轉(zhuǎn)化子和P18EG質(zhì)粒；
(4)P18PEG質(zhì)粒制備:將纖維二糖水解酶I啟動子和P18EG質(zhì)粒分別進(jìn)行Hindm和KpnI雙酶切，酶切體系為:分別選取40yL的纖維二糖水解酶I啟動子或40yL的P18EG質(zhì)粒，第一 10\131^€64爰沖液541^，財11(1111和恥111各141^，加純水補(bǔ)至5(^1^，在溫度37°(:的條件下酶切20min，將酶切產(chǎn)物移到85°C水浴中滅活2 min；
以0.9%的瓊脂糖凝膠電泳分別回收纖維二糖水解酶I啟動子片段和P18EG質(zhì)粒片段并進(jìn)行連接，連接反應(yīng)體系:纖維二糖水解酶I啟動子基因4yL，P18EG質(zhì)粒片段2yL，T4連接酶
0.541^，1311打64爰沖液241^，加純水補(bǔ)至2(^1^，于16°(:下連接811，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)，再提取質(zhì)粒，該質(zhì)粒即為P18PEG質(zhì)粒，保存大腸桿菌轉(zhuǎn)化子和P18PEG質(zhì)粒；
(5)P18PEGH質(zhì)粒制備:將潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶的基因表達(dá)盒和P18PEG質(zhì)粒分別進(jìn)行SacI和EcoRI雙酶切，酶切體系為:分別選取40yL的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶的基因表達(dá)盒或40yL的P18PEG質(zhì)粒，第二 10 X buf fer緩沖液5yL，SacI和EcoRI各IyL，加純水補(bǔ)至50yL;在溫度37°C的條件下酶切20min，將酶切產(chǎn)物移到85°C水浴中滅活2 min；
以0.9%的瓊脂糖凝膠電泳分別回收潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶的基因表達(dá)盒片段和P18PEG質(zhì)粒片段并進(jìn)行連接，連接反應(yīng)體系:潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶的基因表達(dá)盒片段4yL，P18PEG質(zhì)粒片段2yL，T4連接酶0.5yL，buffer緩沖液2yL，加純水補(bǔ)至20yL，于16 °C下連接8h，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)，再提取質(zhì)粒，該質(zhì)粒即為P18PEGH質(zhì)粒，保存大腸桿菌轉(zhuǎn)化子和P18PEGH質(zhì)粒。
[0015]里氏木霉基因組重組菌株的制備方法，其步驟包括，
(1)在PDA平板上培養(yǎng)里氏木霉5天，用無菌水收集里氏木霉孢子，接種到Y(jié)H)液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)12小時；
(2)收集孢子，用無菌生理鹽水洗滌兩次，再用第一緩沖液洗兩次，重懸于第二緩沖液中酶解2小時，獲得的酶解液；
(3)將步驟(2)獲得的酶解液同IM山梨醇溶液等體積混合，離心收集菌體，用I M山梨醇溶液洗滌一次，最后重懸于I M山梨醇溶液中，獲得的懸浮液；
(4)取200yL步驟(3)獲得的懸浮液加入5yL的P18PEGH質(zhì)?；旌?，再加入30yL的PEG6000溶液，冰浴15min后加ImL的PEG6000溶液，室溫放置半小時；
(5)加入ImL的IM山梨醇溶液后，涂布潮霉素PDA平板，在30°C條件下進(jìn)行培養(yǎng)，將培養(yǎng)的里氏木霉基因組重組菌株轉(zhuǎn)接PDA平板，保存重組菌株。
[0016]一種密碼子優(yōu)化的內(nèi)切葡聚糖酶的制備方法，其步驟包括，
(I)將里氏木霉基因組重組菌株劃線于PDA平板，28 °C培養(yǎng)5天；
(2 )接種到液體種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h ；
(3)按接種量10%轉(zhuǎn)接至50mL發(fā)酵培養(yǎng)基產(chǎn)酶，在28 °C條件下發(fā)酵120h獲得發(fā)酵液，將發(fā)酵液離心，離心后的上清液為密碼子優(yōu)化的內(nèi)切葡聚糖酶溶液液。
[0017]以羧甲基纖維素鈉(sigma羧甲基纖維素鈉C5678)為底物測定內(nèi)切葡聚糖酶的酶活，一個酶活力單位為每分鐘生成1.Ομπιο?葡萄糖而所需的酶量，以IU/mL表示。
[0018]實(shí)施例3:牛仔布水洗
常規(guī)石磨水洗:將靛藍(lán)染色的牛仔布(20cmX 15cm)投入到1L水中，將500g浮石在10%的次氯酸鈉中浸泡60min后，與牛仔布混合并在60°C溫度條件下翻滾水洗60min，加入1%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的次氯酸鈉繼續(xù)水洗30min，用清水沖洗一次后加入50g亞硫酸氫鈉，繼續(xù)水洗lOmin，再用清水反復(fù)沖洗，烘干。
[0019]酶水洗:將靛藍(lán)染色的牛仔布(20 cmX15 cm)投入到2 L水中，加入8000IU酶活的內(nèi)切葡聚糖酶液，在起始溫度50°C條件下攪拌水洗40min，再用清水沖洗兩次后烘干。
[0020]
SEQ ID NO:1SEQUENCE LISTING<110>江西省科學(xué)院〈120〉一種密碼子優(yōu)化的內(nèi)切葡聚糖酶及其制備方法和應(yīng)用〈130〉 2016〈160〉 I
<170> PatentIn vers1n 3.5
〈210〉 I
〈211〉 999
〈212〉 DNA
〈213〉人工合成
〈400〉 I
atgaagtttc agagcaccct gctgctggcc gccgccggcg gcagcgcgtt ggccgtcccc 60catggtcctg gacataagaa gagggcgtct gtgttcgaat ggttcggatc gaatgagtct 120ggcgctgagt ttgggaccaa tattcctggg gtctggggaa ccgactacat cttccccgac 180ccctcggcta tctctacgtt gattgacaag ggcatgaact tcttccgcgt ccagttcatg 240atggagaggt tgctgcccga ctcaatgact ggctcatatg atgaggagta cctggccaac 300ttgacgaccg tgataaaagc ggtaaccgac ggaggcgctc atgcccttgt tgaccctcat 360aactacggca ggtacaacgg cgagatcatc tccagccgtt ctgatttcca gaccttctgg 420gagaacctgg ccggccagta caaagataac gacctcgtca tgttcgacac caacaacgag 480tatcacgaca tggatcagga tctcgtgctg aacctcaacc aagcagccat taacggcatc 540cgcgccgcag gtgcgaccag ccagtacatc ttcgtcgaag gcaactcctg gaccggcgcc 600tggacgtggg tcgacgtcaa cgacaacatg aagaacttga ccgaccccga agacaagatc 660gtctatgaaa tgcaccagta cctagactcc gacggctccg gcacctcgga gacctgcgtg 720tcggagacca tcggaaaaga gcgagtcact gaagctacac agtggctgaa ggacaataag 780aaggtcggct tcataggcga atatgccggg ggttccaatg atgtatgtcg gagtgccgtg 840tcggggatgc tggagtacat ggcgaataac acggacgttt ggaagggtgc ctcgtggtgg 900gccgccggcc catggtgggg agactacatt ttcagcctcg agcccccgga tggaactgcg 960tacaccggca tgctcgacat cctcgaggcc tacctctga999
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種密碼子優(yōu)化的內(nèi)切葡聚糖酶，其核苷酸序列如SEQID N0:1所示。2.如權(quán)利要求1所述的密碼子優(yōu)化的內(nèi)切葡聚糖酶的制備方法，其步驟包括， (I)將里氏木霉基因組重組菌株劃線于PDA平板，28°C培養(yǎng)5天； (2 )接種到液體種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h ； (3 )按接種量10%轉(zhuǎn)接至50mL發(fā)酵培養(yǎng)基產(chǎn)酶，在28 °C條件下發(fā)酵120h獲得發(fā)酵液，將發(fā)酵液離心，離心后的上清液為密碼子優(yōu)化的內(nèi)切葡聚糖酶溶液液。3.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)中所述液體種子培養(yǎng)基配方為:葡萄糖 16 g/L，酵母粉 20 g/L，(NH4)2S04 2.0 g/L，KH2P04 5 g/L，MgS04 0.6 g/L，CaC121.0 g/L。4.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟(3)中所述發(fā)酵培養(yǎng)基配方為:乳糖16 g/L，微晶纖維素20 g/L酵母粉 20 g/L，(NH4)2S04 4.0 g/L，KH2P04 5 g/L，MgS04 0.8g/L,CaCl2 1.0 g/L，F(xiàn)eS04 0.003 g/L，MnS04 0.001 g/L，ZnS04 0.001 g/L，CoC12 0.002g/L。5.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟(I)中所述里氏木霉基因組重組菌株的制備方法，其步驟包括， (1)在PDA平板上培養(yǎng)里氏木霉5天，用無菌水收集里氏木霉孢子，接種到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)12小時； (2)收集孢子，用無菌生理鹽水洗滌兩次，再用第一緩沖液洗兩次，重懸于第二緩沖液中酶解2小時，獲得的酶解液； (3)將步驟(2)獲得的酶解液同IM山梨醇溶液等體積混合，離心收集菌體，用I M山梨醇溶液洗滌一次，最后重懸于I M山梨醇溶液中，獲得的懸浮液； (4)取200yL步驟(3)獲得的懸浮液加入5yL的P18PEGH質(zhì)?；旌希偌尤?0yL的PEG6000溶液，冰浴15min后加ImL的PEG6000溶液，室溫放置半小時； (5)加入ImL的IM山梨醇溶液后，涂布潮霉素TOA平板，在30°C條件下進(jìn)行培養(yǎng)，將培養(yǎng)的里氏木霉基因組重組菌株轉(zhuǎn)接PDA平板，保存重組菌株。6.如權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，步驟(4)中PEG6000溶液配方為:20%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的PEG6000，20mM的CaC12，1mM的Tris HCl，pH=7.5。7.如權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，步驟(4)中所述P18PEGH質(zhì)粒的制備方法，其步驟包括， (1)以里氏木霉基因組為模板克隆纖維二糖水解酶I啟動子:上游引物:5-GCAAGCTTTTCTGGAGACGGCTTGTT-3，下游引物:5- CGGGTACCCCAAGTGTTGCCATCGTA-3，PCR反應(yīng)條件為95°C 5 min；95°C 50 s，70°C 2 min 5 8，29個循環(huán)；721: 5 min； (2)從質(zhì)粒pDESTR(Genbank:AB218275.1)中擴(kuò)增潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶的基因表達(dá)盒:上游引物:5-CAGAGCTCGGGACGTTAACTGATATTGAAGG-3，下游引物:5_TCGAATTCAACTGGTTCCCGGTCGGC-3，PCR反應(yīng)條件為95 °C 下5 min ; 95 °C 下50s，70 °C 下2minl5s，29 個循環(huán)；72°C 下 5min; (3)P18EG質(zhì)粒制備:將engl基因和HJC18載體分別進(jìn)行KpnI和SacI雙酶切，酶切體系為:分別選取40yL的engl基因或40yL的PUC18載體，第一 10\13時€64爰沖液541^，恥111和33(31各lyL，加純水補(bǔ)至50yL，在溫度37°C的條件下酶切25min，將酶切產(chǎn)物移到85°C水浴中滅活2min； 再以0.9%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的瓊脂糖凝膠電泳分別回收engl基因片段和PUC18載體片段并用連接酶進(jìn)行連接，連接反應(yīng)體系:engl基因片段4yL，HJC18載體片段2yL，T4連接酶0.5yL，buff er緩沖液2yL，加純水補(bǔ)至20yL，16 °C下連接8h ； 然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)方法為:在40 yL大腸桿菌感受態(tài)(杭州寶賽生物科技有限公司，大腸桿菌DH5a感受態(tài))中加入6 yL連接產(chǎn)物，輕輕吹勻后冰浴15 min;再在42°C的水浴中熱激88 S，然后迅速放在冰浴中5 min;之后，加Al mL的LB液體培養(yǎng)基，輕輕吹勻后在37°C下90 rpm的搖床上培養(yǎng)I h;將反應(yīng)物8000 r/min離心I min，棄去850 μ?上清液，保留150 μ?培養(yǎng)液，重懸離心后的大腸桿菌細(xì)胞，涂布抗性LB平板;將LB平板放入37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)15 h，挑取大腸桿菌轉(zhuǎn)化子至5 ml含抗生素的LB液體培養(yǎng)基，于37°C下190 r/min條件振蕩培養(yǎng)15 h，提取質(zhì)粒，該質(zhì)粒即為P18EG質(zhì)粒；保存大腸桿菌轉(zhuǎn)化子和P18EG質(zhì)粒； (4)P18PEG質(zhì)粒制備:將纖維二糖水解酶I啟動子和P18EG質(zhì)粒分別進(jìn)行Hindm和KpnI雙酶切，酶切體系為:分別選取40yL的纖維二糖水解酶I啟動子或40yL的P18EG質(zhì)粒，第一 10\131^€64爰沖液541^，財11(1111和恥111各141^，加純水補(bǔ)至5(^1^，在溫度37°(:的條件下酶切20min，將酶切產(chǎn)物移到85°C水浴中滅活2 min； 以0.9%的瓊脂糖凝膠電泳分別回收纖維二糖水解酶I啟動子片段和P18EG質(zhì)粒片段并進(jìn)行連接，連接反應(yīng)體系:纖維二糖水解酶I啟動子基因4yL，P18EG質(zhì)粒片段2yL，T4連接酶0.541^，1311打64爰沖液241^，加純水補(bǔ)至2(^1^，于16°(:下連接811，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)，再提取質(zhì)粒，該質(zhì)粒即為P18PEG質(zhì)粒，保存大腸桿菌轉(zhuǎn)化子和P18PEG質(zhì)粒； (5)P18PEGH質(zhì)粒制備:將潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶的基因表達(dá)盒和P18PEG質(zhì)粒分別進(jìn)行SacI和EcoRI雙酶切，酶切體系為:分別選取40yL的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶的基因表達(dá)盒或40yL的P18PEG質(zhì)粒，第二 10 X buf fer緩沖液5yL，SacI和EcoRI各IyL，加純水補(bǔ)至50yL;在溫度37°C的條件下酶切20min，將酶切產(chǎn)物移到85°C水浴中滅活2 min； 以0.9%的瓊脂糖凝膠電泳分別回收潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶的基因表達(dá)盒片段和P18PEG質(zhì)粒片段并進(jìn)行連接，連接反應(yīng)體系:潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶的基因表達(dá)盒片段4yL，P18PEG質(zhì)粒片段2yL，T4連接酶0.5yL，buffer緩沖液2yL，加純水補(bǔ)至20yL，于16 °C下連接8h，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)，再提取質(zhì)粒，該質(zhì)粒即為P18PEGH質(zhì)粒，保存大腸桿菌轉(zhuǎn)化子和P18PEGH質(zhì)粒。8.如權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，步驟(I)中所述里氏木霉基因組提取方法，其步驟包括， (1)將里氏木霉在PDA培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)5天； (2)再接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)2天， (3)離心收集菌體，生理鹽水洗滌3次后，液氮研磨， (4)將研磨組織中加入預(yù)熱CTAB提取液，震蕩混勻； (5)升溫至64°C并保溫I小時，期間每隔10分鐘混勻； (6)再加入PCI溶液混勻后，離心， (7)取上層水相加入0.5倍體積預(yù)冷異丙醇，混勾，4°C放置25min，離心5min ； (8)使用70%的乙醇洗沉淀兩次，用含RNase的TE緩沖液溶解后溫水浴30min，獲得里氏木霉基因組。9.如權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)中所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為:羧甲基纖維素鈉10g/L，乳糖10g/L，酵母粉18g/L。10.如權(quán)利要求1所述密碼子優(yōu)化的內(nèi)切葡聚糖酶的應(yīng)用，其特征在于，用于牛仔褲的返舊處理。
【文檔編號】C12N15/56GK105861470SQ201610332234
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年5月19日
【發(fā)明人】顧斌濤, 黃朝, 黃國昌, 熊大維, 黃筱萍, 劉蘭, 金丹鳳
【申請人】江西省科學(xué)院微生物研究所