一種提高基因置換效率的方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及一種利用Cas9核酸酶的aptamer提高基因置換效率的方法，包括以下步驟：(1)雙功能DNA單鏈的合成：合成具有Cas9特異結(jié)合能力的aptamer和DNA供體的序列；所述aptamer序列為：5′?AGTCCATGGTAAACCCACCTTGGGGT?GACT?3′；(2)質(zhì)粒的制備：構(gòu)建Cas9?gRNA質(zhì)粒，使其能表達(dá)Cas9蛋白和轉(zhuǎn)錄靶位點(diǎn)附近的gRNA；(3)把所得雙功能DNA單鏈與質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到要進(jìn)行基因置換的細(xì)胞或組織。本發(fā)明采用高親和度的特異DNA aptamer，不干擾Cas9?gRNA復(fù)合物的形成與穩(wěn)定，使同源性重組和基因修復(fù)的比例達(dá)到最高。
【專利說(shuō)明】
一種提高基因置換效率的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及一種基因置換方法，尤其涉及一種利用Cas9核酸酶的aptamer(適配體)提高基因置換效率的方法，可用于基因治療。
【背景技術(shù)】
[0002]生物醫(yī)學(xué)中的基因置換技術(shù)對(duì)基因功能研究、藥物篩選和基因治療有著不可估量的重要性。細(xì)胞內(nèi)基因置換是通過(guò)同源性重組實(shí)現(xiàn)的，而同源性重組在絕大多數(shù)細(xì)胞中的效率極低，因此提高同源性重組效率是生物學(xué)家面臨的巨大挑戰(zhàn)。若能提高同源性重組的效率，基因置換和基因治療的成功率就會(huì)極大地提高。
[0003]目前，現(xiàn)有基因置換技術(shù)主要存在以下問(wèn)題:(I)同源性重組在絕大多數(shù)細(xì)胞中的效率極低。(2)Cas9-gRNA復(fù)合物只能定位到靶位點(diǎn)進(jìn)行基因切斷，不能完成基因置換。(3)基因治療過(guò)程中的靶定向特異性低，置換、修復(fù)效率低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對(duì)上述問(wèn)題，發(fā)明人進(jìn)行了大量試驗(yàn)，積累的研究表明，先切斷某個(gè)基因片段會(huì)大大提高這個(gè)基因置換的頻率(幾個(gè)數(shù)量級(jí))，進(jìn)而得到一種aptamer介導(dǎo)的提高基因置換效率的方法，采用高親和度的特異DNA aptamer，不干擾Cas9-gRNA復(fù)合物的形成與穩(wěn)定，使同源性重組和基因修復(fù)的比例達(dá)到最高。
[0005 ]為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
[0006]設(shè)計(jì)一種提高基因置換效率的方法，包括以下步驟:
[0007](I)雙功能DNA單鏈的合成:采用DNA合成儀經(jīng)常規(guī)方法合成包含Cas9特異結(jié)合能力的aptamer和DNA供體的單鏈序列；所述3口七3!1161.序列為:5'-AGTCCATGGTAAACCCACCTTGGGGTGACT-3,；
[0008](2)質(zhì)粒的制備:常規(guī)方法構(gòu)建Cas9_gRNA質(zhì)粒，使其能表達(dá)Cas9蛋白和轉(zhuǎn)錄靶位點(diǎn)附近的gRNA;
[0009](3)把所得雙功能DNA單鏈與質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到要進(jìn)行基因置換的細(xì)胞或組織。
[0010]優(yōu)選的，將所述雙功能DNA單鏈與質(zhì)粒以摩爾比1:(15?25)共轉(zhuǎn)染到要進(jìn)行基因置換的細(xì)胞或組織。更優(yōu)選的，將雙功能DNA單鏈、Cas9-gRNA質(zhì)粒以摩爾比1: 20于Lipofectamine試劑盒中室溫混合15?25min，再加入具有細(xì)胞培養(yǎng)液的6孔板中，培養(yǎng)兩天后，篩選細(xì)胞株驗(yàn)證置換效果。所述細(xì)胞培養(yǎng)液濃度為60wt %。
[0011]本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)表現(xiàn)在:
[0012]在本發(fā)明的技術(shù)方案中，將具有Cas9特異結(jié)合能力的單鏈DNAaptamer和單鏈DNA供體(donor)連在一塊，被一個(gè)結(jié)合在革E位點(diǎn)的Cas9核酸酶富集到革E位點(diǎn)，來(lái)對(duì)被Cas9核酸酶切斷后的革E位點(diǎn)進(jìn)行基因置換；即利用Cas9_aptamer把a(bǔ)ptamer-donor富集到革E位點(diǎn)。
[0013I (I)本發(fā)明采用高親和度的特異DNA aptamer，不干擾Cas9-gRNA復(fù)合載體的形成與穩(wěn)定。[OOM] (2)Cas9_gRNA質(zhì)粒，以及aptamer-donor單鏈之間的摩爾比例得到優(yōu)化，同源性重組和基因修復(fù)的比例可達(dá)到最尚(〉15%)。
【附圖說(shuō)明】
[0015]圖1為Cas9_gRNA質(zhì)粒的構(gòu)建流程示意圖；
[0016]圖2為Cas9_gRNA質(zhì)粒的剪切活性試驗(yàn)結(jié)果；
[0017]圖3為aptamer與Cas9-gRNA結(jié)合能力關(guān)系圖；
[0018]圖4為aptamer與Cas9_gRNA剪切活性關(guān)系圖；
[0019]圖5為靶基因修復(fù)率驗(yàn)證效果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0020]以下結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。下述實(shí)施例中所涉及的試驗(yàn)方法或分析方法，如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)方法，所用試劑如無(wú)特別說(shuō)明，均為市售。
[0021]本實(shí)施例以用野生型抗癌基因p53置換突變致病性p53(SEQ ID No:3)為例，提供一種基因置換方法，具體分為以下幾個(gè)步驟實(shí)施:
[0022](I)合成雙功能DNA單鏈:采用DNA合成儀用常規(guī)方法將Cas9aptamer(SEQ ID No:I)和野生型p53序列(SEQ ID No:2)連成一起的DNA單鏈(SEQ ID No:4)0
[0023](2)合成Cas9_gRNA雙功能-雙表達(dá)質(zhì)粒:常規(guī)方法構(gòu)建Cas9_gRNA質(zhì)粒，使其能表達(dá)Cas9蛋白和轉(zhuǎn)錄p53附近位點(diǎn)gRNA;具體構(gòu)建方法見(jiàn)圖1，首先合成寡核苷酸片段，用作PCR模板，其中含有定向到p53的gRNA2和gRNAl序列，被兩個(gè)BbsI內(nèi)切酶位點(diǎn)隔開(kāi)，便于PCR后通過(guò)Gibson連接，加上gRNAl的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子U6，再通過(guò)BbsI加入到表達(dá)Cas9的質(zhì)粒上構(gòu)成Cas9-gRNA雙功能-雙表達(dá)質(zhì)粒。
[0024]完成構(gòu)建后對(duì)Cas9_gRNA雙功能-雙表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果見(jiàn)圖2，其中，圖2a是Cas9-gRNA雙功能-雙表達(dá)質(zhì)粒中的gRNA2、gRNAl和Cas9編碼序列的位置圖；圖2b表明Cas9在有g(shù)RNAl或gRNA2、gRNAl幫助下有剪切活性，而在只有g(shù)RNA2時(shí)不能定向到靶位點(diǎn)進(jìn)行剪切；圖2c和2d進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn)。
[°°25] 從圖3可以看出，在有無(wú)10nM(M=mol/L)aptamer存在的情況下，持續(xù)增加gRNAl的濃度，Cas9與gRNAl的結(jié)合都會(huì)增加，并不受這個(gè)Cas9特異性aptamer的影響，說(shuō)明這個(gè)aptamer與gRNAl可同時(shí)與Cas9結(jié)合發(fā)揮各自的功能，aptamer并不干擾gRNA與Cas9結(jié)合。
[0026]從圖4可以看出，在有無(wú)aptamer存在的情況下，并不影響Cas9的剪切活性。
[0027](3)共轉(zhuǎn)染:將雙功能DNA單鏈、Cas9_gRNA質(zhì)粒以摩爾比1:20于Lipofectamine試劑盒中，室溫混合20min，再加到有細(xì)胞培養(yǎng)液的6孔板中，培養(yǎng)兩天；
[0028](4)篩選基因被置換的細(xì)胞株，基因組DNA提取后，對(duì)靶基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序驗(yàn)證基因置換。將有P53突變的細(xì)胞株培養(yǎng)在48孔板上，Cas9-gRNA雙功能-雙表達(dá)質(zhì)粒與p53-WT-Cy5(p53野生型片段、單鏈、Cy5熒光標(biāo)記)或aptamer-p53-WT-Cy5共轉(zhuǎn)染，數(shù)字熒光顯微鏡計(jì)數(shù);幾天后，收集細(xì)胞群落，分別提取DNA測(cè)序，得到統(tǒng)計(jì)數(shù)字，結(jié)果見(jiàn)圖5，數(shù)據(jù)表明，有aptamer的供體DNA提高基因修復(fù)率十幾倍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種提高基因置換效率的方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)雙功能DNA單鏈的合成:合成包含Cas9特異結(jié)合能力的aptamer和DNA供體的單鏈序列； (2)質(zhì)粒的制備:構(gòu)建Cas9-gRNA質(zhì)粒，使其能表達(dá)Cas9蛋白和轉(zhuǎn)錄靶位點(diǎn)附近的gRNA; (3)把所得雙功能DNA單鏈與質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到要進(jìn)行基因置換的細(xì)胞或組織。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述提高基因置換效率的方法，其特征在于:所述aptamer序列為:5,-AGTCCATGGTAAACCCACCTTGGGGT-GACT-3,。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述提高基因置換效率的方法，其特征在于:步驟(3)中所述雙功能DNA單鏈與質(zhì)粒以摩爾比1: (15?25)共轉(zhuǎn)染。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述提高基因置換效率的方法，其特征在于:步驟(3)中將雙功能DNA單鏈、質(zhì)粒以摩爾比1:20于Lipofectamine試劑盒中室溫混合15?25min，再加入具有細(xì)胞培養(yǎng)液的6孔板中，培養(yǎng)兩天后，篩選細(xì)胞株驗(yàn)證置換效果。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述提高基因置換效率的方法，其特征在于:所述細(xì)胞培養(yǎng)液濃度為60wt% ο
【文檔編號(hào)】C12N15/09GK105861485SQ201610248628
【公開(kāi)日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2016年4月20日
【發(fā)明人】不公告發(fā)明人
【申請(qǐng)人】上海伊麗薩生物科技有限公司