一種抗菌肽Enterocin P 及其制備方法和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種抗菌肽Enterocin P的制備方法及其應(yīng)用。本發(fā)明的抗菌肽Enterocin P基因，具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。本發(fā)明的抗菌肽Enterocin P基因編碼的成熟抗菌肽Enterocin P具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。本發(fā)明的抗菌肽Enterocin P的制備方法，包括如下步驟：(1)人工合成核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的基因；(2)構(gòu)建能高效表達(dá)重組質(zhì)粒；(3)構(gòu)建乳酸乳球菌NZ900的基因工程菌；(4)利用基因工程菌表達(dá)抗菌肽；(5)對(duì)抗菌肽的抑菌活性進(jìn)行檢測(cè)。本發(fā)明對(duì)病原菌具有較強(qiáng)的抑菌活性，安全無(wú)毒，無(wú)副作用。
【專利說(shuō)明】
一種抗菌肽Enteroci n P及其制備方法和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種抗菌肽Enterocin P及其制備方法 和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來(lái)，抗生素在動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)中的大量濫用，導(dǎo)致抗生素耐藥性菌株不斷出現(xiàn)、藥 物殘留、環(huán)境污染和生態(tài)破壞等諸多問(wèn)題，嚴(yán)重威脅到人類健康和畜牧業(yè)的發(fā)展。因此，尋 找一種能替代抗生素的新型抗菌制劑迫在眉睫?？咕木哂锌咕Ч谩岱€(wěn)定性好、無(wú) 毒、無(wú)殘留、無(wú)副作用、安全高效、對(duì)環(huán)境無(wú)污染且不易產(chǎn)生細(xì)菌耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，有望成為解 決抗生素濫用這一難題的有效方法。
[0003] 抗菌肽是生物防御系統(tǒng)中產(chǎn)生的對(duì)抗外源性病原體的肽類物質(zhì)，是生物天然的、 防御系統(tǒng)的重要組成部分。抗菌肽來(lái)源極其廣泛，從植物、昆蟲、鳥類、哺乳動(dòng)物、微生物都 已被發(fā)現(xiàn)有抗菌肽的產(chǎn)生。迄今為止，已有近千種抗菌肽被相繼分離純化及鑒定。
[0004] 細(xì)菌產(chǎn)生的抗菌肽是在其代謝過(guò)程中通過(guò)核糖體合成機(jī)制產(chǎn)生的具有抑菌活性 的多肽類物質(zhì)?？咕脑谝嫔休^為普遍。幾乎所有的益生菌都能產(chǎn)生一種或幾種抗菌 肽物質(zhì)。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已從植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、雙歧桿菌、嗜熱鏈球菌、乳酸乳 球菌等許多益生菌中分離純化得到多種抗菌肽物質(zhì)。
[0005] 抗菌肽Enterocin P是從Enterococcus faecium Ρ13分離純化獲得的抗菌肽，命 名為Enterocin P?？咕腅nterocin P的結(jié)構(gòu)基因編碼71個(gè)氨基酸的前肽。其前肽包括27 個(gè)氨基酸的信號(hào)肽和44個(gè)氨基酸的成熟肽。抗菌肽Enterocin P具有較廣的抗菌譜，尤其對(duì) 單核細(xì)胞增生李斯特菌、金黃色葡萄球菌等病原菌有明顯的抑制效果，具有較好的應(yīng)用前 景。
[0006] 抗菌肽Enterocin P在其產(chǎn)生菌Enterococcus faecium P13中含量極低，從產(chǎn)生 菌中提取抗菌肽產(chǎn)量低、費(fèi)時(shí)長(zhǎng)、工藝復(fù)雜且費(fèi)用昂貴，無(wú)法實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)，從而制約抗 菌肽Enterocin P的實(shí)際應(yīng)用。采用基因工程方法來(lái)研究和解決抗菌肽Enterocin P的實(shí)際 應(yīng)用問(wèn)題可提供一條新的有效技術(shù)手段。
[0007] 目前，缺乏一種具有顯著的抗病原菌作用的抗菌肽Enterocin P及其制備方法和 應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的是針對(duì)上述問(wèn)題，提供一種具有顯著的抗病原菌作用的抗菌肽 Enterocin P及其制備方法和應(yīng)用。
[0009] 為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了下列技術(shù)方案:本發(fā)明的一種抗菌肽Enterocin P 基因，具有SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。
[0010] 本發(fā)明所述的抗菌肽Enterocin P基因編碼的成熟抗菌肽Enterocin P具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
[0011]本發(fā)明所述的抗菌肽Enterocin P的制備方法，包括如下步驟：
[0012] (1)人工合成核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的基因；
[0013] (2)構(gòu)建能高效表達(dá)抗菌肽Enterocin P的pMG36e_Enterocin P重組質(zhì)粒；
[0014] (3)用所述pMG36e-Enterocin P重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌，構(gòu)建乳酸乳球菌NZ900的基 因工程菌；
[0015] (4)利用所述基因工程菌乳酸乳球菌表達(dá)抗菌肽Enterocin P;
[0016] (5)對(duì)抗菌肽Enterocin P的抑菌活性進(jìn)行檢測(cè)。
[0017] 進(jìn)一步地，在步驟（1)中，人工合成兩側(cè)含Sac I和Hindm的酶切位點(diǎn)Enterocin P 基因具有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。
[0018] 進(jìn)一步地，在步驟(2)中，將SEQ ID No. 3所示的核苷酸序列連接與經(jīng)限制性內(nèi)切 酶Sac I和Hindm雙酶切后線性化的pMG36e質(zhì)粒連接獲得pMG36e-Enterocin P連接產(chǎn)物， 將連接產(chǎn)物導(dǎo)入大腸桿菌DH5a，獲得含pMG36e-Enterocin P重組質(zhì)粒。
[0019] 更進(jìn)一步地，在步驟(3)中，所述宿主菌為大腸桿菌DH5a;
[0020] 將提取pMG36e-Enterocin P重組質(zhì)粒，經(jīng)PCR和酶切鑒定正確的質(zhì)粒采用電轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)入乳酸乳酸乳球菌感受態(tài)細(xì)胞MG1363中進(jìn)行抗菌肽Enterocin P的誘導(dǎo)表達(dá)，電轉(zhuǎn)化處 理參數(shù)為2 . OkV、25yF、200 Ω、5ms，經(jīng)紅霉素抗性篩選、PCR驗(yàn)證、酶切鑒定得到正確的含 口]\^366^1^61'〇〇;[11?重組質(zhì)粒的乳酸乳球菌]\^1363的基因工程菌。
[0021] 進(jìn)一步地，在步驟(4)中，將含pMG36e-Enterocin P重組質(zhì)粒的乳酸乳球菌MG1363 的基因工程菌接種于含紅霉素的GM17培養(yǎng)液中，30°C靜置培養(yǎng)過(guò)夜;次日以5%接種量轉(zhuǎn)接 至20ml GMl 7培養(yǎng)液中，30 °C繼續(xù)靜置培養(yǎng)時(shí)間為5-6h至細(xì)菌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，將培養(yǎng)液冰浴 10min，4°C5 OOOrpm，離心5min收集培養(yǎng)液上清，將獲得的上清液進(jìn)行0.22μηι過(guò)濾獲得誘導(dǎo) 后的無(wú)菌上清液，得到抗菌肽Enterocin Ρ。
[0022] 進(jìn)一步地，在步驟(5)中，采用瓊脂擴(kuò)散法對(duì)上清液的抑菌活性進(jìn)行檢測(cè)，經(jīng)37°C 培養(yǎng)后，抗菌肽Enterocin P對(duì)金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌或沙門氏菌的抑菌 活性進(jìn)行檢測(cè)。
[0023]本發(fā)明所述的抗菌肽Enterocin P動(dòng)物飼料中的應(yīng)用。
[0024] 進(jìn)一步地，所述動(dòng)物飼料為飼料添加劑。
[0025] 有益效果:本發(fā)明對(duì)病原菌具有較強(qiáng)的抑菌活性，安全，無(wú)毒，無(wú)副作用，無(wú)抗生素 耐藥性，可用作動(dòng)物飼料添加劑。本發(fā)明的所構(gòu)建的基因工程菌不僅具有乳酸乳球菌本身 的益生作用，還具有抗菌肽Enterocin P明顯的抗病原菌作用，可以更好的作為益生型飼料 添加劑安全有效地應(yīng)用于動(dòng)物飼料。
[0026] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：
[0027] (1)本發(fā)明首先合成抗菌肽Enterocin P的基因序列，并克隆到乳酸乳球菌表達(dá)載 體中，構(gòu)建得到重組表達(dá)載體;將構(gòu)建的重組表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌DH5a擴(kuò)增載體后再采 用電轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入乳酸乳球菌中進(jìn)行抗菌肽Enterocin P的分泌表達(dá)，其對(duì)李斯特菌和金黃 色葡萄球菌等病原菌均具有較強(qiáng)的抑菌活性。
[0028] (2)本發(fā)明的抗菌肽基因?yàn)橐嫔鶨nterococcus faecium P13抗菌肽基因 Enterocin P，所編碼的抗菌肽Enterocin P是從益生菌Enterococcus faecium P13發(fā)酵上 清液中分離得到的。預(yù)期用于動(dòng)物飼料添加劑中對(duì)動(dòng)物會(huì)有更好的作用和益生效果， Enterocin P抗菌肽的成熟肽分子量大約為4.5KDa具有顯著的抗病原菌作用。
[0029] (3)本發(fā)明所表達(dá)的抗菌肽Enterocin P來(lái)自于Enterococcus faecium P13,對(duì)動(dòng) 物體沒(méi)有毒性，因此用本發(fā)明的基因制備的抗菌肽與傳統(tǒng)的抗生素藥物相比，將是一種更 為安全的抗病原菌的短肽類物質(zhì)。
[0030] (4)本發(fā)明以常用的益生菌乳酸乳球菌為宿主菌構(gòu)建的基因工程菌，乳酸乳球菌 本身就是對(duì)動(dòng)物健康有利的益生菌，同時(shí)將抗菌肽Enterocin P在乳酸乳球菌中獲得了有 效的分泌表達(dá)，本發(fā)明的所構(gòu)建的基因工程菌不僅具有乳酸乳球菌本身的益生作用，還具 有抗菌肽Enterocin P明顯的抗病原菌作用，可以更好的作為益生型飼料添加劑安全有效 地應(yīng)用于動(dòng)物飼料。
【附圖說(shuō)明】
[0031] 圖1是本發(fā)明的按照質(zhì)粒提取試劑盒提取由含目的基因的大腸桿菌DH5a質(zhì)粒的示 意圖，泳道1:目的基因質(zhì)粒；泳道M:500bp ladder marker;
[0032] 圖2是本發(fā)明的大腸桿菌DH5a目的基因質(zhì)粒酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳圖，泳 道1:目的基因質(zhì)粒；泳道M:500bp ladder marker;
[0033] 圖3是本發(fā)明的pMG36e質(zhì)粒的示意圖；
[0034] 圖4是本發(fā)明采用TaKaRa Biotech限制性內(nèi)切酶Sac I和Hindm操作說(shuō)明雙酶切 pMG36e質(zhì)粒的示意圖，泳道I :pMG36e質(zhì)粒;泳道2:pMG36e質(zhì)粒;泳道M: Ikb ladder marker;
[0035]圖5是本發(fā)明重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a單菌落的示意圖；
[0036]圖6是本發(fā)明大腸桿菌DH5a單菌落為DNA模板的PCR產(chǎn)物進(jìn)行1 %瓊脂糖凝膠電泳 圖，泳道1:目的基因；泳道2:目的基因；泳道M:250bp ladder marker;
[0037] 圖7是本發(fā)明天根質(zhì)粒提取試劑盒操作說(shuō)明提取大腸桿菌DH5a重組質(zhì)粒后進(jìn)行 1 %瓊脂糖凝膠電泳圖，泳道1:重組質(zhì)粒;泳道2:重組質(zhì)粒;泳道M: Ikb ladder marker;
[0038] 圖8是本發(fā)明提取大腸桿菌DH5a重組質(zhì)粒采用TaKaRa Biotech限制性內(nèi)切酶Sac I和Hindm操作說(shuō)明雙酶切質(zhì)粒，產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳圖，泳道1:重組質(zhì)粒;泳道Μ: 500bp ladder marker；
[0039] 圖9是本發(fā)明重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化乳酸乳球菌MG1363單菌落的示意圖；
[0040]圖10是本發(fā)明乳酸乳球菌MGl 363單菌落為DNA模板的PCR產(chǎn)物進(jìn)行1 %瓊脂糖凝膠 電泳圖，泳道1:目的基因；泳道M:250bp ladder marker;
[0041] 圖11是本發(fā)明天根質(zhì)粒提取試劑盒操作說(shuō)明提取乳酸乳球菌MG1363重組質(zhì)粒后 進(jìn)行1 %瓊脂糖凝膠電泳圖，泳道1:重組質(zhì)粒;泳道M: Ikb ladder marker;
[0042] 圖12是本發(fā)明提取乳酸乳球菌MG1363重組質(zhì)粒采用TaKaRa Biotech限制性內(nèi)切 酶Sac I和Hindm操作說(shuō)明雙酶切質(zhì)粒，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳圖，泳道1:目的基因；泳 道2:目的基因；泳道M:250bp ladder marker;
[0043] 圖13是本發(fā)明Enterocin P對(duì)李斯特菌的抑菌效果圖，其中1、2、3為實(shí)驗(yàn)組；
[0044] 圖14是本發(fā)明Enterocin P對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果圖，其中1、2、3為實(shí)驗(yàn) 組；
[0045]圖15是本發(fā)明Enterocin P對(duì)沙門氏菌的抑菌效果圖，其中1、2、3為實(shí)驗(yàn)組。
【具體實(shí)施方式】
[0046]以下通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。應(yīng)該理解的是，這些實(shí)施例是本發(fā)明的闡釋 和舉例，并不以任何形式限制本發(fā)明的范圍。
[0047] 本發(fā)明的一種抗菌肽Enterocin P基因，具有SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。
[0048] 本發(fā)明所述的抗菌肽Enterocin P基因編碼的成熟抗菌肽Enterocin P具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
[0049]本發(fā)明所述的抗菌肽Enterocin P的制備方法，包括如下步驟：
[0050] (1)人工合成核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示的基因；人工合成兩側(cè)含Sac I和 Hindm的酶切位點(diǎn)Enterocin P基因具有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。
[0051 ] (2)構(gòu)建能高效表達(dá)抗菌肽Enterocin P的pMG36e_Enterocin P重組質(zhì)粒；將SEQ ID No. 3所示的核苷酸序列連接與經(jīng)限制性內(nèi)切酶Sac I和Hindm雙酶切后線性化的 pMG36e質(zhì)粒連接獲得pMG36e-Enterocin P連接產(chǎn)物，將連接產(chǎn)物導(dǎo)入大腸桿菌DH5a，獲得 含 pMG36e_Enterocin P重組質(zhì)粒。
[0052] (3)用所述pMG36e-Enterocin P重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌，構(gòu)建乳酸乳球菌NZ900的基 因工程菌;所述宿主菌為大腸桿菌DH5a;
[0053] 將提取pMG36e-Enterocin P重組質(zhì)粒，經(jīng)PCR和酶切鑒定正確的質(zhì)粒采用電轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)入乳酸乳酸乳球菌感受態(tài)細(xì)胞MG1363中進(jìn)行抗菌肽Enterocin P的誘導(dǎo)表達(dá)，電轉(zhuǎn)化處 理參數(shù)為2 . OkV、25yF、200 Ω、5ms，經(jīng)紅霉素抗性篩選、PCR驗(yàn)證、酶切鑒定得到正確的含 口]\^366^1^61'〇〇;[11?重組質(zhì)粒的乳酸乳球菌]\^1363的基因工程菌。
[0054] (4)利用所述基因工程菌乳酸乳球菌表達(dá)抗菌肽Enterocin P;將含pMG36e- Enterocin P重組質(zhì)粒的乳酸乳球菌MG1363的基因工程菌接種于含紅霉素的GM17培養(yǎng)液 中，30°C靜置培養(yǎng)過(guò)夜;次日以5%接種量轉(zhuǎn)接至20ml GM17培養(yǎng)液中，30°C繼續(xù)靜置培養(yǎng)時(shí) 間為5-6h至細(xì)菌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，將培養(yǎng)液冰浴IOmin，4°C5 OOOrpm，離心5min收集培養(yǎng)液上 清，將獲得的上清液進(jìn)行〇.22μηι過(guò)濾獲得誘導(dǎo)后的無(wú)菌上清液，得到抗菌肽Enterocin P。 [0055] (5)對(duì)抗菌肽Enterocin P的抑菌活性進(jìn)行檢測(cè)。采用瓊脂擴(kuò)散法對(duì)上清液的抑菌 活性進(jìn)行檢測(cè)，經(jīng)37 °C培養(yǎng)后，抗菌肽Enterocin P對(duì)金黃色葡萄球菌、單核細(xì)胞增生李斯 特菌或沙門氏菌的抑菌活性進(jìn)行檢測(cè)。
[0056]本發(fā)明所述的抗菌肽Enterocin P動(dòng)物飼料中的應(yīng)用。
[0057]所述動(dòng)物飼料為飼料添加劑。
[0058] 實(shí)施例1
[0059]本發(fā)明所使用的主要材料
[0060] 菌株與載體:大腸桿菌MC1061、乳酸乳球菌MG1363和pMG36e質(zhì)粒菌購(gòu)于德國(guó)Mo Bi Tec公司；DNA Marker購(gòu)于上海捷瑞有限公司；李斯特菌、金黃色葡萄球菌以及沙門氏菌為 本實(shí)驗(yàn)室所保存;抗菌肽Enterocin P基因由生工生物工程(上海)有限公司合成并轉(zhuǎn)入大 腸桿菌DH5a;引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。
[0061 ]主要試劑與試劑盒:Ml7肉湯培養(yǎng)基購(gòu)自青島海博公司；限制性內(nèi)切酶Sac I和 Hindm、T4 DNA Ligase、EX Taq購(gòu)自TaKaRa Biotech公司；紅霉素、質(zhì)粒提取和DNA凝膠回 收試劑盒購(gòu)自天根公司;nis in購(gòu)于Sigma公司。
[0062]主要試劑的配制：
[0063] GM17:M17肉湯培養(yǎng)基121°C高壓滅菌15min，冷卻后加入過(guò)濾除菌的葡萄糖至終濃 度為〇. 5 % (質(zhì)量體積比）。
[0064] SGM17:M17肉湯加入終濃度為0.5M蔗糖、2.5%甘氨酸、0.5%葡萄糖117肉湯中加 入蔗糖和甘氨酸后121°C高壓滅菌15min，冷卻后加入0.22μπι過(guò)濾除菌的葡萄糖至終濃度為 0.5% (質(zhì)量體積比）。
[0065] 0.5Μ蔗糖/10%甘油：17.115g蔗糖溶解于80ml超純水中，加入IOml甘油后混勻定 容至100mL，0· 22μηι過(guò)濾除菌。
[0066] LB液體培養(yǎng)基：IOg蛋白胨、5g酵母提取物、Ig NaCl溶解于900ml蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH 值至7.0后，定容至IL后121°C高壓滅菌15min。
[0067 ] 主要儀器:高速冷凍離心機(jī)、移液器、PCR儀均購(gòu)于德國(guó)Epp endorf公司；核酸電泳 槽、電泳儀、電轉(zhuǎn)化儀購(gòu)于Bio-Rad公司；凝膠成像儀購(gòu)于上海天能公司；除菌過(guò)濾膜(0.22μ m)購(gòu)自What Man公司。
[0068]目的基因獲得：
[0069] 1.抗菌肽Enterocin P基因由生工生物工程(上海)有限公司合成，兩側(cè)加 Sac I和 Hindm的酶切位點(diǎn)并導(dǎo)入大腸桿菌DH5a。如圖1所示，為本發(fā)明按照質(zhì)粒提取試劑盒提取由 含目的基因的大腸桿菌DH5a質(zhì)粒的示意圖。
[0070] 2.如圖2所示，為本發(fā)明的按照TaKaRa Biotech限制性內(nèi)切酶Sac I和Hindm雙酶 切步驟1中提取的質(zhì)粒的示意圖，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，目的基因片段采用天根 公司DNA回收試劑和操作方法進(jìn)行膠回收，-20°c保存?zhèn)溆谩?br>[0071] 質(zhì)粒pMG36e線性化：
[0072] 如圖3所示，為本發(fā)明的采用TaKaRa Biotech限制性內(nèi)切酶Sac I和Hindm操作說(shuō) 明雙酶切pMG36e質(zhì)粒的示意圖；如圖4所示，為本發(fā)明的線性化產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳 圖，目的基因片段采用天根公司DNA回收試劑和操作方法進(jìn)行膠回收，-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0073]回收的目的基因和線性化質(zhì)粒連接
[0074] 按照TaKaRa Biotech的T4 DNA連接酶試劑盒操作說(shuō)明書對(duì)回收目的基因和質(zhì)粒 進(jìn)行連接。
[0075] 實(shí)施例2
[0076]制備大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞
[0077] I、1 %接種DH5a的LB液體培養(yǎng)基，于37 °C振蕩過(guò)夜培養(yǎng)；
[0078] 2、取過(guò)夜培養(yǎng)菌液1 %接種于LB液體培養(yǎng)基，37°C下振蕩培養(yǎng)4h(此時(shí)細(xì)菌處于對(duì) 數(shù)生長(zhǎng)期），冰上放置IOmin;
[0079] 3、4000g，4°C離心10min收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，棄上清，收集細(xì)菌細(xì)胞沉淀；
[0080] 4、用1/10于之前液體培養(yǎng)基體積的預(yù)冷的0.1 M CaCl2菌體，冰上放置30min;
[00811 5、4000g，4°C離心5min棄上清，收集細(xì)菌細(xì)胞沉淀；
[0082] 6、用1/100于之前液體培養(yǎng)基體積的含0.1 M CaCl2溶液重懸菌體；
[0083] 7、吸取200yL分裝于離心管，-80 cC保存。
[0084] 實(shí)施例3
[0085]連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞
[0086] (1)取100μΙ E.coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞，加入10-50μ1連接產(chǎn)物，輕柔混勻后，冰浴 30min；
[0087] (2)將EP管放入預(yù)熱至42 °C的水浴中90s;
[0088] (3)快速將EP管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻l-2min;
[0089] (4)每管加900μ1 LB培養(yǎng)液體基，37°C搖床溫和震蕩培養(yǎng)1.5h，使細(xì)菌復(fù)蘇并充分 表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性標(biāo)記基因；
[0090] (5)吸取100μΙ復(fù)蘇培養(yǎng)菌液分別涂布于含200yg/mL紅霉素的LB培養(yǎng)基平板上；
[0091] (6)將平板置于室溫至液體吸收，倒置平板，如圖5所示，為本發(fā)明的37°C培養(yǎng)12-24h直至出現(xiàn)單菌落圖。
[0092] 實(shí)施例4
[0093] 大腸桿菌DH5a重組質(zhì)粒菌落PCR及雙酶切鑒定
[0094] 挑取上步驟獲得的單菌落進(jìn)行PCR鑒定
[0095] 用于PCR擴(kuò)增的引物
[0096] 正向引物:AAGTTGATGCAGCTACGC
[0097] 反向引物：TGTCCCATACCTGCCAAA [0098]擴(kuò)增目的片段長(zhǎng)度為142bp。
[0099] 以單菌落為DNA模板的PCR反應(yīng)體系如下： 正向引物（10 PM) I HL 反向引物（?ο μΜ) 1 μι dMTP Mixture 2 M-L
[0100] 10 X PCR Buffer 2* 5 I1L Taq DM 聚合酶（5 U/A) 0.2 μL CidH3O 補(bǔ)足至 25AL
[0101] 擴(kuò)增程序：94°(：，511^11，然后30個(gè)循環(huán)（94°(：，11^11;58°(：，503 ;72°(：，11^11);72°(：延 伸10min。如圖6所示，為本發(fā)明的PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳圖。
[0102] 重組質(zhì)粒酶切鑒定：
[0103] 挑取經(jīng)PCR驗(yàn)證正確的單菌落于LB液體培養(yǎng)基于37°C振蕩培養(yǎng)好的菌液，如圖7所 示，為本發(fā)明的按照天根質(zhì)粒提取試劑盒操作說(shuō)明提取質(zhì)粒后進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳圖； 如圖8所示，為本發(fā)明的提取質(zhì)粒采用TaKaRa Biotech限制性內(nèi)切酶Sac I和Hindm操作 說(shuō)明雙酶切質(zhì)粒，產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳圖。
[0104] 實(shí)施例5
[0105] 制備乳酸乳球菌MGl 363感受態(tài)細(xì)胞
[0106] 1、乳酸乳球菌1 %接種于SGM17 (GM17含0.5M蔗糖，2.5 %甘氨酸），培養(yǎng)至0D600 ? 0·5_0·8;
[0107] 2、5000g，4°C 離心 IOmin 收集菌體；
[0108] 3、用冰預(yù)冷的含10 %甘油的0.5M蔗糖的溶液洗滌菌體2次；
[0109] 4、用1/100與之前培養(yǎng)基體積的含10%甘油的0.5M蔗糖溶液重懸菌體，于-80 °C保 存。
[oho]乳酸乳球菌電轉(zhuǎn)化：
[0111] 取2yL經(jīng)驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒與40yL感受態(tài)細(xì)胞混合后，轉(zhuǎn)入預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯中，冰 上放置lOmin。電轉(zhuǎn)化條件：電壓2000V，電容25yF，電阻200Ω。電擊完畢后，立即往電轉(zhuǎn)杯中 加入ImL GM17培養(yǎng)基(含20mM MgCl2,2mM CaCl2)后，30°C靜置培養(yǎng)2h，涂布于含5μg/ml紅霉 素的GMl 7平板上，如圖9所示，為本發(fā)明的30°C培養(yǎng)直至出現(xiàn)單菌落圖。
[0112] 實(shí)施例6
[0113] 乳酸乳球菌MG1363重組質(zhì)粒菌落PCR及雙酶切驗(yàn)證
[0114] 挑取上步驟獲得的單菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證
[0115] 用于PCR擴(kuò)增的引物
[0116] 正向引物:AAGTTGATGCAGCTACGC
[0117] 反向引物：TGTCCCATACCTGCCAAA
[0118] 擴(kuò)增目的片段長(zhǎng)度為142bp。
[0119] 以單菌落為DNA模板的PCR反應(yīng)體系如下： 正向引物（】〇 _) 1 μL 反向引物（10 μΜ ) I ML dNTP Mixture 2 M-L
[0120] IOXPCR Buffer 2. 5 M-L Taq DNA 聚合酶（：5 ?/UL) 0. 2 μL ddH,0 補(bǔ)足至 25 μι>
[0121] 擴(kuò)增程序：94°(：，511^11，然后30個(gè)循環(huán)（94°(：，11^11;58°(：，503 ;72°(：，11^11);72°(：延 伸I Omin。如圖10所示，為本發(fā)明的PCR產(chǎn)物進(jìn)行1 %瓊脂糖凝膠電泳。
[0122] 挑取經(jīng)PCR驗(yàn)證正確的單菌落于GM17液體培養(yǎng)基于30°C振蕩培養(yǎng)好的菌液，如圖 11所示，按照天根質(zhì)粒提取試劑盒操作說(shuō)明提取質(zhì)粒后進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳圖；圖12所 示，為本發(fā)明的提取質(zhì)粒采用TaKaRa Biotech限制性內(nèi)切酶Sac I和Hindm操作說(shuō)明雙酶 切質(zhì)粒，產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳圖。
[0123] 實(shí)施例7
[0124] 乳酸乳球菌MG1363重組菌的分泌表達(dá)
[0125] 將含pMG36e-Enterocin P重組質(zhì)粒的乳酸乳球菌MG1363的基因工程菌接種于含 紅霉素的GM17培養(yǎng)液中，30°C靜置培養(yǎng)過(guò)夜。次日以5%接種量轉(zhuǎn)接至20ml GM17培養(yǎng)液中， 30 °C繼續(xù)靜置培養(yǎng)時(shí)間為5-6h至細(xì)菌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，將培養(yǎng)液冰浴IOmin，4 °C 5000rpm，離 心5min收集培養(yǎng)液上清，將獲得的上清液進(jìn)行0.22μπι過(guò)濾獲得誘導(dǎo)后的無(wú)菌上清液，用于 下一步的抑菌實(shí)驗(yàn)。
[0126] 實(shí)施例7
[0127] 重組抗菌肽抑菌實(shí)驗(yàn)
[0128] 1.重組抗菌肽抑菌實(shí)驗(yàn)
[0129] 本實(shí)驗(yàn)采用瓊脂擴(kuò)散法對(duì)重組表達(dá)的抗菌肽Enterocin P的抑菌活性進(jìn)行檢測(cè)。 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的金黃色葡萄球菌、李斯特菌、沙門氏菌培養(yǎng)物各取IOOyL涂布與20ml固 體培養(yǎng)基中，再用8mm的打孔器打孔，加入200yL的待測(cè)樣品上清液，以不含有抗菌肽 Enterocin P基因的空載體乳酸乳球菌上清為對(duì)照，37 °C培養(yǎng)觀察。
[0130] 2.抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0131] 采用瓊脂擴(kuò)散法對(duì)重組抗菌肽的抑菌活性進(jìn)行檢測(cè)，經(jīng)37°C培養(yǎng)后，結(jié)果顯示，如 圖13所示，為本發(fā)明Enterocin P對(duì)李斯特菌的抑菌效果圖；如圖14所示，為本發(fā)明 Enterocin P對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果圖；如圖15所示，為本發(fā)明Enterocin P對(duì)沙門 氏菌的抑菌效果圖；本發(fā)明Enterocin P對(duì)三種病原菌均具有抑菌性，對(duì)李斯特菌抑制性最 強(qiáng)。本發(fā)明的益生型抗菌肽Enterocin P的基因工程菌可在飼料添加劑中應(yīng)用。
[0132] 根據(jù)上述說(shuō)明書的揭示和教導(dǎo)，本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員還可以對(duì)上述實(shí)施方 法進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兏托薷?。因此本發(fā)明并不局限于上面揭示和描述的【具體實(shí)施方式】，對(duì)本 發(fā)明的一些修改和變更也應(yīng)當(dāng)落入本發(fā)明的權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。此外，盡管本說(shuō)明書 使用了一些特定的術(shù)語(yǔ)，但是這些術(shù)語(yǔ)只是為了方便說(shuō)明，并不對(duì)本發(fā)明構(gòu)成任何限制。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種抗菌肽Enterocin P基因，其特征在于具有SEQ ID No.l所示的核苷酸序列。2. 權(quán)利要求1所述的抗菌肽Enterocin P基因編碼的成熟抗菌肽Enterocin P具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。3. 權(quán)利要求1或2所述的抗菌肽Enterocin P的制備方法，其特征在于包括如下步驟： (1) 人工合成核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的基因； (2) 構(gòu)建能高效表達(dá)抗菌肽Enterocin P的pMG36e_Enterocin P重組質(zhì)粒； (3) 用所述pMG36e-Enterocin P重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌，構(gòu)建乳酸乳球菌NZ900的基因工 程菌； (4) 利用所述基因工程菌乳酸乳球菌表達(dá)抗菌肽Enterocin P; (5) 對(duì)抗菌肽Enterocin P的抑菌活性進(jìn)行檢測(cè)。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗菌肽Enterocin P的制備方法，其特征在于:在步驟（1)中， 人工合成兩側(cè)含Sac I和Hindm的酶切位點(diǎn)Enterocin P基因具有SEQ ID No.3所示的核苷 酸序列。5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗菌肽Enterocin P的制備方法，其特征在于:在步驟(2)中， 將SEQ ID No.3所示的核苷酸序列連接與經(jīng)限制性內(nèi)切酶Sac I和Hindm雙酶切后線性化 的pMG36e質(zhì)粒連接獲得pMG36e-Enterocin P連接產(chǎn)物，將連接產(chǎn)物導(dǎo)入大腸桿菌DH5a，獲 得含口]^366411丨61'0〇；[11?重組質(zhì)粒。6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗菌肽Enterocin P的制備方法，其特征在于:在步驟(3)中， 所述宿主菌為大腸桿菌DH5a; 將提取pMG36e-Enterocin P重組質(zhì)粒，經(jīng)PCR和酶切鑒定正確的質(zhì)粒采用電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入 乳酸乳酸乳球菌感受態(tài)細(xì)胞MG1363中進(jìn)行抗菌肽Enterocin P的誘導(dǎo)表達(dá)，電轉(zhuǎn)化處理參 數(shù)為2. OkV、25yF、200 Ω、5ms，經(jīng)紅霉素抗性篩選、PCR驗(yàn)證、酶切鑒定得到正確的含pMG36e-Enterocin P重組質(zhì)粒的乳酸乳球菌MG1363的基因工程菌。7. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的抗菌肽Enterocin P的制備方法，其特征在于:在步驟(4)中， 將含pMG36e-Enterocin P重組質(zhì)粒的乳酸乳球菌MG1363的基因工程菌接種于含紅霉素的 GM17培養(yǎng)液中，30°C靜置培養(yǎng)過(guò)夜;次日以5%接種量轉(zhuǎn)接至20ml GM17培養(yǎng)液中，30°C繼續(xù) 靜置培養(yǎng)時(shí)間為5-6h至細(xì)菌對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，將培養(yǎng)液冰浴lOmin，4°C5 OOOrpm，離心5min收 集培養(yǎng)液上清，將獲得的上清液進(jìn)行〇.22μπι過(guò)濾獲得誘導(dǎo)后的無(wú)菌上清液，得到抗菌肽 Enterocin Ρ〇8. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的抗菌肽Enterocin Ρ的制備方法，其特征在于:在步驟(5)中， 采用瓊脂擴(kuò)散法對(duì)上清液的抑菌活性進(jìn)行檢測(cè)，經(jīng)37°C培養(yǎng)后，抗菌肽Enterocin P對(duì)金黃 色葡萄球菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌或沙門氏菌的抑菌活性進(jìn)行檢測(cè)。9. 權(quán)利要求2-8任一項(xiàng)所述的抗菌肽Enterocin P動(dòng)物飼料中的應(yīng)用。10. 根據(jù)權(quán)利要求9的應(yīng)用，所述動(dòng)物飼料為飼料添加劑。
【文檔編號(hào)】A23K20/195GK105861522SQ201610487420
【公開日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2016年6月28日
【發(fā)明人】沈城
【申請(qǐng)人】江蘇鹽城源耀生物科技有限公司