承載GAD65 p271-284肽段的I-Ag7果蠅細(xì)胞高表達(dá)基因序列和構(gòu)建的Tetramer的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供了承載GAD65 p271?284肽段的I?Ag7果蠅細(xì)胞高表達(dá)基因序列，包含如SEQ NO.1所示的MHC II?α?Fos?BSP融合基因序列以及如SEQ NO.2所示的GAD65p271?284?MHC II?β?Jun融合基因序列。還提供了承載GAD65 p271?284肽段的I?Ag7的Tetramer，將SEQ NO.1和SEQ NO.2所示的序列分別克隆到表達(dá)載體中，再同時(shí)轉(zhuǎn)染到果蠅細(xì)胞中表達(dá)，將得到的MHC II?α?Fos?BSP和GAD65p271?284?MHC II?β?Jun融合蛋白形成異源二聚體生物素化，最后與熒光素標(biāo)記的鏈霉親和素結(jié)合，即形成承載GAD65 p271?284肽段的I?Ag7的Tetramer。本發(fā)明通過(guò)探討種屬偏好性表達(dá)，擬找到最佳的表達(dá)序列，最終提高重組蛋白的表達(dá)效率。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
承載GAD65 p271 -284肽段的卜Ag7果蠅細(xì)胞高表達(dá)基因序列 和構(gòu)建的Tetramer
技術(shù)領(lǐng)域：
[000?]本發(fā)明屬于MHC-肽四聚復(fù)合物（tetramer)制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及承載 GAD65p271-284肽段的I-Ag7果蠅細(xì)胞高表達(dá)基因序列和構(gòu)建的Tetramer。
【背景技術(shù)】：
[0002] 抗原特異性T細(xì)胞的傳統(tǒng)檢測(cè)分析方法均為間接的活性測(cè)定，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。如同位素 殺傷分析(51Cr釋放殺傷實(shí)驗(yàn))一般在CD8+經(jīng)體外刺激增殖后進(jìn)行，只可定性，不可定量;有 限稀釋分析法(LDA)，包括酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法(elispot)和細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色（ICS)，都是間 接檢測(cè)T細(xì)胞的數(shù)目和功能，不能檢測(cè)沒(méi)有增殖潛力的T細(xì)胞前體，大大低估了目的細(xì)胞的 數(shù)目。Al tman等首創(chuàng)的可溶性MHC-肽四聚復(fù)合物(tetramer)能夠直接定量檢測(cè)抗原特異性 T細(xì)胞的比率，并通過(guò)流式分選及收集目的細(xì)胞，具有高度的靈敏度和特異性，能檢測(cè)出沒(méi) 有活化的T細(xì)胞前體。被贊譽(yù)為檢測(cè)抗原特異性T細(xì)胞方面的一項(xiàng)革命，是目前定量檢測(cè)病 毒特異性T細(xì)胞的金標(biāo)準(zhǔn)。
[0003] Tetramer構(gòu)建的基本過(guò)程是通過(guò)基因工程技術(shù)把長(zhǎng)度為15個(gè)氨基酸的BirA酶底 物肽（BirA substrate peptide，BSP)加在GAD65p271-284肽段的I-Ag7(I-Ag7是NOD小鼠的 MHC-II類(lèi)分子，是異二聚體，分別由α和β亞基組成）的融合蛋白上;把生物素標(biāo)記在BSP的賴 氨酸殘基上，再將生物素標(biāo)記的MHC-肽復(fù)合物與熒光素標(biāo)記的鏈親素以4:1結(jié)合，即形成 GAD65p271-284肽段的I-Ag7tetramer;形成的MHC-肽四聚體與抗原特異性T細(xì)胞上的TCR結(jié) 合;最后通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析抗原特異性抗原特異性T細(xì)胞。
[0004] 通過(guò)培養(yǎng)細(xì)胞，獲得重組蛋白質(zhì)的表達(dá)仍然是大量生產(chǎn)蛋白質(zhì)的重要方法之一。 細(xì)菌、酵母、哺乳動(dòng)物細(xì)胞以及目前已經(jīng)開(kāi)展的昆蟲(chóng)細(xì)胞的相關(guān)研究都各有其限制。最早在 Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞得到了桿狀病毒輔助重組蛋白質(zhì)的表達(dá)。這種最廣泛使用的系統(tǒng)，用于大在較 高比例的重組蛋白的表達(dá)真核生物中，即重組哺乳動(dòng)物細(xì)胞和桿狀病毒感染的昆蟲(chóng)細(xì)胞 中，缺點(diǎn)也十分明顯。重組哺乳動(dòng)物細(xì)胞系只有在轉(zhuǎn)染后的漫長(zhǎng)過(guò)程中獲得，選擇，放大，克 隆選擇和優(yōu)化。在誘導(dǎo)啟動(dòng)子后常常表現(xiàn)出基礎(chǔ)組成性活性(特別是當(dāng)存在高拷貝數(shù)），并 且在誘導(dǎo)之后，經(jīng)常表達(dá)的蛋白只有中等水平。外源蛋白的表達(dá)往往與多種因素相關(guān)，包括 轉(zhuǎn)錄和翻譯的效率。密碼子優(yōu)化涉及的優(yōu)化點(diǎn)可以從基因合成、載體構(gòu)建、基因轉(zhuǎn)錄、mRNA 翻譯、翻譯后修飾等過(guò)程著手，目的只有一個(gè)，就是便于相關(guān)過(guò)程的高效表達(dá)。本發(fā)明通過(guò) 探討種屬偏好性表達(dá)，擬找到最佳的表達(dá)序列，最終提高重組蛋白的表達(dá)效率。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0005] 本發(fā)明的目的是提供承載GAD65p271-284肽段的I-Ag7果蠅細(xì)胞高表達(dá)基因序列 和構(gòu)建的Tetramer，該經(jīng)過(guò)改造后的基因序列能夠高表達(dá)承載GAD65p271-284肽段的I-Ag7 蛋白，最終提高重組蛋白的表達(dá)效率。
[0006] 承載GAD65P271-284肽段的I-Ag7果蠅細(xì)胞高表達(dá)基因序列，包含如SEQ N0.1所示 的MHCII-α-Fos-BSP融合基因序列以及如SEQN0·2所示的GAD65p271-284-MHCII-β-Jun 融合基因序列。
[0007] 如SEQN0.3所示的序列為本發(fā)明如SEQN0.1所示的MHCII-a-Fos-BSP融合基因 序列改造前的序列，如SEQN0.4所示的序列為本發(fā)明如SEQN0.2所示的GAD65p271-284-MHC ΙΙ-β-Jun融合基因序列改造前的序列。
[0008] 承載GAD65p271-284肽段的I-Ag7的Tetramer，將上述SEQN0.1和SEQN0.2所示的 序列分別克隆到表達(dá)載體中，再同時(shí)轉(zhuǎn)染到果蠅細(xì)胞中表達(dá)，將得到的MHC II-a-Fos-BSP 和GAD65p271-284-MHC ΙΙ-β-Jun融合蛋白形成異源二聚體生物素化，最后與熒光素標(biāo)記的 鏈霉親和素結(jié)合，即形成承載GAD65p271-284肽段的I-Ag7的Tetramer。
[0009] 所述的表達(dá)載體為pMT/BiP/V5-His。果蠅細(xì)胞為S2。
[0010] 所述的承載GAD65p271-284肽段的I-Ag7的Tetramer，具體構(gòu)建過(guò)程如下：
[0011] 1)提取NOD鼠脾臟細(xì)胞的總RNA;
[0012] 2)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA;
[0013] 3)引物和酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)
[0014] 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的序列設(shè)計(jì)引物，并加入酶切位點(diǎn)，采用PCR擴(kuò)增MHC ΙΙ-α鏈并加 入EcoRI和SaU酶切位點(diǎn)，引物如下所示：
[0015] forward primer:5'-AAA AAA GAA TTC ATG CCG TGC AGC AGA GCT CTG-3'；（SEQ NO. 5)
[0016] reverse primer:5'-AAA AAAGTC GAC TTC TGT CAG CTC TGA CAT GG-3'；（SEQ NO. 6)
[0017] 采用重疊 PCR法合成Fos+BSP融合基因，并加入EcoRI和Not I位點(diǎn)進(jìn)行克隆，同時(shí) 在EcoR頂每切位點(diǎn)之后加入SaU酶切位點(diǎn)，首先采用
[0018] forward primer：5-CAGAATAGCGAGCTTGCCTCCACCGCCAATATGCTCCGCGAACAAGTTG-3'；（SEQ N0.7)
[0019] reverse primer：5'-CCGCCATGATTCATAACCTTCTGCTTGAGTTGTGCAACTTGTT CGCGGA-3'（SEQ N0.8)
[0020] 互為模板進(jìn)行擴(kuò)增，然后第二輪以第一輪產(chǎn)物為模板采用
[0021] forward primer:5 '-CCGACTGGAAGAGAAAGTGAAGACACTGAAAGCTCAGAATAGCGAGCTT-3'；（SEQ N0.9)
[0022] reverse primer:5'-CTCAAAAATATCGTTCAGTCCGGA TCCTCCACTGCCGCCATGATTCATA-3'；(SEQ NO.10)
[0023] 進(jìn)行擴(kuò)增；
[0024] 隨后，第三輪以第二輪產(chǎn)物為模板采用
[0025] forward primer：5'-GAATTCGTCGACGGCGGCGGAGGAGGCCGCATAGCCCGACTGGAAGAGAA-3'；(SEQ NO.11)
[0026] reverse primer:5 '-GCGGCCGCCTATTCGTGCCATTCGATCTTCTGCGCCTCAAAAATATCGTT-3'；（SEQ N0.12)
[0027] 最終獲得帶有EcoRI/Sal I和Not頂每切位點(diǎn)的Fos+BSP融合基因序列；
[0028]根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的序列設(shè)計(jì)引物，并加入酶切位點(diǎn)，采用PCR擴(kuò)增MHC ΙΙ-β鏈，加 入EcoRI和SaU酶切位點(diǎn)，引物為：
[0029] forward primer:5，-AAA AAA gAA TTC ATg gCT CTg CAg ATC CCC AgC-3,；（SEQ NO.13)
[0030] reverse primer:5'_AAA AAA gTCgAC CTT gCT CCg ggC AgA CTC ggA_3'；(SEQ NO.14)
[0031] 采用重疊 PCR法合成GAD 271-284和Jun基因，并加入Sma I和Not I位點(diǎn)進(jìn)行克隆； 首先米用，
[0032] forward primer^'-TCGGCGGCGGAGGAGGCCTCACAGATACGCTCCAGGCAGAGACGGACCA-3'；（SEQ N0.15)
[0033] reverse primer:5 '-TTGCAATCTCCGTCTGCAAAGCGCTTTTCTCATCCTCAAGCTGGTCCGT-3'；（SEQ N0.16)
[0034] 互為模板進(jìn)行擴(kuò)增，然后第二輪以第一輪產(chǎn)物為模板采用，
[0035] forward primer^'-TTTGTGCTTTTGGAATATGTCACAGAATTCGTCGACGGCGGCGGAGGAG-3'；(SEQ NO.17)
[0036] reverse primer：5'-ATAAACTCGAGTTTCTCCTTCTCTTT-CAGGAGGTTT-GCAATCTCCGTCT-3 ,；(SEQ NO.18)
[0037] 進(jìn)行擴(kuò)增;隨后，第三輪以第二輪產(chǎn)物為模板采用，
[0038] forward primer:5 '-CCCGGGACCTATGAAATTGCTCCAGTA-TTTGTGCTTTTGGAA-3 '；（SEQ NO.19)
[0039] reverse primer:5，-GCG GCCGCGTGAGCGGCGA-GGATAAACTCGAGTTTC-3,，（SEQ NO.20)
[0040] 最終獲得帶有Sma I和Not頂每切位點(diǎn)的基因序列；
[0041] 4)PCR擴(kuò)增獲得目的片段；
[0042] 5)目的片段采用載體進(jìn)行連接；
[0043] 6)將獲得的基因序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化改造；（獲得如SEQ NO. 1所示的MHC ΙΙ-α- Fos-BSP融合基因序列以及如SEQN0.2所示的GAD65p271-284-MHCII-β-Jun融合基因序 列）
[0044] 7)轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中，再進(jìn)行質(zhì)粒抽提；
[0045] 8)雙酶切獲得目標(biāo)片段；
[0046] 9)重組轉(zhuǎn)化:將MHC ΙΙ-α-Fos-BSP和GAD65p271-284-MHC ΙΙ-β鏈-Jun基因分別克 隆入表達(dá)載體；
[0047] 10)將得到的MHC II-a-Fos-BSP和GAD65p271-284-MHC ΙΙ-β鏈-Jun融合基因雙質(zhì) 粒轉(zhuǎn)染果蠅細(xì)胞表達(dá)蛋白；
[0048] 11)步驟10)獲得的蛋白經(jīng)過(guò)純化后用于制備承載GAD65p271-284肽段的I-Ag7的 Tetramer0
[0049] 步驟5)中的載體為pmD18_t。
[0050] 步驟9)的具體過(guò)程如下：
[0051 ] 對(duì)于MHC ΙΙ-α-Fos-BSP的克隆，先將Fos+BSP用EcoRI和NotI克隆入表達(dá)載體，然 后用EcoRI和Sail將a鏈克隆入帶有Fos+BSP融合基因的表達(dá)載體;對(duì)于GAD65p271-284-MHC π-β鏈-Jun基因的克隆，要先用SmaI和NotI克隆GAD65p271-284-Jun融合基因克隆進(jìn)表達(dá) 載體，然后把β鏈通過(guò)EcoRI和Sal頂每切位點(diǎn)插入GAD65p271-284-Jun融合基因之間。
[0052] 步驟9)利用連接酶進(jìn)行重組連接:連接片段lOOng，加入IOOng pMT/BiP/V5-His質(zhì) 粒，10μ1 10 X反應(yīng)buffer和ΙμL連接酶，補(bǔ)足水到20μ1;在16°C水浴中連接24h，并轉(zhuǎn)化感 受態(tài)細(xì)胞。
[0053] 步驟10)的具體過(guò)程：
[0054] A.選取培養(yǎng)好的健康的S2細(xì)胞，將3 X IO6個(gè)細(xì)胞接種在60mm組織培養(yǎng)皿中，培養(yǎng) 基為針對(duì)S2細(xì)胞的Schneider's Drosophila Medium，每皿加入3ml的培養(yǎng)基，28°C無(wú)菌條 件下在恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)；
[0055] B.使用Life technology公司提供的磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑盒K2780-01進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染；
[0056] a)對(duì)于每個(gè)轉(zhuǎn)染反應(yīng)，采用一個(gè)無(wú)菌的1.5ml的離心管，依次加入雙蒸水236μ1，氯 化鈣240mM 36μ1，IygAUa鏈質(zhì)粒9μ1，lyg/μLβ鏈質(zhì)粒9μ1;
[0057] b)緩慢的將這些混合物混合Imin后轉(zhuǎn)移到一個(gè)含有200μ1的2XHEPES HBS的離心 管，然后混勻;該過(guò)程使質(zhì)粒DNA逐漸進(jìn)入細(xì)胞中；
[0058] c)將混合物在室溫放置30-40min;
[0059] d)緩慢將混合物加入到細(xì)胞培養(yǎng)基中，緩慢旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿以充分混勻；
[0060] e)在28 °C的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1天；
[0061 ] f)給細(xì)胞的培養(yǎng)基進(jìn)行換液；
[0062] i)將培養(yǎng)基連同細(xì)胞一起吸入15ml的離心管中；
[0063] ii)3000r/min離心3min，后去除上清，并加入1ml新鮮培養(yǎng)基到15ml的離心管中；
[0064] iii)將混合物重新加入到新的離心管中；
[0065] iv)用2ml培養(yǎng)基重新清洗一次；
[0066] V)用2ml培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，并轉(zhuǎn)到培養(yǎng)皿中培養(yǎng)；
[0067] g) 28 cC 培養(yǎng)兩天。
[0068]步驟10)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞培養(yǎng)在含2mg/ml G418、10%胎牛血清的SFM培養(yǎng)基中，分為 10個(gè)T225細(xì)胞培養(yǎng)瓶，每瓶IOOrnl培養(yǎng)基，細(xì)胞數(shù)目長(zhǎng)到4x IO6ceIlsAil時(shí)準(zhǔn)備誘導(dǎo)；準(zhǔn)備 誘導(dǎo)時(shí)，將10個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)瓶分為20個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)瓶，每瓶IOOrnl培養(yǎng)基，細(xì)胞數(shù)目為2x IO 6ceI ls/ml;培養(yǎng)基換成含1 %胎牛血清的SFM培養(yǎng)基；加入終濃度500mM的CuS〇4誘導(dǎo)MHC II-a-Fos-BSP和GAD65p271-284-MHC ΙΙ-β鏈-Jun形成的異源二聚體的表達(dá)，4天后收集5L 細(xì)胞上清;將細(xì)胞培養(yǎng)物上清液通過(guò)切向流超濾濃縮后，再通過(guò)鎳離子親和純化色譜靶向 獲得。
[0069]本發(fā)明高表達(dá)優(yōu)化策略及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證
[0070] 首先通過(guò)GCG工作站和Augustus軟件、以及在線的密碼子分析軟件EMBOSS和 CodonW分析計(jì)算密碼子頻率。采用專(zhuān)有算法優(yōu)化替換了稀有密碼子和可優(yōu)化等方面的參 數(shù)。根據(jù)序列的開(kāi)放閱讀框，對(duì)序列采用專(zhuān)有算法優(yōu)化，針對(duì)mRNA結(jié)構(gòu)替換了密碼子和可優(yōu) 化等方面的參數(shù)，篩選了表達(dá)克隆密碼子優(yōu)化的基因。軟件根據(jù)1、翻譯選擇(選擇的壓力 存在于翻譯基因過(guò)程中，即密碼子偏好性不同位點(diǎn)（同義，非同義和基因區(qū)內(nèi)）的多態(tài)性和 分歧之間的關(guān)系；2、構(gòu)成基因的G、C含量;3、基因長(zhǎng)度;4、物種的tRNAs的豐度、5、氨基酸保 守性;6、編碼基因在基因組DNA的位置;7、密碼子堿基組成的上下文關(guān)系等因素構(gòu)建的偏好 性表達(dá)序列，改造 MHC ΙΙ-α-Fos-BSP和GAD65p 271-284-MHC ΙΙ-β鏈-Jun雙鏈基因。分別在 誘導(dǎo)表達(dá)后第四天分別吸取IOOul細(xì)胞上清，Dot blot檢測(cè)。
[0071] 種屬偏好性表達(dá)研究
[0072] 鑒于果蠅和小鼠2種生物對(duì)兼并密碼子不同的偏好性（圖1)，利用GC軟件包生物信 息學(xué)軟件優(yōu)化堿基序列，結(jié)果顯示了合成GAD65肽段-MHC ΙΙ-β-Jun序列，改造前后（如圖2 和3)果蠅偏好性序列可見(jiàn)密碼子得分率普遍提高（圖2和3)。
[0073] Dot blot結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染后，2組改造前序列的蛋白表達(dá)量均明顯低于第1組改 造優(yōu)化后的序列（圖4)。證明偏好性改造序列可以顯著提高目的基因的表達(dá)量。
[0074] 實(shí)時(shí)定量顯示，在轉(zhuǎn)染后，第1組和第2組在mRNA表達(dá)水平上沒(méi)有顯著差異（圖5)。 也就是說(shuō)密碼子優(yōu)化是在翻譯水平而不是轉(zhuǎn)錄水平對(duì)基因的表達(dá)進(jìn)行了改進(jìn)。
【附圖說(shuō)明】
[0075] 圖1小鼠和果蠅不同密碼子的偏好性(灰色-小鼠，黑色-果蠅，縱坐標(biāo)為密碼子使 用頻率）；
[0076] 圖2優(yōu)化前目的基因部分序列密碼子在果蠅中表達(dá)的偏好性(縱坐標(biāo)為密碼子使 用頻率，灰色表示密碼子使用頻率低于20，黑色表示密碼子使用頻率高于20);
[0077] 圖3優(yōu)化后目的基因部分序列密碼子在果蠅中表達(dá)的偏好性(縱坐標(biāo)為密碼子使 用頻率，灰色表示密碼子使用頻率低于20，黑色表示密碼子使用頻率高于20);
[0078] 圖4抗his-tag抗體Dot blot檢測(cè)2組不同密碼子偏好表達(dá)差異；
[0079] 1.果蠅偏好性序列;2.未改造序列；
[0080] 圖5實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)2組不同密碼子偏好mRNA表達(dá)差異；
[0081 ] 1.果蠅偏好性序列;2.未改造序列；
[0082]圖6不同濃度的GAD65p271-284抗原肽對(duì)刺激抗原特異性T細(xì)胞的增值具有不同效 果；
[0083] 圖7 pMT/BiP/V5-His質(zhì)粒圖譜。
【具體實(shí)施方式】：
[0084] 以下結(jié)合實(shí)施例旨在進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。
[0085] 實(shí)施例1、構(gòu)建GAD65p271-284肽段的I-Ag7蛋白
[0086] 1、實(shí)驗(yàn)方法
[0087] 1)獲取NOD鼠脾組織并獲得PBMC
[0088] 斷頸處死NOD鼠，放置于75%酒精中3-5分鐘，無(wú)菌操作外科手術(shù)方法取出小鼠脾 臟。將新鮮的NOD鼠脾浸泡在含有鏈霉素和青霉素的PBS中，過(guò)400目篩孔，制備單細(xì)胞懸液。
[0089] 2)MHC ΙΙ-α-Fos-BSP和GAD65肽段-MHC ΙΙ-β-Jun的克隆和鑒定
[0090] 2.1總RNA 提取
[0091] 采用RNA trizol提取NOD鼠脾臟細(xì)胞的總RNA，具體操作如下：
[0092] 1.在脾臟單核細(xì)胞中加入1ml RNA Trizol，用槍頭反復(fù)吸打直至細(xì)胞充分和裂解 液混合。室溫放置5min以充分裂解。
[0093] 2.加入200μ1三氯甲烷，顛倒混勻，之后，室溫放置5min。
[0094] 3 ·放入高速冷凍離心機(jī)，12000r/min離心15min。
[0095] 4.取上清液到另外一個(gè)無(wú) RNA酶的EP管中（約500μ 1上清液）。
[0096] 5.在新的EP管中加入500μ1異丙醇，顛倒混勻。之后，-20°C放置2h以沉淀RNA。
[0097] 6 ·放入高速冷凍離心機(jī)，12000r/min離心10min。
[0098] 7.棄去上清，這時(shí)可以看到管底有沉淀，即為RNA。
[0099] 8.加入1ml DEPC處理過(guò)的無(wú)菌水和無(wú)水乙醇配制的75%乙醇，用槍頭反復(fù)吹打。
[0100] 9 · 5000r/min 離心 3min，棄去上清。
[0101] 10.重復(fù) 10-11 步驟一次。
[0102] 11.小心用槍頭吸去剩余的75%乙醇后，用50yL DEPC處理過(guò)的水溶解RNA。
[0103]提取好的RNA，采用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性。當(dāng)28s和18s兩條帶明 顯清晰且28s亮于18s的條帶時(shí)，被認(rèn)定為RNA質(zhì)量較好。另外，采用分光光度計(jì)分析了 RNA的 濃度以便于控制后續(xù)的cDNA反轉(zhuǎn)錄時(shí)的加樣量。
[0104] 2.2反轉(zhuǎn)錄
[0105]反轉(zhuǎn)錄采用Promega試劑盒進(jìn)行操作。在反轉(zhuǎn)錄之前，用Iyg DNase I進(jìn)行消化。具 體操作如下：取Iyg RNA加入Iyg DNase I在PCR儀上37°C消化20min，之后用0.1 mM EDTA終 止反應(yīng)，隨即進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：
[0106] 在無(wú) RNA酶的0.5ml離心管中加入DNase I消化后的RNAlyg，加入oligo DT17 ΙμL， dNTP ΙμL，然后補(bǔ)足DEPC處理過(guò)的水到16μ1。
[0107] PCR 儀上 7(TC5min。
[0108] 迅速放置在冰上。
[0109] 當(dāng)離心管樣品冷卻后，依次加入2μ1 IOX RT buffer，RNAse inhibitor ΙμL，MMLV Reverse Transcriptase IuL0
[01 ?Ο] 42°〇?0?儀上反轉(zhuǎn)錄6〇111；!_11，之后90°〇1〇111；!_11以停止反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。
[0111] 將反轉(zhuǎn)錄好的cDNA于-20°C保存，或者立即使用。
[0112] 2.3引物和酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)
[0113] 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的序列設(shè)計(jì)引物，并加入酶切位點(diǎn)。采用PCR擴(kuò)增MHC ΙΙ-α鏈并加 入EcoRI和SaU酶切位點(diǎn)。引物如下所示：
[0114] forward primer:5,-AAA AAA GAA TTC ATG CCG TGC AGC AGA GCT CTG-3,；
[0115] reverse primer:5'-AAA AAAGTC GAC TTC TGT CAG CTC TGA CAT GG-3'〇
[0116] 采用重疊 PCR法合成Fos+BSP融合基因，并加入EcoRI和Not I位點(diǎn)進(jìn)行克隆，同時(shí) 在EcoR頂每切位點(diǎn)之后加入SaU酶切位點(diǎn)。首先采用
[0117] forward primer：5'-CAGAA TAGCGAGCTTGCCTCCACCGCCAATATGCTCCGCGAACAAGTTG-3，；
[0118] reverse primer：5'-CCGCCATGATTCATAACCTTCTGCTTGAGTTGTGCAACTTGTT CGCGGA-3'互為模板進(jìn)行擴(kuò)增。然后第二輪以第一輪產(chǎn)物為模板采用
[0119] forward primer：5'-CCGACTGGAAGAGAAAGTGAAGACACTGAAAGCTCAGAATAG CGAGCTT-3，；
[0120] reverse primer:5'-CTCAAAAATATCGTTCAGTCCGGA TCCTCCACTGCCGCCATGATTCATA-3 '進(jìn)行擴(kuò)增。隨后，第三輪以第二輪產(chǎn)物為模板采用
[0121] forward primer：5'-GAATTCGTCGACGGCGGCGGAGGAGGCCGCATAGCCCGACTGGAAGAGAA- 3，；
[0122] reverse primer:5 '-GCGGCCGCCTATTCGTGCCATTCGATCTTCTGCGCCTCAAAAATATCGTT- 3，。
[0123] 最終獲得帶有EcoRI/Sal I和Not頂每切位點(diǎn)的Fos+BSP融合基因序列。
[0124] 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的序列設(shè)計(jì)引物，并加入酶切位點(diǎn)。采用PCR擴(kuò)增MHC ΙΙ-β鏈和α 鏈的獲得方式相似，加入EcoRI和SaU酶切位點(diǎn)。引物為：
[0125] forward primer:5'-AAA AAA gAA TTC ATg gCT CTg CAg ATC CCC AgC-3'；
[0126] reverse primer:5'-AAA AAA gTCgAC CTT gCT CCg ggC AgA CTC ggA_3'〇
[0127] 采用重疊 PCR法合成GAD 271-284和Jun基因，并加入Sma I和Not I位點(diǎn)進(jìn)行克隆。 首先采用
[0128] forward primer:5，-TCGGCGGCGGAGGAGGCCTCACAGATACGCTCCAGGCAGAGACGGACCA- 3，；
[0129] reverse primer:5 '-TTGCAATCTCCGTCTGCAAAGCGCTTTTCTCATCCTCAAGCTGGTCCGT- 3'互為模板進(jìn)行擴(kuò)增。然后第二輪以第一輪產(chǎn)物為模板采用
[0130] forward primer:5 '-TTTGTGCTTTTGGAATATGTCACAGAATTCGTCGACGGCGGCGGAGGAG- 3，；
[0131] reverse primer:5'-ATAAACTCGAGTTTCTCCTTCTCTTT-CAGGAGGTTT-GCAATCTCCGTCT-3'進(jìn)行擴(kuò)增。隨后，第三輪以第二輪產(chǎn)物為模板采用
[0132] forward primer:5'-CCCGGGACCTATGAAATTGCTCCAGTA-TTTGTGCTTTTGGAA-3'；
[0133] reverse primer:5'-GCG GCCGCGTGAGCGGCGA-GGATAAACTCGAGTTTC-3'〇
[0134] 最終獲得帶有Sma I和Not頂每切位點(diǎn)的基因序列。
[0135] 2.4PCR擴(kuò)增獲得目的片段
[0136] 反轉(zhuǎn)錄的cDNA用PCR擴(kuò)增獲得目的片段，具體操作如下： 試劑 荊量 雙蒸水 4 H 1 CDNA 模板 1 μ 1 正向引物（〇.5nM) 05ul
[0137] 反向引物 C0.5nM): D.5yl 10 X PCR 緩沖液 10 μ 1 綱TP 2 y I Mg2 .1 μ. I Taq 酶 Ι μ Ι
[0138] 反應(yīng)條件:94°C變性5min，之后進(jìn)入40個(gè)循環(huán)，循環(huán)條件為94°C變性30s，55°C退火 3〇8,72°(：延伸11^11。在40個(gè)循環(huán)之后，72°(：最終延伸1〇1^11。？0?的產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝 膠電泳檢測(cè)。
[0139] 2.5PCR產(chǎn)物膠回收
[0140] 1.在PCR反應(yīng)之后，使用凝膠電泳除去PCR模板，以及其它不需要的產(chǎn)物。
[0141] 2.準(zhǔn)備500ml IXTAE(10ml的50倍TAE稀釋到500ml的雙蒸水中）。
[0142] 3.配制1 %的瓊脂糖凝膠。加熱至將近沸騰時(shí)候，混勻后繼續(xù)加熱，直到肉眼看不 到漂浮的顆粒為止（在微波爐上高火加熱l_2min即可）。小心拿出裝有瓊脂糖凝膠的三角 瓶，當(dāng)溫度冷卻到50°C時(shí)，加入3μ1溴化乙錠，導(dǎo)入成膠模具并插入大齒梳子。
[0143] 4.按比例在樣品中加入樣品1/6體積的上樣染料。
[0144] 5.上樣染料和樣品混勻上樣，小心點(diǎn)樣到瓊脂糖凝膠上，并將凝膠運(yùn)行在90伏特 的電泳儀上大約30min。
[0145] 6 ·凝膠成像，然后切出和預(yù)測(cè)大小位置一致的條帶，放入2ml Eppendorf離心管 (EP管）中。切割時(shí)使用紫外線燈來(lái)定位目的條帶。佩戴護(hù)目鏡，使用清潔的手術(shù)刀在目的帶 周?chē)怪毕蛳虑邢拢M量減少多余的瓊脂糖。
[0146] 7.凝膠切除后需要立即稱重，并去除空2ml的EP管的重量，并記好標(biāo)簽。
[0147] 8.使用上海生工生物有限公司的膠回收提取試劑盒回收樣品帶。如果該凝膠重量 超過(guò)400mg，則分開(kāi)2管，一式兩份進(jìn)行回收。
[0148] 9.在離心管中加入600ml binding Buffer，放入55°C恒溫干燥箱進(jìn)行溶解。每隔 Imin輕輕搖晃離心管。大約IOmin后膠塊完全溶解。
[0149] 10.溶解后的溶液用移液槍加入到試劑盒提供的過(guò)濾管中，放置2min。
[0150] 11 ·高速冷凍離心，10000r/min 離心 lmin。
[0151] 12.棄去液體，加入wash buffer 600μ1，高速冷凍離心機(jī)10000r/min離心lmin。
[0152] 13.重復(fù)12步驟一次。
[0153] 14.棄去液體，13000r/min 離心2min。
[0154] 15.將濾膜套入到離心管中，在濾膜中央加入30μ1雙蒸水以溶解DNA，放置2min后， 13000r/min離心lmin。離心管中剩余的液體即含有回收的DNA片段。
[0155] 2.6連接
[0156]采用pmD18-t載體首先進(jìn)行連接：
[0157] 1 ·在離心管中加入以下組分(總量5μ1) apmDIS-t載體(購(gòu)于invitrogen公司）1μ1， 膠回收產(chǎn)物ΙμL，反應(yīng)緩沖液2.5μ1，雙蒸水0.5μ1。
[0158] 2.16°C 孵育反應(yīng) 30min。
[0159] 注：
[0160] (1)連接反應(yīng)可以在5min內(nèi)完成，但是連接效率可能會(huì)稍微降低。
[0161] (2)如果連接片段是超過(guò)2kb的延長(zhǎng)連接反應(yīng)時(shí)間至數(shù)小時(shí)。
[0162] 3.連接好的載體在-20 °C保存，或者立即用來(lái)做轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。
[0163] 2.7將獲得的基因序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化改造；（獲得如SEQ NO. 1所示的MHC ΙΙ-α-Fos-BSP融合基因序列以及如SEQN0.2所示的GAD65p271-284-MHCII-β-Jun融合基因序 列）
[0164] 2.8感受態(tài)制備
[0165] 采用氯化鈣法制備大腸桿菌DH5a感受態(tài)：
[0166] 第一天：
[0167] 1.在冰上融化甘油冷凍的DH5a菌株，然后劃線到LB平板上(注意，這時(shí)的平板沒(méi)有 添加任何抗生素，且所有操作均為無(wú)菌操作）。在培養(yǎng)箱中37°C過(guò)夜培養(yǎng)。
[0168] 2.對(duì)下列物品進(jìn)行高壓滅菌
[0169] IL LB培養(yǎng)基
[0170] IL IOOmM的氯化鈣
[0171] IL IOOmM的氯化鎂
[0172] 100ml 85mM氯化鈣(含15%甘油，體積/體積）
[0173] 4個(gè)離心瓶和瓶蓋
[0174] 大量離心管
[0175] 氯化鈣和氯化鎂冷卻過(guò)夜。
[0176] 第二天：
[0177] 3.挑菌落培養(yǎng)。選擇從新鮮LB平板上挑選大腸桿菌單菌落，接種到IOmL的液體LB 培養(yǎng)基中，在37 °C搖床過(guò)夜培養(yǎng)。
[0178] 第三天：
[0179] 4 .接種Iml菌液用IL培養(yǎng)基擴(kuò)大化培養(yǎng)，37 °C繼續(xù)振蕩。在培養(yǎng)一小時(shí)后測(cè)量 0D600，然后每隔15-20min，測(cè)量OD值。
[0180] 5.當(dāng)0D600達(dá)到0.35-0.4時(shí)，立即置于冰浴。冷卻20-3011^11，偶爾輕輕震蕩以保證 冷卻均勻，離心瓶時(shí)刻保持在冰上。
[0181] 6.將IL培養(yǎng)基分為四個(gè)平行管(每個(gè)管為0.25L)，用高速冷凍離心機(jī)以4000r/min 的速度，在4°C下離心15min。
[0182] 7.棄去上清液，每管用100mL冷卻的氯化鎂輕輕懸浮，將懸浮液轉(zhuǎn)移到新的離心管 中。
[0183] 8.高速冷凍離心機(jī)以3000r/min的速度，在4°C下離心15min。
[0184] 9.去除上清液，用200ml的氯化鈣輕輕懸浮，并在冰上沉淀20min。
[0185] 10.在4°C下15min，通過(guò)3000r/min的速度離心收獲細(xì)菌。
[0186] 11.去除上清液，用50ml含15%甘油的氯化鈣重新懸浮細(xì)菌。
[0187] 12.在4°C下15min，通過(guò)以2000r/min的速度離心收獲細(xì)菌。倒出上清，用2ml含 15 %甘油的氯化鈣重新懸浮。
[0188] 13.分裝到1.5ml EP管中，在-80°C冰箱中冷凍保存。
[0189] 2.9轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)
[0190] 取出貯存在-80 °C的DH5a大腸桿菌，在冰上解凍。每個(gè)離心管中有1〇〇μ1的感受態(tài) 細(xì)胞。對(duì)于每一個(gè)轉(zhuǎn)化反應(yīng)，吸取5μ1的質(zhì)粒到感受態(tài)中，并在冰上孵育20-25min，使得DNA 吸附到細(xì)胞表面。準(zhǔn)備42°C水浴。當(dāng)感受態(tài)預(yù)備好后，在42°C水浴中熱激90s。隨后立即放入 冰浴中，冰上2min后加入1ml的LB培養(yǎng)基，并且振蕩混勻，讓細(xì)胞從熱休克恢復(fù)并重新開(kāi)始 生長(zhǎng)。37°C搖床上培養(yǎng)45-60min，液體會(huì)出現(xiàn)渾濁。涂布100μΙ到含有氨芐青霉素的平板上。 在37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。培養(yǎng)過(guò)夜后的單菌落用槍頭小心挑到含有800μ1 LB培養(yǎng)基 的EP管中。37°C搖床上培養(yǎng)4小時(shí)，隨后采用PCR技術(shù)檢測(cè)是否有目的片段。鑒定為陽(yáng)性的送 上海生工生物有限公司測(cè)序。
[0191] 2.10質(zhì)粒抽提
[0192] I.重懸細(xì)菌在250μ1 Pl緩沖液中。確保核糖核酸酶A已被添加到緩沖液Pl中。
[0193] 2.加入250μ1緩沖液P2,輕輕顛倒混合4-6次，不要漩渦震蕩，因?yàn)檫@將導(dǎo)致基因組 DNA的斷裂。如有必要，繼續(xù)顛倒EP管直到溶液變粘和透明，不要讓裂解反應(yīng)時(shí)間超過(guò)5min。
[0194] 3.加入350μ1緩沖液P3,并立即輕輕顛倒試管4-6次。
[0195] 4.離心10min，緊湊的白色沉淀就會(huì)形成。
[0196] 5.將上清轉(zhuǎn)移至帶有濾膜的離心柱中，下面套一個(gè)EP管。
[0197] 6.離心30-60s，丟棄EP中的液體。
[0198] 7.加0.5ml緩沖液PB，離心30-60s，丟棄EP管中的液體。
[0199] 8 ·加入含75%乙醇的wash buffer，離心Imin以除去殘留的緩沖液，重復(fù)一次。然 后高速離心I-2min，以徹底除去乙醇?xì)埩?，乙醇?huì)影響DNA的洗脫。
[0200] 9.將離心柱放入無(wú)菌的1.5ml EP管中。為了洗脫DNA，加入50μ1緩沖液EB(10mM，pH 值8.5)或無(wú)菌雙蒸水于離心柱的濾膜中心，靜置Imin，并離心lmin。
[0201 ] 10. EP管中所獲得的即為含質(zhì)粒溶液，將其保存在-20 °C中。
[0202] 2.11 雙酶切
[0203] 在提取質(zhì)粒后進(jìn)行雙酶切反應(yīng):膠回收片段2.Oug，加入IOXbuffer 10μ1，兩種酶 各UU，補(bǔ)足無(wú)菌雙蒸水至反應(yīng)體系1〇(^1。37°(：反應(yīng)2小時(shí)，并采用凝膠電泳回收酶切片段。 回收后的片段通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證以確定為目標(biāo)片段。
[0204] 2.12重組轉(zhuǎn)化
[0205] 將MHC ΙΙ-α-Fos-BSP和GAD65p271-284-MHC ΙΙ-β鏈-Jun基因分別克隆入表達(dá)載 體The InducibleDES.ft)vectors(pMT/BiP/V5_His)(購(gòu)于invitrogen公司）。
[0206] 對(duì)于MHC II-a-Fos-BSP(即a鏈融合基因）的克隆，先將Fos+BSP用EcoRI和NotI克 隆入表達(dá)載體，然后用EcoRI和Sail將a鏈克隆入帶有Fos+BSP融合基因的表達(dá)載體;對(duì)于 GAD65p271-284-MHC ΙΙ-β鏈-Jun基因（即β鏈融合基因）的克隆，要先用SmaI和NotI克隆 GAD65p271-284-Jun融合基因克隆進(jìn)表達(dá)載體，然后把β鏈通過(guò)EcoRI和Sal I酶切位點(diǎn)插入 GAD65p271-284-Jun融合基因之間。
[0207] 利用連接酶進(jìn)行重組連接：連接片段100ng，加入IOOng inducibleDE即vectors 質(zhì)粒，10μ1 10X反應(yīng)buffer和lμl連接酶，補(bǔ)足水到20μl。在16°C水浴中連接24h，并轉(zhuǎn)化感 受態(tài)細(xì)胞。
[0208] 2.13重組質(zhì)粒的鑒定
[0209] 轉(zhuǎn)化子用PCR檢測(cè)，如果包含可能為陽(yáng)性的片段即送到上海生工生物有限公司進(jìn) 行測(cè)序。
[0210] 3)果蠅S2細(xì)胞復(fù)蘇和傳代
[0211] 3.1S2細(xì)胞復(fù)蘇從液氮罐中取出凍存的細(xì)胞株在37°C恒溫下解凍；用70%乙醇擦 拭并消毒細(xì)胞瓶外側(cè)，轉(zhuǎn)移細(xì)胞液到4ml室溫下的完全培養(yǎng)基中，重懸細(xì)胞并在1000 g離心 2-3分鐘，去除培養(yǎng)基中的DMSO.接種細(xì)胞到5ml新鮮完全培養(yǎng)基中28°C，無(wú) CO2培養(yǎng)箱中培 養(yǎng)細(xì)胞到密度6~20xl06cells/ml。
[0212] 3.2S2細(xì)胞傳代細(xì)胞密度到達(dá)5X106cells/ml時(shí)，細(xì)胞成簇狀生長(zhǎng)，這并不影響細(xì) 胞的生長(zhǎng)，傳代過(guò)程中可吹打開(kāi)成團(tuán)細(xì)胞。按1:2至1:5比例傳代細(xì)胞。28°C培養(yǎng)細(xì)胞直至密 度達(dá)到 6_20xl06cells/ml。
[0213] 4)重組載體的轉(zhuǎn)染和誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定
[0214] 4. Ia鏈和β鏈融合基因雙質(zhì)粒轉(zhuǎn)染果蠅細(xì)胞
[0215] 在果蠅S2細(xì)胞中的表達(dá)參照DES果蠅表達(dá)系統(tǒng)的操作方案進(jìn)行(Life technology 公司），具體操作如下：
[0216] 1.選取培養(yǎng)好的健康的S2細(xì)胞，將3 X IO6的細(xì)胞種在60mm組織培養(yǎng)皿中。培養(yǎng)基 為針對(duì)S2細(xì)胞的Schneider ' s Drosophila Medium，每皿加入3ml的培養(yǎng)基。28°C無(wú)菌條件 下在恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。
[0217] 2.使用Life technology公司提供的磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑盒(K2780-01)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn) 染，操作均參照試劑盒提供說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。
[0218] a)對(duì)于每個(gè)轉(zhuǎn)染反應(yīng)，采用一個(gè)無(wú)菌的1.5ml的離心管，依次加入雙蒸水236μ1，氯 化鈣240mM 36μ1，α鏈質(zhì)粒（lyg/μL)9yg即9μ1，β鏈質(zhì)粒（lyg/μL)9yg即9μ1。
[0219] b)緩慢的將這些混合物混合Imin后轉(zhuǎn)移到一個(gè)含有200μ1的2 XHEPES HBS，然后 混勻。該過(guò)程使質(zhì)粒DNA逐漸進(jìn)入細(xì)胞中。
[0220] c)將混合物在室溫放置30-40min。
[0221 ] d)緩慢將混合物加入到細(xì)胞培養(yǎng)基中，緩慢旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿以充分混勻。
[0222] e)在28 °C的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1天。
[0223] f)給細(xì)胞的培養(yǎng)基進(jìn)行換液。
[0224] i)將培養(yǎng)基連同細(xì)胞一起吸入15ml的離心管中。
[0225] ii)3000r/min離心3min，后去除上清，并加入1ml新鮮培養(yǎng)基到15ml的離心管中。
[0226] iii)將混合物重新加入到新的離心管中。
[0227] iv)用2ml培養(yǎng)基重新清洗一次。
[0228] V)用2ml培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，并轉(zhuǎn)到培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。
[0229] g)28°C 培養(yǎng)兩天。
[0230] 4.2重組載體的小量表達(dá)、純化和鑒定
[0231] 用β鏈融合基因質(zhì)粒進(jìn)行小量表達(dá)及誘導(dǎo)，β鏈融合基因按上述方法轉(zhuǎn)染S2細(xì)胞， 潮霉素篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株并培養(yǎng)3或4周后，以2Χ IO6ceIVml的量將細(xì)胞種于5ml培養(yǎng)基 中，采用500mM CuS〇4誘導(dǎo)。誘導(dǎo)后第2、3、4、5天，分別用Western blot檢測(cè)His標(biāo)簽表達(dá)，因 為融合基因上帶有His標(biāo)簽蛋白。結(jié)果顯示第4天的誘導(dǎo)效果最好。
[0232] 摸好表達(dá)時(shí)間點(diǎn)之后，將α鏈和β鏈融合基因雙質(zhì)粒轉(zhuǎn)染果蠅S2細(xì)胞進(jìn)行小量表 達(dá)。潮霉素篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株并培養(yǎng)到3或4周后，以2 X IO6CelVml的量將細(xì)胞種于5ml 培養(yǎng)基中，米用500mM CuS〇4誘導(dǎo)。誘導(dǎo)4天后，將5ml上清用超濾管（30kDa，Amicon)濃縮至 Iml左右，加入緩沖液（IOOmM NaCl and20mM Tris pH 8)至5ml，再濃縮至lml，重復(fù)一次后 加入緩沖液至5ml。加入IOOul 50%鎳離子瓊脂糖珠(Qiagen)，室溫孵育20min結(jié)合異源二 聚體。離心得到鎳離子瓊脂糖珠，用緩沖液沖洗珠子2次后，用Western blot檢測(cè)His標(biāo)簽蛋 白和BSP蛋白的表達(dá)。
[0233] 4.3重組蛋白的大量表達(dá)、純化和鑒定
[0234] 在小量表達(dá)摸好時(shí)間點(diǎn)和檢驗(yàn)重組蛋白雙鏈明確表達(dá)之后，將α鏈和β鏈融合基因 雙質(zhì)粒轉(zhuǎn)染果蠅S2細(xì)胞的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞擴(kuò)增進(jìn)行大量表達(dá)。MHC Π -α-Fos-BSP和 GAD65p271-284-MHC ΙΙ-β鏈-Jun形成的異源二聚體可以將細(xì)胞培養(yǎng)物上清液通過(guò)切向流 超濾濃縮后通過(guò)鎳離子親和純化色譜靶向獲得。
[0235]轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞培養(yǎng)在含2mg/ml G418、10%胎牛血清(FCS)的SFM培養(yǎng)基中，分為10 個(gè)T225細(xì)胞培養(yǎng)瓶，每瓶100mL培養(yǎng)基，細(xì)胞數(shù)目長(zhǎng)到大約為4x 106cells/ml時(shí)準(zhǔn)備誘導(dǎo)。 [0236]準(zhǔn)備誘導(dǎo)時(shí)，將10個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)瓶分為20個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)瓶，每瓶100mL培養(yǎng)基，細(xì)胞數(shù) 目大約為2x 106cells/ml。培養(yǎng)基換成含1%FCS的SFM培養(yǎng)基。SDM培養(yǎng)基會(huì)影響細(xì)胞的誘 導(dǎo)和隨后的濃縮過(guò)程。
[0237] 加入500mM CuS〇4(終濃度)誘導(dǎo)MHC class II的表達(dá)，4天后收集5L細(xì)胞上清。并 用切向流濃縮(Minimate切向流超濾膜包，有效過(guò)濾面積50cm2，流速30-40mL/min)至6ml。 根據(jù)目的蛋白的分子量，選擇膜包的合適截留分子量10kD，按儀器的說(shuō)明書(shū)操作將樣品容 器、膜包和壓力計(jì)用無(wú)吸附硅膠軟管連接，蠕動(dòng)栗實(shí)現(xiàn)加壓動(dòng)力并從其中的部分軟管繞過(guò)。 根據(jù)說(shuō)明書(shū)的洗滌程序，用洗滌溶液首先平衡膜包，最后以PBS平衡管道系統(tǒng)，將需要過(guò)濾 的細(xì)胞表達(dá)上清倒入樣品容器，打開(kāi)懦動(dòng)栗系統(tǒng)，緩慢啟動(dòng)懦動(dòng)栗至30-40mL/min的流量， 當(dāng)樣品量濃縮到50ml體積左右時(shí)，在樣品容器中分次緩緩加入Hi s柱結(jié)合緩沖液（50mM NaH2PO4，300mM NaCl，pH 8.0)，將蛋白樣品度濃縮到約6ml左右?；厥諛悠方?jīng)4 °C，12，OOOg離 心12min，上清即為目的蛋白的濃縮液。
[0238] 親和層析，使用Novagen公司HiS-結(jié)合純化試劑盒(Novagen，70239-3)。其原理是 游離的銅離子可以和帶His標(biāo)簽的蛋白螯合，使蛋白固定到固相載體上。
[0239] 將4ml 50%Ni-NTA His · Bind樹(shù)脂懸液與Ni-NTA結(jié)合緩沖液混合完全，上樣到1 X IOcm的玻璃柱中。等待樹(shù)脂凝固后進(jìn)行后續(xù)操作。
[0240]用6ml蒸餾水，清洗該層析柱。
[0241] 加425-600μπι直徑的玻璃珠(Sigma公司，G9268)到樹(shù)脂床的頂部。
[0242] 隨后，加入6毫升I Xbinding buffer，清洗層析柱。用蓋子封閉活栓到柱子的底 部，并在柱子頂部固定蓋子。將層析柱裝到層析架上;并在灌注管上，取出管路。使用注射 器，吸取樣本流體到管口；松開(kāi)頂管，打開(kāi)龍頭，使流體從底部滴落。使用活塞來(lái)調(diào)節(jié)流量， 以2ml/min的量讓液體流過(guò)，收集流過(guò)的液體。
[0243] 通過(guò)的濃縮濾器，在3500rpm/min離心5min收集產(chǎn)物。
[0244] 分子篩層析純化，將2倍柱體積的緩沖液(PBS pH7.45)預(yù)先平衡層析柱至280nm吸 收值無(wú)明顯變化(一般〈0.001AU)，將檢測(cè)器的吸收值歸零。編輯層析運(yùn)行和收集器的方法， 將樣品液（已經(jīng)預(yù)先對(duì)緩沖液透析）注入樣品環(huán)中，轉(zhuǎn)動(dòng)進(jìn)樣器將"Load"狀態(tài)切換至 "Inject"，系統(tǒng)流速為2. Oml/min。同時(shí)開(kāi)啟收集器的程序。自動(dòng)收集器自動(dòng)將280nm吸收值 大于0.005AU的蛋白峰按每管800ul體積收集。采用SDS-PAGE和anti his抗體和抗BSP抗體 Western blot分析檢測(cè)得到的MHC class II蛋白（即MHC ΙΙ-α-Fos-BSP和GAD65p271-284-MHC ΙΙ-β-Jun形成的異源二聚體）。
[0245] 4.4重組載體表達(dá)蛋白的鑒定
[0246] 分離膠的制備
[0247] 1.玻璃板用肥皂和水清洗干凈，然后用乙醇再清洗一次。并組裝好。
[0248] 2 ·首先配制6%的分離膠IOml。加入配制好的分離膠(包含0 · 008ml TEMED和0 · Iml 10%APS)。將分離膠倒入兩玻璃板中間，并密封膠，在分離膠的上面倒入異丁醇以使分離膠 的頂端平整。密封IOmin后準(zhǔn)備倒入濃縮膠。
[0249] 濃縮膠的制備：
[0250] 1.倒出分離膠上端的異丁醇。并用水清洗掉異丁醇。用濾紙擦干內(nèi)表面。
[0251 ] 2.在濃縮膠中加入APS/TEMED，混勻，然后倒在分離膠的上面。
[0252] 3.垂直插入梳子，然后在梳子兩側(cè)倒入少許濃縮膠，以完全密封梳子的兩側(cè)，并去 除氣泡。
[0253] 4.等待20-30min以使得濃縮膠重復(fù)凝集。
[0254] 凝膠電泳：
[0255] 1.將制膠模具放入電泳儀，倒入Tris-甘氨酸電泳緩沖液。
[0256] 2.小心除去電泳槽周?chē)臍馀荨?br>[0257] 3.小心拔出梳子，并用注射器去除孔周?chē)臍馀荨?br>[0258] 4.樣品和loading buffer共同加熱煮沸以變性5min。
[0259] 5. -開(kāi)始用20mA的電流進(jìn)行預(yù)電泳。當(dāng)染色條帶跑到分離膠時(shí)候，將電流轉(zhuǎn)到 30mA。當(dāng)顯色帶跑到快到凝膠底端時(shí)停止電泳。
[0260] 6.凝膠用考馬斯亮藍(lán)進(jìn)行染色。將凝膠放入考馬斯亮藍(lán)中，染色lh。之后，加入脫 色劑(40 %乙醇、10 %乙酸和50 %雙蒸水），分三次脫色，每次Ih。脫色完后，拍照觀察。
[0261 ]采用跑好而且并未染色的SDS-PAGE凝膠進(jìn)行轉(zhuǎn)膜并孵育抗體。
[0262] 1.將凝膠拿出，放入轉(zhuǎn)膜儀。在轉(zhuǎn)膜儀上倒入轉(zhuǎn)膜液體(本實(shí)驗(yàn)所用轉(zhuǎn)膜為濕轉(zhuǎn)技 術(shù)）。在底層鋪設(shè)6層濾紙，中間放上醋酸纖維薄膜，上層放凝膠，之后，上層再鋪上6層濾 紙。
[0263] 2.以電流0.25A、250V電壓轉(zhuǎn)膜40min。
[0264] 3.轉(zhuǎn)好后的膜小心取出。用TBST溶液小心清洗3次，每次5min。隨后進(jìn)入后續(xù)操作。
[0265] 抗體孵育及顯色：
[0266] 1.首先用脫脂牛奶封閉。加入5%的脫脂牛奶，封閉30min。
[0267] 2.將醋酸纖維薄膜用封膜機(jī)封閉好。
[0268] 3.在封閉袋中加入1ml 1:500稀釋后的抗His標(biāo)簽及抗BSP蛋白抗體進(jìn)行孵育，-4 °C下孵育過(guò)夜。
[0269] 4.醋酸纖維薄膜用TBST清洗三次，每次IOmin。
[0270] 5.在封閉袋中加入1ml 1:2000稀釋后的羊抗鼠 IgG二抗，-4°C下孵育過(guò)夜。
[0271] 6.醋酸纖維薄膜用TBST清洗三次，每次lOmin。
[0272] 7.采用HRP法進(jìn)行顯色。A、B液混合后，放入醋酸纖維薄膜以化學(xué)顯色。在醋酸纖維 薄膜上方放置膠片，并用封膠盒子封閉。20_30min后漂洗并掃描。
[0273] 4.5蛋白濃度的測(cè)定
[0274] 蛋白濃度測(cè)定采用二辛可寧酸(BCA)法進(jìn)行，所有試劑由Pierce公司提供。首先配 制試劑：
[0275] 試劑A: Ig BCA，2g碳酸鈉，0.16g酒石酸鈉，0.4g NaOH和0.95g碳酸氫鈉，用100mL 蒸餾水稀釋。將用IOM NaOH將pH值調(diào)節(jié)至11.25。
[0276] 試劑B :4g BCA溶解于蒸餾水10ml。
[0277] 試劑C: 0.4g硫酸銅(5 X水合)溶解于蒸餾水IOml。
[0278] 1.準(zhǔn)備含有0.2至50yg蛋白質(zhì)在500μ1樣品。
[0279] 2.添加500μ1工作液和500μ1樣品混勻，孵育60min。
[0280] 3.冷卻后樣品讀取562nm處吸光值。
[0281] 制備吸光度與蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并確定擬合曲線公式。確定原始樣品的量的蛋 白質(zhì)，以及計(jì)算體積/樣品和稀釋因子的濃度。
[0282] 5)構(gòu)建 GAD65p271-284肽段的 I-Ag7tetramer
[0283 ] 5.1蛋白的生物素化、純化、定量和保存
[0284] 5ml蛋白（即MHC ΙΙ-α-Fos-BSP和GAD65p271-284-MHC ΙΙ-β-Jun形成的異源二聚 體)加入IOOmM咪唑/IOOmM NaCl/20mM Tris pH8的緩沖液中，100μΙ連接酶BirA(25yM)，200 μL生物素（5πιΜ)，200μ1 ΑΤΡ(0·5Μ，溶解于IM Tris ρΗ9· 5)，Iml IOX ligase buffer(50mM MgCh/0.2M Tris ρΗ7·5)，400μ1 protease inhibitor(25X)，3· Iml Η20,25Γ下生物素化 60min〇
[0285] 5.2分子篩純化
[0286] 用Biosep SEC S-3000的分子篩過(guò)柱分離純化濃縮蛋白。-20°C在16%甘油/150mM NaCl/20mM Tris的溶液中保存。
[0287] 5.3四聚體的制備鑒定和保存
[0288] 將生物素化的MHC ΙΙ-α-Fos-BSP和GAD65p271-284-MHC ΙΙ-β-Jun形成的異源二 聚體與PE標(biāo)記的鏈霉親和素混勻，其中二聚體80ug，鏈霉親和素 IOug，每隔五分鐘加入一次 鏈親合素，一共八次。37°C孵育30min。并用非變性PAGE鑒定四聚體的合成。在電泳之前，不 能加熱變性，以防止四聚體的分解。過(guò)分子篩純化濃縮蛋白至lmg/ml。抗his-tag抗體 Weston blot檢測(cè)收集峰蛋白，鑒定后置于保存液（16%甘油、0.5%BSA tris緩沖液)-20°C 保存。
[0289] 應(yīng)用GAD65p271-284刺激T細(xì)胞做體外增殖獲得的抗原特異性T細(xì)胞作為對(duì) Tetramer功能鑒定，終濃度為0、10、50、300ug/ml的表位肽刺激6天后流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) GAD65p271-284抗原特異性T細(xì)胞的增值狀態(tài)。以GAD65p271-284抗原肽MHC II四聚體對(duì)不 同實(shí)驗(yàn)樣品進(jìn)行2色熒光染色。結(jié)果顯示不同濃度的GAD65p271-284抗原肽對(duì)刺激抗原特異 性T細(xì)胞的增值具有不同效果(見(jiàn)圖6)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 承載GAD65P271-284肽段的I-Ag7果蠅細(xì)胞高表達(dá)基因序列，其特征在于，包含如SEQ NO. 1所示的MHC ΙΙ-α-Fos-BSP融合基因序列以及如SEQ勵(lì).2所示的6六065口271-284-]\〇〇 ΙΙ-β-Jun融合基因序列。2. 承載GAD65p271-284肽段的I-Ag7的Tetramer，其特征在于，將權(quán)利要求1中SEQ NO. 1 和SEQ NO. 2所示的序列分別克隆到表達(dá)載體中，再同時(shí)轉(zhuǎn)染到果蠅細(xì)胞中表達(dá)，將得到的 MHC ΙΙ-α-Fos-BSP和GAD65p271-284-MHC ΙΙ-β-Jun融合蛋白形成異源二聚體生物素化，最 后與熒光素標(biāo)記的鏈霉親和素結(jié)合，即形成承載GAD65p271-284肽段的I-Ag7的Tetramer。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的承載GAD65p271-284肽段的I-Ag7的Tetramer，其特征在于，所 述的表達(dá)載體為pMT/BiP/V5-His。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的承載GAD65p271-284肽段的I-Ag7的Tetramer，其特征在于，果 蠅細(xì)胞為S2。5. 根據(jù)權(quán)利要求2或3或4所述的承載GAD65p271-284肽段的I-Ag7的Tetramer，其特征 在于，具體構(gòu)建過(guò)程如下： 1) 提取NOD鼠脾臟細(xì)胞的總RNA; 2) 反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA; 3) 引物和酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì) 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的序列設(shè)計(jì)引物，并加入酶切位點(diǎn)，采用PCR擴(kuò)增MHC ΙΙ-α鏈并加入 EcoRI和SaU酶切位點(diǎn)，引物如下所示： forward primer:5'-AAA AAA GAA TTC ATG CCG TGC AGC AGA GCT CTG-3'； reverse primer:5'-AAA AAA GTC GAC TTC TGT CAG CTC TGA CAT GG-3'； 采用重疊 PCR法合成Fos+BSP融合基因，并加入EcoRI和Not I位點(diǎn)進(jìn)行克隆，同時(shí)在 EcoR頂每切位點(diǎn)之后加入SaU酶切位點(diǎn)，首先采用 forward primer：5-CAGAATAGCGAGCTTGCCTCCACCGCCAATATGCTCCGCGAACAAGTTG-3'； reverse primer:5 '-CCGCCATGATTCATAACCTTCTGCTTGAGTTGTGCAACTTGTTCGCGGA-3 '； 互為模板進(jìn)行擴(kuò)增，然后第二輪以第一輪產(chǎn)物為模板采用 forward primer:5，-CCGACTGGAAGAGAAAGTGAAGACACTGAAAGCTCAGAATAGCGAGCTT-3，； reverse primer:5 '-CTCAAAAATATCGTTCAGTCCGGATCCTCCACTGCCGCCATGATTCATA-3 '； 進(jìn)行擴(kuò)增； 隨后，第三輪以第二輪產(chǎn)物為模板采用 forward primer:5' -GAATTCGTCGACGGCGGCGGAGGAGGCCGCATAGCCCGACTGGAAGAGAA-3，； reverse primer:5 '-GCGGCCGCCTATTCGTGCCATTCGATCTTCTGCGCCTCAAAAATATCGTT-3 '； 最終獲得帶有EcoRI/Sal I和Not I酶切位點(diǎn)的Fos+BSP融合基因序列； 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的序列設(shè)計(jì)引物，并加入酶切位點(diǎn)，采用PCR擴(kuò)增MHC ΙΙ-β鏈，加入 EcoRI和SaU酶切位點(diǎn)，引物為： forward primer:5'-AAA AAA gAA TTC ATg gCT CTg CAg ATC CCC AgC-3'； reverse primer:5'-AAA AAA gTCgAC CTT gCT CCg ggC AgA CTC ggA_3'； 采用重疊 PCR法合成GAD 271-284和Jun基因，并加入Sma I和Not I位點(diǎn)進(jìn)行克?。皇紫?米用， forward primer:5 '-TCGGCGGCGGAGGAGGCCTCACAGATACGCTCCAGGCAGAGACGGACCA-3 '； reverse primer:5 '-TTGCAATCTCCGTCTGCAAAGCGCTTTTCTCATCCTCAAGCTGGTCCGT-3 '； 互為模板進(jìn)行擴(kuò)增，然后第二輪以第一輪產(chǎn)物為模板采用， forward primer:5 '-TTTGTGCTTTTGGAATATGTCACAGAATTCGTCGACGGCGGCGGAGGAG-3 '； reverse primer:5 '-ATAAACTCGAGTTTCTCCTTCTCTTT-CAGGAGGTTT-GCAATCTCCGTCT-3 '； 進(jìn)行擴(kuò)增;隨后，第三輪以第二輪產(chǎn)物為模板采用， forward primer:5 '-CCCGGGACCTATGAAATTGCTCCAGTA-TTTGTGCTTTTGGAA-3 '； reverse primer:5 '-GCGGCCGCGTGAGCGGCGA-GGATAAACTCGAGTTTC-3 '， 最終獲得帶有Sma I和Not I酶切位點(diǎn)的基因序列； 4. PCR擴(kuò)增獲得目的片段； 5) 目的片段采用載體進(jìn)行連接； 6) 將獲得的基因序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化改造； 7) 轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中，再進(jìn)行質(zhì)粒抽提； 8) 雙酶切獲得目標(biāo)片段； 9) 重組轉(zhuǎn)化：將MHC ΙΙ-α-Fos-BSP和GAD65p271-284-MHC ΙΙ-β鏈-Jun基因分別克隆入 表達(dá)載體； 10) 將得到的MHC II-a-Fos-BSP和GAD65p271-284-MHC ΙΙ-β鏈-Jun融合基因雙質(zhì)粒轉(zhuǎn) 染果蠅細(xì)胞表達(dá)蛋白； 11) 步驟10)獲得的蛋白經(jīng)過(guò)純化后用于制備承載GAD65p271-284肽段的I-Ag7的 Tetramer〇6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的承載GAD65p271-284肽段的I-Ag7的Tetramer，其特征在于，步 驟5)中的載體為pmD18-t。7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的承載GAD65p271-284肽段的I-Ag7的Tetramer，其特征在于，步 驟9)的具體過(guò)程如下： 對(duì)于MHC ΙΙ-α-Fos-BSP的克隆，先將Fos+BSP用EcoRI和Notl克隆入表達(dá)載體，然后用 EcoRI和Sail將a鏈克隆入帶有Fos+BSP融合基因的表達(dá)載體;對(duì)于GAD65p271-284-MHC II-β鏈-Jun基因的克隆，要先用Smal和Notl克隆GAD65p271-284-Jun融合基因克隆進(jìn)表達(dá)載 體，然后把β鏈通過(guò)EcoRI和Sal頂每切位點(diǎn)插入GAD65p271-284-Jun融合基因之間。8. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的承載GAD65p271-284肽段的I-Ag7的Tetramer，其特征在于，步 驟9)利用連接酶進(jìn)行重組連接:連接片段100ng，加入100ng pMT/BiP/V5-His質(zhì)粒，10μ1 10 X反應(yīng)buffer和ΙμL連接酶，補(bǔ)足水到20μ1;在16°C水浴中連接24h，并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。9. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的承載GAD65p271-284肽段的I-Ag7的Tetramer，其特征在于，步 驟10)的具體過(guò)程： A. 選取培養(yǎng)好的健康的S2細(xì)胞，將3 X 106個(gè)細(xì)胞接種在60mm組織培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)基為針 對(duì)S2細(xì)胞的Schneider ' s Drosophila Medium，每皿加入3ml的培養(yǎng)基，28°C無(wú)菌條件下在 恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)； B. 使用Life technology公司提供的磷酸|丐轉(zhuǎn)染試劑盒K2780-01進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染； a)對(duì)于每個(gè)轉(zhuǎn)染反應(yīng)，采用一個(gè)無(wú)菌的1.5ml的離心管，依次加入雙蒸水236μ1，氯化|丐 240mM 36μ1，lyg/yla鏈質(zhì)粒9μ1，lyg/μLβ鏈質(zhì)粒9μ1; b) 緩慢的將這些混合物混合lmin后轉(zhuǎn)移到一個(gè)含有200μ1的2XHEPES HBS的離心管， 然后混勻;該過(guò)程使質(zhì)粒DNA逐漸進(jìn)入細(xì)胞中； c) 將混合物在室溫放置30-40min; d) 緩慢將混合物加入到細(xì)胞培養(yǎng)基中，緩慢旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿以充分混勻； e) 在28 °C的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1天； f) 給細(xì)胞的培養(yǎng)基進(jìn)行換液； i) 將培養(yǎng)基連同細(xì)胞一起吸入15ml的離心管中； ii) 3000r/min離心3min，后去除上清，并加入lml新鮮培養(yǎng)基到15ml的離心管中； i i i)將混合物重新加入到新的離心管中； iv) 用2ml培養(yǎng)基重新清洗一次； v) 用2ml培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，并轉(zhuǎn)到培養(yǎng)皿中培養(yǎng)； g) 28°C培養(yǎng)兩天。10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的承載GAD65p271-284肽段的I-Ag7的Tetramer，其特征在于， 步驟10)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞培養(yǎng)在含2mg/ml G418、10%胎牛血清的SFM培養(yǎng)基中，分為10個(gè)T225 細(xì)胞培養(yǎng)瓶，每瓶l〇〇ml培養(yǎng)基，細(xì)胞數(shù)目長(zhǎng)到4xl0 6cells/ml時(shí)準(zhǔn)備誘導(dǎo);準(zhǔn)備誘導(dǎo)時(shí)，將 10個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)瓶分為20個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)瓶，每瓶100ml培養(yǎng)基，細(xì)胞數(shù)目為2 X106cel ls/ml;培養(yǎng) 基換成含1%胎牛血清的SFM培養(yǎng)基；加入終濃度500mM的CuS〇4誘導(dǎo)MHC ΙΙ-α-Fos-BSP和 GAD65p271-284-MHC ΙΙ-β鏈-Jun形成的異源二聚體的表達(dá)，4天后收集5L細(xì)胞上清;將細(xì)胞 培養(yǎng)物上清液通過(guò)切向流超濾濃縮后，再通過(guò)鎳離子親和純化色譜靶向獲得。
【文檔編號(hào)】C12N15/62GK105861530SQ201610209102
【公開(kāi)日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2016年4月6日
【發(fā)明人】孫意, 周智廣
【申請(qǐng)人】中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院