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稀土銩元素?fù)诫s的藍(lán)色上轉(zhuǎn)化納米基因載體的制備方法及應(yīng)用

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稀土銩元素?fù)诫s的藍(lán)色上轉(zhuǎn)化納米基因載體的制備方法及應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及稀土銩元素?fù)诫s的藍(lán)色上轉(zhuǎn)換納米基因載體的制備方法及應(yīng)用。包括:1)稀土銩元素?fù)诫s的藍(lán)色稀土上轉(zhuǎn)換納米顆粒的制備:藍(lán)色上轉(zhuǎn)換納米顆粒采用溶劑熱法制備,制得的直徑為20~50納米;2)采用配體交換法制備水溶性羧基化稀土銩元素?fù)诫s的藍(lán)色上轉(zhuǎn)換納米顆粒;3)稀土銩元素?fù)诫s的藍(lán)色上轉(zhuǎn)換納米顆粒表面連接分子量為600的聚醚酰亞胺。本發(fā)明實(shí)時(shí)跟蹤外源基因的稀土銩元素?fù)诫s的藍(lán)色上轉(zhuǎn)換基因納米載體的基因納米載體的基因轉(zhuǎn)染效率為40~70%,細(xì)胞存活率為80%~95%。本載體還可以通過(guò)在980納米近紅外光的照射,檢測(cè)藍(lán)色上轉(zhuǎn)換的位置來(lái)實(shí)時(shí)跟蹤基因所到達(dá)的目的位置。
【專利說(shuō)明】
稀土銩元素?fù)诫s的藍(lán)色上轉(zhuǎn)化納米基因載體的制備方法及應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種可實(shí)時(shí)跟蹤外源基因的稀土銩元素?fù)诫s的藍(lán)色上轉(zhuǎn)換納米基因載體的制備方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]基因轉(zhuǎn)染是一種非常常規(guī)的生物和醫(yī)藥技術(shù),但是通常的基因轉(zhuǎn)染用的試劑是相對(duì)分子質(zhì)量為25,000的聚醚酰亞胺(PEI),雖然該P(yáng)EI比相對(duì)分子質(zhì)量為600的PEI的轉(zhuǎn)染效率高,但是其細(xì)胞毒性也比相對(duì)分子質(zhì)量為600的PEI大得多,因此將相對(duì)分子質(zhì)量為600的PEI連接至一納米微球上便可以成功制備出一種轉(zhuǎn)染效率高,細(xì)胞毒性低的新型基因轉(zhuǎn)染載體。
[0003]此外,用常規(guī)的基因轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染細(xì)胞時(shí),很難方便的示蹤基因載體的具體位置,也就無(wú)法判定目標(biāo)細(xì)胞是否有外源基因的的進(jìn)入。稀土上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料是一種在近紅外光激發(fā)下能發(fā)出可見(jiàn)光的新型發(fā)光材料,其中近紅外光只引起很小的光損傷并且在組織中有很高的光子滲透性。因此稀土上轉(zhuǎn)換納米發(fā)光材料在醫(yī)學(xué)和生物學(xué)中的應(yīng)用相對(duì)于其他材料,具有極大的優(yōu)越性。而氯化銩摻雜的上轉(zhuǎn)化納米材料,能夠在980納米近紅外光的照射下發(fā)射出藍(lán)紫光較強(qiáng)的。于是將銩元素?fù)诫s藍(lán)色上轉(zhuǎn)換材料制作成為一種基因載體,就可以實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)跟蹤外源基因以及靶細(xì)胞的功能。因此,研制出一種具有轉(zhuǎn)染效率高,細(xì)胞毒性小,并且可以實(shí)時(shí)跟蹤外源基因的納米載體等優(yōu)勢(shì)的新型基因納米載體具有重大的意義,在生物技術(shù)和醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域具有重要的科研和臨床應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明涉及一種可實(shí)時(shí)跟蹤外源基因的稀土銩元素?fù)诫s的藍(lán)色上轉(zhuǎn)換基因納米載體的制備方法及應(yīng)用。
[0005]本發(fā)明的稀土銩元素?fù)诫s的藍(lán)色上轉(zhuǎn)換納米基因載體的特征:其直徑為30?60納米,制備的基因納米載體的基因轉(zhuǎn)染效率為40?70%,細(xì)胞存活率為80%?95%。此外,本載體還可以通過(guò)在980納米近紅外光的照射,檢測(cè)藍(lán)色上轉(zhuǎn)換的位置來(lái)實(shí)時(shí)跟蹤基因所到達(dá)的目的位置。
[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案包括:
[0007]I)稀土銩元素?fù)诫s的藍(lán)色稀土上轉(zhuǎn)換納米顆粒的制備:藍(lán)色上轉(zhuǎn)換納米顆粒采用溶劑熱法制備,制得的直徑為20?50納米;
[0008]2)采用配體交換法制備水溶性羧基化稀土銩元素?fù)诫s的藍(lán)色上轉(zhuǎn)換納米顆粒;
[0009]3)稀土銩元素?fù)诫s的藍(lán)色上轉(zhuǎn)換納米顆粒表面連接分子量為600的聚醚酰亞胺。
[0010]所述的步驟I)稀土銩元素?fù)诫s的藍(lán)色上轉(zhuǎn)換納米載體顆粒的制備方法步驟如下:
[0011]I)稀土銩元素?fù)诫s的藍(lán)色上轉(zhuǎn)換納米顆粒采用溶劑熱法制得:將450毫克YCl3.6H2O,200毫克YbCl3.6H2O和I毫克?3毫克TmCl3.6出0溶解至I?2毫升去離子水中,于300?400轉(zhuǎn)/分鐘磁力攪拌條件下,加熱至100?120°C直至稀土鹽完全溶液變成白色固體;
[0012]2)待水份完全水蒸干后,關(guān)閉加熱并冷卻至50?60°C,加入4?6毫升油酸及8?12毫升十八烯,并升溫至120?140°C使鹽溶液完全溶解;
[0013]3)冷卻至50?60°C,加入溶有50?60毫克氫氧化鈉和100?150毫克氟化銨的5毫升甲醇溶液;升溫至110?120°c,采用油栗抽真空30?40分鐘;
[0014]4)通入氬氣,升溫到310?320°C,在300?400轉(zhuǎn)/分鐘磁力條件下,攪拌反應(yīng)50?60分鐘;
[0015]5)待反應(yīng)結(jié)束后加入丙酮離心純化,得到藍(lán)色上轉(zhuǎn)換納米顆粒。
[0016]所述的步驟2)采用配體交換法制備水溶性羧基化稀土銩元素?fù)诫s的藍(lán)色上轉(zhuǎn)換納米顆粒,具體步驟如下:
[0017]I)取藍(lán)色上轉(zhuǎn)換納米顆粒8?10毫克溶解至1.25毫升的二氯苯中并轉(zhuǎn)移至玻璃瓶中,然后加入等體積的N,N-二甲基甲酰胺,以90?10W的功率超聲混勻;
[0018]2)稱取150?200毫克的無(wú)水檸檬酸溶解至1.25毫升的N,N-二甲基甲酰胺中并加入等體積的二氯苯,以90?10W的功率超聲混勻;
[0019]3)將上述步驟2)中的溶液加入I)中,于300?400轉(zhuǎn)/分鐘,100?110°C磁力攪拌條件下反應(yīng)5?6小時(shí);
[0020]4)待反應(yīng)結(jié)束后,以12,000?13,000轉(zhuǎn)/分鐘,離心8?10分鐘,并用去離子水洗滌沉淀I?3遍,即制得水溶性的藍(lán)色上轉(zhuǎn)換納米顆粒;
[0021]所述的步驟3)稀土銩元素?fù)诫s的藍(lán)色上轉(zhuǎn)換納米顆粒表面連接分子量為600的聚醚酰亞胺方法如下:
[0022]I)將水溶性藍(lán)色上轉(zhuǎn)換納米顆粒溶解至2?3毫升的去離子水中并轉(zhuǎn)移至玻璃瓶中,然后加入75?100微升、相對(duì)分子質(zhì)量為600的聚醚酰亞胺,并于15?20 °C加熱,300?400轉(zhuǎn)/分鐘磁力條件下,攪拌反應(yīng)10?12小時(shí),然后以12,000?13,000轉(zhuǎn)/分鐘,離心8?10分鐘,得到表面吸附有聚醚酰亞胺的藍(lán)色上轉(zhuǎn)換納米顆粒;
[0023]2)將上述沉淀全部加入去離子水中,并按照質(zhì)量份數(shù)比碳二亞胺:N-羥基琥珀酰亞胺=0.5:0.5?I,繼續(xù)攪拌3?4小時(shí)后離心純化,制得吸附DNA的藍(lán)色上轉(zhuǎn)換基因納米載體。
[0024]稀土銩元素?fù)诫s的藍(lán)色上轉(zhuǎn)換基因納米載體應(yīng)用轉(zhuǎn)染外源綠色熒光蛋白質(zhì)粒DNA至He I a細(xì)胞。
[0025]具體應(yīng)用方法是:
[0026]I)藍(lán)色上轉(zhuǎn)換基因納米載體吸附質(zhì)粒DNA:將藍(lán)色上轉(zhuǎn)換基因納米載體溶解至100?150微升的無(wú)菌去離子水中;取一無(wú)菌的1.5毫升的離心管,加入80?100微升的OPT1-MEM無(wú)血清培養(yǎng)基和0.3?0.6微克的綠色熒光蛋白質(zhì)粒DNA并充分混勻,再加入與質(zhì)粒DNA的質(zhì)量體積比為1:1?2的藍(lán)色上轉(zhuǎn)換基因納米載體,并混勻后靜止30?40分鐘;
[0027]2)將藍(lán)色上轉(zhuǎn)換基因納米載體轉(zhuǎn)染基因至動(dòng)物細(xì)胞:將上述含有外源基因質(zhì)粒DAN和藍(lán)色上轉(zhuǎn)換基因納米載體的復(fù)合物全部加入至一24孔板或48孔板的海拉細(xì)胞中,再于37°C,5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3?4小時(shí)后吸取培養(yǎng)液,并加入200?300毫升的新鮮完全培養(yǎng)液;培養(yǎng)18?20小時(shí)后于熒光顯微鏡觀察并計(jì)算轉(zhuǎn)染效率。
[0028]實(shí)時(shí)跟蹤外源基因的稀土銩元素?fù)诫s的藍(lán)色上轉(zhuǎn)換基因納米載體的基因納米載體的基因轉(zhuǎn)染效率為40?70%,細(xì)胞存活率為80%?95%。
[0029]本載體還可以通過(guò)在980納米近紅外光的照射,檢測(cè)藍(lán)色上轉(zhuǎn)換的位置來(lái)實(shí)時(shí)跟蹤基因所到達(dá)的目的位置。
[0030]本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)在于:I)制備的基因納米載體的基因轉(zhuǎn)染效率為40?70%,細(xì)胞存活率為80 %?95 %。2)可以通過(guò)在980納米近紅外光的照射,檢測(cè)藍(lán)色上轉(zhuǎn)換的位置來(lái)實(shí)時(shí)跟蹤基因所到達(dá)的目的位置。
【附圖說(shuō)明】
[0031]圖1:用溶膠凝膠法制備的介孔稀土銩元素?fù)诫s的藍(lán)色上轉(zhuǎn)換納米基因載體的透射電子顯微鏡照片(形貌分析)。
[0032]圖2:將稀土銩元素?fù)诫s的藍(lán)色上轉(zhuǎn)換基因納米載體轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白(GFP)基因至人宮頸癌細(xì)胞(Hela細(xì)胞)后的轉(zhuǎn)染結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0033]下面的實(shí)施例中將對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述,但本發(fā)明不限于此。
[0034]一種稀土銩元素?fù)诫s的藍(lán)色上轉(zhuǎn)換納米基因載體的制備方法;其特征步驟如下:
[0035]I)藍(lán)色上轉(zhuǎn)換納米顆粒采用溶劑熱法制得:將450毫克YCl3.6H20,200毫克YbCb.6H2O和I毫克?3毫克TmCh.6H2O溶解至I?2毫升去離子水中,于300?400轉(zhuǎn)/分鐘磁力攪拌條件下,加熱至100?120°C直至稀土鹽完全溶液變成白色固體。
[0036]2)待水份完全水蒸干后,關(guān)閉加熱并冷卻至50?60°C以,用移液管加入4?6毫升油酸及8?12毫升十八烯,并升溫至120?140°C使鹽溶液完全溶解。
[0037]3)冷卻至50?60 °C以下,加入溶有50?60毫克氫氧化鈉、100?150毫克氟化銨的5毫升甲醇溶液;調(diào)節(jié)溫度并升溫至110?120°c,采用油栗抽真空30?40分鐘。
[0038]4)通入氬氣,迅速升溫到310?320°C,維持在300?400轉(zhuǎn)/分鐘磁力條件下,攪拌反應(yīng)50?60分鐘。
[0039]5)待反應(yīng)結(jié)束后加入丙酮離心純化,最終產(chǎn)物真空干燥處理,以備后用。
[0040]采用配體交換法制備水溶性羧基化藍(lán)色上轉(zhuǎn)換納米顆粒,具體步驟如下:
[0041]I)取權(quán)利要求1中制得的藍(lán)色上轉(zhuǎn)換納米顆粒8?10毫克溶解至1.25毫升的二氯苯中并轉(zhuǎn)移至玻璃瓶中,然后加入等體積的N,N-二甲基甲酰胺,以90?100W的功率超聲混勻。
[0042]2)稱取150?200毫克的無(wú)水檸檬酸溶解至1.25毫升的N,N-二甲基甲酰胺中并加入等體積的二氯苯,以90?10W的功率超聲混勻。
[0043]3)將上述步驟2)中的溶液加入I)中,于300?400轉(zhuǎn)/分鐘,100?110°C磁力攪拌條件下反應(yīng)5?6小時(shí)。
[0044]4)待反應(yīng)結(jié)束后,以12,000?13,000轉(zhuǎn)/分鐘,離心8?10分鐘,并用去離子水洗滌沉淀I?3遍,即制得水溶性的藍(lán)色上轉(zhuǎn)換納米顆粒。
[0045]水溶性藍(lán)色上轉(zhuǎn)換納米顆粒表面連接聚醚酰亞胺:
[0046]I)將權(quán)利要求2中制得的水溶性藍(lán)色上轉(zhuǎn)換納米顆粒溶解至2?3毫升的去離子水中并轉(zhuǎn)移至玻璃瓶中,然后加入75?100微升,相對(duì)分子質(zhì)量為600的聚醚酰亞胺,并于15?20°C加熱,300?400轉(zhuǎn)/分鐘磁力條件下,攪拌反應(yīng)10?12小時(shí),然后以12,000?13,000轉(zhuǎn)/分鐘,離心8?10分鐘,得到表面吸附有聚醚酰亞胺的藍(lán)色上轉(zhuǎn)換納米顆粒。
[0047]2)將上述沉淀全部加入至加2?3毫升的去離子水中,并按照質(zhì)量份數(shù)比碳二亞胺:N-羥基琥珀酰亞胺=0.5:0.5?I,繼續(xù)攪拌3?4小時(shí)后離心純化,即制得可以吸附DNA的藍(lán)色上轉(zhuǎn)換基因納米載體。
[0048]藍(lán)色上轉(zhuǎn)換基因納米載體轉(zhuǎn)染外源綠色熒光蛋白(GFP)質(zhì)粒DNA至Hela細(xì)胞應(yīng)用。
[0049]I)藍(lán)色上轉(zhuǎn)換基因納米載體吸附質(zhì)粒DNA:將權(quán)利要求4所述中制得的藍(lán)色上轉(zhuǎn)換基因納米載體溶解至100?150微升的無(wú)菌去離子水中。取一無(wú)菌的1.5毫升的離心管,加入80?100微升的OPT1-MEM無(wú)血清培養(yǎng)基和0.3?0.6微克的綠色熒光蛋白(GFP)質(zhì)粒DNA并充分混勻,再加入與質(zhì)粒DNA的質(zhì)量體積比為1:1?2的藍(lán)色上轉(zhuǎn)換基因納米載體,并混勻后靜止30?40分鐘。
[0050]2)將藍(lán)色上轉(zhuǎn)換基因納米載體轉(zhuǎn)染基因至動(dòng)物細(xì)胞:將上述含有外源基因質(zhì)粒DAN和藍(lán)色上轉(zhuǎn)換基因納米載體的復(fù)合物全部加入至一 24孔板或48孔板的海拉(Hela)細(xì)胞中,再于37°C,5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3?4小時(shí)后吸取培養(yǎng)液,并加入200?300毫升的新鮮完全培養(yǎng)液。培養(yǎng)18?20小時(shí)后于熒光顯微鏡觀察并計(jì)算轉(zhuǎn)染效率。
[0051 ] 實(shí)施例1:
[0052]稀土銩元素?fù)诫s的藍(lán)色稀土上轉(zhuǎn)換基因納米載體的制備方法,具體步驟如下:
[0053]I)稀土銩元素?fù)诫s的藍(lán)色上轉(zhuǎn)換納米顆粒采用溶劑熱法制得:將450毫克YCl3.6H20,200毫克YbCl3.6H20和I毫克TmCl3.6H20溶解至I毫升去離子水中,于300轉(zhuǎn)/分鐘磁力攪拌條件下,加熱至100°C直至稀土鹽完全溶液變成白色固體。待水份完全水蒸干后,關(guān)閉加熱并冷卻至80°C以下,用移液管加入2毫升油酸及5毫升十八烯,并升溫至150°C使鹽溶液完全溶解。冷卻至60°C以下,加入溶有50毫克氫氧化鈉、100毫克氟化銨的5毫升甲醇溶液;調(diào)節(jié)溫度并升溫至120°C,采用油栗抽真空10分鐘。通入氬氣,迅速升溫到280°C,維持在100轉(zhuǎn)/分鐘磁力條件下,攪拌反應(yīng)0.5小時(shí)。待反應(yīng)結(jié)束后加入丙酮離心純化,最終產(chǎn)物真空干燥處理,以備后用。
[0054]2)采用配體交換法制備水溶性羧基化稀土銩元素?fù)诫s的藍(lán)色上轉(zhuǎn)換納米顆粒:取上述步驟制得的藍(lán)色上轉(zhuǎn)換納米顆粒2毫克溶解至1.25毫升的二氯苯中并轉(zhuǎn)移至一 10毫升的玻璃瓶中,然后加入等體積的N,N-二甲基甲酰胺,以50W的功率超聲混勻。再稱取50毫克的無(wú)水檸檬酸溶解至1.25毫升的N,N-二甲基甲酰胺中并加入等體積的二氯苯,以50W的功率超聲混勻。將上述兩種溶液混勻,于100轉(zhuǎn)/分鐘,100°C磁力攪拌條件下反應(yīng)2小時(shí)。待反應(yīng)結(jié)束后,以11,000轉(zhuǎn)/分鐘,離心20分鐘,并用去離子水洗滌沉淀I遍,即制得水溶性的藍(lán)色上轉(zhuǎn)換納米顆粒。
[0055]3)水溶性稀土銩元素?fù)诫s的藍(lán)色上轉(zhuǎn)換納米顆粒表面連接聚醚酰亞胺(PEI):將上述步驟制得的水溶性藍(lán)色上轉(zhuǎn)換納米顆粒溶解至2毫升的去離子水中并轉(zhuǎn)移至一 10毫升的玻璃瓶中,然后加入50微升,相對(duì)分子質(zhì)量為600的聚醚酰亞胺(PEI),并于20°C加熱,100轉(zhuǎn)/分鐘磁力條件下,攪拌反應(yīng)6小時(shí)。待反應(yīng)結(jié)束后,以11,000轉(zhuǎn)/分鐘,離心20分鐘,并用去離子水洗滌沉淀I遍,即制得可以吸附DNA的藍(lán)色上轉(zhuǎn)換基因納米載體。
[0056]實(shí)施例2:
[0057]稀土銩元素?fù)诫s的藍(lán)色稀土上轉(zhuǎn)換基因納米載體的制備方法,具體步驟如下:
[0058]I)稀土銩元素?fù)诫s的藍(lán)色上轉(zhuǎn)換納米顆粒采用溶劑熱法制得:將450毫克YCl3.6H20,200毫克YbCl3.6H20和2毫克TmCl3.6H20溶解至1.5毫升去離子水中,于350轉(zhuǎn)/分鐘磁力攪拌條件下,加熱至110Γ直至稀土鹽完全溶液變成白色固體。待水份完全水蒸干后,關(guān)閉加熱并冷卻至80°C以下,用移液管加入5毫升油酸及10毫升十八烯,并升溫至160°C使鹽溶液完全溶解。冷卻至60 °C以下,加入溶有75毫克氫氧化鈉、200毫克氟化銨的5毫升甲醇溶液;調(diào)節(jié)溫度并升溫至120°C,采用油栗抽真空30分鐘。通入氬氣,迅速升溫到300°C,維持在300轉(zhuǎn)/分鐘磁力條件下,攪拌反應(yīng)0.75小時(shí)。待反應(yīng)結(jié)束后加入丙酮離心純化,最終產(chǎn)物真空干燥處理,以備后用。
[0059]2)采用配體交換法制備水溶性羧基化稀土銩元素?fù)诫s的藍(lán)色上轉(zhuǎn)換納米顆粒:取上述步驟制得的藍(lán)色上轉(zhuǎn)換納米顆粒8毫克溶解至1.25毫升的二氯苯中并轉(zhuǎn)移至一 10毫升的玻璃瓶中,然后加入等體積的N,N-二甲基甲酰胺,以80W的功率超聲混勻。再稱取100毫克的無(wú)水檸檬酸溶解至1.25毫升的N,N-二甲基甲酰胺中并加入等體積的二氯苯,以80W的功率超聲混勻。將上述兩種溶液混勻,于300轉(zhuǎn)/分鐘,120°C磁力攪拌條件下反應(yīng)4小時(shí)。待反應(yīng)結(jié)束后,以10,000轉(zhuǎn)/分鐘,離心10分鐘,并用去離子水洗滌沉淀2遍,即制得水溶性的藍(lán)色上轉(zhuǎn)換納米顆粒。
[0060]3)水溶性稀土銩元素?fù)诫s的藍(lán)色上轉(zhuǎn)換納米顆粒表面連接聚醚酰亞胺(PEI):將上述步驟制得的水溶性藍(lán)色上轉(zhuǎn)換納米顆粒溶解至3毫升的去離子水中并轉(zhuǎn)移至一 10毫升的玻璃瓶中,然后加入100微升,相對(duì)分子質(zhì)量為600的聚醚酰亞胺(PEI),并于30°C加熱,300轉(zhuǎn)/分鐘磁力條件下,攪拌反應(yīng)9小時(shí)。待反應(yīng)結(jié)束后,以10,000轉(zhuǎn)/分鐘,離心10分鐘,并用去離子水洗滌沉淀2遍,即制得可以吸附DNA的藍(lán)色上轉(zhuǎn)換基因納米載體。
[0061 ] 實(shí)施例3:
[0062]稀土銩元素?fù)诫s的藍(lán)色稀土上轉(zhuǎn)換基因納米載體的制備方法,具體步驟如下:
[0063]I)稀土銩元素?fù)诫s的藍(lán)色上轉(zhuǎn)換納米顆粒采用溶劑熱法制得:將450毫克YCl3.6H20,200毫克YbCl3.6H20和3毫克TmCl3.6H20溶解至I?2毫升去離子水中,于400轉(zhuǎn)/分鐘磁力攪拌條件下,加熱至120°C直至稀土鹽完全溶液變成白色固體。待水份完全水蒸干后,關(guān)閉加熱并冷卻至80°C以下,用移液管加入10毫升油酸及30毫升十八烯,并升溫至180°C使鹽溶液完全溶解。冷卻至60°C以下,加入溶有100毫克氫氧化鈉、300毫克氟化銨的5毫升甲醇溶液;調(diào)節(jié)溫度并升溫至120°C,采用油栗抽真空40分鐘。通入氬氣,迅速升溫到320°C,維持在500轉(zhuǎn)/分鐘磁力條件下,攪拌反應(yīng)I小時(shí)。待反應(yīng)結(jié)束后加入丙酮離心純化,最終產(chǎn)物真空干燥處理,以備后用。
[0064]2)采用配體交換法制備水溶性羧基化稀土銩元素?fù)诫s的藍(lán)色上轉(zhuǎn)換納米顆粒:取上述步驟制得的藍(lán)色上轉(zhuǎn)換納米顆粒10毫克溶解至1.25毫升的二氯苯中并轉(zhuǎn)移至一 10毫升的玻璃瓶中,然后加入等體積的N,N-二甲基甲酰胺,以100W的功率超聲混勻。再稱取200毫克的無(wú)水檸檬酸溶解至1.25毫升的N,N-二甲基甲酰胺中并加入等體積的二氯苯,以100W的功率超聲混勻。將上述兩種溶液混勻,于500轉(zhuǎn)/分鐘,150°C磁力攪拌條件下反應(yīng)6小時(shí)。待反應(yīng)結(jié)束后,以11,000轉(zhuǎn)/分鐘,離心20分鐘,并用去離子水洗滌沉淀3遍,即制得水溶性的藍(lán)色上轉(zhuǎn)換納米顆粒。
[0065]3)水溶性稀土銩元素?fù)诫s的藍(lán)色上轉(zhuǎn)換納米顆粒表面連接聚醚酰亞胺(PEI):將上述步驟制得的水溶性藍(lán)色上轉(zhuǎn)換納米顆粒溶解至5毫升的去離子水中并轉(zhuǎn)移至一 10毫升的玻璃瓶中,然后加入200微升,相對(duì)分子質(zhì)量為600的聚醚酰亞胺(PEI),并于80°C加熱,500轉(zhuǎn)/分鐘磁力條件下,攪拌反應(yīng)12小時(shí)。待反應(yīng)結(jié)束后,以9,000轉(zhuǎn)/分鐘,離心5分鐘,并用去離子水洗滌沉淀3遍,即制得可以吸附DNA的藍(lán)色上轉(zhuǎn)換基因納米載體。
[0066]實(shí)施例4:
[0067]稀土銩元素?fù)诫s的藍(lán)色上轉(zhuǎn)換基因納米載體轉(zhuǎn)染外源綠色熒光蛋白(GFP)質(zhì)粒DNA至He Ia細(xì)胞,具體步驟如下:
[0068]I)稀土銩元素?fù)诫s的藍(lán)色上轉(zhuǎn)換基因納米載體吸附質(zhì)粒DNA:將權(quán)利要求3所述中制得的藍(lán)色上轉(zhuǎn)換基因納米載體溶解至100微升的無(wú)菌去離子水中。取一無(wú)菌的1.5毫升的離心管,加入50微升無(wú)血清培養(yǎng)基OPT1-MEM和0.3微克的綠色熒光蛋白(GFP)質(zhì)粒DNA并充分混勻,再加入I微升裝藍(lán)色上轉(zhuǎn)換基因納米載體,并混勻后靜止10分鐘。
[0069]2)將稀土銩元素?fù)诫s的藍(lán)色上轉(zhuǎn)換基因納米載體轉(zhuǎn)染基因至動(dòng)物細(xì)胞:將上述含有外源基因質(zhì)粒DAN和藍(lán)色上轉(zhuǎn)換基因納米載體的復(fù)合物全部加入至一 24孔板或48孔板的海拉(HeIa)細(xì)胞中,再于37°C,5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時(shí)后吸取培養(yǎng)液,并加入200毫升的新鮮完全培養(yǎng)液。培養(yǎng)48小時(shí)后,用熒光顯微鏡觀察并計(jì)算基因表達(dá)效率,基因表達(dá)效率如圖2所示。
[0070]實(shí)施例5:
[0071]稀土銩元素?fù)诫s的藍(lán)色上轉(zhuǎn)換基因納米載體轉(zhuǎn)染外源綠色熒光蛋白(GFP)質(zhì)粒DNA至He Ia細(xì)胞,具體步驟如下:
[0072]I)稀土銩元素?fù)诫s的藍(lán)色上轉(zhuǎn)換基因納米載體吸附質(zhì)粒DNA:將權(quán)利要求3所述中制得的藍(lán)色上轉(zhuǎn)換基因納米載體溶解至100?500微升的無(wú)菌去離子水中。取一無(wú)菌的1.5毫升的離心管,加入100微升無(wú)血清培養(yǎng)基OPT1-MEM和0.1微克的綠色熒光蛋白(GFP)質(zhì)粒DNA并充分混勻,再加入I?5微升裝藍(lán)色上轉(zhuǎn)換基因納米載體,并混勻后靜止20分鐘。
[0073]2)將稀土銩元素?fù)诫s的藍(lán)色上轉(zhuǎn)換基因納米載體轉(zhuǎn)染基因至動(dòng)物細(xì)胞:將上述含有外源基因質(zhì)粒DAN和藍(lán)色上轉(zhuǎn)換基因納米載體的復(fù)合物全部加入至一 24孔板或48孔板的海拉(HeIa)細(xì)胞中,再于37°C,5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6小時(shí)后吸取培養(yǎng)液,并加入300毫升的新鮮完全培養(yǎng)液。培養(yǎng)48小時(shí)后,用熒光顯微鏡觀察并計(jì)算基因表達(dá)效率,基因表達(dá)效率如圖2所示。
[0074]實(shí)施例6:
[0075]稀土銩元素?fù)诫s的藍(lán)色上轉(zhuǎn)換基因納米載體轉(zhuǎn)染外源綠色熒光蛋白(GFP)質(zhì)粒DNA至He Ia細(xì)胞,具體步驟如下:
[0076]I)稀土銩元素?fù)诫s的藍(lán)色上轉(zhuǎn)換基因納米載體吸附質(zhì)粒DNA:將權(quán)利要求3所述中制得的藍(lán)色上轉(zhuǎn)換基因納米載體溶解至500微升的無(wú)菌去離子水中。取一無(wú)菌的1.5毫升的離心管,加入200微升無(wú)血清培養(yǎng)基OPT1-MEM和3微克的綠色熒光蛋白(GFP)質(zhì)粒DNA并充分混勻,再加入I?5微升裝藍(lán)色上轉(zhuǎn)換基因納米載體,并混勻后靜止30分鐘。
[0077]2)將稀土銩元素?fù)诫s的藍(lán)色上轉(zhuǎn)換基因納米載體轉(zhuǎn)染基因至動(dòng)物細(xì)胞:將上述含有外源基因質(zhì)粒DAN和藍(lán)色上轉(zhuǎn)換基因納米載體的復(fù)合物全部加入至一 24孔板或48孔板的海拉(HeIa)細(xì)胞中,再于37°C,5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8小時(shí)后吸取培養(yǎng)液,并加入500毫升的新鮮完全培養(yǎng)液。培養(yǎng)48小時(shí)后,用熒光顯微鏡觀察并計(jì)算基因表達(dá)效率,基因表達(dá)效率如圖2所示。
[0078]實(shí)施例7:
[0079]形態(tài)觀察、粒徑及其分布測(cè)定。取介孔藍(lán)色上轉(zhuǎn)換納米基因載體溶液經(jīng)離心分離后,取出沉淀物,加蒸餾水少量使分散,滴于碳支持膜上制樣,在透射電鏡下觀察其形貌狀態(tài)并拍照。透射電鏡下觀察到介孔藍(lán)色上轉(zhuǎn)換納米基因載體呈均勻規(guī)則的球形粒子,其直徑在20?50nm范圍內(nèi)可控。所制得的納米載體如圖1所示。
[0080]本發(fā)明公開(kāi)和提出的稀土銩元素?fù)诫s的藍(lán)色上轉(zhuǎn)換納米基因載體的制備方法及應(yīng)用,本領(lǐng)域技術(shù)人員可通過(guò)借鑒本文內(nèi)容,適當(dāng)改變條件路線等環(huán)節(jié)實(shí)現(xiàn),盡管本發(fā)明的方法和制備技術(shù)已通過(guò)較佳實(shí)施例子進(jìn)行了描述,相關(guān)技術(shù)人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法和技術(shù)路線進(jìn)行改動(dòng)或重新組合,來(lái)實(shí)現(xiàn)最終的制備技術(shù)。特別需要指出的是,所有相類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的,他們都被視為包括在本發(fā)明精神、范圍和內(nèi)容中。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種稀土銩元素?fù)诫s的藍(lán)色上轉(zhuǎn)換納米基因載體的制備方法;其特征是步驟如下: 1)稀土銩元素?fù)诫s的藍(lán)色稀土上轉(zhuǎn)換納米顆粒的制備:藍(lán)色上轉(zhuǎn)換納米顆粒采用溶劑熱法制備,制得的直徑為20?50納米; 2)采用配體交換法制備水溶性羧基化稀土銩元素?fù)诫s的藍(lán)色上轉(zhuǎn)換納米顆粒; 3)稀土銩元素?fù)诫s的藍(lán)色上轉(zhuǎn)換納米顆粒表面連接分子量為600的聚醚酰亞胺。2.如權(quán)利要求1所述的方法,其特征是所述的步驟I)稀土銩元素?fù)诫s的藍(lán)色上轉(zhuǎn)換納米載體顆粒的制備方法步驟如下: 1)稀土銩元素?fù)诫s的藍(lán)色上轉(zhuǎn)換納米顆粒采用溶劑熱法制得:將450毫克YCl3.6H20,200毫克YbCl3.6H20和I毫克?3毫克TmCl3.6H20溶解至I?2毫升去離子水中,于300?400轉(zhuǎn)/分鐘磁力攪拌條件下,加熱至100?120°C直至稀土鹽完全溶液變成白色固體; 2)待水份完全水蒸干后,關(guān)閉加熱并冷卻至50?60°C,加入4?6毫升油酸及8?12毫升十八烯,并升溫至120?140°C使鹽溶液完全溶解; 3)冷卻至50?60°C,加入溶有50?60毫克氫氧化鈉和100?150毫克氟化銨的5毫升甲醇溶液;升溫至110?120°C,采用油栗抽真空30?40分鐘; 4)通入氬氣,升溫到310?320°C,在300?400轉(zhuǎn)/分鐘磁力條件下,攪拌反應(yīng)50?60分鐘; 5)待反應(yīng)結(jié)束后加入丙酮離心純化,得到藍(lán)色上轉(zhuǎn)換納米顆粒。3.如權(quán)利要求1所述的方法,其特征是所述的步驟2)采用配體交換法制備水溶性羧基化稀土銩元素?fù)诫s的藍(lán)色上轉(zhuǎn)換納米顆粒,具體步驟如下: 1)取藍(lán)色上轉(zhuǎn)換納米顆粒8?10毫克溶解至1.25毫升的二氯苯中并轉(zhuǎn)移至玻璃瓶中,然后加入等體積的N,N-二甲基甲酰胺,以90?10W的功率超聲混勻; 2)稱取150?200毫克的無(wú)水檸檬酸溶解至1.25毫升的N,N-二甲基甲酰胺中并加入等體積的二氯苯,以90?100W的功率超聲混勻; 3)將上述步驟2)中的溶液加入I)中,于300?400轉(zhuǎn)/分鐘,100?110°C磁力攪拌條件下反應(yīng)5?6小時(shí); 4)待反應(yīng)結(jié)束后,以12,000?13,000轉(zhuǎn)/分鐘,離心8?10分鐘,并用去離子水洗滌沉淀I?3遍,即制得水溶性的藍(lán)色上轉(zhuǎn)換納米顆粒。4.如權(quán)利要求1所述的方法,其特征是所述的步驟3)稀土銩元素?fù)诫s的藍(lán)色上轉(zhuǎn)換納米顆粒表面連接分子量為600的聚醚酰亞胺方法如下: 1)將水溶性藍(lán)色上轉(zhuǎn)換納米顆粒溶解至2?3毫升的去離子水中并轉(zhuǎn)移至玻璃瓶中,然后加入75?100微升、相對(duì)分子質(zhì)量為600的聚醚酰亞胺,并于15?20°C加熱,300?400轉(zhuǎn)/分鐘磁力條件下,攪拌反應(yīng)10?12小時(shí),然后以12,000?13,000轉(zhuǎn)/分鐘,離心8?10分鐘,得到表面吸附有聚醚酰亞胺的藍(lán)色上轉(zhuǎn)換納米顆粒; 2)將上述沉淀全部加入去離子水中,并按照質(zhì)量份數(shù)比碳二亞胺:N-羥基琥珀酰亞胺= 0.5:0.5?I,繼續(xù)攪拌3?4小時(shí)后離心純化,制得吸附DNA的藍(lán)色上轉(zhuǎn)換基因納米載體。5.稀土銩元素?fù)诫s的藍(lán)色上轉(zhuǎn)換基因納米載體應(yīng)用轉(zhuǎn)染外源綠色熒光蛋白質(zhì)粒DNA至Hela細(xì)胞。6.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用,其特征是: I)藍(lán)色上轉(zhuǎn)換基因納米載體吸附質(zhì)粒DNA:將藍(lán)色上轉(zhuǎn)換基因納米載體溶解至100?150微升的無(wú)菌去離子水中;取一無(wú)菌的1.5毫升的離心管,加入80?100微升的OPT1-MEM無(wú)血清培養(yǎng)基和0.3?0.6微克的綠色熒光蛋白質(zhì)粒DNA并充分混勻,再加入與質(zhì)粒DNA的質(zhì)量體積比為1:1?2的藍(lán)色上轉(zhuǎn)換基因納米載體,并混勻后靜止30?40分鐘; 2)將藍(lán)色上轉(zhuǎn)換基因納米載體轉(zhuǎn)染基因至動(dòng)物細(xì)胞:將上述含有外源基因質(zhì)粒DAN和藍(lán)色上轉(zhuǎn)換基因納米載體的復(fù)合物全部加入至一24孔板或48孔板的海拉細(xì)胞中,再于37°C,5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3?4小時(shí)后吸取培養(yǎng)液,并加入200?300毫升的新鮮完全培養(yǎng)液;培養(yǎng)18?20小時(shí)后于熒光顯微鏡觀察并計(jì)算轉(zhuǎn)染效率。7.稀土銩元素?fù)诫s的藍(lán)色上轉(zhuǎn)換基因納米載體轉(zhuǎn)染外源綠色熒光蛋白質(zhì)粒DNA至Hela細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率為:40?70 %。
【文檔編號(hào)】C12N15/85GK105861549SQ201610209491
【公開(kāi)日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2016年4月5日
【發(fā)明人】常津, 鄭斌, 王漢杰, 諶紅彬, 潘慧卓
【申請(qǐng)人】天津大學(xué)
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