聯(lián)合表達(dá)microRNAs抑制乳腺癌細(xì)胞增殖的載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明為聯(lián)合表達(dá)microRNAs抑制乳腺癌細(xì)胞增殖的載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，公開(kāi)了一種核酸構(gòu)建載體。本發(fā)明還公開(kāi)了核酸構(gòu)建載體用于制備抑制乳腺癌細(xì)胞增殖的組合物方面的應(yīng)用。本發(fā)明還公開(kāi)了一種真核聯(lián)合表達(dá)載體pEGFPC3?miR145/16，本載體可以同時(shí)表達(dá)兩個(gè)成熟的microRNA分子：miR145?5p和miR16?5p，其表達(dá)效率不受插入位置(即距離啟動(dòng)子遠(yuǎn)近)的影響，并且靶向miR155?5p高水平表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞系具有很強(qiáng)的協(xié)同抑制腫瘤生長(zhǎng)作用。本發(fā)明的microRNAs聯(lián)合表達(dá)載體可顯著抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖并表現(xiàn)特異性。本發(fā)明為建立靶向治療特定種類乳腺癌的miR145?5p和miR16?5p聯(lián)合治療核酸藥物提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。
【專利說(shuō)明】
聯(lián)合表達(dá)m i croRNAs抑制乳腺癌細(xì)胞増殖的載體及其構(gòu)建方 法和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體設(shè)及聯(lián)合表達(dá)microRNAs抑制乳腺癌細(xì)胞增殖的 載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用；具體構(gòu)建用于聯(lián)合表達(dá)miR145-5p和miR16-5p的抑制乳腺癌細(xì) 胞增殖的真核表達(dá)載體，在乳腺癌細(xì)胞中驗(yàn)證其作用效應(yīng)和治療用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來(lái)，乳腺癌發(fā)病率呈現(xiàn)快速上升的趨勢(shì)。我國(guó)女性乳腺癌發(fā)病率正W每年3% ~4 %的比例急劇增加，而中國(guó)城鎮(zhèn)中年人口中，乳腺癌發(fā)病率在過(guò)去數(shù)十年增長(zhǎng)了 20 %~ 30%，成為我國(guó)發(fā)病率增幅最快的惡性腫瘤之一。由于乳腺癌發(fā)病率高、危害性大，已經(jīng)成 為嚴(yán)重危害人民健康、制約經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重要疾病。然而，迄今為止，國(guó)際上對(duì)于乳腺癌治療 的特效藥物并不多，針對(duì)各類型乳腺癌的治療方法并不完全有效，探索乳腺癌的發(fā)病機(jī)制 和防治方法是應(yīng)用基礎(chǔ)和臨床研究領(lǐng)域的重要課題。
[0003] MicroRNAs為一種新型的基因調(diào)控因子，它能在轉(zhuǎn)錄后水平抑制祀基因的表達(dá)或 蛋白翻譯，從而參與生物體內(nèi)多種生理、病理過(guò)程的調(diào)節(jié)，如細(xì)胞分化、增殖、調(diào)亡、遷移和 侵襲等。乳腺癌組織/細(xì)胞特異性高水平表達(dá)的microRNAs有幾大類，如miR21、miR155、 miR301、miR375 等，特異性低表達(dá)的 microRNAs 有:11111?145、11111?12513、11111?16、161-7日等。關(guān)于 microRNAs與腫瘤的關(guān)系已經(jīng)有很多文獻(xiàn)報(bào)道，正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中的microRNAs表達(dá)水 平的差異，表明microRNAs的異常表達(dá)與腫瘤發(fā)生之間具有特定的相關(guān)性。MicroRNAs作為 有前景的腫瘤治療的核酸藥物，其體外轉(zhuǎn)染給藥和其表達(dá)豐度對(duì)腫瘤的祀向治療尤為重 要。如何將體外microRNAs運(yùn)送到祀組織，保持其效能與祀向性成為此項(xiàng)技術(shù)的關(guān)鍵點(diǎn)之 O
[0004] MicroRNAs種類及其作用的祀基因眾多，考慮到單種microRNA分子對(duì)腫瘤細(xì)胞的 作用有限，因此常將抑癌的microRNAs與腫瘤抑制劑聯(lián)合使用。此外，還可考慮聯(lián)合兩種或 多種microRNAs的表達(dá)及其協(xié)同作用獲得增強(qiáng)的抗腫瘤效應(yīng)，有研究報(bào)道將共表達(dá)（CO-expressed)的miR145和miR143的分子簇(miR143/145cluste;r)轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，共同作用于腫 瘤細(xì)胞，具有良好的協(xié)同作用。但有研究發(fā)現(xiàn)將兩個(gè)microRNAs分子依次插入在同一個(gè)表達(dá) 載體上轉(zhuǎn)染細(xì)胞其表達(dá)水平存在差異，即表達(dá)效率受插入位置的影響：靠近啟動(dòng)子的 microRNAs表達(dá)效率要高于遠(yuǎn)離啟動(dòng)子的microRNAs分子。因此，研究不受插入表達(dá)載體位 置（即距離啟動(dòng)子遠(yuǎn)近）的影響從而滿足高效表達(dá)，又同時(shí)可發(fā)揮幾種microRNAs協(xié)同作用 的基因藥物成為此項(xiàng)技術(shù)的另一個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的第一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供了一種核酸構(gòu)建載體，用真核表達(dá)載體 高效表達(dá)microRNAs，使得插入的目的microRNAs的表達(dá)不受插入位置的影響，即所表達(dá)的 mi croRNAs表達(dá)效率相互不影響；
[0006] 本發(fā)明還要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種核酸重組表達(dá)載體。本發(fā)明的目的是提供 一種microRNAs表達(dá)載體，所構(gòu)建的microRNAs表達(dá)載體只在miR155-5p高表達(dá)的乳腺癌腫 瘤細(xì)胞中高表達(dá)，而在miR155-5p低表達(dá)的正常細(xì)胞中表達(dá)很弱，從而達(dá)到祀向抑制特定乳 腺癌細(xì)胞的作用。
[0007] 本發(fā)明最后要解決的技術(shù)問(wèn)題是根據(jù)乳腺癌細(xì)胞中兩種microRNAs的表達(dá)的特異 性，通過(guò)上述的核酸重組表達(dá)載體在乳腺癌細(xì)胞/組織內(nèi)表達(dá)期望的microRNAs,從而實(shí)現(xiàn) 協(xié)同抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖達(dá)到抑癌方面的應(yīng)用。
[0008] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
[0009] 本發(fā)明提供了一種核酸構(gòu)建載體，其包括至少一種編碼microRNAs的核酸分子，和 一種編碼結(jié)合沉默復(fù)合物的核酸序列，和一種編碼間隔microRNAs的核酸序列，和一種編碼 減少通讀現(xiàn)象的核酸序列;其中所述的核酸構(gòu)建載體使得所述的microRNAs的核酸分子，和 結(jié)合沉默復(fù)合物的核酸序列，和間隔microRNAs的核酸序列，和編碼減少通讀現(xiàn)象的核酸序 列能夠共順?lè)醋拥谋磉_(dá)。
[0010] 其中，上述的編碼microRNAs的核酸分子是miR145-5p和miR16-5p，其核巧酸序列 分別如SEQ ID NO: 1和核巧酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0011] 其中，上述的一種編碼結(jié)合沉默復(fù)合物的序列是miR155-5p的反義鏈，其核巧酸序 列如沈Q ID NO:3所示。
[0012] 其中，上述的一種編碼間隔microRNAs的序列是6bp的核酸序列，其核巧酸序列如 沈Q ID NO:4所示。
[0013] 其中，上述的一種編碼減少通讀現(xiàn)象的序列是一個(gè)短的POlyA序列，其核巧酸序列 如沈Q ID NO:5所示。
[0014] 上述的核酸構(gòu)建載體用于制備抑制細(xì)胞增殖的組合物方面的應(yīng)用。
[0015] -種重組載體，其含有上述的核巧酸序列。
[0016] 上述的重組載體，包括編碼microRNAs的核酸分子，編碼miR155-5p的對(duì)應(yīng)反義鏈 核酸序列，編碼間隔microRNAs的核酸序列，編碼減少通讀現(xiàn)象的核酸序列中的一種或幾 種，并且編碼microRNAs的核酸分子兩邊都是miR155-5p反義鏈，編碼microRNAs的核酸分子 與miR155-5p反義鏈之間由化P間隔序列連接，所述編碼microRNAs的核酸分子包括miR145-5p和miR16-5p;其中所述重組載體使得所述編碼microRNAs的核酸分子能夠共順?lè)醋拥乇?達(dá)。
[0017] 一種真核聯(lián)合表達(dá)載體pEGFPC3-miR145/16,所述載體同時(shí)表達(dá)兩個(gè)成熟的 microRNAs 分子:miR145-5p 和miR16-5p。
[0018] 上述的重組載體在制備乳腺癌藥物方面的應(yīng)用。
[0019] 上述的重組載體在乳腺癌導(dǎo)管癌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)期望的microRNAs協(xié)同抑制增殖藥物 方面的應(yīng)用。
[0020] 本發(fā)明構(gòu)建的microRNAs表達(dá)載體，表達(dá)的兩種microRNAs為miR145-5p和miR16-5p的成熟序，列具有抑癌作用、協(xié)同作用；該表達(dá)載體含有可W特異性結(jié)合癌細(xì)胞中的 miR155-5p的序列:miR155-5p反義鏈。
[0021] 本發(fā)明構(gòu)建的microRNAs表達(dá)載體的目的片段兩側(cè)都是miR155-5p反義鏈。
[0022] 本發(fā)明構(gòu)建的microRNAs表達(dá)載體，表達(dá)的序列在吸附miR155-5p后，會(huì)被沉默復(fù) 合物剪切，將miR155-5p反義鏈從表達(dá)序列上切下。
[0023] 本發(fā)明構(gòu)建的microRNAs表達(dá)載體，在miR155-5p反義鏈被切掉之后，即形成 miR145-5p和miR16-5p的成熟序列。
[0024] 發(fā)明人構(gòu)建了聯(lián)合表達(dá)miR145-5p和miR16-5p并特異性祀向乳腺癌細(xì)胞的真核表 達(dá)載體，實(shí)現(xiàn)特異性高效表達(dá)目的microRNAs，并有效的抑制乳腺癌腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。
[0025] 本發(fā)明的具體方法如下：
[0026] 一、MicroRNAs協(xié)同作用的篩選
[0027] 篩選的microRNA mimics藥物購(gòu)于廣州銳博生物科技有限公司:miR145-5p mimic (micrON? hsa-miR-145-5p agomir)，miR125b-5p mimic(micr0N? hsa-miR-125b-5p agomir)，miR16-5p mimic(micr0N? hsa-miR-16b-5p agomir)，let-7a mimic(micr0N? hsa-let-7a-5p agomir) ,Negative control mimic ( niicrON 蛋.microRNAs mimic control)。
[002引選取4種文獻(xiàn)報(bào)道的乳腺癌中低表達(dá)的microRNAs分子（miR145-5p mimic,、 miR12f5b-5p mimic、miR16-5p mimic、let-7a mimic)，兩兩一組分別共轉(zhuǎn)染T47D細(xì)胞，MTT 增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR145-5p和miR16-5p具有最佳協(xié)同作用（圖1-A、圖1-B)。
[00巧]二、MicroRNAs真核表達(dá)載體的構(gòu)建
[0030] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，發(fā)明人設(shè)計(jì)聯(lián)合表達(dá)miR145-5p和miR16-5p的真核表達(dá) 載體的構(gòu)建方法，在于:用同尾酶將目的片段連接到真核表達(dá)載體祀GFPC3上。
[0031] 本發(fā)明使用的祀GFPC3載體(Clontech公司，美國(guó)）是非病毒性哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá) 載體，啟動(dòng)子是CMV，載體大小4727bp，載體標(biāo)簽:N-EGFP，載體抗性:卡那霉素，載體篩選標(biāo) 記:新霉素。多克隆位點(diǎn)(MCS)區(qū)在1328-1413bp，如圖2-A所示。
[0032] 本發(fā)明構(gòu)建的所有載體，選擇插入目的片段的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)為多克隆位點(diǎn)區(qū) (MCS)的Bgl H和EcoR I(原始載體 1335bp和 1360bp之間），如圖2-A所示。祀GFPC3-miR145/ 16、口66。？〔3-11111?16/145、966。？〔3-11111?145、祀6。？〔3-11111?16和祀6。？〔3-11111?^等載體的構(gòu)建 按圖2-B所示將各個(gè)片段依次插入祀GFPC3。各插入片段由深圳華大基因科技服務(wù)有限公司 合成：
[0033] miR145-5p，其核巧酸序列如沈Q ID N0:1所示。
[0034] miR16-5p，其核巧酸序列如沈Q ID N0:2所示。
[00巧]11111?155-59的反義鏈，其核巧酸序列如沈9 10^:3所示。
[0036] 6bp間隔microRNAs的核酸序列，為限制性內(nèi)切酶連接形成的序列。其核巧酸序列 如沈Q ID NO:4所示。
[0037] 短的POlyA序列，其核巧酸序列如SEQ ID NO: 5所示。
[0038] miRNC(無(wú)意鏈序列，即序列不祀向任何一個(gè)基因），其核巧酸序列如SEQ ID N0:6 所示。
[0039] 所有合成序列5'端加入Bgin，3'端加入Bgin和EcoRI。
[0040] 所有合成序列都是同時(shí)合成兩條互補(bǔ)雙鏈。
[0041 ] =、McroRNAs真核表達(dá)載體對(duì)T47D細(xì)胞抑制率檢測(cè)
[0042] 將構(gòu)建的microRNAs真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染T47D細(xì)胞，通過(guò)MTT增殖實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)不同載 體對(duì)T47D細(xì)胞的抑制率。如圖3所示，在細(xì)胞水平證實(shí)了祀GFPC3-miR145/16具有最佳的抑 制T47D細(xì)胞增殖效果。
[00創(chuàng)四、McroRNAs真核表達(dá)載體的表達(dá)效率檢測(cè)
[0044] 將構(gòu)建的幾種micoRNA真核表達(dá)載體或microRNA mimics轉(zhuǎn)染T47D細(xì)胞，4化后，提 取總RNA，TARAKA公司試劑盒反轉(zhuǎn)錄第一鏈，實(shí)時(shí)巧光定量PCR檢測(cè)各個(gè)載體的目的片段的 表達(dá)。如圖4所示，在mRNA水平證實(shí)構(gòu)建的真核表達(dá)載體能夠成功表達(dá)miR145-5p、miR16-5p、miRNC等相應(yīng)的目的片段。
[0045] 五、Mcr oRNAs真核表達(dá)載體對(duì)預(yù)測(cè)祀基因的mRNA水平的抑制
[0046] 將構(gòu)建的幾種micoRNA真核表達(dá)載體或microRNA mimics轉(zhuǎn)染T47D細(xì)胞，4化后，提 取總RNA，TARAKA公司試劑盒反轉(zhuǎn)錄第一鏈，實(shí)時(shí)巧光定量PCR檢測(cè)各個(gè)實(shí)驗(yàn)組的祀基因的 表達(dá)。如圖5所示，在mRNA水平上證實(shí)了轉(zhuǎn)染構(gòu)建的各種microRNAs表達(dá)質(zhì)?；騧icroRNA 111；[1]1；[。3后，切(31;[]1〇1(周期蛋白01)、(：-1]17(3(>-1]17(3禽骨髓細(xì)胞瘤病毒癌基因同源物）、化41/ 2(細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶)基因的表達(dá)下降，單獨(dú)轉(zhuǎn)染祀GFPC3-miR145或pEGFPC3-miR16,或 單獨(dú)轉(zhuǎn)染miR145-5p mimic或miR16-5p mimic后，B化2(B細(xì)胞慢性淋己細(xì)胞白血病/淋己瘤 2)的表達(dá)上調(diào)，共轉(zhuǎn)染miR145-5p和miR16-5p的mimic或祀GFPC3-miR145/16后，B化2的表達(dá) 下降。
[0047] 六、MicroRNAs真核表達(dá)載體對(duì)預(yù)測(cè)祀基因的蛋白水平的抑制
[004引將構(gòu)建的幾種microRNA真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染T47D細(xì)胞，加藥處理4她后用全蛋白提 取試劑盒化GP2100，凱基生物)提取細(xì)胞總蛋白；然后用BCA法定量蛋白濃度，取50iig蛋白上 樣跑SDS-PAGE電泳;如圖6-A、圖6-B所示，通過(guò)對(duì)4個(gè)祀基因的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)幾個(gè)祀蛋白在單獨(dú) 轉(zhuǎn)染pEGFPC3-miR145或祀GFPC3-miR16時(shí)無(wú)明顯抑制作用，在轉(zhuǎn)染祀GFPC3-miR145/16后， Erkl/2、CyC1 in Dl、C-myC、B化2都被敲降，Wb化2最為明顯。
[0049] 有益效果:本發(fā)明所構(gòu)建的表達(dá)載體用于目的microRNAs的表達(dá)不受插入位置(即 距離啟動(dòng)子遠(yuǎn)近)的影響，可同時(shí)高效表達(dá)兩種抑癌microRNAs分子miR145-5p和miR16-5p; 本發(fā)明所構(gòu)建的載體祀向miR155-5p高表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞體現(xiàn)了顯著的協(xié)同抑癌作用。發(fā) 明人構(gòu)建新型生物載體的方法有望在臨床上應(yīng)用于治療特定種類的乳腺癌，提高患者的存 活率和生存質(zhì)量。
【附圖說(shuō)明】
[0050] 圖1四種microRNAs兩兩組合對(duì)T47D細(xì)胞的抑制率（圖1-A:單獨(dú)加藥處理的抑制 率;圖1-B:組合加藥處理的抑制率；）
[0051] 圖2載體構(gòu)建示意圖。（圖2-A:載體構(gòu)建使用的原始載體PEGFPC3示意圖；圖2-B: 祀 GFPC3-miR145/16 聯(lián)合表達(dá)載體、pEGFPC3-miR16/145 聯(lián)合表達(dá)載體、pEGFPC3-miR145 表 達(dá)載體、祀GFPC3-miR16表達(dá)載體、pEGFPC3-miRNC表達(dá)載體等構(gòu)建示意圖；圖2-C成功構(gòu)建 的祀 GFPC3-miR145/16,祀 GFPC3-miR16/145,祀 GFPC3-miR145 或祀 GFPC3-miR16 或祀 GFPC3-miRNC測(cè)序圖；）
[0052] 圖3 MTT法檢測(cè)構(gòu)建載體抑制T47D細(xì)胞增殖的作用（圖3 :MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果）；
[0053] 圖4實(shí)時(shí)巧光定量PCR檢測(cè)構(gòu)建的質(zhì)粒表達(dá)目的片段的效率（圖4-A:miR145-5p和 miR16-5p含量的實(shí)時(shí)巧光定量PCR檢測(cè)；圖4-B:miRNC含量的實(shí)時(shí)巧光定量PCR檢測(cè)）；
[0054] 圖5實(shí)時(shí)巧光定量PCR檢測(cè)4個(gè)預(yù)測(cè)祀基因表達(dá)；
[0化5] 圖6 Western blot檢測(cè)4個(gè)預(yù)測(cè)勒!基因的表達(dá)（圖6-A:weste;rn blot結(jié)果圖；圖6-B:weste;rn blot條帶灰度掃描結(jié)果柱狀圖）；
【具體實(shí)施方式】
[0056] 下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì) 理解，下列實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。一般地，本說(shuō)明書(shū)中 關(guān)于細(xì)胞核組織培養(yǎng)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)、微生物學(xué)、基因、蛋白質(zhì)和核酸化學(xué)、和雜交使 用的術(shù)語(yǔ)和技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知并且通常使用的。一般地，除非另外指出，否則本發(fā)明方 法和技術(shù)都是根據(jù)本領(lǐng)域眾所周知，并且在本說(shuō)明書(shū)中所引用或討論的各種一般性和專業(yè) 出版物中有介紹的標(biāo)準(zhǔn)方法來(lái)實(shí)施。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商 建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可W通過(guò)市購(gòu)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。
[0057] 實(shí)施例1:四種抑癌的microRNAs兩兩組合對(duì)T47D細(xì)胞的抑制率。
[005引T47D細(xì)胞使用PRIM1640培養(yǎng)基加5%FBS培養(yǎng)，放在細(xì)胞培養(yǎng)箱生長(zhǎng)。傳代時(shí)將細(xì) 胞稀釋成50000個(gè)/ml,在96孔板中每個(gè)孔加入10化1。
[0059] 篩選的microRNA mimics藥物（廣州銳博生物科技有限公司）：miR145-5p mimic (micrON? hsa-miR-145-5p agomir)，miR125b-5p mimic(micr0N? hsa-miR-125b-5p agomir)，miR16-5p mimic(micr0N? hsa-miR-16b-5p agomir)，let-7a mimic(micr0N? hsa-let-7a-5p agomir),Negative control mimic( micrON某microRNAs mimic control)。
[0060] 處理濃度：50nmol microRNA mimic每孔，0.2山 Lipofectamine2000每孔，檢測(cè)時(shí) 間7化。
[0061] 處理方式：將miR145-5p mimic、miR12f5b-5p mimic、miR16-5p mimic、let-7a mimic、四種microRNA mimicS單獨(dú)組合或兩兩一組分別共轉(zhuǎn)染T47D細(xì)胞，對(duì)照組用 Negative con化〇1 mimic等處理，檢測(cè)處理72h后對(duì)T47D細(xì)胞的增殖的抑制率{抑制率= (1-實(shí)驗(yàn)組OD/對(duì)照組OD) X 100% }。
[0062] 圖I-A(數(shù)據(jù)如表1所示)結(jié)果顯示四種microRNAs單獨(dú)作用T47D細(xì)胞抑制率。
[0063] 圖I-B(數(shù)據(jù)如表2所示)顯示miR145-5p mimic和miR16-5p mimic共轉(zhuǎn)染組的抑制 率較預(yù)期高出最多，說(shuō)明miR145-5p mimic和miR16-5p mimic具有最佳協(xié)同作用。（抑制率 預(yù)期為對(duì)應(yīng)的兩種microRNA mimic單獨(dú)藥物處理的抑制率之和）
[0064] 表 1
[00 化]
[0066]
[0067]表 2
[00681
[0069] 實(shí)施例2:MicroRNAs真核表達(dá)載體的構(gòu)建
[0070] 準(zhǔn)備材料:限制性內(nèi)切酶Bgl n、BamHI、EcoRI;常規(guī)PCR體系;Annealing Buffer; 大腸桿菌擴(kuò)增體系;W連接酶，連接緩沖液;凝膠電泳和成像系統(tǒng);本發(fā)明使用的祀GFPC3載 體（Clontech公司，美國(guó)）是非病毒性哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體，啟動(dòng)子是CMV，載體大小 4727bp，載體標(biāo)簽:N-EGFP，載體抗性:卡那霉素，載體篩選標(biāo)記:新霉素。多克隆位點(diǎn)(MCS) 是1328-14136口。原始載體如圖2-4所示。
[0071] 本發(fā)明構(gòu)建的所有載體，選擇插入目的片段的酶切位點(diǎn)為多克隆位點(diǎn)(MCS)區(qū)的 Bgl n和EcoRI (原始載體1335bp和1360bp之間）；按圖2-B所示將各個(gè)片段依次插入載體。 pEGFPC3-miR145/16，pEGFPC3-miR16/145，pEGFPC3-miR145 或祀 GFPC3-miR16 或 PEGFPC3-miRNC等載體的構(gòu)建按圖2-B所示將各個(gè)片段依次插入PEGFPC3。各插入片段由深圳華大基 因科技服務(wù)有限公司合成：
[0072] miR145-5p，其核巧酸序列如沈Q ID N0:1所示。
[0073] miR16-5p，其核巧酸序列如沈Q ID N0:2所示。
[0074] 11111?155-59的反義鏈，其核巧酸序列如沈9 10^:3所示。
[0075] 6bp間隔microRNAs的核酸序列，為限制性內(nèi)切酶連接形成的序列。其核巧酸序列 如沈Q ID NO:4所示。
[0076] 短的POlyA序列，其核巧酸序列如SEQ ID NO: 5所示。
[0077] miRNC(無(wú)意鏈序列，即序列不祀向任何一個(gè)基因），其核巧酸序列如SEQ ID N0:6 所示。
[0078] 所有合成序列5'端加入Bgin，3'端Bgin和EcoRI。
[0079] 所有合成序列都是同時(shí)合成兩條互補(bǔ)核巧酸雙鏈。
[0080] 具體載體構(gòu)建實(shí)驗(yàn)步驟：
[0081 ] 如圖2-B所示，各個(gè)表達(dá)載體在EGFPC3質(zhì)粒上的MCS區(qū)，從5 '端（Bgl n )到3 '端 化coRI)插入的外源核巧酸序列次序如下：
[0082] pEGFPC3-miR145依次插入的核巧酸序列為：SEQ ID N0:3+SEQ ID N0:1+SEQ ID N0:3+SEQ ID NO:5；
[0083] pEGFPC3-miR16依次插入的核巧酸序列為：SEQ ID N0:3+SEQ ID N0:2+SEQ ID N0:3+SEQ ID NO:5；
[0084] pEGFPC3-miRNC依次插入的核巧酸序列為：SEQIDN0:3+:沈QIDN0:6+:SEQID N0:3+SEQ ID NO:5；
[0085] 祀GFPC3-miR145/16依次插入核巧酸的序列為：SEQ ID N0:3+:沈Q ID N0:1+:SEQ ID N0:3+:沈Q ID N0:2+:沈Q ID N0:3+SEQ ID N0:5;
[0086] pEGFPC3-miR16/145依次插入核巧酸的序列為：SEQ ID N0:3+SEQ ID N0:2+沈Q ID N0:3+SEQ ID N0:1+SEQ ID N0:3+SEQ ID N0:5。
[0087] 所有表達(dá)載體每次插入一段新的核巧酸序列的實(shí)驗(yàn)方法步驟均如下面SI到S6所 述。
[008引Sl、取化g需要插入核巧酸序列的載體雙酶切過(guò)夜：
[0089] 需要插入核昔酸序列的載體 1峭
[0090] S2、試劑盒（TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Code No. 9762)回收酶切產(chǎn)物，隨后使用30iil滅菌水溶解吸附柱上的產(chǎn)物。
[0091] S3、按照前面說(shuō)明的核巧酸序列插入順序，將本次需要插入的核巧酸序列的兩條 合成的互補(bǔ)鏈退火形成雙鏈：
[0
[0
[0
[00巧]S5、轉(zhuǎn)化、涂板:取S4產(chǎn)物扣1，Top 10感受態(tài)10化1，按照ToplO產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)轉(zhuǎn)化感受 態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化完成后加入70化1 LB于37 °C搖床震蕩45min，取涂布于培養(yǎng)皿，放37 °C生 化培養(yǎng)箱過(guò)夜。
[0096] S6、鑒定:取S5培養(yǎng)皿，挑取3個(gè)克隆，送測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示載體構(gòu)建成功，將質(zhì)粒 和菌液保種。
[0097] S7、按照?qǐng)D2所示的連接順序，按照Sl到S6的操作順序，依次將合成序列插入 祀GFPC3載體中，構(gòu)建祀GFPC3-miR145/16，祀GFPC3-miR16/145，祀GFPC3-miR145，祀GFPC3-miR16 和祀 GFPC3-miRNC。
[009引 S8、將S6鑒定正確的5個(gè)目的質(zhì)粒（如圖2-C所示，pEGFPC3-miR145/16，PEGFPC3-miR16/145,祀GFPC3-miR145或祀GFPC3-miR16或祀GFPC3-miRNC)擴(kuò)大培養(yǎng)，用去內(nèi)毒素試 劑盒(PureLink? HiPure Plasmid DNA Purification Kits)純化質(zhì)粒，將純化好的質(zhì)粒濃 度調(diào)整為化g/yl。
[0099] 實(shí)施例3 :MTT增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)構(gòu)建的載體對(duì)T47D細(xì)胞的增殖抑制。
[0100] T47D細(xì)胞使用PRIM1640培養(yǎng)基加5%FBS培養(yǎng)，放在細(xì)胞培養(yǎng)箱生長(zhǎng)。傳代時(shí)將細(xì) 胞稀釋成50000個(gè)/ml，在96孔板中每個(gè)孔加入I(K)山；處理濃度：IOOng表達(dá)載體每孔，0. ^口(^6。1日11111162000每孔；檢測(cè)時(shí)間：011、2地、4她、7211、9611。
[0101] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3(數(shù)據(jù)如表3所示)所示:祀GFPC3-miR145表達(dá)載體的抑制細(xì)胞增殖 的效果低于祀GFPC3-miR16表達(dá)載體。祀GFPC3-miR145/miR16表達(dá)載體的抑制率在72h的時(shí) 候具有顯著效應(yīng)。因此，pEGFPC3-miR145/miR16可W有效的抑制T47D乳腺癌細(xì)胞系的增殖。
[0102] 表3
[0103]
[0104] 實(shí)施例4:實(shí)時(shí)巧光定量PCR檢測(cè)構(gòu)建的質(zhì)粒表達(dá)目的片段的效率。
[01化]T47D細(xì)胞培養(yǎng)條件：使用RPMI1640培養(yǎng)基加5 % FBS，置于37 r 5 % C〇2細(xì)胞培養(yǎng)箱 培養(yǎng)；細(xì)胞傳代時(shí)種入6孔板，每孔10000個(gè)細(xì)胞，用1%FBS饑餓處理1天，分別轉(zhuǎn)染各組 microRNAs表達(dá)載體或microRNA mimics，繼續(xù)培養(yǎng)24h，用small RNA提取試劑盒提取總 RNA。
[0106] 實(shí)時(shí)巧光定量PCRUpplied Biosystems):反轉(zhuǎn)錄總RNA用量0.化g，染料采用SY服 Green^astStart Universal SYBR Green Master,Rox)。具體步驟如下：Sl、95°C15min解 開(kāi)雙鏈;S2、95 °C 15s變性;S3、60°C 25sec退火加延伸；S4、重復(fù)S2到S3共40個(gè)循環(huán)，伴隨解鏈 數(shù)量分析。
[0107] MicroRNAs反轉(zhuǎn)錄與實(shí)時(shí)巧光定量引物根據(jù)文獻(xiàn)給出的設(shè)計(jì)方法設(shè)計(jì)，核巧酸序 列如下：
[0108] miR145-5p 反轉(zhuǎn)錄引物：
[0109] GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAGGGATTC(沈Q ID N0:7)
[0110] miR16-5p反轉(zhuǎn)錄引物：
[0111] GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCGCCAATA(SEQ ID NO:8)
[0112] miRNC反轉(zhuǎn)錄引物：
[0113] GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTTTGTGCC(SEQ ID NO:9)
[0114] miR145-5p定量引物化rward:GTCCAGCTGGTCCAGTTTTCCCAGGA(SEQ ID N0:10)
[0115] miR16-5p定量引物化rwarcUGCGGCGGTAGCAGCACGTAAATAT(沈Q ID N0:11)
[0116] miRNC定量引物化rward:GATCC AATTACGATTAGCACTATCCCCAAGATCTG(SEQ ID NO: 12)
[0117] MicroRNA定量反向引物:GTGCAGGGTCCGAGGTATTC(沈Q ID N0:13)
[0118] 如圖4-A(數(shù)據(jù)如表4所示)所示，檢測(cè)轉(zhuǎn)染表達(dá)載體后細(xì)胞內(nèi)的目的microRNAs含 量，其中：miR145-5p和miR16-5p含量都升高，miR145-5p含量最高；從祀GFPC3-miR145/16和 祀GFPC3-miR16/145兩個(gè)目的microRNAs位置互換的質(zhì)粒中兩個(gè)microRNAs分子的表達(dá)量來(lái) 看，不同插入位置對(duì)目的microRNAs的表達(dá)無(wú)影響(p〉0.5);加入miR155-5p的抑制劑，消減 了內(nèi)源性miR155后，目的片段的表達(dá)大幅降低。
[0119] 表4 「01201
[0121] 圖4-B(數(shù)據(jù)如圖5所示）:miRNC含量的實(shí)時(shí)巧光定量PCR檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)方法如實(shí)施例4 中提到。定量結(jié)果顯示加入一個(gè)22bp左右不祀向任何基因的miRNC短片段后，在miR155-5p 高表達(dá)的細(xì)胞中都有約460倍的表達(dá)效率。
[0122] 表5
[0125] W上實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，本載體的構(gòu)建方式可W使插入的microRNAs不受位置影響高
[0123]
[0124] 效表達(dá)目的microRNAs ;在miR155-5p低表達(dá)的細(xì)胞中（正常細(xì)胞中），本載體的表達(dá)效率很 低。miR16-5p的實(shí)時(shí)巧光定量PCR檢測(cè)出含量很少并不是質(zhì)粒表達(dá)少，而是表達(dá)出的產(chǎn)物與 細(xì)胞內(nèi)的祀基因結(jié)合后被大量降解。
[0126] 實(shí)施例5:實(shí)時(shí)巧光定量PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后4個(gè)預(yù)測(cè)祀基因的表達(dá)。
[0127] 細(xì)胞培養(yǎng)、種板、加藥、收集、反轉(zhuǎn)錄W及定量的操作參照實(shí)施例4。實(shí)時(shí)巧光定量 PCR檢測(cè)結(jié)果如圖5(數(shù)據(jù)如表6所示）顯示，轉(zhuǎn)染構(gòu)建的各種microRNAs表達(dá)質(zhì)粒后，mRNA水 平上對(duì)切。1;[]1〇1(周期蛋白01)、(：-1]巧(3(>-1]巧(3禽骨髓細(xì)胞瘤病毒癌基因同源物）、化41/2 (細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶）基因都有抑制作用，但是單獨(dú)轉(zhuǎn)染pEGFPC3-miR145或PEGFPC3-miR16,或單獨(dú)轉(zhuǎn)染miR145-5p mimic或miR16-5p mimic都促進(jìn)B化2(B細(xì)胞慢性淋己細(xì)胞白 血病/淋己瘤2)基因的mRNA的表達(dá)，然而在共轉(zhuǎn)染miR145-5p和miR16-5p的mimic或 祀GFPC3-miR145/16后，B化2也被明顯敲降，說(shuō)明B化2有可能是Cyclin Dl、C-myc、化kl/2等 基因的補(bǔ)償信號(hào)通路(backdoor)上的基因，而當(dāng)miR145和miR16兩個(gè)microRNAs分子同時(shí)作 用時(shí)，B化2運(yùn)條補(bǔ)償?shù)男盘?hào)通路也被抑制。結(jié)果說(shuō)明，miR145-5p和miR16-5p可W協(xié)同抑制 乳腺癌T47D細(xì)胞系的BCL2基因的表達(dá)，從而抑制了 T47D細(xì)胞的增殖。
[012引 表6 [01291
[
[0131 ] 實(shí)施例6:Western blot檢測(cè)預(yù)測(cè)祀基因的表達(dá)
[0132] T47D細(xì)胞使用PRIM1640培養(yǎng)基加 5%FBS培養(yǎng)，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱生長(zhǎng)。傳代時(shí)將細(xì) 胞稀釋成50000個(gè)/ml，在6孔板中每個(gè)孔加入1000 iil;處理濃度：1000 ng表達(dá)載體每孔， Lipofectamine2000每孔。加藥處理4她后提取細(xì)胞總蛋白（全蛋白提取試劑盒KGP2100,凱 基生物）。然后用BCA法定量蛋白濃度，取50iig蛋白上樣SDS-PAGE電泳。
[0133] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6-A，（數(shù)據(jù)如表7所示），圖6-B顯示，轉(zhuǎn)染構(gòu)建的各種microRNAs表達(dá) 質(zhì)粒后，單獨(dú)轉(zhuǎn)染祀GFPC3-miR145或祀GFPC3-miR16對(duì)Cyclin Dl、C-myc、化kl/2、B化2蛋白 都沒(méi)有明顯抑制作用，但是在轉(zhuǎn)染祀GFPC3-miR145/16后，切Clin Dl、C-myc、B化2蛋白都被 敲降，WBCL2蛋白最為明顯，說(shuō)明pEGFPC3-miR145/16聯(lián)合表達(dá)載體能夠同時(shí)表達(dá)兩個(gè) microRNAs，而當(dāng)miR145和miR16兩個(gè)microRNAs分子同時(shí)作用時(shí)，B(X2運(yùn)個(gè)勒1分子受到最明 顯抑制，另外S個(gè)預(yù)測(cè)祀分子的表達(dá)也受到抑制。結(jié)果說(shuō)明，miR145-5p和miR16-5p可W協(xié) 同抑制乳腺癌T47D細(xì)胞系的BCL2等祀分子的表達(dá)，從而抑制了 T47D細(xì)胞的增殖。
[0134] 表7
[0135]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種核酸構(gòu)建載體，其特征在于，其包括至少一種編碼microRNAs的核酸分子，和一 種編碼結(jié)合沉默復(fù)合物的核酸序列，和一種編碼間隔microRNAs的核酸序列，和一種編碼減 少通讀現(xiàn)象的核酸序列;其中所述的核酸構(gòu)建載體使得所述的mi croRNAs的核酸分子，和結(jié) 合沉默復(fù)合物的核酸序列，和間隔microRNA的核酸序列，和編碼減少通讀現(xiàn)象的核酸序列 能夠共順?lè)醋拥谋磉_(dá)。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸構(gòu)建載體，其特征在于，所述的編碼m i c r 〇 RN A s的核酸分 子是miR145-5p和miR16-5p，其核苷酸序列分別如SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2所示。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸構(gòu)建載體，其特征在于，所述的一種編碼結(jié)合沉默復(fù)合物 的核酸序列是miR155-5p的反義鏈，其核苷酸序列如SEQIDN0 :3所示。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸構(gòu)建載體，其特征在于，所述的一種編碼間隔microRNAs 的核酸序列是6bp的核酸序列，其核苷酸序列如SEQ ID N0:4所示。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸構(gòu)建載體，其特征在于，所述的一種編碼減少通讀現(xiàn)象的 核酸序列是一個(gè)短的polyA序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。6. 權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的核酸構(gòu)建載體用于制備抑制細(xì)胞增殖的組合物方面的 應(yīng)用。7. -種重組載體，其含有權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的核酸序列。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的重組載體，其特征在于，所述重組載體包括編碼microRNAs的 核酸分子，編碼miR155_5p的反義鏈核酸序列，編碼間隔mi croRNAs的核酸序列，編碼減少通 讀現(xiàn)象的核酸序列，并且編碼mi croRNAs的核酸分子兩邊都是mi R155-5p反義鏈，編碼 microRNAs的核酸分子與miR155_5p反義鏈之間由6bp間隔序列連接，所述編碼microRNAs的 核酸分子包括miR145-5p和miR16-5p;其中所述重組載體使得所述編碼microRNAs的核酸分 子能夠共順?lè)醋拥乇磉_(dá)。9. 一種真核聯(lián)合表達(dá)載體pEGFPC3-miR145/16，其特征在于，所述載體同時(shí)表達(dá)兩個(gè)成 熟的 111；[(31'〇1?嫩8核酸分子:11111?145-5。和11111?16-5卩。10. 權(quán)利要求9的重組載體在制備乳腺癌藥物方面應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/85GK105861551SQ201610251107
【公開(kāi)日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2016年4月21日
【發(fā)明人】曹新, 秦路洋, 魏欽俊, 姚俊, 魯雅潔
【申請(qǐng)人】南京醫(yī)科大學(xué)