一種基于對(duì)Rbmy基因進(jìn)行編輯來實(shí)現(xiàn)動(dòng)物性別控制的方法和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于對(duì)Rbmy基因進(jìn)行編輯來實(shí)現(xiàn)動(dòng)物性別控制的方法和應(yīng)用，該方法是通過利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)特異性地切割Y染色體上的Rbmy基因來實(shí)現(xiàn)動(dòng)物性別控制的。Rbmy基因編碼一種生殖細(xì)胞特異的核蛋白，這種蛋白是與精子發(fā)生相關(guān)的一種重要因子，對(duì)Rbmy基因進(jìn)行切割，可以使Rbmy基因喪失活性，進(jìn)而使得Y精子或帶有Y精子的受精卵喪失活性而無法發(fā)育為正常的胚胎，最終來提高雌性動(dòng)物的出生比例，達(dá)到性別控制的目的。由此，可以通過該方法對(duì)動(dòng)物后代出生的性別比例進(jìn)行控制，以達(dá)到使具有更好的經(jīng)濟(jì)價(jià)值的雌性動(dòng)物出生比例提高，從而大大提高生產(chǎn)效率和經(jīng)濟(jì)效應(yīng)。
【專利說明】
-種基于對(duì)Rbmy基因進(jìn)行編輯來實(shí)現(xiàn)動(dòng)物性別控制的方法和 應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其設(shè)及一種基于對(duì)肺my基因進(jìn)行編輯來實(shí)現(xiàn)動(dòng) 物性別控制的方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 性別控制（Sex control)是指人為地干預(yù)動(dòng)物的生殖過程，使得雌性動(dòng)物生產(chǎn)出 符合特定性別后代的一口技術(shù)。動(dòng)物性別控制技術(shù)在預(yù)防人類遺傳疾病、提高畜禽生產(chǎn)能 力、動(dòng)物遺傳育種及溯危珍稀動(dòng)物的保護(hù)等方面有著重要意義。
[0003] 目前大約有300余種伴性遺傳疾病與出生時(shí)嬰兒的性別相關(guān)(如血友病、紅綠色盲 和遺傳性腎炎等），在妊娠早期利用性別控制技術(shù)可W預(yù)測(cè)伴性遺傳病的發(fā)生情況，從而達(dá) 到產(chǎn)前診斷預(yù)防疾病發(fā)生的目的。在動(dòng)物生產(chǎn)上，為了獲得更多的牛奶和禽蛋，需要更多地 繁殖出雌性動(dòng)物;為了獲得鹿茸、廳香W及提高動(dòng)物的生長速度，獲得更多的肉類產(chǎn)品，需 要大量的雄性動(dòng)物。在動(dòng)物遺傳育種方面，性別控制技術(shù)可W減少育種年限，提高選育的效 率，提供更多的終端父本及終端母本，同時(shí)可W預(yù)防奶牛由于異卵雙生導(dǎo)致的不孕癥。在捶 救溯危保護(hù)動(dòng)物方面，性別控制技術(shù)能夠擴(kuò)大保護(hù)動(dòng)物的種群，提高雄性動(dòng)物的利用率。
[0004] 應(yīng)用動(dòng)物性別控制技術(shù)產(chǎn)生的社會(huì)價(jià)值W及經(jīng)濟(jì)價(jià)值都是巨大的，但是在動(dòng)物生 產(chǎn)中很難做到很好的性別控制效果。目前動(dòng)物性別控制技術(shù)只在牛上有較為廣泛的應(yīng)用， 要做到多種動(dòng)物的大規(guī)模推廣，還需要探索更為有效合理、更加成熟的方法。
[0005] CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)，是指規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)序列（Clustered regularly interspaced sho;rt pal in 化 omic r 邱 eats, CRISPR)是一種被發(fā)現(xiàn)存在于細(xì)菌 及古生菌中，能夠特異性地識(shí)別并降解入侵病毒或隧菌體攜帶的外源DNA的適應(yīng)性免疫系 統(tǒng)，其中II型CRISPR/Cas9系統(tǒng)是近年來應(yīng)用于基因組編輯最熱口的技術(shù)之一。目前 CRISPR/化s9系統(tǒng)已被廣泛地應(yīng)用于改造動(dòng)物的細(xì)胞基因組，制作模式動(dòng)物、植物，抵抗微 生物W及人類醫(yī)學(xué)上的疾病治療、消除免疫排斥等各方面。CRISPR/tas9的作用機(jī)理是由一 個(gè)帶特異性結(jié)合位點(diǎn)的單一導(dǎo)向RNA(single guide RNA，s排NA)引導(dǎo)Cas9核酸酶到革己位 點(diǎn)，在祀位點(diǎn)附近發(fā)生特異性地切割，最終DNA雙鏈發(fā)生斷裂或被修復(fù)或?qū)е录?xì)胞死亡。
[0006] CRISPR/tas9基因組編輯技術(shù)特異性地切割基因組的能力使得該技術(shù)應(yīng)用于動(dòng)物 性別控制成為可能，根據(jù)CRISPR/化s9系統(tǒng)的作用特點(diǎn)，只要針對(duì)動(dòng)物的X或Y染色體保守序 列設(shè)計(jì)多個(gè)切割位點(diǎn)，使X或Y染色體失活，使得雄性動(dòng)物只產(chǎn)生一種類型的精子或使攜帶 某種類型性染色體的受精卵無法正產(chǎn)發(fā)育，而達(dá)到動(dòng)物性別控制的目的。但是關(guān)于CRISPR/ 化s9系統(tǒng)對(duì)性染色體的基因編輯研究尚未見報(bào)道。
[0007] 通過對(duì)小鼠性染色的深度測(cè)序，發(fā)現(xiàn)在小鼠的Y染色體上，有的基因擁有許多重復(fù) 序列。運(yùn)些多拷貝基因大多數(shù)來自于Y染色體的后天獲得，主要有517、53*7、5^7，它們的拷 貝數(shù)都在100個(gè)W上，且對(duì)應(yīng)的等位基因拷貝數(shù)均在10個(gè)W上。運(yùn)些基因多數(shù)只在雄性小鼠 的生殖系里表達(dá)，與精子發(fā)生密切相關(guān)，敲除部分Y染色體長臂會(huì)導(dǎo)致運(yùn)部分基因拷貝數(shù)減 少，會(huì)造成精子的崎形甚至雄性不育，同時(shí)會(huì)增加雌性后代的出生比例。來自于祖先遺傳的 Y染色體多拷貝基因只有Rbmy-個(gè)基因，據(jù)估計(jì)它的拷貝數(shù)有30個(gè)，且它的等位基因 Rbmx位 于X染色體上，只有一個(gè)拷貝數(shù)。Rbmy基因只有6個(gè)基因座會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)錄，其中的兩個(gè)基因座會(huì) 翻譯蛋白。Rbmy編碼一種生殖細(xì)胞特異的核蛋白，運(yùn)種蛋白是與精子發(fā)生相關(guān)的一種重要 因子，另外Rbmy基因還與精子的能動(dòng)性有關(guān)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[000引本發(fā)明的目的是提供一種基于對(duì)Rbmy基因進(jìn)行編輯來實(shí)現(xiàn)動(dòng)物性別控制的方法 和應(yīng)用，W解決上述問題。
[0009] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種基于對(duì)Rbmy基因進(jìn)行編輯來實(shí)現(xiàn)動(dòng)物性別控 審IJ的方法和應(yīng)用，該方法是通過利用CRISPR/tas9系統(tǒng)特異性地切害化染色體上的Rbmy基因 來實(shí)現(xiàn)動(dòng)物性別控制的。Rbmy基因編碼一種生殖細(xì)胞特異的核蛋白，運(yùn)種蛋白是與精子發(fā) 生相關(guān)的一種重要因子，對(duì)Rbmy基因進(jìn)行切割，可W使Rbmy基因喪失活性，進(jìn)而使得Y精子 或帶有Y精子的受精卵喪失活性而無法發(fā)育為正常的胚胎，最終來提高雌性動(dòng)物的出生比 例，達(dá)到性別控制的目的。通過CRISPR/化s9系統(tǒng)可W特異性的剪切Rbmy基因，避免對(duì)其他 基因生產(chǎn)誤剪，可W準(zhǔn)確的使Y染色體喪失活性，進(jìn)而影響雄性動(dòng)物的出生，而對(duì)雌性動(dòng)物 不產(chǎn)生影響。由此，可W通過該方法對(duì)動(dòng)物后代出生的性別比例進(jìn)行控制，W達(dá)到使具有更 好的經(jīng)濟(jì)價(jià)值的雌性動(dòng)物出生比例提高，從而大大提高生產(chǎn)效率和經(jīng)濟(jì)效應(yīng)。
[0010] 在一些實(shí)施方式中，CRISPR/Cas9系統(tǒng)特異性地切割Rbmy基因的祀位點(diǎn)基因序列 如SEQ ID NO:6所示。CRISPR/Cas9系統(tǒng)的切割效率與目的基因的祀位點(diǎn)基因序列息息相 關(guān)，祀位點(diǎn)不合適時(shí)容易造成脫祀，影響切割效率。同時(shí)，CRISPR/Cas9系統(tǒng)的特異識(shí)別也與 革己位點(diǎn)的基因序列相關(guān)聯(lián)。由此，在Rbmy基因的祀位點(diǎn)基因序列如SEQ ID N0:6所示時(shí)，可 W達(dá)到最高的特異切割的效率，達(dá)到最好的性別控制效果。
[0011] 該基于對(duì)Rbmy基因進(jìn)行編輯來實(shí)現(xiàn)動(dòng)物性別控制的方法包括如下步驟：
[0012] 1)選擇肺my祀基因上的祀位點(diǎn)；
[0013 ] 2)根據(jù)祀位點(diǎn)基因序列設(shè)計(jì)相應(yīng)的SgRNA表達(dá)載體及祀載體；
[0014] 3)將祀載體、SgRNA表達(dá)載體與地Cas9質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染細(xì)胞，進(jìn)行體外檢則S排NA表 達(dá)載體的切割效率；
[0015] 4)體外檢測(cè)篩選出有效的SgRNA表達(dá)載體；
[0016] 5)將篩選出的有效SgRNA表達(dá)載體與地化s9質(zhì)?；旌巷@微注射入動(dòng)物受精卵的雄 原核中；
[0017] 6)對(duì)處理后的受精卵進(jìn)行胚胎移植至代孕雌性動(dòng)物子宮內(nèi)。
[0018] 由此，可W有效的達(dá)到控制動(dòng)物后代性別的出生比例，來提高生產(chǎn)效率及經(jīng)濟(jì)效 益。
[0019] 在一些實(shí)施方式中，篩選出的有效SgRNA表達(dá)載體為pU6-sgRNA6表達(dá)載體，該pU6-sgRNA6表達(dá)載體包含如SEQIDN0:17和沈QIDN0:18所示的序列。CRISPRA：as9系統(tǒng)通過 SgRNA與祀位點(diǎn)特異性識(shí)別，然后通過化s9核酸酶在祀位點(diǎn)處發(fā)生特異切割，最終實(shí)現(xiàn)特異 切割相應(yīng)基因，實(shí)現(xiàn)基因編輯的目的，最終使該祀基因失活。因此，SgRNA序列與祀位點(diǎn)的結(jié) 合效率直接影響了最終的切割效率，包含如SEQ ID NO: 17和SEQ ID NO: 18所示序列的pU6- sgRNA6表達(dá)載體注射入小鼠受精卵雄原核后，可W達(dá)到最大效率的切割Rbmy基因，來提高 雌性小鼠的出生率。
[0020] 在一些實(shí)施方式中，pU6-sgRNA6表達(dá)載體顯微注射入動(dòng)物受精卵雄原核的濃度為 IO-SOngAil，地Cas9質(zhì)粒顯微注射入動(dòng)物受精卵雄原核的濃度為25-125ng/山，pU6-sgRNA6 表達(dá)載體與Ph化s9質(zhì)粒混合物的體積為5-15pl。在顯微注射時(shí)，質(zhì)粒的濃度直接影響了切 割的效率，當(dāng)濃度太高時(shí)會(huì)給受精卵造成過重的代謝負(fù)擔(dān)，進(jìn)而影響受精卵的成活率;而當(dāng) 質(zhì)粒濃度太低時(shí)，會(huì)影響祀基因的切割效率，最終影響性別控制的效果。
[0021] 根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種哺乳動(dòng)物性別控制方法的應(yīng)用，該方法能 夠應(yīng)用于后代動(dòng)物性別的控制，尤其是在生產(chǎn)上大規(guī)模應(yīng)用該方法來提高生產(chǎn)效率。同時(shí)， 該方法還能用于疾病的預(yù)防與治療，尤其是伴性遺傳疾病的預(yù)防與治療。
【附圖說明】
[0022] 圖1為pU6-sgRNA空載體的雙酶切電泳結(jié)果圖，圖中M為化15000DNA maker;l為 pU6-sgRNA空載體質(zhì)粒，2為抓Si單酶切產(chǎn)物。
[0023] 圖2為pU6-sgRNA空載體、pU6-sgRNAl至pU6-sgRNA6表達(dá)載體測(cè)序結(jié)果。
[0024] 圖3為pT7-s排NA空載體雙酶切電泳結(jié)果圖，圖中M為DL15000DNA maker，1為pT7-SgRNA空載體質(zhì)粒，2為抓Si單酶切產(chǎn)物。
[0025] 圖4為pT7-sgRNA空載體、pT7-sgRNAl至pT7-sgRNA6表達(dá)載體測(cè)序結(jié)果。
[00%]圖5為pT7-Cas9載體線性化電泳結(jié)果，Ml為DL15 OOODNA maker,M2為DLlO OOODNA maker，1為超螺旋的pT7-Cas9質(zhì)粒，2為線性化的pT7-Cas9質(zhì)粒。
[0027] 圖6為SgRNA的體外轉(zhuǎn)錄模板電泳結(jié)果，圖中M為化500DNA maker, 1-6分別為 SgRNAl至SgRNAe體外轉(zhuǎn)錄模板，7為空載體擴(kuò)增對(duì)照。
[0028] 圖7為化s9mRNA的體外轉(zhuǎn)錄電泳結(jié)果，圖中M為化5000DNA Markera和2為加尾前 的Cas9mRNA，3和4為加尾后的Cas9mRNA。
[0029] 圖8為SgRNA的體外轉(zhuǎn)錄電泳結(jié)果，圖中M為化500DNA Marker, 1-6分別代表體外轉(zhuǎn) 錄出的SgRNAl 至 SgRNAe。
[0030] 圖9為不同祀載體的測(cè)序結(jié)果圖。
[0031] 圖10為pGCS祀載體與pU6-sgRNAl至pU6-sgRNA6、地Cas9共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞OFP巧光效 果圖（100 X )，圖中A為各祀載體與地化s9共轉(zhuǎn)染組，B為各祀載體與對(duì)應(yīng)pU6-sgRNA載體及 地Cas9共轉(zhuǎn)染組，1-6為pU6-sgRNAl至pU6-sgRNA6的載體。
[0032] 圖11為祀GFFP祀載體與pU6-sgRNAl至pU6-sgRNA6、地Cas9共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞巧光效 果圖。
[0033] 圖12為流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)293細(xì)胞巧光比例結(jié)果圖，圖中B為空白對(duì)照組，NC為陰性 對(duì)照組，1-6為祀GFFP載體、phCas9與pU6-s曲NAl至pU6-s曲NA6共轉(zhuǎn)染組，P為祀GFP-Nl陰性 轉(zhuǎn)染對(duì)照組。
[0034] 圖13為不同處理組細(xì)胞巧光效率的比較結(jié)果圖，圖中B為空白對(duì)照組，NC為陰性對(duì) 照組，1-6為祀GFFP載體、phCas9與pU6-s曲NAl至pU6-s曲NA6共轉(zhuǎn)染組，P為祀GFP-Nl陰性轉(zhuǎn) 染對(duì)照組。**表示與NC相比差異極顯著(P<0.0 l)。
[0035] 圖14為不同處理組平均巧光強(qiáng)度值的比較結(jié)果圖，圖中B為空白對(duì)照組，NC為陰性 對(duì)照組，1-6為祀GFFP載體、phCas9與pU6-s曲NAl至pU6-s曲NA6共轉(zhuǎn)染組，P為祀GFP-Nl陰性 轉(zhuǎn)染對(duì)照組。**表示與NC相比差異極顯著(P<0.0 l)。
[0036] 圖15為不同SgRNA對(duì)祀載體pEGFFP的切割效果電泳結(jié)果圖，圖中M為 DNAlOOOOMarker，P為祀載體pEGFFP，1-6為SgRNAl至S排NA6與Cas9酶切結(jié)果，L為線性化 祀GFFP載體。
[0037] 圖16為不同SgRNA對(duì)各祀片段切割效果電泳結(jié)果圖，圖中M為DNA 5(K)bp Marker,A 為祀片段+Cas9蛋白，B為祀片段+sgRNA(l-6)+Cas9蛋白，1-6為SgRNAl至sgRNA6。
【具體實(shí)施方式】
[0038] 下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。
[0039] pU6-sgRNA空載體、pT7-sgRNA空載體、pT7-Cas9空載體、phCas9載體和pGCS空載體 來源于中國科學(xué)院廣州醫(yī)藥與健康中屯、;pEGFP空載體基因序列來源于GenBank accession number:U55762.1，該載體購買于寶生物工程(大連)有限公司。
[0040] 1、應(yīng)用CRISPR/tas9系統(tǒng)切割小鼠 Y染色體祀位點(diǎn)的選擇
[0041 ]根據(jù)在線軟件化 ttps: //chopchop. rc. fas. harvard. edu/lndex. php)的預(yù)測(cè)結(jié)合 SgRNA的識(shí)別特點(diǎn)W及最少的脫祀概率，本實(shí)驗(yàn)挑選了 Y染色體多拷貝基因 Rbmy的6個(gè)祀位 點(diǎn)進(jìn)行切割檢測(cè)，祀位點(diǎn)的具體信息見下表1。
[0042]
[0043] 檢測(cè)CRI SPR/Cas9系統(tǒng)在各個(gè)祀位點(diǎn)處的切割效率，需要對(duì)祀位點(diǎn)附近DNA進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，目的片段在500bp左右且祀位點(diǎn)不能位于片段中央。設(shè)計(jì)突變檢測(cè)效率引物如下 表：
[0044]
[0045] 2、SgRNA表達(dá)載體的構(gòu)建
[0046] 2. lpU6-s曲NAl至pU6-s曲NA6表達(dá)載體的構(gòu)建
[0047] SgRNA真核表達(dá)載體骨架質(zhì)粒pU6-sgRNA含有2個(gè)化Si酶切位點(diǎn)，用化Si內(nèi)切酶進(jìn) 行單酶切，產(chǎn)生兩個(gè)粘性末端。結(jié)果表明pU6-sgRNA空載體可W經(jīng)化Si內(nèi)切酶酶切完全，可 用于后續(xù)與各退火DNA雙鏈進(jìn)行連接，結(jié)果見附圖1。
[004引表3為設(shè)計(jì)合成的各祀位點(diǎn)退火DNA雙鏈序列，兩端分別帶有不同的粘性末端。
[0049]
[0050] 將線性化后的pU6-sgRNA空載體與各祀位點(diǎn)合成的退火DNA雙鏈化6-sgRNAl至U6-sgRNA6)進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化、涂板，挑取陽性單克隆進(jìn)行測(cè)序，驗(yàn)證載體構(gòu)建的準(zhǔn)確性。由測(cè)序 結(jié)果可知，針對(duì)各祀位點(diǎn)的pU6-sgRNAl至pU6-sgRNA6真核表達(dá)載體序列符合設(shè)計(jì)序列，可 W用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見附圖2。
[0化1 ] 2.2pT7-sgRNAl至pT7-sgRNA6載體的酶切與驗(yàn)證
[0052] SgRNA原核表達(dá)載體骨架質(zhì)粒pT7-sgRNA含有2個(gè)化Si酶切位點(diǎn)，用化Si內(nèi)切酶進(jìn) 行單酶切，產(chǎn)生兩個(gè)粘性末端。結(jié)果表明pT7-sgRNA空載體可W經(jīng)化Si內(nèi)切酶酶切完全，可 用于后續(xù)與各退火DNA雙鏈進(jìn)行連接，結(jié)果見附圖3。
[0053] 表4為設(shè)計(jì)合成的各祀位點(diǎn)退火DNA雙鏈序列，兩端分別帶有不同的粘性末端。
[0化4]
[0055] 將線性化后的pT7-sgRNA空載體與各祀位點(diǎn)合成的退火DNA雙鏈(T7-sgRNAl至T7- sgRNA6)進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化、涂板，挑取陽性單克隆進(jìn)行測(cè)序，驗(yàn)證載體構(gòu)建的準(zhǔn)確性。由測(cè)序 結(jié)果可知，針對(duì)各祀位點(diǎn)的pT7-sgRNAl至pT7-sgRNA6原核表達(dá)載體序列符合設(shè)計(jì)序列，可 W用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見附圖4。
[0化6] 3、化s9mRNA及SgRNA的體外轉(zhuǎn)錄
[0057] (1)體外轉(zhuǎn)錄模板的制備
[0化引用MssI內(nèi)切酶線性化由T7啟動(dòng)子啟動(dòng)表達(dá)化s9的載體pT7-化s9,線性化pT7-化s9 載體電泳結(jié)果見附圖5,切膠回收后用于Cas9mRNA體外轉(zhuǎn)錄模板，SgRNA體外轉(zhuǎn)錄模板由 pT7-sgRNA經(jīng)PCR擴(kuò)增得到，結(jié)果見附圖6。
[0059] (2)體外轉(zhuǎn)錄
[0060] 根據(jù)肥B公司的T7Quick High Yield RNA Syntheis Kit體外轉(zhuǎn)錄試劑盒方法對(duì) Cas9mRNA及SgRNA進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。SgRNAl至sgRNA6體外轉(zhuǎn)錄模板由pT7-sgRNAl至pT7-sgRNA6經(jīng)PCR擴(kuò)增得到，SgRNAl至sgRNA6序列表見表5,由于Cas9mRNA要經(jīng)過體外加尾的過 程才能在細(xì)胞內(nèi)翻譯蛋白，故對(duì)化s9體外轉(zhuǎn)錄要有加 polyA尾的過程，而SgRNA不需要翻譯 蛋白，不必進(jìn)行加尾操作。轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)電泳分析條帶完整，經(jīng)測(cè)定其濃度均在1000 ngAiLW 上，分裝后于-80°C保存?zhèn)溆?，電泳檢測(cè)結(jié)果見附圖7和附圖8<Xas9mRNA可用于真核細(xì)胞的 轉(zhuǎn)染及受精卵的顯微注射，SgRNA轉(zhuǎn)錄序列既可配合化s9mRNA在真核細(xì)胞及胚胎內(nèi)發(fā)揮作 用，又可W在與Cas9蛋白結(jié)合形成特異的人工核酸內(nèi)切酶。
[0061]
[0062] 4、祀載體與pU6-sgRNAl至pU6-sgRNA6、地Cas9載體共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞篩選最有效的 pU6-sgRNA表達(dá)載體
[0063] (1)祀載體的構(gòu)建
[0064] 根據(jù)選定的祀位點(diǎn)，設(shè)計(jì)合成相應(yīng)的DNA退火雙鏈，兩端加上粘性末端，序列信息 如下表6。
[00 化]
[0066]
[0067]將DNA退火雙鏈與pGCS空載體連接，轉(zhuǎn)化后挑取陽性單克隆進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明各 祀位序列均構(gòu)建到空載體中形成相應(yīng)的pGCS祀載體，序列信息與設(shè)計(jì)相符，可用于后續(xù)試 驗(yàn)，結(jié)果見附圖9。
[006引 （2)pGCS祀載體與pU6-s曲NAl至pU6-s曲NA6、地Cas9共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞
[0069] pGCS載體帶有不完整的澄色巧光蛋白（Orange Fluorescent Protein，0FP)序列， 祀序列位于OFP序列中間，正常情況下pGCS轉(zhuǎn)染細(xì)胞不會(huì)有巧光信號(hào)。當(dāng)祀序列位置發(fā)生切 割突變時(shí)由于同源重組的作用PGCS中的OFP序列修復(fù)完整，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞可W檢測(cè)到巧光 信號(hào)。結(jié)果表明當(dāng)祀載體與地化s9共轉(zhuǎn)染29始田胞時(shí)，檢測(cè)不到OFP的巧光信號(hào)，當(dāng)加入pU6-sgRNA(l-6)時(shí)CRISPR/Cas9系統(tǒng)在祀序列處發(fā)生切割，能夠檢測(cè)到微弱的OFP巧光信號(hào)，結(jié) 果見附圖10。
[0070] (3)pEGFP祀載體與pU6-s曲NAl至pU6-s曲NA6、地Cas9共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞
[0071] 設(shè)計(jì)合成祀載體祀GFP，使不同的祀序列連接在位于EGFP基因序列的中間。正常情 況下祀GFP轉(zhuǎn)染細(xì)胞會(huì)有微弱的巧光信號(hào)。當(dāng)祀序列位置發(fā)生切割突變時(shí)由于同源重組的 作用EGFP序列修復(fù)完整，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞可W檢測(cè)到較強(qiáng)的巧光信號(hào)。
[0072] 結(jié)果表明，當(dāng)祀載體祀GFP與地化s9共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞時(shí)，檢測(cè)到微弱的巧光信號(hào)，當(dāng) 加入pU6-sgRNA( 1-6)時(shí)CRISPR/化s9系統(tǒng)在祀序列處發(fā)生切割，能夠檢測(cè)到較強(qiáng)的EGFP巧 光信號(hào)。對(duì)轉(zhuǎn)染4她后的各組細(xì)胞進(jìn)行收集，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的巧光效率和平均 巧光強(qiáng)度值，結(jié)果見附圖11-附圖14。結(jié)果表明相對(duì)于僅有祀GFP和地化s9轉(zhuǎn)染的陰性對(duì)照 組，加入pU6-sgRNA(l-6)后各組細(xì)胞的巧光效率均高于對(duì)照組且平均巧光強(qiáng)度也高于對(duì)照 組。且加入pU6-sgRNA6時(shí)巧光效率接近陽性對(duì)照祀GFP-Nl轉(zhuǎn)染組，平均巧光強(qiáng)度高于陽性 對(duì)照組。說明6個(gè)pU6-sgRNA表達(dá)載體均能夠發(fā)生切割作用，且pU6-sgRNA6質(zhì)粒效果最好。
[0073] 5、不同SgRNA與化s9蛋白質(zhì)粒體外切割祀位點(diǎn)的效率
[0074] 將體外轉(zhuǎn)錄的SgRNAl至SgRNAe與化s9蛋白質(zhì)?；靹颍?7°C解育lOmin，使其形成一 種類似于限制性內(nèi)切酶的蛋白復(fù)合物，向復(fù)合物中加入50ng的含有SgRNA識(shí)別位點(diǎn)的DNA， 37°C反應(yīng)化后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，即可驗(yàn)證SgRNA在各自祀位點(diǎn)的切割效率。
[0075] (1)不同SgRNA對(duì)祀載體祀GFFP的切割效果
[0076] W祀載體祀GFFP為酶切反應(yīng)底物，分別加入相同含量的sgRNA(5化g)，37°C反應(yīng)化 后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。檢測(cè)結(jié)果表明，除了sgRNA2沒有明顯切割效果，其余SgRNAU sgRNA3、sgRNA4、SgRNAS及SgRNAe均有較好的切割效果，結(jié)果見附圖15。
[0077] (2)不同SgRNA對(duì)各祀片段切割效果
[007引 W雄鼠基因組DNA為模板，按照表2中列舉的引物序列擴(kuò)增含有不同祀位點(diǎn)在內(nèi)的 DNA祀片段，純化回收各祀片段后分別用不同SgRNA與化s9蛋白質(zhì)粒復(fù)合物進(jìn)行切割，37°C 反應(yīng)Ih后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果表明，SgRNAl至sgRNA6中，僅有sgRNA6對(duì)其祀片段有較 高的切割效率，灰度掃描結(jié)果顯示其切割效率能夠達(dá)到100%，且切割后的片段大小符合預(yù) 期。運(yùn)說明不同SgRNA對(duì)各祀序列切割效果并不一致，其中S排NA6有最佳切割效率，結(jié)果見 附圖16。
[0079] 6、注射pU6-sgRNA6與地化s9質(zhì)粒對(duì)出生小鼠性別比例的影響
[0080] 收集受精卵并將20ngAU的pU6-sgRNA6與50ng/山曲化s9質(zhì)粒混合物顯微注射入 受精卵的雄原核中，注射體積為IOpl,實(shí)驗(yàn)組共注射807個(gè)受精卵，對(duì)照組共注射801個(gè)受精 卵，注射完畢實(shí)驗(yàn)組共有746枚存活，存活率92.4%，對(duì)照組共有739枚存活，存活率92.3 %。 注射后的胚胎移植到假孕受體母鼠的輸卵管，采用雙側(cè)輸卵管移植手術(shù)，每側(cè)移植15個(gè)左 右的胚胎，實(shí)驗(yàn)組共移植27只受體母鼠，其中有22只成功妊娠并產(chǎn)下后代，共產(chǎn)下小鼠137 只，其中雌性小鼠83只，雄性小鼠54只。經(jīng)X2檢驗(yàn)與理論性別比例(33/33)相比差異顯著(P< 0.05)。對(duì)照組共移植26只受體母鼠，其中有23只成功妊娠并產(chǎn)下后代，共產(chǎn)下小鼠191只， 其中雌性小鼠98只，雄性小鼠93只。經(jīng)X2檢驗(yàn)與理論性別比例（33/33)相比差異不顯著(P〉 0.05)，結(jié)果如下表6:
[0081]
[0082]結(jié)果表明，當(dāng)采用pU6-sgRNA6與phCas9質(zhì)粒混合物顯微注射小鼠受精卵雄原核 后，將受精卵移植入代孕母鼠子宮內(nèi)，可W顯著降低出生小鼠的雄性比例。表明由pU6-SgRNAe與地化s9質(zhì)粒混合物組成的CRISPR/tas9系統(tǒng)可W特異性的切割Y精子內(nèi)Y染色體上 的Rbmy基因，最終使雄性受精卵無法發(fā)育成正常的雄性胚胎，最終來達(dá)到性別控制的目的。
[0083] 在其他實(shí)施例中，pU6-sgRNA6質(zhì)粒(表達(dá)載體)顯微注射的濃度還可W為lOng/山、 1 SngAU、30ngAU 或 SOngAU 等其他濃度。
[0084] 在其他實(shí)施例中，曲Cas9質(zhì)粒顯微注射的濃度還可W為25ngAU、40ng/山、75ng/ii 1或125ngAil等其他濃度。
[00化]在其他實(shí)施例中，pU6-sgRNA6質(zhì)粒(表達(dá)載體)與曲化s9質(zhì)?；旌衔镲@微注射的體 積還可W為5pl、8pl或15pl等其他體積。
[0086] 在其他實(shí)施例中，動(dòng)物不僅限于小鼠，還包括豬、牛、羊等其他的動(dòng)物。
[0087] 在其他實(shí)施例中，染色體編輯不僅限于CRISPR/Cas9系統(tǒng)特異性地切割，還包括 RNA干擾、同源重組、基因敲出及插入等其他能對(duì)基因進(jìn)行編輯的技術(shù)。
[0088] 在其他實(shí)施例中，Y染色體上的基因編輯的祀基因不僅限于肺my基因，還可W為其 他任何基因。
[0089] W上所述的僅是本發(fā)明的一些實(shí)施方式。對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不 脫離本發(fā)明創(chuàng)造構(gòu)思的前提下，還可W做出若干變形和改進(jìn)，運(yùn)些都屬于發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種基于對(duì)Rbmy基因進(jìn)行編輯來實(shí)現(xiàn)動(dòng)物性別控制的方法，其特征在于，所述方法 是通過利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)特異性地切割Y染色體上的Rbmy基因來實(shí)現(xiàn)動(dòng)物性別控制的。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于對(duì)Rbmy基因進(jìn)行編輯來實(shí)現(xiàn)動(dòng)物性別控制的方法，其特 征在于，所述的CRISPR/Cas9系統(tǒng)特異性地切割Rbmy基因的靶位點(diǎn)基因序列如SEQ ID N0:6 所示。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的基于對(duì)Rbmy基因進(jìn)行編輯來實(shí)現(xiàn)動(dòng)物性別控制的方法，其 特征在于，所述方法包括如下步驟： 1) 選擇Rbmy革E1基因上的革E1位點(diǎn)； 2) 根據(jù)靶位點(diǎn)基因序列設(shè)計(jì)相應(yīng)的sgRNA表達(dá)載體及靶載體； 3) 將祀載體、sgRNA表達(dá)載體與phCas9質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染細(xì)胞，進(jìn)行體外檢測(cè)sgRNA表達(dá)載 體的切割效率； 4) 體外檢測(cè)篩選出有效的sgRNA表達(dá)載體； 5) 將篩選出的有效sgRNA表達(dá)載體與phCas9質(zhì)粒混合顯微注射入動(dòng)物受精卵的雄原核 中； 6) 對(duì)處理后的受精卵進(jìn)行胚胎移植至代孕雌性動(dòng)物子宮內(nèi)。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的基于對(duì)Rbmy基因進(jìn)行編輯來實(shí)現(xiàn)動(dòng)物性別控制的方法，其特 征在于，所述的有效sgRNA表達(dá)載體為pU6-sgRNA6表達(dá)載體，所述的pU6-sgRNA6表達(dá)載體包 含如SEQ ID NO: 17和SEQ ID NO: 18所示的序列。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的基于對(duì)Rbmy基因進(jìn)行編輯來實(shí)現(xiàn)動(dòng)物性別控制的方法，其特 征在于，所述的pU6-sgRNA6表達(dá)載體顯微注射入動(dòng)物受精卵雄原核的濃度為10-50ngAU。6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的基于對(duì)Rbmy基因進(jìn)行編輯來實(shí)現(xiàn)動(dòng)物性別控制的方法，其特 征在于，所述的phCas9質(zhì)粒顯微注射入動(dòng)物受精卵雄原核的濃度為25-125ng/yl。7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的基于對(duì)Rbmy基因進(jìn)行編輯來實(shí)現(xiàn)動(dòng)物性別控制的方法，其特 征在于，所述注射入動(dòng)物受精卵雄原核的pU6-sgRNA6表達(dá)載體與phCas9質(zhì)?；旌衔锏捏w積 為5-15pl〇8. -種基于對(duì)Rbmy基因進(jìn)行編輯來實(shí)現(xiàn)動(dòng)物性別控制方法的應(yīng)用，其特征在于，所述 的方法能夠應(yīng)用于后代動(dòng)物性別的控制，尤其是在生產(chǎn)上大規(guī)模應(yīng)用所述方法來提高特定 性別動(dòng)物的出生率，進(jìn)而提高生產(chǎn)效率。
【文檔編號(hào)】C12N15/877GK105861554SQ201610307611
【公開日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2016年5月10日
【發(fā)明人】吳珍芳, 李紫聰, 楊曉峰, 李崇, 劉德武, 蔡更元
【申請(qǐng)人】華南農(nóng)業(yè)大學(xué)