一種痘苗病毒穿梭載體及其制備方法和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種痘苗病毒穿梭載體，含有根據(jù)胸苷激酶基因TK及其上下游序列設(shè)計的同源重組臂TKL和TKR，在TKL和TKR之間存在兩個多克隆位點(diǎn)，分別由P11和P7.5啟動子啟動基因表達(dá)，所述穿梭載體含有大腸桿菌復(fù)制起始位點(diǎn)pUC ori和氨芐青霉素抗性篩選標(biāo)記，該穿梭載體的核苷酸序列如序列1所示。本發(fā)明提供的痘苗病毒穿梭載體以胸苷激酶TK基因作為減毒目標(biāo)，同時又作為篩選標(biāo)記，既可用于篩選重組痘苗病毒，又去除了痘苗病毒的TK基因，降低了病毒毒性。
【專利說明】
-種痘苗病毒穿梭載體及其制備方法和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物基因工程領(lǐng)域，具體設(shè)及一種痘苗病毒穿梭載體，本發(fā)明還設(shè)及 該穿梭載體的制備方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 天花是迄今為止，人類在世界范圍內(nèi)利用疫苗運(yùn)一免疫手段成功根除的唯一一種 疾病。痘苗病毒(vaccinia virus,VACV)作為人類消滅天花的疫苗，在人體的應(yīng)用長達(dá)一個 多世紀(jì)，其安全性和有效性已經(jīng)在實踐中被充分驗證。
[0003] 痘苗病毒屬于痘病毒科，正痘病毒屬，是一種有包膜的雙鏈DNA病毒，其基因組長 達(dá)200kbp。作為疫苗的載體或溶瘤病毒，相比其他病毒載體如逆轉(zhuǎn)錄病毒、人單純瘤疹病毒 和腺病毒等，痘苗病毒具有很多獨(dú)特的優(yōu)勢，包括:1)安全性高，病毒DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄全部在 細(xì)胞質(zhì)中完成，運(yùn)就排除了基因組DNA整合到人染色體的可能性，增強(qiáng)了其作為疫苗載體的 安全性;2)病毒本身的基因組大，可插入較大的外源基因而仍具有感染性;3)重組病毒構(gòu)建 相對簡單，不需要輔助病毒或包裝細(xì)胞;4)依靠自身啟動子，能夠高效表達(dá)外源蛋白，有效 地加工表達(dá)產(chǎn)物;5)宿主范圍廣;6)免疫原性高，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生良好的免疫反應(yīng);7)費(fèi) 用低廉，凍干保存效價穩(wěn)定。
[0004] 痘苗病毒作為第一個成功應(yīng)用于人類的疫苗，引起了長時間普遍的關(guān)注和研究， 生物醫(yī)學(xué)工作者對痘苗病毒的生物學(xué)特性、致病性、免疫性等諸多方面已有了較為透徹的 了解。近年來，國外一些學(xué)者致力于將痘苗病毒應(yīng)用于腫瘤的生物治療，其中一些研究已取 得較大突破，部分產(chǎn)品已進(jìn)入二期臨床。目前，全球仍有很多W重組痘苗病毒為生物制劑的 研究處于醫(yī)學(xué)臨床試驗階段，設(shè)及癌癥、艾滋病、肝炎和追疾等多種疾病的預(yù)防和治療。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種痘苗病毒穿梭載體，該載體可插入兩種外源基因。
[0006] 本發(fā)明的另一個目的是提供一種痘苗病毒穿梭載體的制備方法。
[0007] 本發(fā)明的第=個目的是提供一種痘苗病毒穿梭載體的應(yīng)用及其方法，即采用該痘 苗病毒穿梭載體制備重組痘苗病毒，W胸巧激酶TK基因作為減毒目標(biāo)和篩選標(biāo)記。
[0008] 本發(fā)明所采用的第一個技術(shù)方案是，一種痘苗病毒穿梭載體，含有根據(jù)胸巧激酶 基因 TK及其上下游序列設(shè)計的同源重組臂TKL和TKR，在TKL和TKR之間存在兩個多克隆位 點(diǎn)，分別由Pll和P7.5啟動子啟動基因表達(dá)，所述穿梭載體含有大腸桿菌復(fù)制起始位點(diǎn)pUC ori和氨節(jié)青霉素抗性篩選標(biāo)記，該穿梭載體的核巧酸序列如序列1所示。
[0009] 本發(fā)明的特點(diǎn)還在于，
[0010] 該穿梭載體的出發(fā)載體為PCDNA3.1 ( + )。
[0011] 本發(fā)明所采用的第二個技術(shù)方案是，一種痘苗病毒穿梭載體的制備方法，具體按 照W下步驟實施：
[0012] S1、根據(jù)野生型WR株痘苗病毒的TK基因及其上下游序列，設(shè)計引物，W病毒基因組 為模板，PCR獲得TK基因的左右臂同源序列TKL和TKR;
[001引S2、將獲得的TKL和TKR分另帷接至載體PCDNA3.1 ( + )中，獲得中間質(zhì)粒pcTKLR; [0014] S3、人工設(shè)計并合成含有痘苗病毒Pll和P7.5啟動子序列及兩個多克隆位點(diǎn)的序 列，即MCS序列。通過酶切連接的方法，連接至質(zhì)粒pcTKLR中，獲得中間質(zhì)粒pcTKLRS;
[00巧]S4、經(jīng)過酶切連接，去掉pcTKLRS質(zhì)粒中不相關(guān)的序列，最終獲得穿梭載體PCTK2。
[0016] 本發(fā)明所采用的第=個技術(shù)方案是，痘苗病毒穿梭載體的應(yīng)用，采用痘苗病毒穿 梭載體制備重組痘苗病毒的方法，包括步驟：
[0017] S5，穿梭載體與野生型痘苗病毒在CV-I細(xì)胞內(nèi)重組；
[001引具體步驟為：
[0019] 1)在T25培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)CV-I單層細(xì)胞，至80%覆蓋；
[0020] 2)用野生型痘苗病毒感染CV-I細(xì)胞；
[0021] 3)采用脂質(zhì)體法將穿梭載體質(zhì)粒PCTK2轉(zhuǎn)染至感染細(xì)胞，野生型痘苗病毒與PCTK2 在TK基因左右側(cè)位置發(fā)生同源重組；
[0022] 4)48小時后，收集病毒；
[0023] S6,篩選獲得重組病毒VACV-TK-;
[0024] 具體步驟為：
[0025] 1)在6孔板中培養(yǎng)143TIT細(xì)胞，至80 %覆蓋；
[0026] 2)采用步驟S5中的病毒感染143TK-細(xì)胞，并覆蓋瓊脂培養(yǎng)基；
[0027] 3) 3天后挑取孤立病毒隧斑，進(jìn)行進(jìn)一步篩選，連續(xù)單斑篩選5代；
[0028] S7,對重組病毒進(jìn)行PCR及測序鑒定，并進(jìn)行體外增殖和純化；
[00巧]具體步驟為：
[0030] 1 )PCR和基因測序進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定；
[0031] 2)鑒定無誤后，進(jìn)行重組病毒的體外增殖；
[0032] 3)將最終收獲的重組病毒采用密度梯度離屯、純化，保存于-80°C。
[0033] 通過穿梭載體制備表達(dá)兩種外源基因的重組痘苗病毒，具體步驟為，將痘苗病毒 穿梭載體PCTK2的兩個表達(dá)盒插入外源基因，即在啟動子Pll和P7.5后分別插入EGFP基因和 Lac Z基因，構(gòu)建了驗證穿梭載體pcTKEZ，W此制備重組痘苗病毒，結(jié)果兩個外源基因均能 在痘苗病毒中正常表達(dá)，表明穿梭載體構(gòu)建成功，且提供了一種可表達(dá)外源基因的重組痘 苗病毒，該病毒可作為疫苗和基因治療的載體。
[0034] 本發(fā)明的有益效果是，
[0035] (1)本發(fā)明提供的痘苗病毒穿梭載體用于制備重組痘苗病毒，W胸巧激酶TK基因 作為減毒目標(biāo)，同時又作為篩選標(biāo)記，既可用于篩選重組痘苗病毒，又去除了痘苗病毒TK基 因，降低了病毒毒性。
[0036] (2)本發(fā)明提供的痘苗病毒穿梭載體包含早/晚期啟動子和晚期啟動子，根據(jù)表達(dá) 時間的早晚，可滿足不同外源基因表達(dá)量不同的需求。
[0037] (3)本發(fā)明提供的痘苗病毒穿梭載體為W痘苗病毒為載體的活疫苗研發(fā)和基因治 療提供了重要工具。
【附圖說明】
[0038] 圖I為本發(fā)明中穿梭載體pcTK2的構(gòu)建步驟；
[0039] 圖2為本發(fā)明中驗證穿梭載體pcTKEZ示意圖；
[0040] 圖3為本發(fā)明中重組痘苗病毒EGFP基因 PCR圖，1號為重組痘苗病毒(738bp)，2號為 陰性對照VACV-WR，DNA Marker為Marker III;
[0041] 圖4為本發(fā)明中重組痘苗病毒LacZ基因部分片段PCR圖，1號為重組痘苗病毒 (2024bp)，2號為陰性對照VACV-WR，DNA Marker為Marker III;
[0042] 圖5為本發(fā)明中重組痘苗病毒表達(dá)EGFP產(chǎn)生的綠色巧光蛋白，A為重組痘苗病毒，B 為陰性對照VACV-WR;
[0043] 圖6為本發(fā)明中重組病毒在CV-I細(xì)胞中的生長曲線；
[0044] 圖7為本發(fā)明中重組病毒在Vero細(xì)胞中的生長曲線。
【具體實施方式】
[0045] 下面結(jié)合附圖和【具體實施方式】對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0046] 為了使本發(fā)明的目的及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，W下結(jié)合實施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步 詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅僅用W解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā) 明。
[0047] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0048] 下述實施例中所使用的材料、試劑，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。
[0049] 在本發(fā)明的實例中，野生痘苗病毒為野生型WR株痘苗病毒，野生型WR株痘苗病毒 的基因組DNA序列為GenBank號為AY243312.1 的序列（VRL 14-MAR-2006)。
[0050] W下實施例中的野生型痘苗病毒W(wǎng)R株在西安醫(yī)學(xué)院分子病毒與病毒免疫學(xué)實驗 室(本實驗室，下同）保藏。質(zhì)粒PCDNA3.1 ( + )由本實驗室保藏。質(zhì)粒pEGFP-Nl和pSV-lacZ購 自Clontech公司，細(xì)胞系CV-I ,Vero和134TK-均購自中國典型培養(yǎng)物保藏中屯、。
[0化1] 主要試劑和材料：
[0化2] DMEM，胎牛血清，脂質(zhì)體Qipofectamine 2000)轉(zhuǎn)染試劑均購自Invitrogen公司， Q5高保真聚合酶、限制性內(nèi)切酶及T4DNA連接酶均購自肥B公司，病毒基因組提取試劑盒購 自Biomiga公司，質(zhì)粒提取試劑盒和膠回收試劑盒購自AXYGEN公司。
[0053]實施例1、質(zhì)粒pcTK-2的構(gòu)建及鑒定(如圖1所示）
[0化4] 將野生痘苗病毒W(wǎng)R株的基因組DNA序列的第80269-80996位(對應(yīng)序列2的1-728 位，命名為上游同源右臂TKL)和第81029-81938位(對應(yīng)序列3的1-910位，命名為下游同源 左臂TKR)，分別克隆至PCDNA3.U + )質(zhì)粒，得到含有TK重組臂的pcTKLR質(zhì)粒，進(jìn)而將人工合 成的含有多克隆位點(diǎn)的啟動子表達(dá)盒連接到pcTKLR質(zhì)粒的TKL與TKR之間，得到中間質(zhì)粒 pcTKLRS，然后經(jīng)酶切連接，去掉pcTKLRS中不相關(guān)的序列，獲得目的質(zhì)粒PCTK2。
[0化日]具體操作如下：
[0化6] 步驟1.野生型痘苗病毒W(wǎng)R株基因組DNA提取
[0化7] (1)取-8(TC凍存的野生型痘苗病毒20化1，4。(：解凍。
[0化引 （2)加入等體積的PLY buffer,縱滿混勻，室溫放置15分鐘。
[0059] (3)加入0.5倍體積的無水乙醇，移液器混勻。
[0060] (4)轉(zhuǎn)移裂解液至吸附柱中，13000rpm離屯、1分鐘，將過濾柱轉(zhuǎn)移至一個新的收集 管中。
[0061 ] (5)向過濾柱中加入65化1 Wash buffer,13000巧m離屯、I分鐘，棄廢液。
[0062] (6)重復(fù)洗一次，棄廢液。
[0063] (7)將過濾柱放入收集管中1300化pm離屯、2分鐘W去除殘留的乙醇。
[0064] (8)過濾柱放入新的收集管中，向過濾柱中加入30-5化1 DEPC水，室溫靜置3分鐘。 [00化](9)13000巧111離屯、1分鐘，洗脫0臟。
[0066] (10)野生型痘苗病毒基因組DNA放置于-20°C備用。
[0067] 步驟2.引物設(shè)計與合成
[0068] 根據(jù)野生型痘苗病毒W(wǎng)R株的基因組DNA序列設(shè)計并合成如下兩對引物：
[0069] 擴(kuò)增TK上游同源臂的引物對：
[0070] TKkFl: 5 ' -CCCAAGCTTAACGATGTTCTTCGCAG-3 '（下劃線之前部分為保護(hù)堿基，下劃 線部分為化ndIII酶切位點(diǎn)識別序列，其后序列為GenBank:AY243312.1的第80269-80285 位，即序列2的第1-17位）
[0071] TKkRl: 5 ' -CCGAATTCAACAATGTCTGGAAAGAACTG-3 '（下劃線之前部分為保護(hù)堿基， 下劃線部分為EcoRI酶切位點(diǎn)識別序列，其后序列為GenBank:AY243312.1的80976-80996位 的反向互補(bǔ)序列，即序列2的第708-728位的反向互補(bǔ)序列）。
[0072] 擴(kuò)增TK下游同源臂的引物對：
[0073] TKR-Fl: 5 ' -TCCCCCCGGGAATAGTTATAGTAGCCGCACTC-3 '（下劃線之前部分為保護(hù)堿 基，下劃線部分為XmaI酶切位點(diǎn)識別序列，其后序列為GenBank: AY243312.1的第81029-81050位，即序列3的第1-22位）
[0074] TKR-Rl ： 5'-TATGGCGCCCTGAATATGAAGGAGCAAAAG-3'（下劃線之前部分為保護(hù)堿基， 下劃線部分為KasI酶切位點(diǎn)識別序列，其后序列為GenBank:AY243312.1的第81918-81938 位的反向互補(bǔ)序列，即序列3的第890-910位的反向互補(bǔ)序列）；
[00"7日]去除不相關(guān)序列，保留Bla promoter-pUC origin片段的引物對：
[0076] P-Fl: 5 ' -TATGGCGCCGGCGTAATCATGGTCATAGCTG-3 '（下劃線之前部分為保護(hù)堿基， 下劃線部分為KasI酶切位點(diǎn)識別序列，其后序列為PCDNA3.U + )質(zhì)粒的第3262-3282位）
[0077] P-Rl: 5 ' -CCCAAGCTTCACTACTCAGCGACCTCCAAC-3 '（下劃線之前部分為保護(hù)堿基，下 劃線部分為化ndin酶切位點(diǎn)識別序列，其后序列為PCDNA3.U + )質(zhì)粒的第98-118位的反向 互補(bǔ)序列）
[0078] 步驟3.含多克隆位點(diǎn)的表達(dá)盒的人工設(shè)計與合成：
[0079] 選擇痘苗病毒早期啟動子Pll和晚期啟動子P7.5,并篩選合適的多克隆位點(diǎn)，多克 隆位點(diǎn)位于啟動子之后，在兩啟動子之間設(shè)計連接片段，使兩啟動子保持距離，該人工序列 在5'端和3'端的酶切位點(diǎn)分別為趾Ol和XmaK將設(shè)計的人工序列送華大基因公司進(jìn)行合 成。合成序列見序列4。
[0080] 步驟4.穿梭質(zhì)粒PCTK2的構(gòu)建及鑒定
[0081] (I)W步驟1中野生型痘苗病毒基因組DNA為模板，W步驟2中合成的TK上下游同源 臂引物對T化斗1、1'化-1?1和1'邸斗1、1'邸-1?1分別進(jìn)行?0?，獲得帶有相應(yīng)酶切位點(diǎn)的11(上下 游同源臂TKL和TKR。
[0082] PCR反應(yīng)體系為:DNA化l，dNTP mix(lOmM)化1，正向引物F(l〇yM)2.扣1，反向引物 R( lOiiM)2.5iU，5 X Q5buff er 1化1，Q5聚合酶O.化1，加 DEPC水至總體積50iU。
[0083] PCR反應(yīng)條件為:98°C預(yù)變性30s;98°C變性10s，58°C退火30s，72°C延伸30秒，循環(huán) 30次;72°C延伸2分鐘，最后置于4°C;
[0084] PCR結(jié)果:PCR產(chǎn)物上樣電泳，TKL為74化P，TKR為929bp，切膠回收目的條帶。
[0085] (2)首先用限制性內(nèi)切酶化ndin和EcoRI對上游同源臂TKL進(jìn)行雙酶切，與經(jīng)同樣 雙酶切的PCDNA3.U + )質(zhì)粒的大片段進(jìn)行連接，得到中間質(zhì)粒pcTKL，接著用限制性內(nèi)切酶 XmaI和KasI對下游同源臂TKR進(jìn)行雙酶切，與經(jīng)同樣雙酶切的中間質(zhì)粒pcTKL的大片段進(jìn)行 連接，得到中間質(zhì)粒pcTKLR。
[0086] (3)用限制性內(nèi)切酶Xho I和Xma I對步驟3中設(shè)計合成的含多克隆位點(diǎn)表達(dá)盒的人 工序列進(jìn)行雙酶切，與經(jīng)同樣雙酶切的中間質(zhì)粒pcTKLR的大片段進(jìn)行連接，得到中間質(zhì)粒 pcTKLRSo
[0087] (4)WpcDNA3.1( + )質(zhì)粒DNA為模板，W步驟2中合成的用于去除不相關(guān)序列、保留 Bla promoter-pUC origin片段的引物對P-FUP-Rl進(jìn)行PCR，獲得帶有相應(yīng)酶切位點(diǎn)的Bla promoter-pUC origin片段。
[008引 PCR反應(yīng)體系為:DNA化l，dNTP mix(lOmM)化1，正向引物F(l0yM)2.扣1，反向引物 R( IOiiM)2.5iU，5 X Q5buff er 1化1，Q5聚合酶0.化1，加 DEPC水至總體積50iU。
[0089] PCR反應(yīng)條件為:98°C預(yù)變性30s;98°C變性10s，58°C退火30s，72°C延伸70秒，循環(huán) 30次;72°C延伸2分鐘，最后置于4°C;
[0090] PCR結(jié)果:PCR產(chǎn)物上樣電泳，片段大小為2303bp，切膠回收目的條帶。
[0091] (5)用限制性內(nèi)切酶KasI和化ndin對上述基因片段進(jìn)行雙酶切，與經(jīng)同樣雙酶切 的中間質(zhì)粒pcTKLRS的小片段進(jìn)行連接，獲得目的質(zhì)粒。經(jīng)酶切和測序鑒定無誤后，得到穿 梭質(zhì)粒，命名為PCTK2。
[0092] 實施例2、構(gòu)建驗證穿梭載體pcTKEZ
[0093] 為驗證穿梭載體的有效性，將兩個表達(dá)盒插入了外源基因進(jìn)行表達(dá)驗證，在啟動 子P7.5和Pll后分別插入EGFP基因（增強(qiáng)型綠色巧光蛋白基因，序列5)和Lac Z基因（0-半 乳糖巧酶基因，序列6)，步驟如下：
[0094] 1.用限制性內(nèi)切酶BamH巧日XbaI對pEGFP-Nl進(jìn)行雙酶切，回收75化P片段，與經(jīng)同 樣雙酶切的穿梭質(zhì)粒PCTK2的4327bp片段進(jìn)行連接，將EGFP插入到PCTK2的P7.5啟動子之 后，獲得中間質(zhì)粒pcTKE。
[00巧]2. WpSV-IacZ質(zhì)粒的DNA序列為模板，擴(kuò)增IacZ基因，引物如下：
[0096] LacZ-Fl: 5 ' -CCGCTCGAGGAGATGGATCCCGTCGTTTTAC-3 '（下劃線之前部分為保護(hù)堿 基，下劃線部分為化Ol酶切位點(diǎn)識別序列，其后序列為pSV-lacZ質(zhì)粒的第698-719位）
[0097] LacZ-Rl: 5 ' -AACTGCAGCTTACGCGAAATACGGGCAG-3 '（下劃線之前部分為保護(hù)堿基， 下劃線部分為PstI酶切位點(diǎn)識別序列，其后序列為pSV-lacZ質(zhì)粒的第3779-3798位）
[009引 PCR反應(yīng)體系為:DNA化l，dNTP mix(lOmM)化1，正向引物F(l0yM)2.扣1，反向引物 R( IOiiM)2.5iU，5 X Q5buff er 1化1，Q5聚合酶0.化1，加 DEPC水至總體積50iU ;
[0099] PCR反應(yīng)條件為:98°C預(yù)變性30s;98°C變性10s，58°C退火30s，72°C延伸100秒，循 環(huán)30次;72°C延伸2分鐘，最后置于4°C ;
[0100] PCR結(jié)果:PCR產(chǎn)物上樣電泳，片段大小為3118bp，切膠回收目的條帶。
[0101] 用限制性內(nèi)切酶BamHI和XbaI對上述片段進(jìn)行雙酶切，與經(jīng)同樣雙酶切的中間質(zhì) 粒pcTKE的大片段進(jìn)行連接，將EGFP插入到pcTKE的Pl 1啟動子之后，獲得目的質(zhì)粒。
[0102] 3.經(jīng)酶切和測序鑒定無誤后，得到驗證穿梭載體，命名為pcTKEZ，質(zhì)粒示意圖見圖 2。
[0103] 實施例3、痘苗病毒的重組，篩選與鑒定
[0104] 1.痘苗病毒重組
[0105] (1) WT25培養(yǎng)瓶培養(yǎng)CV-I細(xì)胞至80 %單層；
[0106] (2似0.05M0I感染野生型痘苗病毒，37°C培養(yǎng)2小時；
[0107] (3)去除病毒液，按照轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000說明書轉(zhuǎn)染pcTKEZ至感染細(xì) 胞中，培養(yǎng)48小時；
[0108] (4)收集細(xì)胞，反復(fù)凍融=次，進(jìn)行超聲破碎后，保存于-80°C。
[0109] 2.痘苗病毒的篩選
[0110] (1)用6孔板培養(yǎng)143TK-細(xì)胞至80 %單層；
[0111] (2)取經(jīng)超聲破碎后的病毒懸液，做倍比稀釋，感染143TIT細(xì)胞，37°C培養(yǎng)2小時；
[0112] (3)每孔覆蓋3ml含化加的瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行正向篩選，培養(yǎng)2天；
[0113] (4)每孔加入2ml含X-gal的上層瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜；
[0114] (5)在巧光顯微鏡下觀察病毒隧斑綠色巧光蛋白表達(dá)情況，同時觀察藍(lán)斑情況，挑 取孤立藍(lán)斑進(jìn)行進(jìn)一步篩選，連續(xù)單斑純化5代，至病毒純化。
[0115] 3.重組痘苗病毒的鑒定
[0116] 將上述經(jīng)多次單斑純化的重組痘苗病毒進(jìn)行小量增殖，然后提取重組痘苗病毒基 因組，方法如實施例1。對重組痘苗病毒進(jìn)行PCR鑒定和基因測序。
[0117] EGFP鑒定引物：
[0118] EGFP-Fl:5 '-TCCACCGGTCGCCACCATG-3 '
[0119] EGFP-Rl:5'-CTTTACTTGTACAGCTCGTC-3'
[0120] IacZ鑒定引物：
[0121] LacZ-Fl:5 '-TGTCGTCGTCCCCTCAAAC-3 '
[0122] LacZ-Rl:5 '-CCAACGCTTATTACCCAGCTCG-3 '
[0123] W上述提取的重組痘苗病毒的基因組DNA為模板，用上述2對鑒定引物分別進(jìn)行 PCR反應(yīng)，同時設(shè)置野生型VACV-WR為對照。
[0124] PCR反應(yīng)體系：
[0125]
[01 %] PCR反應(yīng)條件為:98 °C預(yù)變性30s; 98 °C變性IOs，58 °C退火30s，72°C延伸20秒或100 秒，循環(huán)30次;72 °C延伸2分鐘，最后置于4°C ;
[0127] PCR結(jié)果：產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳分析，EGFP基因：738bp，IacZ基因部分片段： 2024bp，觀察結(jié)果并回收目的片段，將回收的目的片段送測序。
[012引4.鑒定結(jié)果
[0129] 基因組PCR檢測結(jié)果表明，外源基因已整合進(jìn)痘苗病毒基因組中。重組痘苗病毒 EGFP基因為陽性，而陰性對照VACV-WR無 EGFP基因（圖3);重組痘苗病毒LacZ基因為陽性，而 陰性對照VACV-WR無 LacZ基因（圖4);藍(lán)白斑實驗表明，重組痘苗病毒可正常表達(dá)外源基因 lacZ，隧斑周圍形成藍(lán)色物質(zhì)；同時，巧光檢測結(jié)果表明，重組痘苗病毒可正常表達(dá)外源基 因 EGFP，產(chǎn)生明亮的綠色巧光，而陰性對照VACV-WR無巧光出現(xiàn)（圖5, W野生痘苗病毒為陰 性對照）。
[0130] W上結(jié)果表明，W該穿梭載體制備的重組痘苗病毒可同時正常表達(dá)兩種外源基 因，且相互之間無影響。
[0131] 實施例4、重組痘苗病毒的生物學(xué)特性檢測
[0132] 1.取鑒定無誤后的重組痘苗病毒，此處命名為VACV-Tr,用Vero細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)增 殖。將收獲的病毒采用密度梯度離屯、進(jìn)行純化，分裝后保存于-80°C。
[0133] 2.用VACV-Tr與野生痘苗病毒VACV-WR分別感染CV-I和Vero細(xì)胞，感染劑量為 0.05M0I，培養(yǎng)條件34°C/5%C02。分別于24、48和72小時收集病毒，進(jìn)行滴度測定和隧斑形 成能力及隧斑特性的檢測。
[0134] 3.檢測結(jié)果
[0135] VACV-TIT的生長曲線與對照組野生型痘苗病毒VACV-WR在CV-I和Vero細(xì)胞中均非 常相似(圖6和圖7)。同一時間點(diǎn)(感染后3天），在CV-I細(xì)胞中形成的病毒隧斑，其大小、形狀 無明顯差別，表明TK缺失和外源基因插入后，痘苗病毒本身的生物學(xué)特性，包括隧斑形成和 在細(xì)胞中的感染復(fù)制能力等均無明顯改變。
[0136] W上結(jié)果表明，本發(fā)明制備了一種可表達(dá)量兩種外源基因的重組痘苗穿梭載體， 該載體包含不同啟動子，表達(dá)早晚不同，可滿足不同外源基因表達(dá)量不同的需求，同時提高 了重組痘苗病毒安全性，為活病毒載體疫苗的研制和基因治療提供了更為有效的載體，為 生物技術(shù)藥物的研發(fā)奠定了堅實的基礎(chǔ)。
[0137] W上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可W作出若干改進(jìn)和潤飾，運(yùn)些改進(jìn)和潤飾也應(yīng) 視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種痘苗病毒穿梭載體，其特征在于，含有根據(jù)胸苷激酶基因 TK及其上下游序列設(shè) 計的同源重組臂TKL和TKR，在TKL和TKR之間存在兩個多克隆位點(diǎn)，分別由PI 1和Ρ7.5啟動子 啟動基因表達(dá)，所述穿梭載體含有大腸桿菌復(fù)制起始位點(diǎn)pUC ori和氨芐青霉素抗性篩選 標(biāo)記，該穿梭載體的核苷酸序列如序列1所示。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的痘苗病毒穿梭載體，其特征在于，該穿梭載體的出發(fā)載體為 pcDNA3·1(+)〇3. -種如權(quán)利要求1或2所述的痘苗病毒穿梭載體的制備方法，其特征在于，具體按照 以下步驟實施： 51、 根據(jù)野生型WR株痘苗病毒的TK基因及其上下游序列，設(shè)計引物，以病毒基因組為模 板，PCR獲得TK基因的左右臂同源序列TKL和TKR; 52、 將獲得的TKL和TKR通過酶切連接的方法先后連接至載體pcDNA3.1 ( + )中，獲得中間 質(zhì)粒 pcTKLR; 53、 人工設(shè)計并合成含有痘苗病毒P11和P7.5啟動子序列及兩個多克隆位點(diǎn)的序列，通 過酶切連接的方法，連接至質(zhì)粒pcTKLR中，獲得中間質(zhì)粒pcTKLRS; 54、 經(jīng)過酶切連接，去掉pcTKLRS質(zhì)粒中不相關(guān)的序列，最終獲得穿梭載體pcTK2。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的痘苗病毒穿梭載體的制備方法，其特征在于，S1中根據(jù)野生型 痘苗病毒W(wǎng)R株的基因組DNA序列設(shè)計并合成如下兩對引物： 擴(kuò)增TK上游同源臂的引物對： TKL-F1:5 '-CCCAAGCTTAACGATGTTCTTCGCAG-3'； TKL-R1:5 '-CCGAATTCAACAATGTCTGGAAAGAACTG-3'； 擴(kuò)增TK下游同源臂的引物對： TKR-F1:5 '-TCCCCCCGGGAATAGTTATAGTAGCCGCACTC-3'； TKR-R1:5 '-TATGGCGCCCTGAATATGAAGGAGCAAAAG-3'； 對TK上下游同源臂引物對分別進(jìn)行PCR，獲得帶有相應(yīng)酶切位點(diǎn)的TK上下游同源臂TKL 和 TKR; PCR反應(yīng)體系為:DNA ΙμL，dNTP mix(lOmM)ΙμL，正向引物F(10yM)2.5μ1，反向引物R( 10 μΜ) 2 · 5μ1，5 X Q5buf f er ΙΟμΙ，Q5聚合酶Ο · 5μ1，加 DEPC水至總體積50μ1; PCR反應(yīng)條件為：98°C預(yù)變性3〇8;98°(：變性1〇8,58°(：退火3〇8,72°(：延伸30秒，循環(huán)30 次;72°C延伸2分鐘，最后置于4°C ; PCR結(jié)果:PCR產(chǎn)物上樣電泳，TKL為745bp，TKR為929bp，切膠回收目的條帶。5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的痘苗病毒穿梭載體的制備方法，其特征在于，S2中首先用限制 性內(nèi)切酶Hindll I和EcoRI對上游同源臂TKL進(jìn)行雙酶切，與經(jīng)同樣雙酶切的pcDNA3.1 ( + )質(zhì) 粒的大片段進(jìn)行連接，得到中間質(zhì)粒pcTKL，接著用限制性內(nèi)切酶Xmal和KasI對下游同源臂 TKR進(jìn)行雙酶切，與經(jīng)同樣雙酶切的中間質(zhì)粒pcTKL的大片段進(jìn)行連接，得到中間質(zhì)粒 pcTKLR〇6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的痘苗病毒穿梭載體的制備方法，其特征在于，S3中用限制性內(nèi) 切酶Xhol和Xmal對人工設(shè)計并合成含有痘苗病毒P11和P7.5啟動子序列進(jìn)行雙酶切，與經(jīng) 同樣雙酶切的中間質(zhì)粒pcTKLR的大片段進(jìn)行連接，得到中間質(zhì)粒pcTKLRS。7. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的痘苗病毒穿梭載體的制備方法，其特征在于，S4中以pcDNA3.1 (+ )質(zhì)粒DNA為模板，以用于去除不相關(guān)序列、保留Bla promoter-pUC origin片段的引物對 進(jìn)行PCR，獲得帶有相應(yīng)酶切位點(diǎn)的Bla promoter-pUC origin片段； PCR反應(yīng)體系為:DNA ΙμL，dNTP mix(lOmM)ΙμL，正向引物F(10yM)2.5μ1，反向引物R( 10 μΜ) 2 · 5μ1，5 X Q5buf f er 10μ1，Q5 聚合酶 0 · 5μ1，加 DEPC 水至總體積 50μ1; PCR反應(yīng)條件為：98°C預(yù)變性3〇8;98°(：變性1〇8,58°(：退火3〇8,72°(：延伸70秒，循環(huán)30 次;72°C延伸2分鐘，最后置于4°C ; PCR結(jié)果:PCR產(chǎn)物上樣電泳，片段大小為2303bp，切膠回收目的條帶； 其中去除不相關(guān)序列，保留Bla promoter-pUC origin片段的引物對： P-F1:5 '-TATGGCGCCGGCGTAATCATGGTCATAGCTG-3'； P-R1:5 '-CCCAAGCTTCACTACTCAGCGACCTCCAAC-3'； 用限制性內(nèi)切酶KasI和Hindlll對上述基因片段進(jìn)行雙酶切，與經(jīng)同樣雙酶切的中間 質(zhì)粒pcTKLRS的小片段進(jìn)行連接，獲得目的質(zhì)粒，經(jīng)酶切和測序鑒定無誤后，得到穿梭載體。8. -種痘苗病毒穿梭載體在制備重組痘苗病毒作為活病毒載體疫苗及亞單位疫苗制 備及生物制藥中的應(yīng)用。9. 采用權(quán)利要求1或2所述的痘苗病毒穿梭載體制備重組痘苗病毒的方法，其特征在 于，包括步驟： S5,穿梭載體與野生型痘苗病毒在CV-1細(xì)胞內(nèi)重組； 具體步驟為： 1) 在T25培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)CV-1單層細(xì)胞，至80 %覆蓋； 2) 用野生型痘苗病毒感染CV-1細(xì)胞； 3) 采用脂質(zhì)體法將穿梭載體質(zhì)粒pcTK2轉(zhuǎn)染至感染細(xì)胞，野生型痘苗病毒與pcTK2在TK 基因左右側(cè)位置發(fā)生同源重組； 4) 48小時后，收集病毒； S6，篩選純化獲得重組病毒VACV-TK-; 具體步驟為： 1) 在6孔板中培養(yǎng)143ΤΙΓ細(xì)胞，至80%覆蓋； 2) 采用步驟S44中的病毒感染143TK-細(xì)胞，并覆蓋瓊脂培養(yǎng)基； 3) 3天后挑取孤立病毒噬斑，進(jìn)行進(jìn)一步篩選，連續(xù)單斑篩選5代； S7，對重組病毒進(jìn)行PCR及測序鑒定，鑒定無誤后，進(jìn)行重組病毒的體外增殖，并將最終 收獲的病毒采用密度梯度離心純化，保存于_80°C。
【文檔編號】C12N15/66GK105861558SQ201610473043
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年6月24日
【發(fā)明人】馬茜, 汪洋, 蘇興利
【申請人】西安醫(yī)學(xué)院