一種微生物生產(chǎn)苯甲酸巰的方法
【專利摘要】一種微生物生產(chǎn)苯甲酸巰的方法，具體是一種青霉生物催化制備醫(yī)藥中間體1?苯甲酸?2，5?2巰的方法，微生物發(fā)酵液中加入底物，攪拌乳化，進行生物催化反應，產(chǎn)品收率高，反應條件溫和，常溫、常壓操作，解決了現(xiàn)有方法生產(chǎn)條件苛刻的困難。
【專利說明】
-種微生物生產(chǎn)苯甲酸琉的方法
技術領域
[0001] 本發(fā)明屬于制藥工程技術領域，特別設及到青霉生物催化制備醫(yī)藥中間體1-苯甲 酸-2,5-2琉的技術。
【背景技術】
[0002] 生物催化具有催化效率高、選擇性強、條件溫和、環(huán)境友好等突出優(yōu)點，是可持續(xù) 發(fā)展過程中替代和拓展傳統(tǒng)有機化學合成的重要方法。其中微生物催化是生物催化最具吸 引力的應用領域之一，在工業(yè)生物催化中一直扮演著重要角色。
[0003] 芳控的簇化反應是一類重要的反應，其產(chǎn)物為芳控徑基簇酸，是重要的藥物合成 起始原料。但是，現(xiàn)在的生產(chǎn)采用傳統(tǒng)的化學合成，用芳控與C〇2反應，反應壓力高達lOMPa， 溫度高達140-380°C，反應選擇性差，副產(chǎn)物多。采用微生物催化，則可能改變運種狀況。采 用微生物催化，可W在常溫、常壓下反應生產(chǎn)芳控徑基簇酸，條件溫和，選擇性高，副反應 少，產(chǎn)率高。
[0004] 本發(fā)明將采用微生物催化反應，生產(chǎn)芳控徑基簇酸:1-苯甲酸-2，5-2琉。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明采用青霉催化制備1-苯甲酸-2,5-2琉，反應式如下：
底物苯-1，4-2琉(1)經(jīng)青霉催化反應，得到產(chǎn)物1-苯甲酸-2，5-2琉(2)。有多種微生物 可W催化此反應，經(jīng)過大量實驗篩選，最終確定采用青霉作為催化劑，因為其催化反應的效 果最好，副產(chǎn)物極少，反應收率高。
[0006] 許多霉菌都可W進行生物催化此反應，然而，其效果不同，相差很大，經(jīng)實驗，本發(fā) 明選用青霉菌株為DSM-2430，其催化反應效果最佳。
[0007] 由于底物溶解度較低，所W，加入表面活性劑W增加底物的溶解度。盡管表面活性 劑增加了底物溶解度，底物仍然不能很好溶解，屬于液-液2相反應，底物、產(chǎn)物的相間傳質(zhì) 為反應的限制環(huán)節(jié)，所W，還需采取措施，W提高反應速度。增加非均相反應的反應界面，是 提高非均相反應的有效措施之一。加入表面活性劑后，在強烈攬拌下，反應液成為乳液，使 得催化反應界面大幅度增加，從而大幅度提高反應速度。特別是，加入的表面活性劑，必須 生物相容，不抑制微生物的催化活性，所W，表面活性劑種類和濃度的選擇，是非常重要的。 大量實驗表明，對于本反應，加入山梨坦單月桂酸醋16-18g/L是最佳的。
[000引反應結(jié)束后，用有機溶劑萃取產(chǎn)物。需要破乳，有多種方法可W破乳，包括鹽析法： 加入氯化鋼、硫酸錠或氯化巧、氯化儀、硫酸巧、硫酸儀;凝聚法:加入聚合氯化侶、明抓等； 或者將上述2類混合加入;加熱等。不同產(chǎn)物，所用的方法不同，實驗表明，對于本反應，加入 1.5%的硫酸巧+0.01%明抓是最佳的。
[0009] 簇化反應中，采用化肥化提供C〇2,實際上，有多種物質(zhì)可W提供C〇2,但是，通過大 量實驗，結(jié)果表明，對于本發(fā)明，使用化肥化是最佳的。由于加入化肥化會使反應液的pH升 高，而適宜的抑，對微生物催化反應致關重要，所W，不能一次加入，必須采用流加方式加入 Na肥化。然而，即使流加化肥化，反應液的抑仍然升高，所W，還必須采取措施，維持反應液處 于適宜的抑，使微生物能夠正常發(fā)揮生物催化作用。通過大量實驗表明，流加鹽酸水溶液是 適宜的方法，調(diào)節(jié)化肥化與鹽酸水溶液的流加速率，可W使溶液的抑處于最佳范圍，使生物 催化反應正常進行。
[0010] 可W明顯看出，本發(fā)明所設及的微生物菌株選擇、表面活性劑選擇、破乳劑選擇、 〇化供體選擇，還有反應溫度，反應時間，反應抑，底物濃度，生物催化反應液成分確定等，眾 多因素均需考慮，并且，它們相互影響。特別是，需要從實驗室小試、中試，直到工業(yè)規(guī)模反 應，更是大幅度增加了工作難度、工作量。所W，實驗設計至管重要，如此多的因素，生物催 化反應動力學理論分析和實驗工作量巨大。
[0011] 培養(yǎng)介質(zhì)： 1、種子培養(yǎng)基成份為：酵母提取物10 g/L，葡萄糖20 g/L，蛋白腺20 g/L，麥芽浸膏 25-30 g，硫酸錠0.5-0.7g/l;配制固體培養(yǎng)基時添加15g/L的瓊脂粉。
[0012] 2、培養(yǎng)液成份:玉米漿（W干物質(zhì)計)含量為30-33g/L，酵母浸膏8-10 g/L，葡萄 糖18-22 g/L，麥芽浸膏25-30 g，硫酸錠0.5-0.7g/L，硫酸儀0.3-0.4g/L，憐酸二氧鐘1.8-2.3g/L，碳酸巧 0.7 邑/1，硫酸亞鐵 0.18 g/l，硫酸儘 0.025 g/L;pH 5.5。
[0013] 2、固體培養(yǎng)基成份：在液體培養(yǎng)基中加入2%的瓊脂粉。
[0014] 微生物發(fā)酵液制備。青霉DSM-2430經(jīng)斜面、搖瓶、種子罐培養(yǎng)得到種子液;發(fā)酵罐 加入培養(yǎng)液，裝料系數(shù)為0.6-0.7，121°C高壓滅菌30分鐘冷卻至25-27 °C，將青霉菌種子液 接種至發(fā)酵罐，接種比例為9-10%，通氣比為0.9-1V/V?分鐘，25-27°C培養(yǎng)38-41小時，發(fā)酵 液中濕酵母細胞濃度為90-93g/L，此發(fā)酵液用作生物催化反應催化劑。
[0015] 用HPLC測產(chǎn)品收率及純度，C18柱，紫外檢測器，波長254皿，流動相為抑3的憐酸緩 沖液：甲醇=90:10。
[0016] 生物催化反應:發(fā)酵罐，即制備微生物發(fā)酵液發(fā)酵罐，在其發(fā)酵液中加入底物苯-1，4-2琉，使?jié)舛葹?2-95g/L，補加 W下成份，使?jié)舛葹椋河衩诐{干物質(zhì)計)含量為5-8g/ L，山梨坦單月桂酸醋16-18g/L，葡萄糖17-19g/L、麥芽糖30-32g/L、紅豆粉18-22 g/L，121 °(：高壓滅菌30分鐘；冷卻至32-33°C時，攬拌乳化，進行生物催化反應，反應時間為45-50小 時；反應開始時，立即流加濃度為5%的化肥化水溶液，同時流加濃度為1 %的鹽酸水溶液， 調(diào)節(jié)化肥化與鹽酸水溶液的流加速率，維持抑5.3-5.6，所加入的物料均經(jīng)過滅菌處理;通 氣比為0.6-0.65V/V ?分鐘，即每分鐘通氣量為0.6-0.65倍反應液體積，反應結(jié)束后，破乳， 用0.2倍反應液體積乙酸乙醋萃取反應液萃取3次，合并有機相，有機相蒸出乙酸乙醋，得到 產(chǎn)物1-苯甲酸-2，5-2琉，反應轉(zhuǎn)化率97.3-99.4%，產(chǎn)品收率95.6-97.5%。
[0017]實施例1 培養(yǎng)液成份:玉米漿（W干物質(zhì)計)含量為30-33g/L，酵母浸膏8-10 g/L，葡萄糖18- 22 g/L，麥芽浸膏25-30 g，硫酸錠0.5-0.7g/L，硫酸儀0.3-0.4g/L，憐酸二氧鐘1.8-2.3g/ U碳酸巧0.7旨/1，硫酸亞鐵0.18 g/l，硫酸儘0.025 g/L;pH 5.5。
[0018] 微生物發(fā)酵液制備。青霉DSM-2430經(jīng)斜面、搖瓶、種子罐培養(yǎng)得到種子液;發(fā)酵罐 加入培養(yǎng)液，裝料系數(shù)為0.6-0.7，121°C高壓滅菌30分鐘冷卻至25-27 °C，將青霉菌種子液 接種至發(fā)酵罐，接種比例為9-10%，通氣比為0.9-1V/V?分鐘，25-27°C培養(yǎng)38-41小時，發(fā)酵 液中濕酵母細胞濃度為90-93g/L，此發(fā)酵液用作生物催化反應催化劑。
[0019] 生物催化反應：1化發(fā)酵罐，即制備微生物發(fā)酵液發(fā)酵罐，在其發(fā)酵液中加入底物 苯-1,4-2琉，使?jié)舛葹?2-95g/L，補加 W下成份，使?jié)舛葹?玉米漿（W干物質(zhì)計)含量為5-8g/L，山梨坦單月桂酸醋16-18g/L，葡萄糖17-19g/L、麥芽糖30-32g/L、紅豆粉18-22 g/L， 12 rC高壓滅菌30分鐘;冷卻至32-33 °C時，攬拌乳化，進行生物催化反應，反應時間為45-50 小時；反應開始時，立即流加濃度為5 %的化H(X)3水溶液，同時流加濃度為1 %的鹽酸水溶 液，調(diào)節(jié)化肥化與鹽酸水溶液的流加速率，維持抑5.3-5.6，所加入的物料均經(jīng)過滅菌處理； 通氣比為0.6-0.65V/V ?分鐘，即每分鐘通氣量為0.6-0.65倍反應液體積，反應結(jié)束后，破 乳，用0.2倍反應液體積乙酸乙醋萃取反應液萃取3次，合并有機相，有機相蒸出乙酸乙醋， 得到產(chǎn)物1-苯甲酸-2，5-2琉，反應轉(zhuǎn)化率97.3-99.4%，產(chǎn)品收率95.6-97.5%。
[0020] 實施例2 培養(yǎng)液成份及微生物發(fā)酵液制備同實施例1。
[0021] 生物催化反應:150L發(fā)酵罐，即制備微生物發(fā)酵液發(fā)酵罐，在其發(fā)酵液中加入底物 苯-1,4-2琉，使?jié)舛葹?2-95g/L，補加 W下成份，使?jié)舛葹椋河衩诐{（W干物質(zhì)計)含量為5-8g/L，山梨坦單月桂酸醋16-18g/L，葡萄糖17-19g/L、麥芽糖30-32g/L、紅豆粉18-22 g/L， 12 rC高壓滅菌30分鐘;冷卻至32-33 °C時，攬拌乳化，進行生物催化反應，反應時間為45-50 小時；反應開始時，立即流加濃度為5 %的化H(X)3水溶液，同時流加濃度為1 %的鹽酸水溶 液，調(diào)節(jié)化肥化與鹽酸水溶液的流加速率，維持抑5.3-5.6，所加入的物料均經(jīng)過滅菌處理； 通氣比為0.6-0.65V/V ?分鐘，即每分鐘通氣量為0.6-0.65倍反應液體積，反應結(jié)束后，破 乳，分別用0.2倍、0.15倍、0.1倍反應液體積的乙酸乙醋萃取反應液各萃取1次，合并有機 相，蒸出乙酸乙醋，得到產(chǎn)物1 -苯甲酸-2，5-2琉，反應轉(zhuǎn)化率97.3 %，產(chǎn)品收率95.6 %。 [0022]實施例3 培養(yǎng)液成份及微生物發(fā)酵液制備同實施例1。
[0023]生物催化反應：100化發(fā)酵罐，即制備微生物發(fā)酵液發(fā)酵罐，在其發(fā)酵液中加入底 物苯-1,4-2琉，使?jié)舛葹?2-95g/L，補加 W下成份，使?jié)舛葹?玉米漿（W干物質(zhì)計)含量為 5-8g/L，山梨坦單月桂酸醋16-18g/L，葡萄糖17-19g/L、麥芽糖30-32g/L、紅豆粉18-22 g/ L，121°C高壓滅菌30分鐘;冷卻至32-33 °C時，攬拌乳化，進行生物催化反應，反應時間為45-50小時；反應開始時，立即流加濃度為5 %的化肥化水溶液，同時流加濃度為1 %的鹽酸水溶 液，調(diào)節(jié)化肥化與鹽酸水溶液的流加速率，維持抑5.3-5.6，所加入的物料均經(jīng)過滅菌處理； 通氣比為0.6-0.65V/V ?分鐘，即每分鐘通氣量為0.6-0.65倍反應液體積，反應結(jié)束后，破 乳，分別用0.2倍、0.15倍、0.1倍反應液體積的乙酸乙醋萃取反應液各萃取1次，合并有機 相，蒸出乙酸乙醋，得到產(chǎn)物1 -苯甲酸-2，5-2琉，反應轉(zhuǎn)化率98.7 %，產(chǎn)品收率96.4 %。 [0024] 實施例4 培養(yǎng)液成份及微生物發(fā)酵液制備同實施例1。
[0025]生物催化反應:15000L發(fā)酵罐，即制備微生物發(fā)酵液發(fā)酵罐，在其發(fā)酵液中加入底 物苯-1,4-2琉，使?jié)舛葹?2-95g/L，補加 W下成份，使?jié)舛葹?玉米漿（W干物質(zhì)計)含量為 5-8g/L，山梨坦單月桂酸醋16-18g/L，葡萄糖17-19g/L、麥芽糖30-32g/L、紅豆粉18-22 g/ L，121°C高壓滅菌30分鐘;冷卻至32-33 °C時，攬拌乳化，進行生物催化反應，反應時間為45-50小時；反應開始時，立即流加濃度為5 %的化肥化水溶液，同時流加濃度為1 %的鹽酸水溶 液，調(diào)節(jié)化肥化與鹽酸水溶液的流加速率，維持抑5.3-5.6，所加入的物料均經(jīng)過滅菌處理； 通氣比為0.6-0.65V/V ?分鐘，即每分鐘通氣量為0.6-0.65倍反應液體積，反應結(jié)束后，破 乳，用逆流萃取機萃取，萃取液為乙酸乙醋，蒸出有機相的乙酸乙醋，蒸出乙酸乙醋，得到產(chǎn) 物1 -苯甲酸-2，5-2琉，反應轉(zhuǎn)化率99.4 %，產(chǎn)品收率97.5 %。
【主權項】
1. 一種青霉生物催化制備1-苯甲酸-2，5-2巰的方法，其特征在于青霉發(fā)酵液中加入底 物苯-1，4-2巰，使?jié)舛葹?2-95g/L，補加以下成份，使?jié)舛葹?玉米漿為5-8g/L，山梨坦單月 桂酸酯16_18g/L，葡萄糖17-19g/L、麥芽糖30-32g/L、紅豆粉18-22 g/L，121°C高壓滅菌30 分鐘；冷卻至32-33 °C時，攪拌乳化，進行生物催化反應，反應時間為45-50小時；反應開始 時，立即流加濃度為5 %的NaHC03水溶液，同時流加濃度為1 %的鹽酸水溶液，調(diào)節(jié)NaHC03與 鹽酸水溶液的流加速率，維持PH5.3-5.6，所加入的物料均經(jīng)過滅菌處理；通氣比為0.6- 0.65V/V ·分鐘，即每分鐘通氣量為0.6-0.65倍反應液體積，反應結(jié)束后，破乳，用乙酸乙酯 萃取反應液，有機相蒸出乙酸乙酯，得到產(chǎn)物1-苯甲酸-2,5-2巰，反應轉(zhuǎn)化率97.3-99.4%， 產(chǎn)品收率95.6-97.5 % ;所述發(fā)酵液由培養(yǎng)液發(fā)酵微生物得到。2. 權利要求1所述的方法，其特征在于青霉發(fā)酵液制備過程如下:青霉經(jīng)斜面、搖瓶、種 子罐培養(yǎng)得到種子液;發(fā)酵罐加入培養(yǎng)液，裝料系數(shù)為〇. 6-0.7，121°C高壓滅菌30分鐘冷卻 至25-27°C，將青霉菌種子液接種至發(fā)酵罐，接種比例為9-10%，通氣比為0.9-1V/V·分鐘， 25-27°C培養(yǎng)38-41小時，發(fā)酵液中濕酵母細胞濃度為90-93g/L，此發(fā)酵液用作生物催化反 應催化劑;發(fā)酵罐中培養(yǎng)液成份為:玉米漿為30_33g/L，酵母浸膏8-10 g/L，葡萄糖18-22 g/L，麥芽浸膏25-30 g，硫酸銨0.5-0.7g/L，硫酸鎂0.3-0.4g/L，磷酸二氧鉀1.8-2.3g/L，碳 酸鈣 0.7 g/L，硫酸亞鐵 0.18 g/L，硫酸錳 0.025 g/L;pH 5.5。
【文檔編號】C12R1/80GK105861583SQ201610464859
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年6月24日
【發(fā)明人】馬玉潔, 張媛媛, 劉均洪
【申請人】青島科技大學