L-色氨酸的發(fā)酵和提取工藝的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于氨基酸發(fā)酵領(lǐng)域，其提供了發(fā)酵生產(chǎn)L?色氨酸的方法，包括改造細(xì)菌染色體上的野生型的tdcD基因或其調(diào)控元件，使改造獲得的細(xì)菌的tdcD酶的表達(dá)量和/或酶活性降低。另外，本發(fā)明還包括對(duì)發(fā)酵獲得的L?色氨酸發(fā)酵液分離提取的方法。
【專利說明】
L-色氨酸的發(fā)酵和提取工藝
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明屬于氨基酸發(fā)酵領(lǐng)域，是中國(guó)專利第201310278997.2號(hào)和第 201310278996.8號(hào)的繼續(xù)申請(qǐng)，具體而言，本發(fā)明設(shè)及發(fā)酵生產(chǎn)心色氨酸的工藝及其后續(xù) 從發(fā)酵液中提取的工藝(包括分離提取心色氨酸的工藝）。
【背景技術(shù)】
[0002] 心色氨酸是人體和動(dòng)物生命活動(dòng)中八種必需的氨基酸之一，W游離態(tài)或結(jié)合態(tài)存 在于生物體中。當(dāng)前利用微生物直接發(fā)酵法生產(chǎn)k色氨酸W其原料成本低，來源廣泛，產(chǎn) 品純度高，反應(yīng)條件溫和等優(yōu)點(diǎn)逐漸成為心色氨酸的主要生產(chǎn)方法，和其他生物工程產(chǎn)品 一樣，色氨酸工業(yè)生產(chǎn)也常常會(huì)受到生產(chǎn)成本的制約，而在生產(chǎn)成本的構(gòu)成中，分離提取等 下游工程的成本占有相當(dāng)?shù)谋壤?。因此，研究k色氨酸的提取方法具有重要的理論意義和 實(shí)用價(jià)值。
[0003] 通過產(chǎn)k色氨酸的細(xì)菌(如，埃希氏菌屬的大腸桿菌和棒桿菌屬的桿狀細(xì)菌)發(fā)酵 來生產(chǎn)心色氨酸已經(jīng)得到了產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。運(yùn)些細(xì)菌，可W是從自然界分離的細(xì)菌，也可W是 通過誘變或基因工程改造獲得的細(xì)菌，或者兩者兼而有之。當(dāng)前的文獻(xiàn)報(bào)道中，通過基因工 程改造的注意力主要集中在mtr、aroP、tnaA、化pB、gnd W及化aB等基因上（參見中國(guó)專利 85101270、93117586、96111972、200580043246、200710056966、201010598350等），未見為了 k色氨酸生產(chǎn)而關(guān)注tdcD酶及其調(diào)控序列。
[0004] TdcD酶由tdcD基因編碼。在E. COli K12菌株及其衍生菌株(如，W3110菌株)等中， 野生型的tdcD基因的核巧酸序列如Genbank登錄號(hào)AP009048.1中第3263515-3262220位所 示，通過Genbank提供的同源性比較工具，也能夠找到其他野生型的tdcD基因及其上游調(diào)控 元件。
[0005] 本發(fā)明人經(jīng)過長(zhǎng)期研究和實(shí)踐，尤其憑借了一些運(yùn)氣，偶然發(fā)現(xiàn)tdcD基因及其上 游調(diào)控元件的改造能夠有助于提高k色氨酸的產(chǎn)量，并且后續(xù)可W采用禪合分離工藝對(duì)發(fā) 酵液中的心色氨酸進(jìn)行分離提取，使得收率高，運(yùn)行維護(hù)成本低，減少=廢水排。
[0006]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供新的發(fā)酵生產(chǎn)k色氨酸的方法及分離提取k 色氨酸的方法。
[000引具體而言，在第一方面，本發(fā)明提供了發(fā)酵生產(chǎn)k色氨酸的方法，其包括： (1) 改造細(xì)菌染色體上的野生型的tdcD基因，使改造獲得的細(xì)菌的tdcD酶的表達(dá)量和/ 或酶活性降低;和， (2) 用步驟(1)改造而得到的細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)心色氨酸。
[0009 ]在第二方面，本發(fā)明提供了發(fā)酵生產(chǎn)k色氨酸的方法，其包括： (1)改造細(xì)菌染色體上tdcD基因的野生型的調(diào)控元件，使改造獲得的細(xì)菌的該調(diào)控元 件對(duì)其下游酶基因的表達(dá)啟動(dòng)能力減弱但不消失;和， (2)用步驟(1)改造而得到的細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)心色氨酸。
[0010] 在本文中，術(shù)語"改造"指的是是相應(yīng)被改造的對(duì)象發(fā)生變化，從而達(dá)到一定的效 果。改造位于染色體上的基因的手段包括但是不限于，誘變、定點(diǎn)突變、和/或同源重組，優(yōu) 選是后兩者。運(yùn)些技術(shù)手段廣泛記載于分子生物學(xué)和微生物學(xué)文獻(xiàn)中，有許多甚至已經(jīng)商 品化了。在本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】中，根據(jù)同源重組的原理，采用Biovector公司商品化的 PKD46質(zhì)粒系統(tǒng)來進(jìn)行改造，將未改造細(xì)菌染色體上的野生型的tdcD基因，改造成能夠使改 造獲得的細(xì)菌的tdcD酶的表達(dá)量和/或酶活性降低的新的tdcD基因。因此，在本文文中，優(yōu) 選改造是通過同源重組進(jìn)行的改造。
[0011] 在本文中，術(shù)語"下游酶基因"指的是tdcD基因的野生型的調(diào)控元件所能調(diào)控的編 碼酶的基因，而且該酶位于該調(diào)控元件的下游。所W，該調(diào)控原件一般是啟動(dòng)子。優(yōu)選在本 文中，下游酶基因是tdcD基因。
[0012] 本發(fā)明人經(jīng)過長(zhǎng)期研究發(fā)現(xiàn)，使得tdcD基因所編碼的tdcD酶的表達(dá)量消失，或使 得tdcD基因所編碼的tdcD酶的酶活性消失，在一定培養(yǎng)基下，并不造成細(xì)菌本身生長(zhǎng)困難， 仍舊能夠正常生長(zhǎng)/繁殖，并發(fā)酵。更為令人意想不到的是，tdcD基因座位上的基因徹底消 失，將進(jìn)一步提高心色氨酸的產(chǎn)量。因此，本發(fā)明的"改造"要相對(duì)于未改造的細(xì)菌，使改造 獲得的細(xì)菌的tdcD酶的表達(dá)量和/或酶活性降低，優(yōu)選使改造獲得的細(xì)菌的tdcD酶的表達(dá) 量和/或酶活性降低50%W上，更優(yōu)選降低70%W上，如降低80%、90%或95%W上，最加優(yōu)選降 低100%(即，消失），也最優(yōu)選是改造細(xì)菌染色體上的野生型的tdcD基因，使改造獲得的細(xì)菌 的tdcD酶的表達(dá)量和/或酶活性消失并且使得tdcD基因座位上的基因被敲除（即，徹底消 失)。
[0013] 改造的方式可W是在tdcD酶活性結(jié)構(gòu)域，如該酶的氨基酸序列的第17-38位、第 90-156位、183-205位和330-362位，進(jìn)行突變，一般都能造成活性下降；也可W是在tdcD基 因上引入終止密碼子，使得無法表達(dá)有活性的tdcD酶;也可W通過同源重組，將tdcD基因替 換成其他基因，如抗生素抗性基因，例如抗氯霉素抗性基因；或者完全敲除tdcD基因座位上 的基因，使之徹底消失。在本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】中，優(yōu)選采用后兩者。
[0014] 另外，本發(fā)明人經(jīng)過長(zhǎng)期研究也發(fā)現(xiàn)，使得tdcD基因的野生型的調(diào)控元件被敲除 (替換成其他無關(guān)序列），將造成細(xì)菌本身生長(zhǎng)困難，甚至無法生長(zhǎng)/繁殖(而只是使tdcD酶 的表達(dá)量消失卻在一些培養(yǎng)基中能正常生長(zhǎng)）。因此，本發(fā)明的"改造"要相對(duì)于未改造的細(xì) 菌，使改造獲得的細(xì)菌的該調(diào)控元件對(duì)其下游酶基因的表達(dá)啟動(dòng)能力減弱但不消失，優(yōu)選 減弱20%~95%，更優(yōu)選減弱50%~90%，更加優(yōu)選減弱70%~85%，如減弱15%、20%、25%或30%。在本 文中，該調(diào)控元件對(duì)其下游酶基因的表達(dá)啟動(dòng)能力減弱但不消失可W通過其下游酶基因 (如，tdcD基因）所編碼的酶的表達(dá)量降低但不消失來表征，優(yōu)選表達(dá)量降低20%~95%，更優(yōu) 選降低50%~90%，更加優(yōu)選降低70%~85%，如降低15%、20%、25%或30〇/〇。
[0015] 在本文中，細(xì)菌優(yōu)選是埃希氏菌屬細(xì)菌，更優(yōu)選是大腸桿菌，如大腸桿菌K-12菌株 的后續(xù)菌株，包括W3110衍生的菌株。由于現(xiàn)有技術(shù)幾乎沒有在1-色氨酸生產(chǎn)/發(fā)酵中關(guān)注 過細(xì)菌的tdcD基因，改造的染色體的基因大多集中于mtr、aroP、tnaA、t巧B、gnd W及traB等 基因位點(diǎn)上，因此現(xiàn)有技術(shù)中的細(xì)菌(尤其是埃希氏菌屬細(xì)菌，如大腸桿菌)沒有被報(bào)道不 帶有野生型的tdcD基因。在本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】中，無論高產(chǎn)還是低產(chǎn)心色氨酸的細(xì)菌， 只要帶有野生型的tdcD基因，通過本發(fā)明的方法進(jìn)行改造，就能使得k色氨酸的發(fā)酵量得 到提局。
[0016] 在第S方面，針對(duì)現(xiàn)有發(fā)酵法生產(chǎn)心色氨酸的工業(yè)化過程中，提取收率低W及環(huán) 境污染嚴(yán)重的問題，本發(fā)明提供了分離提取k色氨酸的方法，其包括： (一） 向含有k色氨酸的發(fā)酵液加入明抓和Na服化后，攬拌并加熱； (二) 納濾(如用陶瓷納濾膜納濾）W分離得到色氨酸微濾液和菌體蛋白（所述菌體蛋白 進(jìn)一步制成高蛋白飼料）； (=)用閃蒸脫氣機(jī)對(duì)所述色氨酸微濾液脫氣； (四） 將脫氣的色氨酸微濾液進(jìn)行色譜分離，得到色氨酸提取液； (五) 將所述色譜提取液蒸發(fā)至其色氨酸濃度提高至5%，再通過雙效結(jié)晶器進(jìn)行濃縮結(jié) 晶； (六) 將所述結(jié)晶獲得的漿料用酸(如，硫酸)調(diào)節(jié)pH至6.0~7.0,然后進(jìn)行梯度降溫，終 點(diǎn)溫度控制在18~40°C，再進(jìn)行離屯、分離； (屯)對(duì)所述離屯、分離獲得的濕晶體閃蒸干燥，獲得含水率0.5~1.0%的色氨酸晶體； (八) 對(duì)所述離屯、分離獲得的一次母液脫色，脫色液過濾后進(jìn)入雙效結(jié)晶器濃縮結(jié)晶并 再進(jìn)行離屯、分離;和， (九) 將所述色譜分離的殘液與所述再進(jìn)行離屯、分離的二次母液合并制成生物肥料。
[0017] 優(yōu)選在本發(fā)明第S方面的方法中，所述含有k色氨酸的發(fā)酵液是通過本發(fā)明第一 或第二方面的方法制備的。
[0018] 在本文中，如無相反的指示（如下述占體積的百分比濃度，顯然是重量體積百分比 濃度(g/mL))，百分比濃度均為質(zhì)量(重量)百分比濃度。
[0019] 優(yōu)選在本發(fā)明第=方面的方法中，所述明抓為所述發(fā)酵液體積的0.1 %~1.0%。
[0020] 優(yōu)選在本發(fā)明第S方面的方法中，所述Na服化為所述發(fā)酵液體積的0.1 %~1.0%。
[0021] 優(yōu)選在本發(fā)明第=方面的方法中，所述加熱是加熱到40~80°C。
[0022] 優(yōu)選在本發(fā)明第=方面的方法中，所述色譜分離是用SSMB色譜系統(tǒng)進(jìn)行的。
[0023] 優(yōu)選在本發(fā)明第=方面的方法中，在所述色譜分離中，Wo. 05-0.8%氨水將色氨酸 進(jìn)行解脫。
[0024] 優(yōu)選在本發(fā)明第=方面的方法中，所述色譜分離包括： (1) 首尾循環(huán)連接色譜系統(tǒng)的1區(qū)、2區(qū)、3區(qū)和4區(qū)的各層析柱，使得脫氣的色氨酸微濾 液在各層析柱內(nèi)置換循環(huán)，不排出； (2) 切斷各層析柱間連接，對(duì)3區(qū)的層析柱出料； (3) 向1區(qū)的層析柱加入0.05-0.8%氨水，并收集1區(qū)的層析柱的洗脫液;和， (4) 依次連接色譜系統(tǒng)的1區(qū)、2區(qū)和3區(qū)，并收集3區(qū)的層析柱的洗脫液。
[0025] 優(yōu)選在本發(fā)明第=方面的方法中，所述一次母液經(jīng)過10%的粉狀活性炭脫色，脫色 溫度65-70°(：，脫色時(shí)間6〇111111。
[0026] 本發(fā)明的有益效果在于，開辟并且實(shí)踐證明了新的提高レ色氨酸的發(fā)酵量的方 式，對(duì)于高產(chǎn)和低產(chǎn)k色氨酸的細(xì)菌都適用，而且與現(xiàn)有改造的大量高產(chǎn)心色氨酸的細(xì)菌 的染色體改造位點(diǎn)沒有沖突;本發(fā)明采用陶瓷納濾膜分離系統(tǒng)過濾發(fā)酵液，與普通陶瓷微 濾膜相比除菌除雜更徹底，濾液質(zhì)量更好，為后續(xù)操作減輕了除雜壓力;與有機(jī)材質(zhì)的超濾 納濾膜相比，耐酸堿耐高溫，使用壽命長(zhǎng)，運(yùn)行維護(hù)費(fèi)用低;采用順序式模擬移動(dòng)床色譜精 制工藝與傳統(tǒng)離子交換和活性炭脫色工藝相比，樹脂用量減少了70%，樹脂無需酸堿再生， 用純水解析避免了氨水的使用，杜絕了高氨氮廢水排放;而且脫鹽脫色一步禪合完成，大大 提高了操作效率，杜絕了使用活性炭脫色造成的固體廢碳的排放;1^-色氨酸提取收率從原 來75%提升到90%W上，色氨酸得到高效分離回收，能夠提高產(chǎn)品純度和等級(jí)，實(shí)現(xiàn)了清潔 連續(xù)在線生產(chǎn)。色譜殘夜與菌體蛋白綜合利用制造生物菌肥，實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)品利潤(rùn)的最大化。
[0027] 為了便于理解，W下將通過具體的附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)地描述。需要特別 指出的是，運(yùn)些描述僅僅是示例性的描述，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明范圍的限制。依據(jù)本說明書的 論述，本發(fā)明的許多變化、改變對(duì)所屬領(lǐng)域技術(shù)人員來說都是顯而易見的。
[0028] 另外，本發(fā)明引用了公開文獻(xiàn)，運(yùn)些文獻(xiàn)是為了更清楚地描述本發(fā)明，它們的全文 內(nèi)容均納入本文進(jìn)行參考，就好像它們的全文已經(jīng)在本文中重復(fù)敘述過一樣。
[0029]
【附圖說明】
[0030] 圖1為心色氨酸分離提取工藝示意圖。
[0031] 圖2為心色氨酸色譜分離流程示意圖。
[0032]
【具體實(shí)施方式】
[0033] W下通過實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容。如未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù) 手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段和市售的常用儀器、試劑，可參見《分子克隆實(shí)驗(yàn) 指南(第3版)》(科學(xué)出版社）、《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)(第4版)》(高等教育出版社）W及相應(yīng)儀器和 試劑的廠商說明書等參考。
[0034] 實(shí)施例1使tdcD基因表達(dá)失活及徹底敲除 將不再含有tdcD酶的ORF的1100 bp的DNA片段分別隨地D46質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化入幾乎不產(chǎn) レ色氨酸的E. COli K12 W3110菌株（可購(gòu)自日本技術(shù)評(píng)價(jià)研究所生物資源中屯、（NITE Biological Resource Center,NBRC))和高產(chǎn)心色氨酸的E. coli 1-1703菌株（可購(gòu)自中 科院微生物研究所，其為經(jīng)E. COli K12 W3110誘變突變得到的心色氨酸生產(chǎn)工程菌，經(jīng)測(cè) 序保留了野生型的tdcD基因）中，得到兩種具有氯霉素抗性的陽性菌株，分別記為YPT-W-OOU來自E. COli K12 W3110菌株)和YPT-W-Oll(來自E. COli 1-1703)。
[0035] 再將 pCP20 質(zhì)粒(可購(gòu)自 Biovector, Inc)電轉(zhuǎn)化入 YPT-W-OOl 和 YPT-W-Ol 1，篩選 W 將引入的氯霉素抗性基因也敲除(使得tdcD基因座位上的基因被徹底敲除），得到不具有氨 節(jié)青霉素和氯霉素抗性的菌株，分別記為YPT-W-002(來自YPT-W-001)和YPT-W-012(來自 YPT-W-011)。
[0036] 實(shí)施例2用轉(zhuǎn)錄活性較弱的啟動(dòng)子替換tdcD的上游調(diào)控序列 將弱轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子并委托中科院微生物所合成并構(gòu)建入地OV-Up-P-Down質(zhì)粒中，來替換 菌株tdcD基因 ORF上游33化P的野生型的啟動(dòng)子區(qū)域，W減弱野生型tdcD基因的表達(dá)強(qiáng)度。
[0037] 將構(gòu)建好的地OV-Up-P-Down質(zhì)粒分別電轉(zhuǎn)化入幾乎不產(chǎn)心色氨酸的E. COli K12 W3110菌株（可購(gòu)自日本技術(shù)評(píng)價(jià)研究所生物資源中屯、（NITE Biological Resource Center,NBRC))和高產(chǎn)心色氨酸的E. coli 1-1703菌株(可購(gòu)自中科院微生物研究所，其為 經(jīng)E. COli K12 W3110誘變突變得到的心色氨酸生產(chǎn)工程菌，經(jīng)測(cè)序保留了野生型的tdcD 的上游序列）中，分別得到tdcD啟動(dòng)子突變的（低/高產(chǎn)k色氨酸）大腸桿菌，分別記為YPT-W-IOl(來自E. COli K12 W3110菌株)和YPT-W-Ill(來自E. COli 1-1703)。
[00；3 引 實(shí)施例3色氨酸發(fā)酵實(shí)驗(yàn) 將E. COli K12 W3110菌株和E. COli 1-1703W及實(shí)施例1、2制備的菌株分別接種在 25mL表1所述的種子培養(yǎng)基中，于37°C、220巧m培養(yǎng)8 h。然后取1 mL種子培養(yǎng)基的培養(yǎng)物接 種在25 mL表1所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中，于37°C、220rpm培養(yǎng)培養(yǎng)36 h。當(dāng)培養(yǎng)完成時(shí)，通過 HPLC測(cè)定^色氨酸的產(chǎn)生。 <51 擊i + 立単慧耐古
結(jié)呆觀巧所不，巧巧本友明的例運(yùn)，巧勃酸友醉重得判J巧局，兀具巧n于個(gè)廣巧勃 酸的菌株，提高心色氨酸的產(chǎn)量的提高非常可觀，盡管絕對(duì)提高量比不過高產(chǎn)菌株，但是相 對(duì)提高量卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于高產(chǎn)菌株。
[0040]表2色氨酸發(fā)酵量
實(shí)施例4色氨酸提取實(shí)驗(yàn) 本發(fā)明的色氨酸分離提取工藝采用禪合分離工藝，其工藝流程如圖I所示，具體而言， 該工藝包括W下步驟： 第一步、對(duì)直接發(fā)酵法產(chǎn)生的含有k色氨酸發(fā)酵液進(jìn)行預(yù)處理:處理方式為分別加入 發(fā)酵液體積0.1 %~1.0 %的明抓和發(fā)酵液體積0.1 %~1.0 %的化HS03后，攬拌并加熱到40~ 80°C，制為處理液； 第二步、將處理液累入陶瓷納濾膜過濾器，得到除去菌體的色氨酸微濾液W及菌體蛋 白； 第=步、將色氨酸微濾液累入閃蒸脫氣機(jī)進(jìn)行脫氣處理，得到進(jìn)色譜前的預(yù)處理液； 第四步、將色譜預(yù)處理液累入SSMB色譜系統(tǒng)，使料液中的色氨酸和其他雜質(zhì)在色譜體 系下進(jìn)行有效分離，同時(shí)在0.05-0.8%氨水的作用下，將色氨酸進(jìn)行解脫，得到純度更高的 色氨酸提取液;具體色譜分離流程如下： 如圖2所示，k色氨酸色譜分離流程分為W下幾個(gè)步驟： 第1步物料循環(huán)無進(jìn)無出：間隙體積的移動(dòng)，同體積的物料在各柱內(nèi)置換； 第2步進(jìn)料/吸附物料由3區(qū)進(jìn)入柱內(nèi)，殘液由3區(qū)出料； 第3步提取液收集/解吸洗提液由1區(qū)進(jìn)入，提取液由1區(qū)收集;其中，第2步和第3步同 時(shí)進(jìn)行W提高產(chǎn)能。程序中會(huì)使2,3運(yùn)兩步的生產(chǎn)時(shí)間相同。該步驟進(jìn)行時(shí)，2區(qū)和4區(qū)無 任何操作； 第4步殘液收集洗提液由1區(qū)進(jìn)入，殘液由3區(qū)排出并收集。該步驟下，4區(qū)無任何操 作;不同的區(qū)帶中色譜柱通過進(jìn)料口和出料口自動(dòng)閥切換； 第五步、將色譜提取液通過預(yù)熱器換熱后累入二效降膜式蒸發(fā)器，使料液濃度由1.5% 提高至5%，再經(jīng)過雙效結(jié)晶器進(jìn)行濃縮結(jié)晶，結(jié)晶出料溫度控制65°C左右； 第六步、將結(jié)晶漿料累入拉冷罐進(jìn)行梯度降溫，終點(diǎn)溫度控制在18-20°C，降溫前用硫 酸調(diào)pH至6.0-7.0,溫度降到后使用平板刮刀離屯、機(jī)進(jìn)行離屯、分離，晶體水分控制在10-30%； 第屯步、將離屯、機(jī)分離得到的濕晶體用螺旋輸送器輸送到閃蒸干燥系統(tǒng)，在氣流作用 下，中細(xì)顆粒直接進(jìn)入上部氣流干燥機(jī)烘干;大塊料向下落入攬拌器內(nèi)，在攬拌器作用下， 大塊料被打碎，小顆粒料順著氣流干燥管烘干，進(jìn)入旋風(fēng)分離器、空屯、漿葉冷卻機(jī)冷卻;經(jīng) 冷卻后再經(jīng)過振動(dòng)篩的篩分進(jìn)入料倉(cāng)進(jìn)行包裝，烘干成品水分控制在含0.5%。
[0041] 第八步、離屯、分離得到的一次母液經(jīng)過10%的粉狀活性炭脫色，脫色溫度65-70°C， 脫色時(shí)間60min，脫色液經(jīng)壓濾機(jī)過濾后進(jìn)入母液結(jié)晶系統(tǒng)。
[0042] 第九步、SSMB色譜分離的殘液與離屯、分離的二次母液一起經(jīng)過濃縮，噴漿造粒工 藝制成生物肥料，減少=廢的排放。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 發(fā)酵生產(chǎn)L-色氨酸的方法，其包括： (1) 改造細(xì)菌染色體上的野生型的tdcD基因，使改造獲得的細(xì)菌的tdcD酶的表達(dá)量和/ 或酶活性降低，優(yōu)選消失，更優(yōu)選徹底消失;和， (2) 用步驟（1)改造而得到的細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)L-色氨酸。2. 發(fā)酵生產(chǎn)L-色氨酸的方法，其包括： (1) 改造細(xì)菌染色體上tdcD基因的野生型的調(diào)控元件(如，啟動(dòng)子），使改造獲得的細(xì)菌 的該調(diào)控元件對(duì)其下游酶基因的表達(dá)啟動(dòng)能力減弱但不消失;和， (2) 用步驟（1)改造而得到的細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)L-色氨酸。3. 權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述細(xì)菌是埃希氏菌屬細(xì)菌，優(yōu)選是大腸桿菌。4. 權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述下游酶基因是tdcD基因。5. 分離提取L-色氨酸的方法，其包括： (一） 向含有L-色氨酸的發(fā)酵液加入明研^PNaHS〇3后，攪拌并加熱； (二) 納濾(如用陶瓷納濾膜納濾）以分離得到色氨酸微濾液和菌體蛋白（所述菌體蛋白 進(jìn)一步制成尚蛋白伺料）； (三) 用閃蒸脫氣機(jī)對(duì)所述色氨酸微濾液脫氣； (四） 將脫氣的色氨酸微濾液進(jìn)行色譜分離，得到色氨酸提取液； (五) 將所述色譜提取液蒸發(fā)至其色氨酸濃度提高至5%，再通過雙效結(jié)晶器進(jìn)行濃縮結(jié) 晶； (六) 將所述結(jié)晶獲得的漿料用酸（如，硫酸）調(diào)節(jié)pH至6.0~7.0,然后進(jìn)行梯度降溫，終 點(diǎn)溫度控制在18~40°C，再進(jìn)行離心分離； (七) 對(duì)所述離心分離獲得的濕晶體閃蒸干燥，獲得含水率0.5~1.0%的色氨酸晶體； (八) 對(duì)所述離心分離獲得的一次母液脫色，脫色液過濾后進(jìn)入雙效結(jié)晶器濃縮結(jié)晶并 再進(jìn)行離心分離;和， (九) 將所述色譜分離的殘液與所述再進(jìn)行離心分離的二次母液合并制成生物肥料。6. 權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述含有L-色氨酸的發(fā)酵液是通過權(quán)利要求1~4之任 一所述的方法制備的。7. 權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述明礬為所述發(fā)酵液體積的0.1 %~1.0%;所述 NaHS03為所述發(fā)酵液體積的0.1 %~1.0 % ;和/或，所述加熱是加熱到40~80 °C。8. 權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述色譜分離是用SSMB色譜系統(tǒng)進(jìn)行的；和/或，在所 述色譜分離中，以0.05-0.8%氨水將色氨酸進(jìn)行解脫。9. 權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述色譜分離包括： (1) 首尾循環(huán)連接色譜系統(tǒng)的1區(qū)、2區(qū)、3區(qū)和4區(qū)的各層析柱，使得脫氣的色氨酸微濾 液在各層析柱內(nèi)置換循環(huán)，不排出； (2) 切斷各層析柱間連接，對(duì)3區(qū)的層析柱出料； (3 )向1區(qū)的層析柱加入0.05-0.8%氨水，并收集1區(qū)的層析柱的洗脫液;和， (4)依次連接色譜系統(tǒng)的1區(qū)、2區(qū)和3區(qū)，并收集3區(qū)的層析柱的洗脫液。10. 權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述一次母液經(jīng)過10%的粉狀活性炭脫色，脫色溫度 65-70°C，脫色時(shí)間 60min。
【文檔編號(hào)】C12P13/22GK105861588SQ201610360760
【公開日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2016年5月29日
【發(fā)明人】趙春光, 哈志瑞, 孟剛, 馬文友, 陳崇安, 詹志林, 馬吉銀
【申請(qǐng)人】寧夏伊品生物科技股份有限公司