一種鱘魚(yú)性別差異性分子標(biāo)記及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種鱘魚(yú)性別差異性分子標(biāo)記及其應(yīng)用，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述SEQ ID NO.1所示的DNA序列采用PCR引物檢測(cè)，根據(jù)PCR檢測(cè)結(jié)果鑒定鱘魚(yú)的性別，PCR引物的正向引物為F：5’-CACACTGATGCTCTACATGT-3’和反向引物R：5’-AGGCTGGACAGTGATGCTGT-3’，分別如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。本發(fā)明提供了用于檢測(cè)鱘魚(yú)性別的核酸片段以及用于檢測(cè)與鱘魚(yú)相關(guān)的分子標(biāo)記的PCR引物，該分子標(biāo)記不受鱘魚(yú)的年齡限制，準(zhǔn)確可靠，操作方便，在生產(chǎn)方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
【專利說(shuō)明】
一種鱘魚(yú)性別差異性分子標(biāo)記及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種鋳魚(yú)性別差異性分子標(biāo)記及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]鋳魚(yú)，為大型軟骨硬鱗魚(yú)類，營(yíng)養(yǎng)及經(jīng)濟(jì)價(jià)值高，還可以作為觀賞魚(yú)類，性成熟時(shí)間長(zhǎng)，一般最少5年以上，有的甚至達(dá)到15年之久，而鋳魚(yú)沒(méi)有第二性征，且幼魚(yú)期只有一個(gè)“同樣”的性腺，而區(qū)分鋳魚(yú)的性別對(duì)鋳魚(yú)的養(yǎng)殖和加工業(yè)都具有非常重要的意義。
[0003]目前，鋳魚(yú)的性別鑒定的方法主要有微創(chuàng)手術(shù)法、內(nèi)窺鏡技術(shù)、超聲波鑒定法、血液生化及激素指標(biāo)法。微創(chuàng)手術(shù)法是鋳魚(yú)性別鑒定的常規(guī)方法，首先將鋳魚(yú)麻醉，然后用解剖刀在腹鰭前第4-5腹骨板間切一小口，用挖卵器取出性腺組織用肉眼在顯微鏡下進(jìn)行觀察，鑒別性別或者性腺的發(fā)育時(shí)期，此種方法容易造成鋳魚(yú)的死亡，而且鋳魚(yú)個(gè)體必須性腺發(fā)育，且對(duì)操作者經(jīng)驗(yàn)水平要求高。內(nèi)窺鏡技術(shù)是將窺鏡軸從鋳魚(yú)生殖孔插入，使其前段緊貼性腺組織，通過(guò)目鏡或外接成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察，該方法同樣受個(gè)體大小限制，而且鑒別率低，操作經(jīng)驗(yàn)要求高。超聲鑒別法是利用超聲波的手段捕捉鋳魚(yú)內(nèi)臟器官的圖像，然后分析得到結(jié)果，受腹部組織阻擋影響，同樣鑒別率低，而且性腺發(fā)育不同程度對(duì)結(jié)果也產(chǎn)生影響。血液生化及激素指標(biāo)法則是根據(jù)鋳魚(yú)性腺發(fā)育的時(shí)期某些激素及生化指標(biāo)的波動(dòng)來(lái)檢測(cè)鋳魚(yú)的性別，該方法不穩(wěn)定，需要探討的指標(biāo)多，而且檢測(cè)程序復(fù)雜。
[0004]鋳魚(yú)的性別由基因決定，而分子標(biāo)記(molecular markers)，是以個(gè)體間遺傳物質(zhì)內(nèi)核苷酸序列變異為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記，是DNA水平遺傳多態(tài)性的直接的反映。與其他幾種遺傳標(biāo)記一一形態(tài)學(xué)標(biāo)記、生物化學(xué)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記相比，DNA分子標(biāo)記具有的優(yōu)越性有:大多數(shù)分子標(biāo)記為共顯性，對(duì)隱性的性狀的選擇十分便利；基因組變異極其豐富，分子標(biāo)記的數(shù)量幾乎是無(wú)限的；在生物發(fā)育的不同階段，不同組織的DNA都可用于標(biāo)記分析；分子標(biāo)記揭示來(lái)自DNA的變異；表現(xiàn)為中性，不影響目標(biāo)性狀的表達(dá)；檢測(cè)手段簡(jiǎn)單、迅速。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測(cè)鋳魚(yú)性別的核酸片段，該核酸片段的序列如SEQ ID N0.1所示，基因組DNA中含有該核酸片段的鋳魚(yú)為雄魚(yú)，反之則為雌魚(yú)。
[0006]本發(fā)明的另一目的是提供用于檢測(cè)與鋳魚(yú)相關(guān)的分子標(biāo)記的PCR引物，利用該P(yáng)CR引物鑒定鋳魚(yú)性別。
[0007]本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
[0008]一種鋳魚(yú)性別差異性分子標(biāo)記，核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0009]作為優(yōu)選，所述SEQ ID N0.1所示的DNA序列采用PCR引物檢測(cè)，根據(jù)PCR檢測(cè)結(jié)果鑒定鋳魚(yú)的性別。
[0010]作為優(yōu)選，所述PCR引物的正向引物為F:5’ -CACACTGATGCTCTACATGT-3’和反向引物 R:5，-AGGCTGGACAGTGATGCTGT-3’，分別如 SEQ ID N0.2 和 SEQ ID N0.3 所示。
[0011]一種檢測(cè)鋳魚(yú)性別的方法，包括以下步驟:
[0012](I)提取待測(cè)鋳魚(yú)的基因組DNA ;
[0013](2)以待測(cè)鋳魚(yú)的基因組DNA為模板，利用引物F和R，通過(guò)PCR反應(yīng)擴(kuò)增出鋳魚(yú)如 SEQ ID N0.1 所示的核酸片段，其中，F(xiàn):5’ -CACACTGATGCTCTACATGT-3’，R:5’ -AGGCTGGACAGTGATGCTGT-3’ ；
[0014](3)采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，如果有286bp (接近300bp)的電泳條帶，則是雄性鋳魚(yú)；如果沒(méi)有286bp(接近300bp)的電泳條帶，則是雌性鋳魚(yú)。
[0015]作為優(yōu)選，所述步驟⑵中PCR反應(yīng)使用的擴(kuò)增體系以25 μ I計(jì)為:50_100ng/ μ I模板DNAl 4 1，10?11101/^1引物？和1?各14 1，10臟01/1 dNTP mix2.0 μ 1，5U/μ I Taq DNA聚合酶0.125 μ 1，10XPCR反應(yīng)緩沖液2.5 μ I，余量為雙蒸水。
[0016]作為優(yōu)選，所述步驟(2)中PCR反應(yīng)的條件為:94°C 5分鐘；進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的940C 30 秒，55°C 30 秒，72°C 30 秒；72°C 5 分鐘。
[0017]綜上所述，由于采用了上述技術(shù)方案，本發(fā)明的有益效果是:
[0018](I)本發(fā)明提供的分子標(biāo)記不受鋳魚(yú)的年齡限制，可用于鋳魚(yú)的早期選擇，可顯著提尚鋳魚(yú)養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)效益。
[0019](2)本發(fā)明提供了用于檢測(cè)與鋳魚(yú)相關(guān)的分子標(biāo)記的PCR引物來(lái)檢測(cè)鋳魚(yú)的性另IJ，如SEQ ID N0.1所示的DNA序列的方法準(zhǔn)確可靠，操作方便，在生產(chǎn)方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
[0020](3)本發(fā)明提供了用于檢測(cè)鋳魚(yú)性別的核酸片段，如SEQ ID N0.1所示的DNA序列的檢測(cè)，為鋳魚(yú)的性別鑒定提供了科學(xué)依據(jù)。
【附圖說(shuō)明】
[0021 ]圖1是本發(fā)明中的實(shí)施例2中的電泳膠圖；
[0022]圖2是本發(fā)明中的實(shí)施例3中的電泳膠圖；
[0023]其中，中間泳道為分子量Marker，Marker最上面一條帶為1500bp，最下面一條帶為lOObp，膠圖Marker左側(cè)為雄魚(yú)，右側(cè)為雌魚(yú)。
【具體實(shí)施方式】
[0024]本說(shuō)明書(shū)中公開(kāi)的所有特征，或公開(kāi)的所有方法或過(guò)程中的步驟，除了互相排斥的特征和/或步驟以外，均可以以任何方式組合。
[0025]本說(shuō)明書(shū)(包括任何附加權(quán)利要求、摘要)中公開(kāi)的任一特征，除非特別敘述，均可被其他等效或具有類似目的的替代特征加以替換。即，除非特別敘述，每個(gè)特征只是一系列等效或類似特征中的一個(gè)例子而已。
[0026]實(shí)施例1與鋳魚(yú)性別相關(guān)的分子標(biāo)記的獲得
[0027]1.1已知性別鋳魚(yú)群體的獲得
[0028]所采用的群體為江蘇某鋳魚(yú)養(yǎng)殖場(chǎng)已知性別的史氏鋳，雌雄魚(yú)各有50尾。剪取魚(yú)體背鰭鰭條于95%乙醇_20°C保存，用于基因組DNA提取。
[0029]1.2鋳魚(yú)基因組DNA提取
[0030]本試驗(yàn)采用常規(guī)酚氯仿方法抽提鋳魚(yú)鰭條中的基因組DNA，具體步驟如下:
[0031](I)取0.3?0.5g鰭條于1.5ml Eppendorf管中，剪碎，在超凈工作臺(tái)上開(kāi)蓋干燥20min ；
[0032](2)待乙醇基本揮發(fā)后，TE 緩沖液(10mmol/ml Tris、lmmol/ml EDTA、SDS 5%,pH=8.0)洗滌 I ?2 次，再加入 600 μ I DNA 抽提液(0.001mol/L Tris-CU0.lmol/L EDTA、SDS 5%，pH = 8.0)和 3 μ I 蛋白酶 k(200mg/ml)，55°C水浴消化 3h 左右，前 30min 每 1min
輕搖離心管I次，消化至管內(nèi)液體澄清；
[0033](3)加入自配酚氯仿溶液(酚:氯仿:異戊醇=25: 24: 1)600 μ 1，輕輕來(lái)回顛倒離心管lOmin，12000r離心lOmin，取上層水相用等體積上述酸氯仿再抽提，直至水相與有機(jī)相之間沒(méi)有白色沉淀；
[0034](4)再用氯仿抽提I次，取出上清液，加入2倍體積已預(yù)冷的無(wú)水乙醇沉淀DNA，顛倒混勻，4°C靜置30min，12000r離心lOmin，沉淀再用70 %乙醇洗滌，離心晾干沉淀后加50 μ I無(wú)菌水溶解，4°C保存?zhèn)溆没?20°c長(zhǎng)期保存。
[0035]1.3 米用 RAD 測(cè)序(Restrict1n-site Associated DNA，酶切位點(diǎn)相關(guān)DNA)獲得雄性鋳魚(yú)特異的DNA片段
[0036]基于Hiseq2000高通量測(cè)序平臺(tái)，對(duì)每個(gè)個(gè)體進(jìn)行RAD測(cè)序，測(cè)序策略為PE91bp，每個(gè)個(gè)體產(chǎn)生30M左右的reads，對(duì)雌雄魚(yú)之間的reads進(jìn)行比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)有I對(duì)reads只存在于雄性個(gè)體，而在雌性個(gè)體不存在，這對(duì)reads的序列分別如SEQ ID N0.4和SEQ IDN0.5所示。
[0037]實(shí)施例2與鋳魚(yú)性別相關(guān)的分子標(biāo)記的驗(yàn)證
[0038]2.1提取待驗(yàn)證鋳魚(yú)鰭條中的基因組DNA
[0039]待驗(yàn)證鋳魚(yú)為實(shí)施例1中的群體，雌雄分別隨機(jī)挑選12尾，DNA抽提方法如實(shí)施例I中所述。
[0040]2.2擴(kuò)增含雄性特異性reads的核苷酸片段
[0041]根據(jù)雄魚(yú)特異性reads的DNA序列SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.5分別設(shè)計(jì)引物，引物序列如SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.3所示。以2.1中的基因組DNA為模板，PCR反應(yīng)體系以 25 μ I 計(jì)為:50-100ng/ μ I 模板 DNAl μ 1，1pmoI/ μ I 引物 F 和 R 各 I μ 1，1mmol/L dNTP mix 2.0 μ I, 5U/μ I Taq DNA 聚合酶 0.125 μ 1，10XPCR 反應(yīng)緩沖液 2.5 μ 1，余量為雙蒸水；PCR反應(yīng)條件為:94°C 5分鐘；進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的94°C 30秒，55°C 30秒，72°C 30秒；72°C 5分鐘。其中，雄魚(yú)可擴(kuò)增出特異的核苷酸片段，序列如SEQ ID N0.1所示，雌魚(yú)則無(wú)此擴(kuò)增產(chǎn)物。擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖譜如附圖1所示，膠圖中間泳道為分子量Marker，Marker最上面一條帶為1500bp，最下面一條帶為100bp，每條帶間隔100bp。膠圖Marker左側(cè)為雄魚(yú)，右側(cè)為雌魚(yú)，雄魚(yú)可擴(kuò)增得到一條明顯的接近300bp的條帶，雌魚(yú)無(wú)明顯的擴(kuò)增條帶。
[0042]實(shí)施例3與鋳魚(yú)性別相關(guān)的分子標(biāo)記的應(yīng)用
[0043]3.1提取待測(cè)鋳魚(yú)鰭條中的基因組DNA
[0044]待測(cè)鋳魚(yú)為浙江某鋳魚(yú)養(yǎng)殖場(chǎng)的已知性別的史氏鋳，雌雄分別隨機(jī)挑選12尾，DNA抽提方法如實(shí)施例1中所述。
[0045]3.2擴(kuò)增鋳魚(yú)性別相關(guān)的分子標(biāo)記
[0046]采用序列如SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.3所示的引物，以3.1中的基因組DNA為模板，采用2.2中的PCR反應(yīng)體系和條件。結(jié)果顯示，能擴(kuò)增出286bp條帶的為雄魚(yú)，雌魚(yú)則無(wú)此擴(kuò)增產(chǎn)物。擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖譜如附圖2所示，膠圖中間泳道為分子量Marker，Marker最上面一條帶為1500bp，最下面一條帶為lOObp，每條帶間隔lOObp。膠圖Marker左側(cè)為雄魚(yú)，右側(cè)為雌魚(yú)，雄魚(yú)可擴(kuò)增得到一條明顯的接近300bp的條帶，雌魚(yú)無(wú)明顯的擴(kuò)增條帶。
[0047]以上所述的具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果進(jìn)行了進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，所應(yīng)理解的是，以上所述僅為本發(fā)明的具體實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明。本發(fā)明擴(kuò)展到任何在本說(shuō)明書(shū)中披露的新特征或任何新的組合，以及披露的任一新的方法或過(guò)程的步驟或任何新的組合。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種鋳魚(yú)性別差異性分子標(biāo)記，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。2.如權(quán)利要求1所述的一種鋳魚(yú)性別差異性分子標(biāo)記，其特征在于，所述SEQID N0.1所示的DNA序列采用PCR引物檢測(cè)，根據(jù)PCR檢測(cè)結(jié)果鑒定鋳魚(yú)的性別。3.如權(quán)利要求1所述的一種鋳魚(yú)性別差異性分子標(biāo)記，其特征在于，所述PCR引物的正向引物為 F:5’ -CACACTGATGCTCTACATGT-3’ 和反向引物 R:5’ -AGGCTGGACAGTGATGCTGT-3’，分別如 SEQ ID N0.2 和 SEQ ID N0.3 所示。4.一種檢測(cè)鋳魚(yú)性別的方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)提取待測(cè)鋳魚(yú)的基因組DNA; (2)以待測(cè)鋳魚(yú)的基因組DNA為模板，利用引物F和R，通過(guò)PCR反應(yīng)擴(kuò)增出鋳魚(yú)如 SEQ ID N0.1 所示的核酸片段，其中，F(xiàn):5’ -CACACTGATGCTCTACATGT-3’，R:5’ -AGGCTGGACAGTGATGCTGT-3’ ； (3)采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，如果有286bp(接近300bp)的電泳條帶，則是雄性鋳魚(yú)；如果沒(méi)有286bp(接近300bp)的電泳條帶，則是雌性鋳魚(yú)。5.如權(quán)利要求4所述的一種檢測(cè)鋳魚(yú)性別的方法，其特征在于，所述步驟⑵中PCR反應(yīng)使用的擴(kuò)增體系以25 μ I計(jì)為:50-100ng/ μ I模板DNAl μ 1，1pmoI/ μ I引物F和R各I μ 1，1mmoI/L dNTP mix 2.0 μ 1，5U/ μ I Taq DNA 聚合酶 0.125 μ 1，1XPCR 反應(yīng)緩沖液2.5 μ 1，余量為雙蒸水。6.如權(quán)利要求4所述的一種檢測(cè)鋳魚(yú)性別的方法，其特征在于，所述步驟⑵中PCR反應(yīng)的條件為:94°C 5分鐘；進(jìn)行30個(gè)循環(huán)的94°C 30秒，55°C 30秒，72°C 30秒；72°C 5分鐘。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK105861642SQ201510075500
【公開(kāi)日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2015年2月11日
【發(fā)明人】石瓊, 游欣欣, 徐軍民, 阮志強(qiáng), 馬興宇
【申請(qǐng)人】華大(鎮(zhèn)江)水產(chǎn)科技產(chǎn)業(yè)有限公司