與玉米南方銹病基因緊密連鎖的分子標(biāo)記組合及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了與玉米南方銹病基因緊密連鎖的分子標(biāo)記組合，包括分子標(biāo)記P2.913，擴(kuò)增該分子標(biāo)記P2.913的一對(duì)引物序列如SEQ ID NO:1和2所示。還包括分子標(biāo)記P2.649，擴(kuò)增該分子標(biāo)記P2.649的一對(duì)引物序列如SEQ ID NO:3和4所示。還包括分子標(biāo)記P3.187，擴(kuò)增該分子標(biāo)記P3.187的一對(duì)引物序列如SEQ ID NO:5和6所示。本發(fā)明還公開了該分子標(biāo)記組合在玉米南方銹病基因定位和玉米遺傳育種中的應(yīng)用。本發(fā)明用于培育玉米南方銹病抗性株系，拓寬了玉米抗病資源種質(zhì)研究的方法，明確了玉米抗南方銹病性狀的遺傳規(guī)律，對(duì)于玉米抗病機(jī)制的理論研究具有極大地指導(dǎo)意義。
【專利說明】
與玉米南方誘病基因緊密連鎖的分子標(biāo)巧組合及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種與玉米南方誘病基因緊密連鎖的分子標(biāo)記組合及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 玉米是重要的糧飼兼用作物，是人類和動(dòng)物的重要食物來源，同時(shí)也是工業(yè)原料 和能源植物，在國(guó)民經(jīng)濟(jì)中占有重要的地位。2009年W來，我國(guó)玉米播種面積已經(jīng)超過水 稻，成為第一大糧食作物。在玉米生產(chǎn)過程中，病害的發(fā)生與流行是我國(guó)玉米生產(chǎn)的重要限 制因素之一。在我國(guó)，玉米生產(chǎn)中發(fā)生的病害約30余種（王曉鳴2001)，常年發(fā)生條件下，玉 米病蟲害造成的損失為10%-20%，大發(fā)生時(shí)高達(dá)30-50%，甚至絕收(王振營(yíng)1998)。近年 來，隨著全球氣候和農(nóng)業(yè)耕作制度的改變W及品種的更新?lián)Q代，玉米病蟲害也發(fā)生了明顯 的改變。原有的一些次要病害如莖腐病、粗縮病、絲黑穗病和南方誘病等正在逐漸上升為目 前為害玉米的主要病害，對(duì)玉米的安全生產(chǎn)構(gòu)成了很大的威脅(王曉鳴2006;石潔2005)。
[0003] 選育和推廣抗病的優(yōu)良品種，仍然是玉米改良的重要目標(biāo)之一。近十幾年來在育 成的新品種中，其單產(chǎn)水平并沒有顯著提高，運(yùn)些新品種之所W比對(duì)照品種增產(chǎn)10% W上， 并獲得審定推廣，抗病性喪失而導(dǎo)致對(duì)照品種產(chǎn)量迅速下降是重要的原因之一。然而，由于 育種工作者在抗病性上取得了重要的進(jìn)展，及時(shí)地育成了較抗病的新品種，才保證了玉米 單產(chǎn)在栽培條件不斷改進(jìn)的基礎(chǔ)上(如化肥投入增加和種植密度增大)獲得穩(wěn)定的提高。持 久提高玉米自交系和雜交種的抗病性，保證玉米生產(chǎn)的持續(xù)和穩(wěn)定的增長(zhǎng)，是育種工作始 終不能放松的主攻目標(biāo)。因此，拓寬玉米抗病資源的種質(zhì)基礎(chǔ)，明確抗病性狀的遺傳規(guī)律， 加強(qiáng)玉米抗病機(jī)制的理論研究，仍然是進(jìn)行抗病育種的基礎(chǔ)性工作。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的一個(gè)目的是解決至少上述問題和/或缺陷，并提供至少后面將說明的優(yōu) 點(diǎn)。
[0005] 本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供一種與玉米南方誘病基因緊密連鎖的分子標(biāo)記組合。
[0006] 本發(fā)明再有一個(gè)目的是提供上述的分子標(biāo)記組合在玉米南方誘病基因定位和玉 米遺傳育種中的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：
[000引與玉米南方誘病基因緊密連鎖的分子標(biāo)記組合，所述分子標(biāo)記組合包括SSR分子 標(biāo)記P2.913,擴(kuò)增該分子標(biāo)記P2.913的一對(duì)引物序列如SEQ ID NO: 1和2所示。
[0009] 優(yōu)選的是，所述的與玉米南方誘病基因緊密連鎖的分子標(biāo)記組合中，所述分子標(biāo) 記組合還包括SSR分子標(biāo)記P2.649，擴(kuò)增該分子標(biāo)記P2.649的一對(duì)引物序列如沈Q ID NO: 3 和4所示。
[0010] 優(yōu)選的是，所述的與玉米南方誘病基因緊密連鎖的分子標(biāo)記組合中，所述分子標(biāo) 記組合還包括SSR分子標(biāo)記P3.187,擴(kuò)增該分子標(biāo)記P3.187的一對(duì)引物序列如沈Q ID N0:5 和6所示。
[0011] 本發(fā)明還提供上述的分子標(biāo)記組合在玉米南方誘病基因定位和玉米遺傳育種中 的應(yīng)用。
[0012] 優(yōu)選的是，所述分子標(biāo)記組合在玉米品種CML496中用于其玉米南方誘病基因的定 位。
[0013] 本發(fā)明至少包括W下有益效果：
[0014] 本發(fā)明提供了與玉米南方誘病基因緊密連鎖的分子標(biāo)記組合，該分子標(biāo)記組合可 指示玉米株系中的抗南方誘病基因，能夠用于培育玉米南方誘病抗性株系，拓寬了玉米抗 病資源種質(zhì)研究的方法，明確了玉米抗南方誘病性狀的遺傳規(guī)律，對(duì)于玉米抗病機(jī)制的理 論研究具有極大地指導(dǎo)意義。
[0015] 本發(fā)明的其它優(yōu)點(diǎn)、目標(biāo)和特征將部分通過下面的說明體現(xiàn)，部分還將通過對(duì)本 發(fā)明的研究和實(shí)踐而為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所理解。
【附圖說明】
[0016] 圖IA為2012年海南樂東種植的103份自交系的抗性表型調(diào)查結(jié)果。
[0017] 圖IB為2013年海南樂東種植的103份自交系的抗性表型調(diào)查結(jié)果。
[0018] 圖IC為2012和2013年海南樂東種植的103份自交系抗性平均值的次數(shù)分布圖。 [0019]圖2為本發(fā)明中幾個(gè)親本間的表型抗性調(diào)查圖。
[0020] 圖3為(CML496 X Z肥NG58) X Z肥NG58群體抗病區(qū)域分子標(biāo)記遺傳連鎖圖譜。
[0021] 圖4為(CML496XGems41) XGems41群體抗病區(qū)域分子標(biāo)記遺傳連鎖圖譜。
[0022] 圖5為(CML496XLx9801) XLx9801群體抗病區(qū)域分子標(biāo)記遺傳連鎖圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0023] 下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，W令本領(lǐng)域技術(shù)人員參照說明書文 字能夠據(jù)W實(shí)施。
[0024] 應(yīng)當(dāng)理解，本文所使用的諸如"具有"、"包含"W及"包括"術(shù)語并不配出一個(gè)或多 個(gè)其它元件或其組合的存在或添加。
[0025] 玉米種質(zhì)基礎(chǔ)狹窄、缺乏鑒定的高抗材料，是抗玉米抗病育種難W取得突破的重 要原因。因此，挖掘和鑒定新的抗玉米矮花葉病種質(zhì)資源、拓寬玉米種質(zhì)基礎(chǔ)是進(jìn)行抗病育 種工作的重要內(nèi)容。
[00%]本發(fā)明提供與玉米南方誘病基因緊密連鎖的分子標(biāo)記組合，所述分子標(biāo)記組合包 括SSR分子標(biāo)記P2.913，擴(kuò)增該分子標(biāo)記P2.913的一對(duì)引物序列如SEQ ID NO: 1和2所示。
[0027] 在本發(fā)明的其中一個(gè)實(shí)施例中，作為優(yōu)選，所述分子標(biāo)記組合還包括SSR分子標(biāo)記 P2.649,擴(kuò)增該分子標(biāo)記P2.649的一對(duì)引物序列如SEQ ID N0:3和4所示。
[0028] 在本發(fā)明的其中一個(gè)實(shí)施例中，作為優(yōu)選，所述分子標(biāo)記組合還包括SSR分子標(biāo)記 P3.187,擴(kuò)增該分子標(biāo)記P3.187的一對(duì)引物序列如SEQ ID N0:5和6所示。
[0029] 本發(fā)明還提供所述的分子標(biāo)記組合在玉米南方誘病基因定位和玉米遺傳育種中 的應(yīng)用。
[0030] 在本發(fā)明的其中一個(gè)實(shí)施例中，作為優(yōu)選，所述分子標(biāo)記組合在玉米品種CML496 中用于其玉米南方誘病基因的定位。
[00311
[
[0033] 實(shí)施例1
[0034] 本發(fā)明的目的和內(nèi)容
[0035] 基于W上分析，本實(shí)驗(yàn)從我國(guó)玉米種質(zhì)缺乏已鑒定的抗病材料的現(xiàn)狀出發(fā)，通過 抗源篩選和抗源分析，豐富我國(guó)玉米南方誘病的遺傳基礎(chǔ);通過抗病遺傳規(guī)律研究，對(duì)抗病 基因進(jìn)行定位，W獲取到與玉米南方誘病基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，為育種和遺傳分析等 工作提供簡(jiǎn)便方便地序列鑒定。內(nèi)容主要包括：
[0036] 1、通過人工接種鑒定，對(duì)100余份玉米自交系進(jìn)行抗病篩選，并對(duì)其抗病基因的來 源進(jìn)行追蹤分析；
[0037] 2、通過對(duì)鑒定出的兩份綜合農(nóng)藝性狀較好的抗病自交系CML496和P178和感病自 交系Lx9801，Gems41和鄭58組配分離群體，通過對(duì)分離群體的抗性鑒定，并利用微衛(wèi)星分子 標(biāo)記技術(shù)，對(duì)抗病基因進(jìn)行精細(xì)定位。
[0038] 3、對(duì)定位的抗病基因與已知抗病基因進(jìn)行比較分析，鑒定新的位點(diǎn)或者單倍型。
[0039] 2材料和方法
[0040] 2.1供試材料
[0041] 本發(fā)明共采用103份材料用于抗性鑒定和抗源篩選，包括一些國(guó)內(nèi)常見的玉米骨 干自交系、自選系和熱帶亞熱帶材料，2012年11月份和2013年11月份播種于河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 南繁農(nóng)場(chǎng)（海南樂東）。田間試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，每個(gè)環(huán)境2次重復(fù)，株距0.26m，行距 0.67m。
[0042] 對(duì)鑒定出的抗病自交系CML496分別和感病親本Z皿NG58、GEMS41、LX9801雜交，組 配相應(yīng)的Fl群體，并采用相應(yīng)的感病親本和Fl回交，組配3個(gè)BCl分離群體（（CML496 X Z肥NG58) X Z肥NG58，（ CML496 X GEMS41) X GEMS41，（CML496 X LX9801) X LX9801)。對(duì)鑒定出 的抗病自交系P178和感病親本GEMS41雜交，組配相應(yīng)的Fl群體，并采用感病親本GEMS41和 Fl 回交，組配 BCl 分離群體(P178XGEMS41)XGEMS41)。
[0043] 2013年11月份，種植抗病親本，感病親本和相應(yīng)的Fl，BC1群體于河南農(nóng)業(yè)大學(xué)南 繁實(shí)驗(yàn)基地，抗病和感病親本各種植20株，F(xiàn)l種植30-40株，BCl種植80-100株，肥水管理按 照常規(guī)進(jìn)行。
[0044] 2.2接種方法
[0045] 收集感病葉片上的南方玉米誘病病原菌放入無菌水中，井加入幾滴Tween-20(每 100mL水中加3-4滴Tween-20)，菌液濃度為100倍顯徽鏡下每視野有40-45個(gè)抱子。采用葉片 噴霧的接種方法進(jìn)行接種鑒定:在大田玉米的小卿趴口時(shí)期，進(jìn)行噴霧接種，并在接種后5-7天補(bǔ)接一次，確保充分發(fā)病。
[0046] 2.3調(diào)查和記錄標(biāo)準(zhǔn)
[0047] 在玉米散粉后20-30天進(jìn)行南方誘病抗性調(diào)查。并根據(jù)玉米穗即十的葉片發(fā)病面積 進(jìn)行抗性分級(jí)。采用1-9級(jí)的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，即：1級(jí):無癥狀;2級(jí)：發(fā)病面積占葉片總面積的1-3%，局部組織有稱綠壞死斑;3級(jí):發(fā)病面積占葉片面積的4-10% ; 4級(jí):發(fā)病面積占葉片面 積的10-25% ;5級(jí):發(fā)病面積占葉片面積的26-40% ;6級(jí):發(fā)病面積占葉片面積的41-55% ;7 級(jí):發(fā)病面積占葉片面積的56-70% ;8級(jí):發(fā)病面積占葉片面積的71-85% ;9級(jí):發(fā)病面積占 葉片面積的86-100 %。
[004引2.4數(shù)據(jù)分析方法
[0049]對(duì)于骨干自交系的抗病性鑒定，分別調(diào)查每個(gè)環(huán)境中每一個(gè)重復(fù)的表型值，分別 計(jì)算每個(gè)環(huán)境中兩個(gè)重復(fù)的性狀平均數(shù)和兩個(gè)環(huán)境的平均值。應(yīng)用SAS軟件統(tǒng)計(jì)骨干自交 系在各個(gè)環(huán)境的考察性狀均值、變異范圍并繪制各個(gè)性狀分布次數(shù)圖。對(duì)于BCl分離群體， 分別對(duì)每個(gè)單株進(jìn)行編號(hào)，單株進(jìn)行調(diào)查。
[(K)加]2.5植株基因組DNA提取和檢測(cè)
[0化1] W玉米葉片為材料，采用的CTAB法(Sambrook et al 1989)提取種植的親本、F1、 和BCl群體單株DNA。其中，4個(gè)BCl分離群體中，（CML496 X Z皿NG58) X Z皿NG58，（CML496 X GEMS41) XGEMS41，（P178XGEMS41) XGEMS41僅提取極端抗感材料的DNA,而分離群體 (CML496 X LX9801) X LX9801)則采用全部的BCl群體單株進(jìn)行抗病基因定位。SSR引物的名 稱和序列來源于玉米數(shù)據(jù)庫(kù)化ttp ://www.maizeg化.org)，分子標(biāo)記連鎖圖構(gòu)建采用 MAPMAKER/EXP ver.S.O軟件化ander et al.l987)，操作步驟如下：分子標(biāo)記的記錄采用常 規(guī)Mapmaker軟件的記錄方法，用"r表示抗病親本的純合帶型；"2"表示感病親本的純合帶 型，"3"表示雜合帶型。對(duì)于每個(gè)標(biāo)記的帶型在群體中的分布進(jìn)行卡方測(cè)驗(yàn)。首先用"group" 命令化〇D = 3.0)對(duì)所有的標(biāo)記進(jìn)行分組。分組后分別對(duì)每組標(biāo)記用"order"命令進(jìn)行自動(dòng) 排序。對(duì)于無法自動(dòng)排序的group，進(jìn)行手工排序，即應(yīng)用"compare"命令進(jìn)行比較排序，選 定最有可能的一種序列，用"try"命令將該組內(nèi)剩余標(biāo)記逐一添加到該序列中，最后用 "ripple"命令確定每一條染色體上的所有標(biāo)記最佳排列順序。
[0化2] 3結(jié)果分析
[0053] 3.1抗玉米南方誘病材料的鑒定和篩選
[0化4] 3.1.1抗源鑒定結(jié)果
[0055]在海南樂東河南農(nóng)業(yè)大學(xué)南繁試驗(yàn)基地，2012年和2013年分別種植103份自交系， 并通過人工接種鑒定，對(duì)南方誘病的抗性進(jìn)行了調(diào)查?？剐哉{(diào)查結(jié)果的次數(shù)分布圖詳見圖 1A，圖IB和圖1C?？蒞看出，玉米南方誘病的抗性在不同的自交系間表現(xiàn)出廣泛的變異。在 不同年份間，玉米南方誘病的抗性也表現(xiàn)出較大的差異。如2012年玉米南方誘病普遍發(fā)病 較重，在不同自交系間表現(xiàn)出1-9級(jí)的分離，而2013年的田間發(fā)病偏輕，在不同自交系間表 現(xiàn)出1-6級(jí)的分離。
[0056] 圖1A，B，C分別表示2012年海南樂東，2013年海南樂東的抗性表型調(diào)查結(jié)果W及兩 個(gè)環(huán)境抗性平均值的次數(shù)分布圖，其中，橫坐標(biāo)表示發(fā)病的級(jí)別，縱坐標(biāo)表示103份自交系 中相應(yīng)級(jí)別所占的比例。
[0057] 根據(jù)抗性級(jí)別從大到小的順序，W2012和2013年的南方誘病抗性的平均值為基 礎(chǔ)，按照抗性級(jí)別從小到大的順序?qū)?03份材料的抗性進(jìn)行了排序，并根據(jù)抗性表現(xiàn)，把103 份材料分為高抗、抗、中抗、感和高感5種類型。其中，篩選出CML305，CML307，CML411， CML470，CML496，CML497，S37，Pl 7 巧化 22等9 份高抗材料和 526018等 16 份抗病材料，Hua83-2 等12份中抗材料(表3.1)。
[005引表3.1 103份材料的南方誘病抗性鑒定結(jié)果 [0化9]
[0060]
[0061 ] 3.1.2參試材料的系譜分析
[0062] 篩選出的9份高抗材料（CML305，CML307，CML411，CML470，CML496，CML497，S37， P178和K22)，從材料的系譜來源分析，可W看出，其抗性可W追蹤到熱帶材料（CML305， 〔11^307，〔11^411，〔11^470，〔11^496，和〔11^497)或者熱帶改良材料（537，？178和1(22);然而， 化803和化n21-3等運(yùn)兩份熱帶改良材料，也表現(xiàn)出高感南方誘病的特性。在其余的高感南 方誘病材料中，均來自溫帶種質(zhì)。
[0063] 3.2南方誘病主效抗病基因的定位
[0064] 3.2.1多態(tài)性引物的篩選
[00化]2013年11月份在海南種植抗病親本〔11^496和？178感病親本鄭58、66]?541和 1x9801，W及組配的4個(gè)分離群體(群體1: CML496 X Z肥NG58) X Z皿NG58，群體2: (CML496 X GEMS41) XGEMS41，群體3: (CML496XLx9801) XLx9801和群體4: (P178XGEMS41) X GEMS41 )，運(yùn)4個(gè)分離群體分別包括96、56、100和62個(gè)單株。待散粉后20天對(duì)每個(gè)群體內(nèi)的單 株W及相應(yīng)的親本進(jìn)行南方誘病抗性調(diào)查，并對(duì)單株進(jìn)行編號(hào)取樣，用于DNA的提取。
[0066] 根據(jù)已經(jīng)報(bào)道的抗南方誘病基因定位的研究結(jié)果，本研究用于抗病親本篩選的引 物來源分為3個(gè)部分，1)玉米數(shù)據(jù)庫(kù)中的第10染色體上10.00-10.02區(qū)域的已有的SSR引物， 2)已經(jīng)發(fā)表文章中的抗誘病的分子標(biāo)記，3)根據(jù)玉米基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中10.00-10.02區(qū)域的 基因組數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)的SSR引物。共采用了 15對(duì)標(biāo)記，分布在玉米基因組的2.14-4.70Mb范圍內(nèi)， 對(duì)抗病親本CML496和感病親本Z肥NG58、GEMS41和Lx9801之間的多態(tài)性進(jìn)行了篩選，共篩選 出R畑64、？091、？092、6047和11111。2053共5個(gè)多態(tài)性的分子標(biāo)記，分別在1個(gè)或2個(gè)分離群體的 親本間存在多態(tài)性，可W用于后續(xù)的群體基因組擴(kuò)增。引物名稱、序列、物理位置和群體間 的多態(tài)性詳見表3.2。
[0067] 表3.2 BCl群體親本間分子標(biāo)記信息 [006引
[(
[0070] 3.2.2自交系CML496抗南方誘病基因的定位
[0071] 2013年11月份，于河南農(nóng)業(yè)大學(xué)南繁基地種植親本CML496、Z肥NG58、GEMS41、 Lx9801 和3個(gè)BCl群體（群體1: CML496 X Z皿NG58) X Z皿NG58，群體2: (CML496 XGEMS41) X GEMS41，群體3:(CML496XLx9801)XLx9801)。其中群體l包括96個(gè)單株，群體2包括56個(gè)單 株，群體3包括100個(gè)單株。散粉后25天調(diào)查親本及BCl分離群體中每個(gè)單株的南方誘病抗 性，并提取親本和BCl分離群體中的單株DNA，用于抗病基因的定位。親本間的表型抗性調(diào)查 表明，親本CML496高抗南方誘病，Z肥NG58、Gems41和Lx9801高感南方誘病(見圖2)。
[0072] 3.2.2.1利用回交群體1進(jìn)行抗南方誘病基因的定位
[0073] 在96個(gè)BCl分離群體單株中，共有32個(gè)單株表現(xiàn)出極端的抗病或感病類型（10個(gè)高 抗單株和22個(gè)高感單株）。利用3個(gè)在親本間有多態(tài)性的分子標(biāo)記RRD64，P092,和P091，對(duì)運(yùn) 32個(gè)BCl群體單株進(jìn)行了 PCR擴(kuò)增和基因型檢測(cè)，群體的基因型檢測(cè)結(jié)果和表型抗性鑒定結(jié) 果詳見表3.3。
[0074] 親3.3 (CMU96XZHRNG58) XZHRNG58群體內(nèi)單株親巧巧其巧型檢測(cè)結(jié)果
[0075]
[0076]
[0077] 注："3"表示雜合帶型，"2"表示感病親本Z肥NG58的帶型，"郵'表示高抗南方誘病， 巧S"表示高感南方誘病。
[007引利用MAPERMAKER3.0軟件，構(gòu)建了抗病區(qū)域的遺傳連鎖圖譜（圖3)，對(duì)抗病基因進(jìn) 行了定位，定位結(jié)果表明，抗病基因距離分子標(biāo)記RRD64的遺傳距離為3.2cM，而與分子標(biāo)記 P092和P091共分離。
[0079] 3.2.2.2利用回交群體2進(jìn)行抗南方誘病基因的定位
[0080] 在56個(gè)BCl分離群體單株中，共有26個(gè)單株表現(xiàn)出極端的抗病或感病類型（12個(gè)高 抗單株和14個(gè)高感單株）。利用3個(gè)在親本間有多態(tài)性的分子標(biāo)記RRD64，P092，和G047，對(duì)運(yùn) 26個(gè)BCl群體單株進(jìn)行了 PCR擴(kuò)增和基因型檢測(cè)，群體的基因型檢測(cè)結(jié)果和表型抗性鑒定結(jié) 果詳見表3.4。
[0081 ] 表3.4 (CML496XGEMS41)XGEMS41群體內(nèi)單株表型和基因型檢測(cè)結(jié)果
[0082]
[0083]
[0084] 狂："；r巧不采曾巧塑，巧不萊本Gems41巧塑，-Hr巧不局巧南萬誘炳，"比T巧 示高感南方誘病。
[0085] 利用MAPERMAKER3.0軟件，構(gòu)建了抗病區(qū)域的遺傳連鎖圖譜（圖4)，對(duì)抗病基因進(jìn) 行了定位，定位結(jié)果表明，抗病基因距離分子標(biāo)記RRD64的遺傳距離為3.2cM，而與分子標(biāo)記 P092和G047共分離。
[0086] 3.2.2.3利用回交群體3進(jìn)行抗南方誘病基因的定位
[0087] 在100個(gè)BCl分離群體單株中，共有82個(gè)單株表現(xiàn)出極端的抗病或感病類型（36個(gè) 高抗單株和46個(gè)高感單株）。利用2個(gè)在親本間有多態(tài)性的分子標(biāo)記umcl380和G047，對(duì)運(yùn)82 個(gè)BCl群體單株進(jìn)行了 PCR擴(kuò)增和基因型檢測(cè)，群體的基因型檢測(cè)結(jié)果和表型抗性鑒定結(jié)果 詳見表3.5。
[008引表3.5 (CML496XLx9801)XLx9801群體內(nèi)單株表型和基因型檢測(cè)結(jié)果
[0090I
[0091] 注："3"表示雜合帶型，"2"表示感病親本Lx9801的帶型，"HR"表示高抗南方誘病， "R"表示抗南方誘病/'S"表示感南方誘病，巧5"表示高感南方誘病。
[0092] 利用MAPERMAKER3.0軟件，構(gòu)建了抗病區(qū)域的遺傳連鎖圖譜（圖5)，對(duì)抗病基因進(jìn) 行了定位，定位結(jié)果表明，抗病基因距離分子標(biāo)記umc 1380的遺傳距離為7. OcM，而與分子標(biāo) 記G047的遺傳距離為1.3cM。
[0093] 3.2.3自交系CML496抗南方誘病基因的精細(xì)定位
[0094] 利用（CML496 X Lx9801) X Lx9801群體，在對(duì)抗病基因進(jìn)行初步定位的基礎(chǔ)上，通 過在抗病區(qū)域內(nèi)進(jìn)一步開發(fā)標(biāo)記，對(duì)抗病基因進(jìn)行了精細(xì)定位。在玉米第10染色體上 2.3Mb-3. IMb的范圍內(nèi)，W玉米B73基因組序列為參考，在抗病區(qū)域內(nèi)開發(fā)出16對(duì)SSR標(biāo)記， 均勻分布在抗病區(qū)域，其中5對(duì)標(biāo)記在親本CML496和LX9801之間有多態(tài)性，可W用于后代群 體的檢測(cè)。引物名稱、序列、物理位置和親本間的多態(tài)性詳見表3.6。
[00巧]表3.6 (CML496 XLx9801) XLx9801群體目標(biāo)抗病區(qū)域分子標(biāo)記的開發(fā) [0096]
[0097]
[0098] 利用新開發(fā)的5對(duì)SSR標(biāo)記，對(duì)(CML496XLx9801) XLx9801群體的100個(gè)單株進(jìn)行 了檢測(cè)，其中標(biāo)記P2.649，P2.913和P3.187在后代群體中擴(kuò)增出了清晰的條帶，因此，利用 運(yùn)3對(duì)標(biāo)記對(duì)分離群體的基因型進(jìn)行了檢測(cè)?；蛐蜋z測(cè)結(jié)果詳見表3.7。
[0099] 表3.7 (CML496XLx9801)XLx9801描體杭病基閑精細(xì)定仿的基閑巧巧表巧
[0100]

[0102]
[0103] 注："3"表示雜合帶型，"2"表示感病親本Gems41的帶型，"HR"表示高抗南方誘病， 巧S"表示高感南方誘病。
[0104] 利用分離群體中的重組單株，結(jié)合抗性表現(xiàn)，對(duì)抗病基因進(jìn)行了精細(xì)定位（表 3.8)。由重組單株1，2和3的基因型和表型可W判定，抗病基因在標(biāo)記P2.913W后；由重組單 株4可W判定，抗病基因在標(biāo)記G047 W前;綜合判定，抗病基因在標(biāo)記P2.913和G047之間；結(jié) 合標(biāo)記在B73基因組上的參考基因組序列可知，抗病基因在2.913Mb-3.187Mb之間，標(biāo)記間 的物理距離為274肺。
[0105] 表3.8 (CML496XLx9801)XLx9801群體關(guān)鍵重組單株的基因型和表型
[0106]
[0107] 根據(jù)玉米B73參考基因組序列，對(duì)274肺范圍內(nèi)的基因進(jìn)行了預(yù)測(cè)，在該抗病區(qū)域 內(nèi)，除了預(yù)測(cè)到與轉(zhuǎn)座相關(guān)的轉(zhuǎn)座酶基因外，還預(yù)測(cè)到10個(gè)編碼轉(zhuǎn)座酶W外的抗病候選基 因。
[0108] 3.4抗病區(qū)域內(nèi)預(yù)測(cè)到的抗病候選基因
[0109] 對(duì)預(yù)測(cè)到的10個(gè)候選基因，采用P-BLAST的方法，對(duì)其蛋白序列和NCBI網(wǎng)站上的蛋 白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列比對(duì)，對(duì)其相應(yīng)的生物學(xué)功能進(jìn)行注(表3.9)。在運(yùn)10個(gè)候選基因中， 第5,6和10個(gè)基因由于編碼序列較短，沒有預(yù)測(cè)到相應(yīng)的基因的功能，而在其余7個(gè)候選基 因中，基因5,8和9均預(yù)測(cè)到了典型的抗病基因結(jié)構(gòu)功能域，可作為抗病基因的候選基因。
[0110] 表3.9預(yù)測(cè)到的候選基因名稱，物理位置和功能注釋
[0111]
[0112] 4.1 結(jié)論
[0113] 1.通過田間人工接種鑒定，對(duì)103份自交系中的南方誘病抗性進(jìn)行了鑒定，發(fā)現(xiàn)玉 米南方誘病的抗性在不同的自交系間表現(xiàn)出廣泛的變異。篩選出CML305，CML307，CML411， CML470 ,CML496 ,CML497，S37，P178和K22等9份高抗材料和526018等16份抗病材料。
[0114] 2.利用抗病親本CML496和感病親本Lx9801組配的BCl分離群體，在對(duì)南方誘病抗 性進(jìn)行了人工接種鑒定的基礎(chǔ)上，采用微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)抗病基因進(jìn)行了定位，結(jié)果表明在玉 米第十染色體上鑒定出了一個(gè)主效抗病基因，距分子標(biāo)記umcl380的遺傳距離為7.OcM,而 與分子標(biāo)記G047的遺傳距離為1.3cM。利用抗病親本CML496與感病Z皿NG58、GEMS41分別組 配的BCl分離群體，也在玉米第十染色體上定位到相同的位點(diǎn)；綜合W上分析，表明CML496 在玉米第十染色體上存在一個(gè)主效的南方誘病抗病基因，且在不同的遺傳背景下抗病性表 現(xiàn)穩(wěn)定。
[0115] 3.在對(duì)抗病親本CML496的南方誘病抗病基因進(jìn)行初步定位的基礎(chǔ)上，通過在抗病 區(qū)域內(nèi)開發(fā)分子標(biāo)記和交換單株篩選，對(duì)抗病基因進(jìn)行了精細(xì)定位。精細(xì)定位結(jié)果表明，抗 病基因在標(biāo)記P2.913和G047之間，標(biāo)記間的物理距離為274肺。根據(jù)玉米B73參考基因組序 列，對(duì)該區(qū)域的基因進(jìn)行了預(yù)測(cè)和功能注釋，篩選到3個(gè)基因，具有典型的抗病基因結(jié)構(gòu)功 能域，可W作為抗病基因的候選基因。
[0116] 4.2 討論
[0117] 4.2.1抗南方誘病的新種質(zhì)的發(fā)現(xiàn)為抗病育種提供了新材料
[011引目前，抗南方誘病品種的抗源基本可W追溯到美國(guó)的雜交種78599。為避免抗南方 誘病基因利用的單一化，本發(fā)明通過人工接種鑒定獲得了一批抗病種質(zhì)，但其中多數(shù)抗南 方誘病種質(zhì)仍屬熱帶種質(zhì)，如在鑒定出的9份高抗材料中，CML305 ,CML307，CML411 ,CML470， CML496，CML497屬于熱帶材料，而S37，P178和K22則屬于熱帶材料的改良系。本發(fā)明結(jié)果進(jìn) 一步表明在熱帶亞熱帶種質(zhì)中蘊(yùn)含著豐富的抗病基因，特別是抗病材料CML496,其抗病性 在不同的遺傳背景下都表現(xiàn)穩(wěn)定，鑒定出的熱帶亞熱帶材料為抗病育種提供了新的種質(zhì)資 源。
[0119] 4.2.2玉米第十染色體上存在一個(gè)抗病基因簇
[0120] 現(xiàn)在已定位的玉米抗誘病基因中，包括抗南方誘病和普通誘病的基因，已經(jīng)有多 個(gè)基因定位在玉米第十染色體上，本發(fā)明通過對(duì)自交系CML496和P178運(yùn)兩個(gè)自交系的抗性 基因的定位結(jié)果，進(jìn)一步證實(shí)了運(yùn)個(gè)推斷。
[0121] 4.2.3不同抗病材料中抗病基因的比較
[0122] 目前，國(guó)內(nèi)外多個(gè)研究小組，利用齊319，P25和W2D等自交系為材料，對(duì)南方誘病的 抗病基因進(jìn)行了定位;并對(duì)抗病材料P25進(jìn)行了精細(xì)定位和候選基因預(yù)測(cè)。在本發(fā)明中，在 對(duì)抗病親本CML496的南方誘病抗病基因進(jìn)行初步定位的基礎(chǔ)上，對(duì)抗病基因進(jìn)行了精細(xì)定 位。在2 74郵的抗病區(qū)域內(nèi)。篩選到3個(gè)基因（6312]\126004412,61?12]\1263 56817和 GRMZM2G356839)具有典型的抗病基因結(jié)構(gòu)功能域，可W作為抗病基因的候選基因。
[0123] 通過比較本研究中所采用的CML496和P25的抗病候選基因，發(fā)現(xiàn)GRMZM2G356817和 GRMZM2G356839都被預(yù)測(cè)到。因此，CML496和P25是否具有相同的抗病基因或者不同的基因 或單倍型，還需要進(jìn)行進(jìn)一步的精細(xì)定位工作。
[0124] 并且，通過本發(fā)明中公開的分子標(biāo)記組合包括標(biāo)記P2.649，P2.913和P3.187，也進(jìn) 一步證實(shí)了是與玉米南方誘病基因緊密連鎖的，能夠
[0125] 盡管本發(fā)明的實(shí)施方案已公開如上，但其并不僅僅限于說明書和實(shí)施方式中所列 運(yùn)用，它完全可W被適用于各種適合本發(fā)明的領(lǐng)域，對(duì)于熟悉本領(lǐng)域的人員而言，可容易地 實(shí)現(xiàn)另外的修改，因此在不背離權(quán)利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發(fā)明并不限 于特定的細(xì)節(jié)和運(yùn)里示出與描述的圖例。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 與玉米南方銹病基因緊密連鎖的分子標(biāo)記組合，所述分子標(biāo)記組合包括SSR分子標(biāo) 記P2.913,擴(kuò)增該分子標(biāo)記P2.913的一對(duì)引物序列如SEQ ID NO: 1和2所示。2. 如權(quán)利要求1所述的與玉米南方銹病基因緊密連鎖的分子標(biāo)記組合，其特征在于，所 述分子標(biāo)記組合還包括SSR分子標(biāo)記P2.649，擴(kuò)增該分子標(biāo)記P2.649的一對(duì)引物序列如SEQ ID NO:3和4所示。3. 如權(quán)利要求1所述的與玉米南方銹病基因緊密連鎖的分子標(biāo)記組合，其特征在于，所 述分子標(biāo)記組合還包括SSR分子標(biāo)記P3.187，擴(kuò)增該分子標(biāo)記P3.187的一對(duì)引物序列如SEQ ID NO:5和6所示。4. 權(quán)利要求1所述的分子標(biāo)記組合在玉米南方銹病基因定位和玉米遺傳育種中的應(yīng) 用。5. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述分子標(biāo)記組合在玉米品種CML496中用于 其玉米南方銹病基因的定位。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK105861647SQ201610179256
【公開日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2016年3月25日
【發(fā)明人】丁俊強(qiáng), 張學(xué)林, 李志敏, 韓麗蘋, 艾堂順, 田志強(qiáng)
【申請(qǐng)人】河南農(nóng)業(yè)大學(xué)