一種定量鑒別浙貝母的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種定量鑒別浙貝母的方法，旨在提供一種鑒別準(zhǔn)確率高、專屬性強(qiáng)的定量鑒別浙貝母的方法，該方法依次包括下述步驟：1)引物的稀釋；2)樣品的前處理；3)DNA的提取；4)PCR反應(yīng)液的配制；5)加模板；6)羅氏LightCycler96熒光定量PCR儀上機(jī)；7)數(shù)據(jù)處理；8)結(jié)果判定；屬于化學(xué)檢測技術(shù)領(lǐng)域。
【專利說明】
-種定量鑒別浙貝母的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明提供一種對(duì)浙貝母的鑒別方法，具體的說，實(shí)時(shí)巧光定量PCR對(duì)浙貝母的鑒 別方法;屬于化學(xué)檢測技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 浙貝母為百合科植物浙貝母(Fritillaria thunbergii Miq.)的干燥鱗莖，為浙 江重要道地中藥材"浙八味"之一，具有清熱化疲止咳、解毒散結(jié)消癡的功效，藥用價(jià)值較 高。傳統(tǒng)的浙貝母的鑒別，主要是性狀、顯微鑒別，由于市場上貝母類藥材品種較多，相同品 種間也會(huì)因?yàn)樗幵粗参飦碓床灰?、種植環(huán)境、產(chǎn)地和加工等因素存在相當(dāng)?shù)幕祀s度，運(yùn)就使 得實(shí)驗(yàn)人員必須具備較高的藥材鑒別經(jīng)驗(yàn)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，使得中藥材的分 子遺傳標(biāo)記鑒別成為可能。目前文獻(xiàn)上已有聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)法鑒別浙貝母藥材的相 關(guān)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 針對(duì)上述不足，本發(fā)明的目的是提供一種通過磁珠法提取浙貝母中的DNA，利用 PCR巧光探針法來鑒別，較普通PCR法操作簡單、時(shí)間短、準(zhǔn)確率高、環(huán)保。
[0004] -種定量鑒別浙貝母的方法，依次包括下述步驟：
[000引1)引物的稀釋
[0006] 每管加超純水0.29ml來稀釋配制工作濃度為IOiiM的引物，將稀釋好的引物滿旋振 蕩混勻使其充分溶解，放-20°C冰箱保存?zhèn)溆茫?br>[0007] 2)樣品的前處理
[000引取Ig試樣，用研鉢研成粉末，稱取20mg至1.5mL或2ml滅菌離屯、管中；
[0009] 3) DNA 的提取
[0010] 取前處理好的樣品，采用磁珠法用核酸提取儀提取DNA，提取到的試樣DNA置-20°C 保存?zhèn)溆茫?br>[0011] 3)PCR反應(yīng)液的配制
[0012] 依次稱取下述物質(zhì)：
[0013] 2x巧光定量預(yù)混試劑彩色版IOiil;
[0014] 5-ACAGTACTGGGGGAGAAGTC-30.化1;
[0015] 5-CAAATGGAGGGTATGTGTCG-30.化1，
[0016] 無 RNA酶水化1，
[0017] 將各個(gè)試劑加入至干凈的離屯、管中，滿旋振蕩混勻后，放冰盒上待用，取出干凈滅 菌的PCR八聯(lián)管固定在PCR管盒上，將冰盒上的反應(yīng)液短暫離屯、后，輕輕打開蓋子，往PCR管 中分裝反應(yīng)液，每管1祉1，管中盡量避免氣泡的存在；
[001引 4)加模板
[0019]往上述含有反應(yīng)液的PCR管中加入化1提取好的DNA，輕輕敲打PCR管盒，使反應(yīng)液 與DNA混勻，并經(jīng)3000轉(zhuǎn)離屯、數(shù)30S，立即進(jìn)行PCR反應(yīng)；
[0020] 5)羅氏Li曲tCycler96巧光定量PCR儀上機(jī)；
[0021] 6)數(shù)據(jù)處理
[0022] 將數(shù)據(jù)同步至電腦上，設(shè)置陰性對(duì)照、陽性對(duì)照、檢品類型；選擇定性檢測對(duì)試樣 進(jìn)行分析；
[0023] 7)結(jié)果判定
[0024] 陰性對(duì)照需無 Cq值，曲線為直線或輕微斜線，無明顯指數(shù)增長期；
[0025] 陽性對(duì)照需Cq < 30,曲線有明顯指數(shù)擴(kuò)增期；
[0026] 樣品若無 Cq值，曲線為直線或輕微斜線，無明顯指數(shù)增長期，可判為非浙貝母；
[0027] 樣品若Cq值<36,曲線有明顯指數(shù)擴(kuò)增期，可判為浙貝母。
[00%]進(jìn)一步的，上述的定量鑒別浙貝母的方法，所述羅氏Li曲tCycle巧6巧光定量PCR 儀上機(jī)設(shè)置方法為:檢測模式為巧光通道，反應(yīng)總體積為20山，染色選擇DNA巧光染料，依次 選擇預(yù)變性、=步擴(kuò)增，最后選擇單通道收集巧光。
[0029] 進(jìn)一步的，上述的定量鑒別浙貝母的方法，所述PCR反應(yīng)參數(shù)為95°C、4minl個(gè)循 環(huán);95 °C、30s，60 °C，30s，72 °C，60s，45個(gè)循環(huán)。
[0030] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的用實(shí)時(shí)巧光定量PCR法從試樣中提取DM,進(jìn)行引 物擴(kuò)增，并通過Cq值和擴(kuò)增曲線對(duì)樣品進(jìn)行判斷。結(jié)果:4批浙貝母的Cq值均低于30,曲線有 明顯的指數(shù)增長期;平貝母、川貝母和±貝母則無 Cq值，曲線為一直線，說明本發(fā)明提供的 方法用于鑒別浙貝母操作簡單，準(zhǔn)確率高，經(jīng)過多次重復(fù)測試，樣品結(jié)果穩(wěn)定一致，表明該 方法對(duì)浙貝母的鑒別準(zhǔn)確率高、專屬性強(qiáng)。
【附圖說明】
[0031] 圖1是浙貝母對(duì)照藥材擴(kuò)增曲線圖；
[0032] 圖2是浙貝母擴(kuò)增曲線圖；
[0033] 圖3是陽性對(duì)照擴(kuò)增曲線；
[0034] 圖4是平貝母、川貝母和±貝母擴(kuò)增曲線圖；
[0035] 圖5是陰性對(duì)照擴(kuò)增曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0036] 下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】，對(duì)本發(fā)明的權(quán)利要求做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，但不構(gòu)成對(duì) 本發(fā)明的任何限制，任何在本發(fā)明權(quán)利要求保護(hù)范圍所做的有限次的修改，仍在本發(fā)明的 權(quán)利要求保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0037] 實(shí)施例1
[0038] 1.材料與儀器
[0039] 1.1 藥材
[0040] 1.1.1浙貝母對(duì)照藥材來源于中國食品藥品檢定研究院，浙貝母1、2來源于安徽毫 州中藥材市場，浙貝母3和4、平貝母、川貝母和±貝母來源于廣西玉林中藥材市場，并經(jīng)過 形態(tài)學(xué)鑒定確認(rèn)。
[0041 ] 1.1.2 試劑
[0042] 本發(fā)明所設(shè)及到的百分濃度，沒有特別說明的，液體均為體積濃度，溶質(zhì)為固體的 指質(zhì)量濃度。
[0043] 磁珠法植物DNA提取試劑盒（購自LabServ King Fisher,型號(hào)：LabServ Plant DNA Kit)'
[0044] SuperReal巧光定量預(yù)混試劑增強(qiáng)版(購自TIANGEN，型號(hào):FP205)，內(nèi)含2x巧光定 量預(yù)混試劑彩色版(DNA巧光染料)和RNase-Free dd肥0，
[0045] 浙貝母引物(購自invitrogen，型號(hào):A12925，
[0046] 序列為:5-ACAGTACTGGGGGAGAAGTC-3
[0047] 5-CAAATGGAGGGTATGTGTCG-3)〇
[004引 1.1.3耗材Kingf isher Duo 12tip comb(磁套）'Kingfisher Duo elution strip (洗脫條）、Deep Well 96plate(96孔深孔板）、1.5mL或2ml滅菌離屯、管、96孔凍存盒、滅菌 PCR八聯(lián)管（0.2ml離屯、管）、PCR管盒。
[0049] 1.2儀器XA20加 U電子天平(德國梅特勒托利多公司）、Minispin臺(tái)式高速離屯、機(jī) (德國化pendorf)、MINIB-100F恒溫金屬浴(杭州米歐儀器有限公司）、Li曲t切Cle巧6巧光 定量PCR儀(瑞±羅氏公司）、化ermo Fisher Duo核酸提取儀和-20°C冰箱(美的公司）。 [0化0] 2.方法
[0051] 2.1引物的稀釋按引物產(chǎn)品合成說明書，本次實(shí)驗(yàn)所需引物工作濃度為10測，此引 物每OD為一管，每管的nmole數(shù)為2.9,按照管內(nèi)nmole數(shù)/工作液濃度=所需加入的超純水 量(ml )，則每管需加超純水0.29ml來稀釋，稀釋好的引物滿旋振蕩混勻使其充分溶解，放-20°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br>[0052] 2.2樣品的前處理取一部分試樣，用研鉢研成粉末，稱取20mg至1. SmL或2ml滅菌離 屯、管中。
[0053] 2.3DNA的提取取前處理好的樣品，按磁珠法植物DNA提取試劑盒使用說明書進(jìn)行 操作，用核酸提取儀提取DNA，提取到的試樣DNA置-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0054] 2.4PCR反應(yīng)液的配制按照SuperReal巧光定量預(yù)混試劑使用說明書配制PCR反應(yīng) 液，每管樣品的試劑取用量如下：
[00551
[i
[0057] 每次PCR實(shí)驗(yàn)需要陰性對(duì)照、陽性對(duì)照各一個(gè)(試劑盒配套），所W此次樣品總共10 份，上機(jī)的管數(shù)有10管。按照W上順序依次加入試劑至干凈的離屯、管中，滿旋振蕩混勻后， 放冰盒上待用。取出干凈滅菌的PCR八聯(lián)管(0.2ml離屯、管）固定在PCR管盒上，將冰盒上的反 應(yīng)液短暫離屯、后，輕輕打開蓋子，往PCR管中分裝反應(yīng)液，每管I祉I，管中盡量避免氣泡的存 在。
[005引2.5加模板往上述含有反應(yīng)液的PCR管中加入化1提取好的DNA(反應(yīng)總體積為20y 1)，加樣順序?yàn)殛幮詫?duì)照、待檢樣品、陽性對(duì)照。輕輕敲打PCR管盒，使反應(yīng)液與DNA混勻，并 經(jīng)3000轉(zhuǎn)離屯、數(shù)秒，立即進(jìn)行PCR反應(yīng)。
[0化9] 2.6羅氏Li曲tCycler96巧光定量PCR儀上機(jī)
[0060] 2.6.1儀器設(shè)置:檢測模式為巧光通道，反應(yīng)總體積為20iU，染色選擇DNA巧光染 料，依次選擇預(yù)變性和=步擴(kuò)增，選擇Single收集巧光。
[0061 ] 2.6.2?0?反應(yīng)參數(shù)設(shè)置：
[0OA91
[C
[0064」 2.7數(shù)據(jù)處理
[0065] 將數(shù)據(jù)同步至電腦上，設(shè)置陰性對(duì)照為"Negative control";陽性對(duì)照為 (中ositive conhol";檢品類型為"Unknown"。選擇"Qualitative Detection"(定性檢測） 對(duì)試樣進(jìn)行分析。
[0066] 2.8結(jié)果判定
[0067] 2.8.1陰性對(duì)照需無 Cq值，曲線為直線或輕微斜線，無明顯指數(shù)增長期；
[0068] 2.8.2陽性對(duì)照需Cq < 30，曲線有明顯指數(shù)擴(kuò)增期；
[0069] 2.8.3樣品若無 Cq值，曲線為直線或輕微斜線，無明顯指數(shù)增長期，可判為非浙貝 母；
[0070] 2.8.4樣品若Cq值。6,曲線有明顯指數(shù)擴(kuò)增期，可判為浙貝母。
[0071] 3.結(jié)果
[007^ qPCR測試結(jié)果見表1，浙貝母對(duì)照藥材、浙貝母、陽性對(duì)照、非浙貝母類和陰性對(duì)照 擴(kuò)增曲線圖分別見圖1-5。浙貝母對(duì)照藥材、浙貝母1、2、3、4和陽性對(duì)照Cq值均<30,且擴(kuò)增 曲線有明顯指數(shù)增長期，故可判定為陽性;而其它貝母類和陰性對(duì)照均無 Cq值，且曲線均為 一條直線，故為陰性。經(jīng)過多次重復(fù)測試，樣品結(jié)果穩(wěn)定一致，表明該方法對(duì)浙貝母的鑒別 準(zhǔn)確率高、專屬性強(qiáng)。
[0073] 表1:浙貝母1、2、3、4、平貝母、川貝母、±貝母及陽性、陰性對(duì)照的Cq值 「AA-7>1 1

【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種定量鑒別浙貝母的方法，其特征在于，依次包括下述步驟： 1) 引物的稀釋 每管加超純水0.29ml來稀釋配制工作濃度為ΙΟμΜ的引物，將稀釋好的引物渦旋振蕩混 勻使其充分溶解，放-20 °C冰箱保存?zhèn)溆茫? 2) 樣品的前處理 取lg試樣，用研缽研成粉末，稱取20mg至1.5mL或2ml滅菌離心管中； 3. DNA的提取 取前處理好的樣品，采用磁珠法用核酸提取儀提取DNA，提取到的試樣DNA置-20°C保存 備用； 3. PCR反應(yīng)液的配制 依次稱取下述物質(zhì)： 2x熒光定量預(yù)混試劑彩色版10μ1; 5-ACAGTACTGGGGGAGAAGTC-30.5μ1； 5-CAAATGGAGGGTATGTGTCG-30.5μ1， 無 RNA酶水7μ1， 將各個(gè)試劑加入至干凈的離心管中，渦旋振蕩混勻后，放冰盒上待用，取出干凈滅菌的 PCR八聯(lián)管固定在PCR管盒上，將冰盒上的反應(yīng)液短暫離心后，輕輕打開蓋子，往PCR管中分 裝反應(yīng)液，每管18μ1，管中盡量避免氣泡的存在； 4) 加模板 往上述含有反應(yīng)液的PCR管中加入2μ1提取好的DNA，輕輕敲打PCR管盒，使反應(yīng)液與DNA 混勻，并經(jīng)3000轉(zhuǎn)離心數(shù)30S，立即進(jìn)行PCR反應(yīng)； 6) 羅氏LightCycler96熒光定量PCR儀上機(jī)； 7) 數(shù)據(jù)處理 將數(shù)據(jù)同步至電腦上，設(shè)置陰性對(duì)照、陽性對(duì)照、檢品類型;選擇定性檢測對(duì)試樣進(jìn)行 分析； 8) 結(jié)果判定 陰性對(duì)照需無 Cq值，曲線為直線或輕微斜線，無明顯指數(shù)增長期； 陽性對(duì)照需Cq < 30,曲線有明顯指數(shù)擴(kuò)增期； 樣品若無 Cq值，曲線為直線或輕微斜線，無明顯指數(shù)增長期，可判為非浙貝母； 樣品若Cq值< 36,曲線有明顯指數(shù)擴(kuò)增期，可判為浙貝母。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量鑒別浙貝母的方法，其特征在于，所述羅氏 LightCycler96熒光定量PCR儀上機(jī)設(shè)置方法為:檢測模式為熒光通道，反應(yīng)總體積為20μ1， 染色選擇DNA熒光染料，依次選擇預(yù)變性、三步擴(kuò)增，最后選擇單通道收集熒光。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量鑒別浙貝母的方法，其特征在于，所述PCR反應(yīng)參數(shù)為95 °C、4minl個(gè)循環(huán);95°C、30s，60°C，30s，72°C，60s，45個(gè)循環(huán)。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK105861663SQ201610235408
【公開日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2016年4月15日
【發(fā)明人】陳學(xué)松, 羅達(dá)龍, 黃林杰, 黃琳
【申請(qǐng)人】廣西壯族自治區(qū)梧州食品藥品檢驗(yàn)所