用于微嵌合檢測(cè)和個(gè)體識(shí)別的引物、探針、試劑盒及方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，公開了一種用于微嵌合檢測(cè)和個(gè)體識(shí)別的引物和探針組合、含有該引物和探針組合的試劑盒以及采用該引物和探針組合或試劑盒進(jìn)行微嵌合檢測(cè)和個(gè)體識(shí)別的方法。本發(fā)明基于最新的InDel位點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)，以亞洲人群為基準(zhǔn)，篩選出針對(duì)亞洲人群高個(gè)體識(shí)別率的15個(gè)InDel位點(diǎn)，并針對(duì)每一InDel位點(diǎn)，進(jìn)一步設(shè)計(jì)特異性引物和探針組合。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明方法具有多態(tài)性強(qiáng)、特異性好、靈敏度高和簡(jiǎn)便快捷的優(yōu)點(diǎn)，為亞洲人群進(jìn)行微嵌合檢測(cè)和個(gè)體識(shí)別提供了非常重要的檢測(cè)手段。
【專利說明】
用于微嵌合檢測(cè)和個(gè)體識(shí)別的引物、探針、試劑盒及方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及用于微嵌合檢測(cè)和個(gè)體識(shí)別的引物、探 針、試劑盒及方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 現(xiàn)代遺傳學(xué)家認(rèn)為，基因是DNA(脫氧核糖核酸)分子上具有遺傳效應(yīng)的特定核巧 酸序列的總稱，是具有遺傳效應(yīng)的DNA分子片段。基因不僅可W通過復(fù)制把遺傳信息傳遞給 下一代，還可W使遺傳信息得到表達(dá)。運(yùn)種遺傳信息蘊(yùn)含在人的骨骼、毛發(fā)、血液等所有人 體組織或器官中。通過人類基因組多態(tài)性位點(diǎn)的差異，進(jìn)行基因檢測(cè)來識(shí)別不同個(gè)體，目前 已被廣泛運(yùn)用于法醫(yī)和臨床試驗(yàn)。
[0003] 近來已開發(fā)出多種遺傳標(biāo)記用于個(gè)體識(shí)別。其中，短串聯(lián)重復(fù)序列（Shod Tandem R邱eats,STR)由于檢測(cè)方法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確性高、擴(kuò)增片段大小適中，被認(rèn)為是法醫(yī)DNA鑒 定中最標(biāo)準(zhǔn)、最權(quán)威的途徑和方法，能夠解決大多數(shù)的實(shí)際問題。但是，由于STR存在局突變 率(一般為1〇- 2~1〇-4)，檢測(cè)的片段較長(zhǎng)（100~400bp)，不易實(shí)現(xiàn)對(duì)降解檢材的DNA分型，同 時(shí)嵌合率檢測(cè)靈敏度在5 %左右，而臨床上進(jìn)行微移植或者微治療的時(shí)候，一般嵌合率需要 維持在1~2 % W下，無法滿足要求。
[0004] 嵌合體是指同一個(gè)體體內(nèi)存在不同遺傳性狀的細(xì)胞嵌合現(xiàn)象，即含有兩套或兩套 W上染色體組的狀態(tài)。其中，微嵌合是指不同個(gè)體來源的細(xì)胞成分低于1%的現(xiàn)象。微嵌合 檢測(cè)要求更高靈敏度的檢測(cè)方法。因此，STR不能進(jìn)行微嵌合分析。
[0005] 隨著基因組研究的進(jìn)展，多態(tài)性位點(diǎn)相繼受到了廣泛的關(guān)注。其中，單核巧酸多態(tài) 性（Single Nucleotide Polymo巧Msm,SNP)具有相對(duì)較低的自發(fā)突變率（IQ-S);而單個(gè)的 SNP位點(diǎn)擴(kuò)增產(chǎn)物可W控制在2(K)bpW下，有利于降解檢材的分型。然而SNP等位基因間差異 只有一個(gè)堿基，因此難W設(shè)計(jì)高靈敏度的檢測(cè)方案，檢測(cè)靈敏度只能達(dá)到1%，仍然不適用 于微嵌合檢測(cè)。而且SNP定量方法復(fù)雜，實(shí)驗(yàn)儀器昂貴，使用成本高，操作繁瑣，通量小，并 不適合在常規(guī)的法醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室推廣。
[0006] 近年來新一代的多態(tài)性位點(diǎn)--插入或缺失多態(tài)性（Insertion or Deletion Polymorphisms , InDeI或DIP)，即基因組中插入或缺失不同類型和大小的DNA片段（4~ 2化P)所形成的多態(tài)性遺傳標(biāo)記，在法醫(yī)物證鑒定、親子鑒定和其他醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)方面有著廣泛 運(yùn)用。從法醫(yī)學(xué)物證檢驗(yàn)的角度來看，InDel標(biāo)記具有W下特點(diǎn)：（1)在人類基因組中含量豐 富，數(shù)量?jī)H次于SNP; (2)與SNP具有相近的自然突變率(~2.3 X 1(T9); (3)InDel擴(kuò)增片段更 短（低于160bp)，更適于檢測(cè)高度降解和低拷貝的DNA模板，增加 DNA降解檢材分型的成功 率；（4)InDel位點(diǎn)存在顯著的人群和種族差異；（5)可通過巧光PCR擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行InDel檢 ，技術(shù)平臺(tái)普遍適用性強(qiáng)；（6)基于InDel位點(diǎn)，使用雙色巧光定量PCR方法，確定區(qū)分供者 和受者的特異性位點(diǎn)后，進(jìn)行定量PCR，最低嵌合率檢測(cè)可W達(dá)到0.01~0.05%。因此，近些 年來日漸引起國(guó)內(nèi)外許多法醫(yī)學(xué)者的關(guān)注。然而，截止到目前為止，基于InDel遺傳標(biāo)記的 商業(yè)上比較成熟的用于微嵌合檢測(cè)和個(gè)體識(shí)別的試劑盒還非常少見，只有荷蘭的 Investigator DIP試劑盒是比較成熟的商業(yè)化產(chǎn)品。同時(shí)，由于遺傳標(biāo)記存在人群和種族 的差異，Investigator DIP試劑盒對(duì)于亞洲人群來說，適用性并不是特別強(qiáng)。因此，研發(fā)一 套適用于亞洲人群的用于微嵌合檢測(cè)和個(gè)體識(shí)別的InDel遺傳標(biāo)記試劑盒就顯得非常必 要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述缺陷，基于最新的InDel位點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)，并W亞洲 人群為基準(zhǔn)，重新設(shè)計(jì)了用于微嵌合檢測(cè)和個(gè)體識(shí)別的引物和探針W及檢測(cè)方法。本發(fā)明 的檢測(cè)方法多態(tài)性強(qiáng)、特異性好、靈敏度高且簡(jiǎn)便快捷。
[0008] 為此，本發(fā)明一方面提供了一種用于微嵌合檢測(cè)和個(gè)體識(shí)別的引物和探針組合， 其由SEQ ID NO. 1-75所示的引物和探針組成。
[0009] 在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，該引物和探針組合進(jìn)一步由第1-15組引物和探針組 成，其中第1組由SEQ ID NO. 1-4所示的引物和SEQ ID NO.5所示的探針組成，第2組由SEQ ID NO.6-9所示的引物和沈Q ID NO. 10所示的探針組成，第3組由沈Q ID NO. 11-14所示的 引物和SEQ ID NO. 15所示的探針組成，第4組由SEQ ID NO. 16-19所示的引物和SEQ ID NO.20所示的探針組成，第5組由SEQ ID NO.21-24所示的引物和SEQ ID NO.25所示的探針 組成，第6組由沈Q ID NO.26-29所示的引物和SEQ ID NO.30所示的探針組成，第7組由沈Q ID NO.31-34所示的引物和沈Q ID NO.35所示的探針組成，第8組由沈Q ID NO.36-39所示 的引物和SEQ ID NO. 40所示的探針組成，第9組由SEQ ID NO.41-44所示的引物和SEQ ID NO.45所示的探針組成，第10組由SEQ ID NO.46-49所示的引物和SEQ ID NO.50所示的探針 組成，第11組由SEQ ID NO.51-54所示的引物和SEQ ID NO.55所示的探針組成，第12組由 沈Q ID NO.56-59所示的引物和沈Q ID NO.60所示的探針組成，第13組由沈Q ID NO.61-64 所示的引物和SEQ ID NO.65所示的探針組成，第14組由SEQ ID NO.66-69所示的引物和SEQ ID NO. 70所示的探針組成，第15組由SEQ ID NO. 71-74所示的引物和SEQ ID NO. 75所示的 探針組成。
[0010] 本發(fā)明基于最新的InDel位點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)，W亞洲人群為基準(zhǔn)，從中篩選出針對(duì)亞洲人 群高個(gè)體識(shí)別率的15個(gè)InDel位點(diǎn)，它們分別為:化-1片32308010)、化-2片334855933)、化-3(rs4646006)、N2-l(rs3042783)、N5-l(rsl610937)、N5-4(rsl610932)、N7-l(rsl6458)、 N9-l(rs2308112)、Nll-l(rs2307696)、Nll-2(rsl40790)、N13-l(rs3038530)、N13-2 (rs3049448)、N14-l(rs56024302)、N16-2(rs2067204)和 N21-l(rsl6663)，括號(hào)中的 rs 號(hào)表 示該位點(diǎn)在化SNP數(shù)據(jù)庫(kù)的編號(hào)。
[0011] 本發(fā)明進(jìn)一步針對(duì)上述每一個(gè)InDel位點(diǎn)，分別設(shè)計(jì)一條共用的上游引物(F)、下 游引物(R)、插入特異性引物F( + )和缺失特異性引物F(-)，其中擴(kuò)增片段長(zhǎng)度(Amplified Fragment Length,AFL)為該引物與對(duì)應(yīng)的上游引物或下游引物配對(duì)所得到的擴(kuò)增片段長(zhǎng) 度，例如F( + )與R用來特異性擴(kuò)增插入片段，R(-)與F用來特異性擴(kuò)增缺失片段，F(xiàn)與R用來擴(kuò) 增非特異性片段(其中：灰色底色代表插入/缺失的特異性堿基）。
[0012] 針對(duì)上述亞洲人群高個(gè)體識(shí)別率的15個(gè)InDel位點(diǎn)，本發(fā)明設(shè)計(jì)的具體引物和探 針情況如表1所示。
[001引表1、本發(fā)明的引物和探針情況表
[0015]
[0016] 本發(fā)明另一方面提供了一種用于微嵌合檢測(cè)和個(gè)體識(shí)別的試劑盒，其包含本發(fā) 明所述的引物和探針組合。該試劑盒保存于-20°C，并由W下試劑組成。
[0017] 1、全血基因組DNA提取試劑，購(gòu)于QIAamp DNA Blood Mini kit試劑盒；
[001 引 2、RNase-Free ddH20;
[0019] 3、2XS叩er Real PreMix反應(yīng)液，購(gòu)于天根生化科技（北京）有限公司，貨號(hào)： FP206；
[0020] 4、50XR0X Reference Dye,購(gòu)于天根生化科技(北京)有限公司，貨號(hào):FP206;
[0021] 5、分別分裝在相應(yīng)編號(hào)離屯、管中的引物和探針組合。
[0022] 在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，試劑盒中每種引物的濃度為6iiM，每種探針的濃度為
[0023] 本發(fā)明另一方面提供了本發(fā)明所述的引物和探針組合在制備微嵌合檢測(cè)和個(gè)體 識(shí)別試劑盒中的應(yīng)用。
[0024] 本發(fā)明再一方面提供了本發(fā)明所述的引物和探針組合，或者本發(fā)明所述的試劑盒 在微嵌合檢測(cè)和個(gè)體識(shí)別中的應(yīng)用。
[0025] 本發(fā)明最后一方面提供了一種微嵌合檢測(cè)和個(gè)體識(shí)別的方法，其包含W下步驟：
[0026] 1、獲取待測(cè)樣品的DNA。
[0027] DNA提取可W采用QIAamp DNA Blood Mini kit試劑盒。
[0028] 2、采用本發(fā)明所述的引物和探針組合，或采用本發(fā)明所述的試劑盒，W步驟1中獲 取的DNA為模板，進(jìn)行巧光PCR擴(kuò)增，并收集巧光信號(hào)。
[00巧]巧光PCR擴(kuò)增的體系為20化：IOuL 2 XS叫er Real PreMix反應(yīng)液(天根生化科技 (北京)有限公司，貨號(hào):FP206);0.化L 50XR0X Reference Dye(天根生化科技(北京)有限 公司，貨號(hào)：FP206);luL 6uM 引物 F( + )/F(-);luL 6uM 引物 R;luL 4uM 探針；IuL 20ng/uL DNA;用RNase-Free d地2〇補(bǔ)足反應(yīng)體系。
[0030] 巧光PCR的反應(yīng)條件為:95。(：預(yù)變性15min，然后95。(：變性3s-6(TC退火延伸32s， 共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，在6(TC處收集巧光信號(hào)。
[0031] 3、根據(jù)Ct值判斷待測(cè)樣品在15個(gè)InDel位點(diǎn)上的多態(tài)性差異，從而對(duì)待測(cè)樣品進(jìn) 行微嵌合檢測(cè)和個(gè)體識(shí)別。
[0032] 通過Ct值來判斷每個(gè)遺傳標(biāo)記陽(yáng)性樣本和陰性樣本的Ct值區(qū)間范圍，陽(yáng)性樣本Ct 值落在24-29之間，陰性樣本Ct值在38W上，陽(yáng)性樣本和陰性樣本Ct值相差12W上，表示引 物和探針的特異性良好。
[0033] 在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，采用的引物和探針是針對(duì)亞洲人群高個(gè)體識(shí)別率的 15個(gè)InDel位點(diǎn)設(shè)計(jì)的。
[0034] 在本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，每種引物的濃度為6測(cè)，每種探針的濃度為化 M。
[0035] 由上述描述可知，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具備如下優(yōu)點(diǎn)。
[0036] 1、多態(tài)性強(qiáng):通過本發(fā)明篩選的15個(gè)InDel位點(diǎn)，對(duì)隨機(jī)選取的94個(gè)樣本進(jìn)行基因 頻率測(cè)試，結(jié)果表明運(yùn)15個(gè)InDe 1位點(diǎn)等位基因頻率分布均衡，多態(tài)性強(qiáng)。根據(jù)運(yùn)15個(gè)InDe 1 位點(diǎn)的多態(tài)性信息，能夠進(jìn)行微嵌合檢測(cè)和個(gè)體識(shí)別。
[0037] 2、特異性好:通過本發(fā)明篩選的15個(gè)InDel位點(diǎn)，對(duì)陽(yáng)性樣本和陰性樣本進(jìn)行檢 ，結(jié)果表明特異性好、穩(wěn)定性強(qiáng)、重復(fù)性好，分型結(jié)果準(zhǔn)確(在測(cè)序結(jié)果基礎(chǔ)上進(jìn)行比較）。
[0038] 3、靈敏度高:進(jìn)行嵌合狀態(tài)分析時(shí)，利用本發(fā)明篩選的15個(gè)InDel位點(diǎn)，進(jìn)行巧光 PCR擴(kuò)增，當(dāng)模板量?jī)H為14化g時(shí)，即可進(jìn)行精確的定量分析，最低嵌合率檢測(cè)可達(dá)0.025%。
[0039] 4、本發(fā)明的檢測(cè)方法采用雙巧光標(biāo)記擴(kuò)增技術(shù)，該技術(shù)簡(jiǎn)便、快捷，只需一臺(tái) Applied Biosystems 7500 Real Time PCR System即可，結(jié)果進(jìn)行自動(dòng)分析，能夠保證不 同實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。
【附圖說明】
[0040] 圖1:本發(fā)明用于檢測(cè)引物和探針特異性的PCR擴(kuò)增結(jié)果圖。
[0041] 圖2:本發(fā)明試劑盒用于個(gè)體識(shí)別檢測(cè)的PCR擴(kuò)增結(jié)果圖。
[0042] 圖3:本發(fā)明遺傳標(biāo)記N13-U + )的檢測(cè)結(jié)果圖。
[0043] 圖4:本發(fā)明遺傳標(biāo)記 N13-U + )的標(biāo)準(zhǔn)品（100%、90%、50%、10%、1%、0.1%、 0.05%、0.025%)擴(kuò)增曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0044] 下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，旨在用于說明本發(fā)明而非限定 本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可W對(duì)本 發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn)和修飾，運(yùn)些改進(jìn)和修飾也同樣落入本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0045] 實(shí)施例1:引物的設(shè)計(jì)與合成
[0046] ( -HnDel 位點(diǎn)篩選
[0047] 采用如下原則對(duì)InDel位點(diǎn)進(jìn)行篩選：
[004引 UInDel等位基因片段長(zhǎng)度差異(插入或缺失堿基數(shù)目）大于3bp小于30bp;
[0049] 2、位于人類22條常染色體上；
[(K)加]3、同一條染色體上的InDel位點(diǎn)間距大于5Mb;
[0化1] 4、最小等位基因頻率(Minimum allele打equency,MAF)介于0.30到0.50之間（W 東亞人群為基準(zhǔn)）；
[0052] 5、總位點(diǎn)數(shù)不少于30個(gè)，累積個(gè)體識(shí)別率達(dá)到0.9999W上；
[0053] 6、同一染色體上不形成連鎖，在人群中的分布符合化rdy-Weinbe巧遺傳平衡；
[0054] 7、避免InDel位點(diǎn)與某些特殊的疾病表型相關(guān)聯(lián)，多態(tài)性位點(diǎn)最好位于內(nèi)含子區(qū) 域。
[0055] 采用上述原則，分別通過http : //www . ensembl . org/index . html和http : // www.ncbi .nlm.nih.gov/projects/SNP/所示的網(wǎng)址，對(duì)多態(tài)性較強(qiáng)的InDel位點(diǎn)進(jìn)行初步 篩選，最終選定了 15個(gè)InDel位點(diǎn)，分別為:Nl-l(rs2308010)、Nl-2(rs：34855933)、Nl-3 (rs4646006)、N2-l(rs3042783)、N5-l(rsl610937)、N5-4(rsl610932)、N7-l(rsl6458)、N9-1(rs2308112)、N11-1(rs2307696)、N11-2(rs140790)、N13-l(rs3038530)、N13-2 (rs3049448)、N14-l(rs56024302)、N16-2(rs2067204)、N21-l(rsl6663)，括號(hào)中的 rs 號(hào)表 示該位點(diǎn)在化SNP數(shù)據(jù)庫(kù)的編號(hào)。
[0056] (二)樣本選擇、基因頻率測(cè)試和引物序列修改
[0057] 隨機(jī)選取94個(gè)中國(guó)人群DNA樣本，進(jìn)行擴(kuò)增和基因測(cè)序。采用初步選定的引物對(duì)94 個(gè)健康人基因組DNA樣本進(jìn)行檢測(cè)，用W評(píng)估引物的擴(kuò)增效率和各位點(diǎn)的基因頻率。
[0化引 UDNA提取
[0059] DNA提取按照QIAamp DNA Blood Mini kit試劑盒進(jìn)行，隨后采用RNase-^ee d地2〇稀釋到20ng/uL備用。
[0060] 2、PCR擴(kuò)增體系
[0061] 采用25uL的PCR擴(kuò)增體系：2.5uL 10 Xbuffer反應(yīng)液；0.7加 L IOmM dNTP; IuL SuM 引物F;1.8uL 加 M引物R;1.4uL 加 M引物F( + )/F(-);化L DNA;0.2uL Hot Stad Taq;luL Mg2+;0.1 uL DMSO，用RNase-Free d地2〇補(bǔ)足反應(yīng)體系。
[0062] 3、PCR反應(yīng)條件
[0063] 采用如下的PCR反應(yīng)條件:95°C預(yù)變性30s，然后95°C變性30s-58°C退火30s-68 。(:延伸30s，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后68 °C延伸5min。
[0064] 4、電泳檢測(cè)和引物序列修改
[0065] PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖電泳30min后進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證設(shè)計(jì)的特異性引物是否合適。W 一代測(cè)序結(jié)果為準(zhǔn)，針對(duì)電泳假陽(yáng)性和假陰性的情況，修改引物序列，重新進(jìn)行檢測(cè)。
[0066] 經(jīng)過檢測(cè)和修改之后，最終確定的15個(gè)InDel位點(diǎn)的引物及探針序列如表1所示， 委托上海英驗(yàn)生物技術(shù)有限公司合成上述引物和探針。
[0067] 分別用15個(gè)InDel位點(diǎn)的引物和探針對(duì)94個(gè)樣本進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明等位基因頻 率分布比較均衡，具體多態(tài)性信息如表2所示。其中：V'代表插入多態(tài)性；代表缺失多態(tài) 性；"+/+"代表插入純合子多態(tài)性；代表插入/缺失雜合子多態(tài)性；代表缺失純合 子多態(tài)性。
[006引表2 15個(gè)InDel位點(diǎn)的多態(tài)性信息（測(cè)序結(jié)果）
[0069]
[0070]
[0071 ] 實(shí)施例2:引物和探針特異性測(cè)試
[0072]在實(shí)施例1的測(cè)序結(jié)果下，分別選取5個(gè)插入純合子、缺失純合子和雜合子，進(jìn)行巧 光PCR，用于檢測(cè)引物和探針的特異性。
[0073] I、巧光PCR擴(kuò)增體系
[0074] 采用20uL的巧光PCR擴(kuò)增體系：IOuL 2 X Super Real PreMix反應(yīng)液(天根生化科 技(北京)有限公司，貨號(hào):FP206);0.2uL 50XR0X Reference Dye快根生化科技(北京)有 限公司，貨號(hào)：FP206);luL 6uM引物F( + )/F(-);luL 6uM引物R;luL 4uM探針；IuL 20ng/uL DNA;用RNase-Free d地2〇補(bǔ)足反應(yīng)體系。
[00巧]2、巧光PCR反應(yīng)條件
[0076] 采用如下的巧光PCR反應(yīng)條件:95°C預(yù)變性15min，然后95°C變性3s-60°C退火延 伸32s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，在6(TC處收集巧光信號(hào)。
[0077] 3、引物和探針特異性判斷
[0078] 通過Ct值來判斷每個(gè)遺傳標(biāo)記陽(yáng)性樣本和陰性樣本的Ct值區(qū)間范圍，陽(yáng)性樣本Ct 值落在24-29之間，陰性樣本Ct值在38W上，陽(yáng)性樣本和陰性樣本Ct值相差12W上，表示引 物和探針的特異性良好。
[0079] WNl-2( + )插入遺傳標(biāo)記為例，陽(yáng)性樣本(插入純合子和雜合子)的Ct值落在范圍 26-28內(nèi)（參見說明書附圖la)，陰性樣本(缺失純合子)的Ct值檢測(cè)不到（即在40個(gè)PCR循環(huán) 數(shù)下，沒有檢測(cè)到巧光信號(hào)，Ct值大于40)(參見說明書附圖Ib),表明引物和探針的特異性 良好。
[0080] 實(shí)施例3:本發(fā)明試劑盒的組成
[0081] 本發(fā)明用于微嵌合檢測(cè)和個(gè)體識(shí)別的InDel遺傳標(biāo)記試劑盒，保存于-20°C，由W 下試劑組成。
[0082] 1、全血基因組DNA提取試劑:購(gòu)于QIAamp DNA Blood Mini kit試劑盒。
[0083] 2、RNase-Free (1地2〇。
[0084] 3 JXSuper Real PreMix反應(yīng)液，購(gòu)于天根生化科技（北京）有限公司，貨號(hào)： FP206。
[0085] 4、50XR0X Reference Dye,購(gòu)于天根生化科技(北京)有限公司，貨號(hào):FP206。
[0086] 5、分別分裝在相應(yīng)編號(hào)離屯、管中的引物和探針組合，每種引物的濃度為6uM，每種 探針濃度為4uM。
[0087] 實(shí)施例4:本發(fā)明試劑盒用于個(gè)體識(shí)別的檢測(cè)
[0088] 隨機(jī)選取兩個(gè)不同來源的DNA樣本(分別命名為A和B)，用本發(fā)明試劑盒中的InDel 遺傳標(biāo)記進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)。
[0089] 巧光PCR擴(kuò)增體系及反應(yīng)條件同實(shí)施例2"PCR擴(kuò)增反應(yīng)后，對(duì)于每一個(gè)遺傳標(biāo)記， 擴(kuò)增后可能出現(xiàn)四種結(jié)果，具體參見說明書附圖2。圖2a中，樣本A和B均為陽(yáng)性；圖化中，樣 本A和B均為陰性；圖2c中，樣本A為陽(yáng)性，樣本B為陰性；圖2d中，樣本A為陰性，樣本B為陽(yáng)性。 圖2a和2b沒有多態(tài)性差異，圖2c和2d具有多態(tài)性差異，根據(jù)多態(tài)性差異即可判斷出樣本是 否來源于不同個(gè)體。
[0090] 根據(jù)Ct值進(jìn)行判斷，在15個(gè)InDel位點(diǎn)中，樣本A和樣本B有14個(gè)遺傳標(biāo)記(N1-1 (+)、Nl-2(-)、Nl-3(-)、N2-l(+)、N2-l(-)、N5-4(+)、N7-l(+)、N9-l(+)、Nll-l(-)、Nll-2 (-)、N13-l( + )、N13-l(-)、N14-l( + )、N16-2(-))具有多態(tài)性差異。因此，可判斷樣本A和樣本 B來源于不同的個(gè)體。
[0091 ] 實(shí)施例5:引物和探針準(zhǔn)確性和靈敏性測(cè)試
[0092] 選取40對(duì)DNA樣本進(jìn)行InDel遺傳標(biāo)記定性檢測(cè)，W獲得每對(duì)樣本的InDel位點(diǎn)多 態(tài)性信息。
[0093] 針對(duì)每一對(duì)樣本，選出可用的遺傳標(biāo)記（可用遺傳標(biāo)記需符合W下特點(diǎn)：Ct<28陽(yáng) 性樣本定為受者，Ct〉38陰性樣本定為供者），W不同比例混合，得到不同比例的標(biāo)準(zhǔn)品，通 過巧光PCR進(jìn)行靈敏度和準(zhǔn)確性檢測(cè)。同時(shí)，為了達(dá)到ICT 5的檢測(cè)靈敏度，初始DNA模板的量 至少為140ng。
[0094] 選擇其中一對(duì)樣本為例(樣本命名為C和D)，具體實(shí)施方法如下。
[0095] 1、對(duì)樣本C和樣本D進(jìn)行InDel位點(diǎn)多態(tài)性測(cè)試
[0096] 巧光PCR反應(yīng)體系及條件同實(shí)施例2。W樣本C為受者，樣本D為供著，按照Ct值的大 小(C: Ct<28陽(yáng)性樣本;D: Ct〉38陰性樣本），選出可用的遺傳標(biāo)記。
[0097] 2、標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建
[009引針對(duì)樣本C和樣本D，W不同比例混合（受者C/供者0:90%、50%、10%、1%、 0.1%、0.05%、0.025%)，得到不同比例的濃度為20ng/uL的標(biāo)準(zhǔn)品。
[0099] 3、通過定量分析的方法檢測(cè)引物和探針的準(zhǔn)確性和靈敏性
[0100] 將制備的嵌合比例分別為 100%、90%、50%、10%、1%、0.1%、0.05%、0.025% 的 標(biāo)準(zhǔn)品作為定量分析的模板，同時(shí)WRNase-Free d加 2〇為模板作為空白對(duì)照。為了達(dá)到 14化g DNA初始模板（1〇-5的檢測(cè)靈敏度），需添加7uL 20ng/uL的標(biāo)準(zhǔn)品，其它巧光PCR反應(yīng) 體系及條件同實(shí)施例2。
[0101] 4、定量分析
[0102] 通過巧光PCR，獲得不同比例的標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)所得的遺傳標(biāo)記和內(nèi)參基因的Ct值，并 計(jì)算兩者所得Ct值的差值（A Ct)。
[0103] 說明書附圖3為遺傳標(biāo)記N13-U + )的檢測(cè)結(jié)果?？磮D3可W看出，遺傳標(biāo)記N13-1 (+ )和內(nèi)參基因擴(kuò)增曲線形態(tài)良好，PCR產(chǎn)物特異性高、無非特異性擴(kuò)增，同時(shí)對(duì)照空白組無 擴(kuò)增。
[0104] 說明書附圖4為遺傳標(biāo)記N13-U + )的標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線。圖中顯示，標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線 形態(tài)良好。WC作為手術(shù)移植前的樣本，CD作為移植后的樣本，根據(jù)移植后與移植前A Ct的 差值（A A Ct)，可W計(jì)算獲得CD嵌合率％ = X 100%，其中A A Ct= A Ct移醋-A Ct纖節(jié) =(Ct極鑑g-Ct膨標(biāo)IOTfBtrC咕。通過比較理論值和巧光PCR計(jì)算獲得 的測(cè)試值，可W用來判斷各個(gè)遺傳標(biāo)記的靈敏度和準(zhǔn)確性。
[0105] 對(duì)于N13-U + )遺傳標(biāo)記，測(cè)試值分別為93.34% (理論90%)、65.19% (理論50%)、 13.25% (理論10% )、0.9452% (理論1%)、0.1053% (理論0.!%)、0.0598%(理論0.05%) W及0.0282% (理論0.025 % )，表明引物和探針測(cè)試準(zhǔn)確性良好，靈敏度可W達(dá)到0.025% JjL -?" O
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于微嵌合檢測(cè)和個(gè)體識(shí)別的引物和探針組合，其由SEQ ID NO.1-75所示的引 物和探針組成。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物和探針組合，其進(jìn)一步由第1-15組引物和探針組成，其中 第1組由SEQ ID NO. 1-4所示的引物和SEQ ID NO.5所示的探針組成，第2組由SEQ ID NO.6-9所示的引物和SEQ ID NO. 10所示的探針組成，第3組由SEQ ID NO. 11-14所示的引物和SEQ ID NO. 15所示的探針組成，第4組由SEQ ID NO. 16-19所示的引物和SEQ ID NO.20所示的探 針組成，第5組由SEQ ID NO.21-24所示的引物和SEQ ID NO.25所示的探針組成，第6組由 SEQ ID NO.26-29所示的引物和SEQ ID NO.30所示的探針組成，第7組由SEQ ID NO.31-34 所示的引物和SEQ ID NO.35所示的探針組成，第8組由SEQ ID NO.36-39所示的引物和SEQ ID NO.40所示的探針組成，第9組由SEQ ID NO.41-44所示的引物和SEQ ID NO.45所示的探 針組成，第10組由SEQ ID NO.46-49所示的引物和SEQ ID NO.50所示的探針組成，第11組由 SEQ ID NO.51-54所示的引物和SEQ ID NO.55所示的探針組成，第12組由SEQ ID NO.56-59 所示的引物和SEQ ID NO.60所示的探針組成，第13組由SEQ ID NO.61-64所示的引物和SEQ ID NO.65所示的探針組成，第14組由SEQ ID NO.66-69所示的引物和SEQ ID NO.70所示的 探針組成，第15組由SEQ ID NO.71-74所示的引物和SEQ ID NO.75所示的探針組成。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的引物和探針組合，其是針對(duì)亞洲人群高個(gè)體識(shí)別率的15個(gè) InDel位點(diǎn)設(shè)計(jì)的。4. 一種用于微嵌合檢測(cè)和個(gè)體識(shí)別的試劑盒，其包含權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的引 物和探針組合。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其中每種引物的濃度為6μΜ，每種探針的濃度為4μΜ。6. 權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的引物和探針組合在制備微嵌合檢測(cè)和個(gè)體識(shí)別試劑盒 中的應(yīng)用。7. 權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的引物和探針組合，或者權(quán)利要求4或5所述的試劑盒在 微嵌合檢測(cè)和個(gè)體識(shí)別中的應(yīng)用。8. -種微嵌合檢測(cè)和個(gè)體識(shí)別方法，其包含以下步驟： (1) 獲取待測(cè)樣品DNA; (2) 采用權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的引物和探針組合，或采用權(quán)利要求4或5所述的試 劑盒，以步驟(1)中獲取的DNA為模板，進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增，并收集熒光信號(hào)； (3) 根據(jù)Ct值判斷待測(cè)樣品在15個(gè)InDel位點(diǎn)上的多態(tài)性差異，從而對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行微 嵌合檢測(cè)和個(gè)體識(shí)別。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中采用的引物和探針是針對(duì)亞洲人群高個(gè)體識(shí)別率 的15個(gè)InDel位點(diǎn)設(shè)計(jì)的。10. 根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的方法，其中每種引物的濃度為6μΜ，每種探針的濃度為4μ Μ〇
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK105861675SQ201610268840
【公開日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2016年4月27日
【發(fā)明人】鄭仲征, 杜金偉, 謝桂貞, 翼麗軍, 潘捷
【申請(qǐng)人】上海荻碩貝肯生物科技有限公司