一種用于實時熒光pcr的通用探針及其檢測方法和應用
【專利摘要】本發(fā)明涉及實時熒光PCR領(lǐng)域，尤其涉及一種用于實時熒光PCR的通用探針及其檢測方法和應用；其中，通用探針包括正鏈探針和負鏈探針，正鏈探針包括由5’端至3’端依次相連的寡聚核苷酸正鏈序列和接頭序列，負鏈探針包括與寡聚核苷酸正鏈序列互補的寡聚核苷酸負鏈序列，正鏈探針的5’端連接有熒光基團，負鏈探針的3’端連接有淬滅基團。采用本發(fā)明用于實時熒光PCR的通用探針的檢測方法以及應用，可以實現(xiàn)實時檢測、無需PCR后續(xù)處理、節(jié)省設(shè)計和合成時間、降低成本、結(jié)果穩(wěn)定性好且易于分析。
【專利說明】
-種用于實時黃光PCR的通用探針及其檢測方法和應用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及實時巧光PCR領(lǐng)域，尤其設(shè)及一種用于實時巧光PCR的通用探針及其檢 測方法和應用。
【背景技術(shù)】
[0002] 現(xiàn)有技術(shù)中，巧光素標記方法在PCR中的應用，主要體現(xiàn)在巧光引物或巧光探針兩 個方面。
[000引其中，巧光引物的方法，主要有直接標記引物或者標記接頭引物，而PCR產(chǎn)物采用 遺傳分析儀，如ABI遺傳分析儀310、3130、3130別、3730等，通常用于檢測微衛(wèi)星及基因分 型，例如中國專利公告號為CN104178566的發(fā)明專利，即公開了一種可用于微衛(wèi)星檢測的多 重巧光PCR通用接頭及檢測方法和應用，其引物設(shè)計圖和檢測流程圖分別如圖1和圖2所示。 該技術(shù)的缺點包括:a)不能實現(xiàn)實時檢測;b)圖譜結(jié)果分析難，易誤判；c)PCR產(chǎn)物需后處 理，易污染檢測環(huán)境。
[0004] 巧光探針又可分為水解探針和雜交探針，其巧光信號檢測主要通過實時巧光定量 PCR儀進行。其中，1)水解探針:如圖3所示，WTaqMan探針為例進行說明，水解探針的5 '端和 3'端分別標記了一個報告巧光基團和一個澤滅巧光基團，在探針完整時，系統(tǒng)激發(fā)供體而 產(chǎn)生的巧光信號被臨近的澤滅基團吸收，所W此時檢測不到供體巧光信號;而當PCR過程中 化q DNA聚合酶擴增到探針結(jié)合模版的位點時，其5 '-3 '核酸外切酶的活性切割掉探針5 '端 的報告基團一一游離的報告基團遠離澤滅基團，打破能量的傳遞，激發(fā)報告基團產(chǎn)生的巧 光信號就可W被巧光檢測系統(tǒng)檢測到，檢測的是信號的積累。運種化qMan探針技術(shù)，需要針 對目的基因或突變位點設(shè)計特異性探針，不同基因或突變位點需重新設(shè)計、合成，存在成本 高且費時的問題。2)雜交探針，復性時兩條特異探針雜交到模板上，相互靠近而產(chǎn)生檢測信 號，到升溫變性探針遠離模板，無信號，檢測的是實時巧光信號。
[0005] 分子信標(Molecular beacon,MB)是一種呈發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖環(huán)雙標記寡核巧酸探 針，兩端的核酸序列互補配對，巧光基團與標記在另一端的澤滅基團緊緊靠近，在復性溫度 下，模板不存在時，形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，當加熱變性會使互補配對的莖環(huán)雙鏈解開，如圖4所示， 如果有模板存在環(huán)序列，分子信標將與模板配對。與模板配對后，分子信標將成鏈狀而非發(fā) 夾狀，使得巧光基團與澤滅劑分開。當巧光基團被激發(fā)時，澤滅作用被解除，發(fā)出激發(fā)光子。 運種分子信標技術(shù)，需要針對目的基因或突變位點設(shè)計特異性探針，不同基因或突變位點 需重新設(shè)計、合成，存在成本高且費時的問題；另外需通過烙解曲線Tm峰值進行檢測，檢測 靈敏度有限。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的目的是提供一種實現(xiàn)實時檢測、無需PCR后續(xù)處 理、節(jié)省設(shè)計和合成時間、降低成本、結(jié)果穩(wěn)定性好且易于分析的用于實時巧光PCR的通用 探針及其檢測方法和應用。
[0007] 本發(fā)明第一方面提供一種用于實時巧光PCR的通用探針，包括正鏈探針和負鏈探 針，所述正鏈探針包括由5'端至3'端依次相連的寡聚核巧酸正鏈序列和接頭序列，所述負 鏈探針包括與寡聚核巧酸正鏈序列互補的寡聚核巧酸負鏈序列，所述正鏈探針的5'端連接 有巧光基團，所述負鏈探針的3 '端連接有澤滅基團。
[0008] 進一步的，所述寡聚核巧酸正鏈序列的化值大于接頭序列的化值。
[0009] 應當說明的是，為了實現(xiàn)通用探針在某一類目的生物中的通用檢測，所述寡聚核 巧酸正鏈序列和接頭序列與采用該通用探針進行檢測的目的生物的序列相比無同源性或 序列相似度小于30 %。
[0010] 應當說明的是，同源性是指進化過程中源于同一祖先的分支之間的關(guān)系，同源性 是來描述物種之間的進化關(guān)系的，所謂同源序列，是指從某一共同祖先經(jīng)趨異進化而形成 的不同序列。相似性是指序列比對過程中用來描述檢測序列和目標序列之間相同DNA堿基 或氨基酸殘基順序所占比例的局低。一般認為，序列之間的相似性(similarity)越局，序列 之間同源的可能性越大。當相似程度高于50%時，比較容易推測檢測序列和目標序列可能 是同源序列;而當相似性程度低于20%時，就難W確定或者根本無法確定兩者具有同源性。
[0011] 關(guān)于通用探針的設(shè)計，若目的生物為真核生物，則所述寡聚核巧酸正鏈序列可根 據(jù)酵母菌基因組序列設(shè)計而成。
[0012] 進一步的，所述寡聚核巧酸正鏈序列采用如SEQ ID NO: 1-4中任一項所示的核巧 酸序列。其序列信息具體如下：
[0013] R-CCCGCCGCGTAGATCGAATA(SEQ ID N0：1)
[0014] R-CCAAGGCCGATCGCATGTTC(沈Q ID N0:2)
[0015] R-ACCTTCGGATCGCGGGTCT(沈Q ID N0:3)
[0016] R-CCTCCGAATCCGCCGTCGTACAAG(SEQ ID NO：4)
[0017]其中，R代表巧光基團。
[0018] 相應的，所述寡聚核巧酸負鏈序列采用如SEQ ID N0:5-8中任一項所示的核巧酸 序列。其序列信息具體如下：
[0019] TATTCGATCTACGCGGCGGG-Q(SEQ ID NO：5)
[0020] GAACATGCGATCGGCCTTGG-Q(SEQ ID NO：6)
[0021] AGACCCGCGATCCGAAGGT-Q(沈Q ID N0:7)
[0022] CTTGTACGACGGCGGATTCGGAGG-Q(SEQ ID NO：8)
[0023] 其中，Q代表澤滅基團。
[0024] 應當說明的是，若目的生物為真核生物，則所述接頭序列可根據(jù)細菌的16s rDNA 序列設(shè)計而成。
[0025] 進一步的，所述接頭序列采用如SEQ ID N0:9-12中任一項所示的核巧酸序列。其 序列信息具體如下：
[00%] TTCATTAGCGGCGCAATTT(沈Q ID N0:9)
[0027] CTAGCCCGAACGAATACTCA(SEQ ID NO：10)
[002引 TGATACAACCCGTAACCGT(沈Q ID N0:11)
[0029] ACTCATCGATCCCGCATAC(沈Q ID N0:12)
[0030] 進一步的，所述巧光基團包括但不限于FAM、TET、Texas RecUVIC或切5,所述澤滅 基團包括但不限于B冊I或B冊2。
[0031] 本發(fā)明第二方面提供一種采用前述用于實時巧光PCR的通用探針的檢測方法，包 括W下步驟：
[0032] S1、提取樣品的基因組DNA;
[0033] S2、將通用探針、特異性上游引物和下游引物按一定比例混合為混合引物；
[0034] S3、配制PCR反應體系，進行實時巧光PCR擴增；
[0035] S4、根據(jù)實時檢測的巧光信號強度進行結(jié)果分析；
[0036] 其中，所述特異性上游引物包括與通用探針中接頭序列相同的連接序列、W及與 目標基因的祀點序列相互補的特異引物序列。
[0037] 應當說明的是，對于低豐度目標樣品或者低回收率的核酸樣本，在步驟Sl之后還 可包括上游引物(FP)和下游引物(RP)對DNA模板預擴增的步驟，然后再將通用探針、特異性 上游引物(ADA-ASP)和下游引物(RP)按一定比例混合為混合引物，然后進行PCR擴增;對于 高豐度目標樣品或者高回收率的核酸，可W直接將通用探針、特異性上游引物(ADA-ASP)和 下游引物(RP)按一定比例混合為混合引物，然后進行PCR擴增。
[0038] 進一步的，所述上游引物和下游引物、W及相應的混合引物均設(shè)置為多組W同時 檢測多個目標基因，或者，所述混合引物設(shè)置為多組W檢測目標基因的多個基因型。
[0039] 本發(fā)明第S方面提供一種前述用于實時巧光PCR的通用探針，在基因分型和突變 基因檢測上的應用。
[0040] 借由上述方案，本發(fā)明至少具有W下優(yōu)點：
[0041] 1)與巧光引物相比，可W實現(xiàn)實時檢測，無需PCR后續(xù)處理；
[0042] 2)與化qMan等巧光探針相比，節(jié)省設(shè)計和合成時間，降低成本；
[0043] 3)通用探針兼有探針和引物的雙重功能；
[0044] 4)穩(wěn)定性好；
[0045] 5)結(jié)果易于分析。
[0046] 上述說明僅是本發(fā)明技術(shù)方案的概述，為了能夠更清楚了解本發(fā)明的技術(shù)手段， 并可依照說明書的內(nèi)容予W實施，W下W本發(fā)明的較佳實施例并配合附圖詳細說明如后。
【附圖說明】
[0047] 圖1是現(xiàn)有技術(shù)中多重巧光PCR通用接頭引物設(shè)計圖；
[0048] 圖2是現(xiàn)有技術(shù)中用于微衛(wèi)星檢測的多重巧光PCR通用接頭的檢測方法流程圖；
[0049] 圖3是現(xiàn)有技術(shù)中化qMan探針的工作原理圖；
[0050] 圖4是現(xiàn)有技術(shù)中分子信標的工作原理圖；
[0051 ]圖5是本發(fā)明第一實施例中實時巧光PCR的通用探針設(shè)計圖；
[0052] 圖6是本發(fā)明第一實施例中特異性上游引物、上游引物和下游引物的設(shè)計圖；
[0053] 圖7是本發(fā)明第一實施例中實時巧光PCR流程圖；
[0054] 圖8是本發(fā)明第二實施例中突變型等位基因擴增圖；
[0055] 圖9是本發(fā)明第二實施例中突變型等位基因擴增圖；
[0056] 圖10是本發(fā)明第二實施例中基因分型結(jié)果圖；
[0057] 圖11是本發(fā)明第S實施例中突變型等位基因擴增圖；
[0058] 圖12是本發(fā)明第S實施例中突變型等位基因擴增圖；
[0059] 圖13是本發(fā)明第S實施例中基因分型結(jié)果圖；
[0060] 圖14是本發(fā)明第四實施例中靈敏度實時擴增圖。
【具體實施方式】
[0061] 下面結(jié)合附圖和實施例，對本發(fā)明的【具體實施方式】作進一步詳細描述。W下實施 例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0062] 實施例一
[0063] 本發(fā)明一較佳實施例提供一組用于實時巧光PCR的通用探針，包括正鏈探針和負 鏈探針，正鏈探針包括由5 '端至3 '端依次相連的寡聚核巧酸正鏈序列（SFP-R)和接頭序列 (ADA)，負鏈探針包括與寡聚核巧酸正鏈序列互補的寡聚核巧酸負鏈序列（SFP-Q)，正鏈探 針的5'端連接有巧光基團(R)，負鏈探針的3'端連接有澤滅基團(Q)。
[0064] 用于實時巧光PCR的通用探針的檢測方法，包括W下步驟：
[00化]Sl、提取樣品的基因組DNA;
[0066] S2、加入上游引物和下游引物對目標基因進行預擴增；
[0067] S3、將通用探針、特異性上游引物和下游引物按一定比例混合為混合引物；
[006引 S4、配制PCR反應體系，進行實時巧光PCR擴增；
[0069] S5、根據(jù)實時檢測的巧光信號強度進行結(jié)果分析；
[0070] 其中，所述特異性上游引物包括與通用探針中接頭序列相同的連接序列、W及與 目標基因的祀點序列相互補的特異引物序列。
[0071] 通用探針的設(shè)計原理如圖5所示，其中，標號SFP-M和SFP-W代表兩組不同的通用探 針，分別用于目的基因中突變型和野生型的檢測，即，SFP-M和SFP-W在使用時分別與相應的 用于突變型或野生型PCR檢測的特異性上游引物、上游引物和下游引物混合使用，其要點在 于特異性上游引物中的連接序列分別與SFP-M和SFP-W的接頭序列相同，不同特異性上游引 物中的特異引物序列分別祀向突變型和野生型目的基因。
[0072] SFP-M的正鏈探針序列為：
[0073] R-CCCGCCGCGTAGATCGAATATTCATTAGCGGCGCAATTT(沈Q ID NO:13)
[0074] 其中，標記下劃線的部分為接頭序列(ADA-I)。
[00巧]SFP-M的負鏈探針序列為：
[0076] TATTCGATCTACGCGGCGGG-Q(SEQ ID NO：5)
[0077] SFP-W的正鏈探針序列為：
[007引 R-CCAAGGCCGATCGCATGTTCCTAGCCCGAACGAATACTCA(SEQ ID NO:14)
[0079] 其中，標記下劃線的部分為接頭序列(ADA-2)。
[0080] SFP-W的負鏈探針序列為：
[0081 ] TATTCGATCTACGCGGCGGG-Q(SEQ ID NO：6)
[0082] 應當說明的是，SFP-M和SFP-W中的寡聚核巧酸正鏈序列（SFP-R)和接頭序列(ADA) 可自由組合，并不局限于前述序列，本實施例僅提出一種實施方式。
[0083] 本發(fā)明用到兩種通用探針，由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。W目的基因為 真核生物的基因為例，SFP-M-R及SFP-M-Q序列根據(jù)酵母菌基因組序列設(shè)計的，2個接頭序列 (ADA)是根據(jù)細菌的16s序列設(shè)計的，目的是與真核生物的序列同源性最低，避免非特異性 擴增干擾。具體序列信息如表1所示。
[0084]表1用于實時巧光PCR的通用探針的序列信息
[00? 引
[0086] 表1中，R代表巧光基團，可選用FAM、TET、Texas RecUVIC和切5，Q代表澤滅基團，可 選用B冊UB冊2。
[0087] 另外，應當說明的是，SFP-M-R的Tm值大于ADA-I、SFP-W-R的Tm值大于ADA-2，為實 行實時巧光檢測的必要條件。
[008引巧光基團，標記在SFP-R的5'端，并可與其任意組合，但是同時使用的不同通用探 針的巧光基團不能重復，需建立一一對應關(guān)系?，F(xiàn)有的巧光基團（FAM、TET、Texas RecUVIC、 C巧等），根據(jù)儀器檢測通道及檢測類型選擇巧光基團，避免光譜重疊。
[0089] 澤滅基團，標記在SFP-Q序列的3 '端，并可與其任意組合，但是同時使用的不同通 用探針之間的澤滅基團不能重復，需建立一一對應關(guān)系?，F(xiàn)有的澤滅基團（BHQUB冊2等）， 根據(jù)儀器檢測通道及檢測類型選擇巧光基團，避免光譜重疊。
[0090] W基因分型中等位基因的檢測為例，進一步說明特異性上游引物、上游引物和下 游引物的設(shè)計過程。如圖6所示，特異性上游引物(本例中即圖中所示的等位基因特異性引 物），包括由5'端至3'端依次連接的連接序列(ADA)和特異引物序列(ASP)，其中連接序列 (ADA-I、ADA-2)分別與SFP-M和SFP-W的接頭序列(ADA-I、ADA-2)相同。對于低豐度目標樣 品或者低回收率的核酸，上游引物(FP)和下游引物(RP)用于對DNA模板預擴增，然后將通用 探針、特異性上游引物(ADA-ASP)和下游引物(RP)按一定比例混合為混合引物，然后進行 PCR擴增;對于高豐度目標樣品或者高回收率的核酸，可W直接將通用探針、特異性上游引 物(ADA-ASP)和下游引物(RP)按一定比例混合為混合引物，然后進行PCR擴增。
[0091 ] W檢測等位基因中的突變型基因位點為例，具體實驗流程如下：
[0092] S1、設(shè)計通用探針、特異性上游引物、上游引物和下游引物；
[0093] S2、上游引物(FP)和下游引物(RP)配置反應體系，進行DNA模板預擴增；
[0094] S3、將通用探針（SFP)、下游引物(RP)及特異引物序列(ADA-ASP)按一定比例混合 為混合引物，配置反應體系，W預擴增產(chǎn)物進行實時巧光定量PCR檢測，其擴增流程如圖7所 示，圖中AMPLIC0N分別代表不同擴增產(chǎn)物，巧光信號強度與AMPLIC0N-4產(chǎn)物成線性關(guān)系；
[00巧]反應體系為10化，包括2X hKaRa Taq?HS Perfect Mix加1、混合引物1.化L、巧 光標記接頭0.化L、去離子水化UDNA 20ng。
[0096] S4、結(jié)果分析，生成檢測報告。
[0097] 實施例二
[0098] 本發(fā)明提供一種實時巧光PCR儀運用通用探針進行RS1801133位點基因分型的方 法，具體步驟如下：
[0099] S1、合成特異性上游引物(等位基因特異性引物1、等位基因特異性引物2)、上游引 物(FP)和下游引物(RP);
[0100] 等位基因特異性引物1的序列為：
[0101]
[0102] 其中，標記下劃線的部分為接頭序列(ADA-I)，方框標記的堿基對應為RS1801133 位點突變型。
[0103] 等位基因特異性引物2的序列為：
[0104]
[01化]其中，標記下劃線的部分為接頭序列(ADA-2)，方框標記的堿基對應為RS1801133 位點野生型。
[0106]上游引物的序列為：
[0107] TGTGTCAGCCAAAGAAAAGC(沈Q ID N0:17)
[010引下游引物的序列為：
[0109] AGGCTGACCAAGCACTTGA(SEQ ID NO：18)
[0110] S2、選取人唾液樣本，提取樣本的基因組DM;
[0111] S3、選取新合成的Rs 1801133位點的FP及RP對DNA模板進行預擴增；
[0112] S4、采用實施例1中的通用探針(SFP-M和SFP-W)，并將其與等位基因特異性引物1、 等位基因特異性引物2、下游引物(RP)按照一定比例(摩爾比）混合，在滿旋混合器上混勻組 成混合引物；
[0113] S5、將混合引物配置成PCR反應體系，W預擴增產(chǎn)物進行實時巧光PCR擴增；
[0114] S6、根據(jù)實時檢測的巧光信號強度進行結(jié)果分析;突變型和野生型等位基因的實 時擴增圖分別如圖8和圖9所示，可見巧光信號強度與擴增次數(shù)基本成線性關(guān)系，通用探針 (SFP-M和SFP-W)可W實現(xiàn)實時巧光PCR擴增。根據(jù)巧光檢測結(jié)果進行基因分型，其結(jié)果如圖 10所示，可見兩套通用探針(SFP-M和SFP-W)可W很好地將待測目的基因的突變型和野生型 分開。
[011引實施例；
[0116] 本發(fā)明提供一種實時巧光PCR儀運用通用探針進行RS267606617及RS267606619位 點基因分型的方法，具體步驟如下：
[0117] S1、合成特異性上游引物(等位基因特異性引物1、等位基因特異性引物2)、上游引 物(FP)和下游引物(RP);
[011引 其中；
[0119] 1)RS267606617 的引物設(shè)計
[0120] 等位基因特異性引物1的序列為：
[0121]
[0122] 其中，標記下劃線的部分為接頭序列（ADA-I)，方框標記的堿基對應為 RS267606617位點突變型。
[0123] 等位基因特異性引物2的序列為：
[0124]
[012引其中，標記下劃線的部分為接頭序列（ADA-2)，方框標記的堿基對應為 RS267606617位點野生型。
[0126] 上游引物的序列為：
[0127] GTCCAAGTGCACTTTCCAGT(沈Q ID N0:21)
[012引下游引物的序列為：
[01 巧]CCCTCCTCAAGTATACTTCAAAGGACA(SEQ ID N0:22)
[0130] 2)RS267606619 的引物設(shè)計
[0131] 等位基因特異性引物1的序列為：
[0132]
[0133] 其中，標記下劃線的部分為接頭序列（ADA-I)，方框標記的堿基對應為 RS267606619位點突變型。
[0134] 等位基因特異性引物2的序列為：
[0135]
[0136] 其中，標記下劃線的部分為接頭序列（ADA-2)，方框標記的堿基對應為 RS267606619位點野生型。
[0137] 上游引物的序列為：
[0138] ACTTACCATGTTACGACTTGTCTCC(沈Q ID N0:25)
[0139] 下游引物的序列為：
[0140] GGTGGCAAGAAATGGGCTAC(沈Q ID N0:26)
[0141] S2、選取人全血樣本，提取樣本的基因組DNA，對DNA均一化到同一濃度；
[0142] S3、選取新合成的RS267606617及RS267606619的FP、RP對樣本DNA模板進行預擴 增；
[0143] S4、采用實施例1中的通用探針（SFP-M和SFP-W)，并將其分別與RS267606617及 RS267606619的等位基因特異性引物1、等位基因特異性引物2、下游引物(RP)按照一定比例 (摩爾比）混合，在滿旋混合器上混勻組成混合引物；
[0144] S5、將混合引物配置成PCR反應體系，W預擴增產(chǎn)物進行實時巧光PCR擴增；
[0145] S6、根據(jù)實時檢測的巧光信號強度進行結(jié)果分析；
[0146] S7、根據(jù)實時檢測的巧光信號強度進行結(jié)果分析;突變型和野生型等位基因的實 時擴增圖分別如圖11和圖12所示，可見巧光信號強度與擴增次數(shù)基本成線性關(guān)系，通用探 針可W實現(xiàn)實時巧光PCR擴增。根據(jù)巧光檢測結(jié)果進行基因分型，其結(jié)果如圖13所示，可見 通用探針可W很好地將待測目的基因的突變型和野生型分開，適用于多個基因位點的基因 分型檢測。
[0147] 實施例四
[0148] 本發(fā)明提供一種實時巧光PCR儀運用通用探針進行腫瘤突變基因檢測的方法，突 變位點RSl 13488022,具體步驟如下：
[0149] Sl、合成特異性上游引物、上游引物腫)和下游引物(RP);
[0150] 其中；
[0151] 特異性上游引物的序列為：
[0152]
[0153] 其中，標記下劃線的部分為接頭序列（ADA-I)，方框標記的堿基對應為 RSl 13488022位點突變型。
[0154] 上游引物的序列為：
[01 巧]GTCCAAGTGCACTTTCCAGT(沈Q ID N0:27)
[0156] 下游引物的序列為：
[0157] CCCTCCTCAAGTATACTTCAAAGGACA(SEQ ID NO：28)
[0158] S2、選取人野生型樣本及突變型細胞系樣本，提取樣本的基因組DM,測定濃度；
[0159] S3、配置不同突變含量樣本，用于靈敏度檢測；
[0160] S4、選取新合成的RSl 13488022的FP及RP對DNA模板進行預擴增；
[0161] S5、選用已合成的通用探針(SFP-M)、新合成RS113488022的特異性上游引物、下游 引物RP按照一定比例(摩爾比）混合，在滿旋混合器上混勻組成混合引物；
[0162] S6、將混合引物配置成PCR反應體系，進行實時巧光PCR擴增；
[0163] S7、根據(jù)實時檢測的巧光信號強度進行結(jié)果分析；
[0164] S8、靈敏度實時擴增圖如圖14所示，可見通用探針可W適用于稀釋不同濃度（1% M、10%M和50%M)的樣本的突變基因檢測，靈敏度較高。
[0165] W上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，并不用于限制本發(fā)明，應當指出，對于本技 術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可W做出若干改進和 變型，運些改進和變型也應視為本發(fā)明的保護范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種用于實時熒光PCR的通用探針，其特征在于：包括正鏈探針和負鏈探針，所述正 鏈探針包括由5'端至3'端依次相連的寡聚核苷酸正鏈序列和接頭序列，所述負鏈探針包括 與寡聚核苷酸正鏈序列互補的寡聚核苷酸負鏈序列，所述正鏈探針的5'端連接有熒光基 團，所述負鏈探針的3 '端連接有淬滅基團。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于實時熒光PCR的通用探針，其特征在于:所述寡聚核苷酸 正鏈序列的Tm值大于接頭序列的Tm值。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于實時熒光PCR的通用探針，其特征在于:所述寡聚核苷酸 正鏈序列和接頭序列與采用通用探針檢測的目的生物的序列相比無同源性或序列相似度 小于30 %。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于實時熒光PCR的通用探針，其特征在于:所述寡聚核苷酸 正鏈序列根據(jù)酵母菌基因組序列設(shè)計而成。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的用于實時熒光PCR的通用探針，其特征在于:所述寡聚核苷酸 正鏈序列采用如SEQ ID NO: 1-4中任一項所示的核苷酸序列。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于實時熒光PCR的通用探針，其特征在于:所述接頭序列根 據(jù)細菌的16s rDNA序列設(shè)計而成。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的用于實時熒光PCR的通用探針，其特征在于:所述接頭序列采 用如SEQ ID NO:9-12中任一項所示的核苷酸序列。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于實時熒光PCR的通用探針，其特征在于:所述熒光基團包 括但不限于FAM、TET、Texas RecUVIC或Cy5,所述淬滅基團包括但不限于BHQ1或BHQ2。9. 一種采用根據(jù)權(quán)利要求1至8任一項的用于實時熒光PCR的通用探針的檢測方法，其 特征在于:包括以下步驟： 51、 提取樣品的基因組DNA; 52、 將通用探針、特異性上游引物和下游引物按一定比例混合為混合引物； 53、 配制PCR反應體系，進行實時熒光PCR擴增； 54、 根據(jù)實時檢測的熒光信號強度進行結(jié)果分析； 其中，所述特異性上游引物包括與通用探針中接頭序列相同的連接序列、以及與目標 基因的靶點序列相互補的特異引物序列。10. -種根據(jù)權(quán)利要求1至8任一項的用于實時熒光PCR的通用探針，在基因分型和突變 基因檢測上的應用。
【文檔編號】C12N15/11GK105861706SQ201610329478
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年5月18日
【發(fā)明人】周立新, 葉紹云, 李丹, 楊小娟, 蔣峻峰
【申請人】健路生物科技（蘇州）有限公司