測序接頭、其制備方法及其在超低頻變異檢測中的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明提供了測序接頭、其制備方法及其在超低頻變異檢測中的應(yīng)用。其中，測序接頭包括依次相連的文庫擴(kuò)增引物序列、目的片段擴(kuò)增引物序列以及錯誤提示序列，錯誤提示序列位于靠近目的片段的一側(cè)，文庫擴(kuò)增引物序列位于遠(yuǎn)離目的片段的一側(cè)，錯誤提示序列為已知堿基順序的序列。通過在靠近目的片段的一側(cè)增設(shè)了已知堿基順序的錯誤提示序列，錯誤提示序列能夠為每個雙鏈的DNA模板加上特有的外源標(biāo)記。便于后續(xù)得到目的片段的測序數(shù)據(jù)后，根據(jù)測序序列是否帶有相同的錯誤提示序列篩選或剔除測序本身或者文庫擴(kuò)增步驟中引入的突變，然后將在兩條鏈同一位置都出現(xiàn)變異的位點確定為真實的突變，而將只有一條鏈有突變的位點認(rèn)定為擴(kuò)增或者測序誤差，從而提高變異檢測精度。
【專利說明】
測序接頭、其制備方法及其在超低頻變異檢測中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及高通量測序文庫構(gòu)建領(lǐng)域，具體而言，設(shè)及一種測序接頭、其制備方法 及其在超低頻變異檢測中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著高通量測序技術(shù)的逐步成熟，其應(yīng)用領(lǐng)域也越來越廣泛，不僅能夠?qū)崿F(xiàn)由大 量樣本到微量樣本的檢測，而且還實現(xiàn)了由高頻突變到超低頻變異的檢測。但由于目前最 準(zhǔn)確的高通量測序本身的單個堿基的錯誤率就在1(T 3~1(T2左右，再加上眾所周知的DNA聚 合酶的固有錯誤率QCT7~1〇4)，因而，目前常規(guī)的實驗建庫方法是不可能做到1%甚至更 高的檢測精度的，而運種誤差使得我們很難檢測到一些罕見的變異(又叫做超低頻變異，突 變率為0.5%~0.1 % )。盡管目前已經(jīng)有多種針對超低頻變異的改進(jìn)的建庫測序方法，在實 際應(yīng)用中還是存在諸多局限性。
[0003] 現(xiàn)有針對低頻檢測類的方法大致分為W下=類，其特點及相應(yīng)的局限性如下：
[0004] -、特異性的富集突變分子
[0005] 代表性的方法包括IYansgenomic公司采用的Multiplexed ICE C0LD-PCR(MX-ICP)W及Boreal公司的Synchronous coefficient of 化ag alteration(SCODA)技術(shù)，所 需測序數(shù)據(jù)量較低，但是需要額外的儀器用來富集突變分子，而且只能用于檢測單核巧酸 多態(tài)性(SNP)，儀器的額外采購W及檢測種類的單一限制了上述方法的應(yīng)用范圍。
[0006] 二、重疊序列矯正和信息分析優(yōu)化
[0007] 1.個體化建檔深度測序分析方法（Cancer Personalized Profiling by deep sequencing CAPP-seq)的實驗流程并沒有進(jìn)行大的改動，只是在深度測序的前提下對信息 分析流程進(jìn)行了一些優(yōu)化，運種方法不能消除實驗方法帶來的誤差；
[000引2.通過對雙端測序的重疊部分的原始reads進(jìn)行重疊序列矯正降低測序錯誤率來 提高檢測精度，但是運種方法并不能消除建庫方法帶來的錯誤。
[0009] S、單分子滾環(huán)擴(kuò)增(circle sequencing)
[0010] 利用單分子滾環(huán)復(fù)制的形式對模板分子進(jìn)行多次擴(kuò)增，形成一種來源于同一模板 的序列連接在一起的長鏈，將長鏈進(jìn)行打斷處理后進(jìn)行文庫的構(gòu)建，隨后對運些來源于同 一模板的擴(kuò)增子進(jìn)行測序，通過后期的信息分析方法對運些來源同一模板的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行 分析來降低測序W及實驗帶來的錯誤。但是運種方法應(yīng)用有兩個限制點：1)單鏈分子環(huán)化 效率較低，對于微量樣本會造成模板丟失;2)需要比較長的測序讀長。
[0011] 因而，仍需要對現(xiàn)有的超低頻變異的建庫檢測方法進(jìn)行改進(jìn)，W提高對超低頻變 異的檢測精度。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 本發(fā)明的主要目的在于提供一種測序接頭、其制備方法及其在超低頻變異檢測中 的應(yīng)用，W解決現(xiàn)有技術(shù)中檢測精度不夠高的問題。
[0013] 為了實現(xiàn)上述目的，根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了一種測序接頭，該測序接頭包 括依次相連的文庫擴(kuò)增引物序列、目的片段擴(kuò)增引物序列W及錯誤提示序列，錯誤提示序 列位于靠近目的片段的一側(cè)，文庫擴(kuò)增引物序列位于遠(yuǎn)離目的片段的一側(cè)，其中，錯誤提示 序列為已知堿基順序的序列。
[0014] 進(jìn)一步地，測序接頭為Y字型接頭。
[0015] 進(jìn)一步地，Y字型接頭包括第一鏈和與第一鏈部分互補的第二鏈，第一鏈和第二鏈 中較長的鏈的長度為30~67bp，優(yōu)選為40~50bp，更優(yōu)選，第一鏈的序列為SEQ ID NO: 1: 5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNT-3'，第二鏈的序列為SEQ ID N0:2:5'-NNNNNNAGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC-3 '，其中，6個N所形成的序列代表堿基序列 已知的錯誤提示序列。
[0016] 進(jìn)一步地，錯誤提示序列的長度為4~12bp，優(yōu)選為化P。
[0017] 進(jìn)一步地，文庫擴(kuò)增引物序列的長度為15~30bp。
[0018] 根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，還提供了一種測序接頭的制備方法，該制備方法包括： 設(shè)計測序接頭的兩條單鏈序列，每條單鏈序列中包含錯誤提示序列，且錯誤提示序列位于 單鏈序列靠近所欲連接的目的片段的一側(cè)，錯誤提示序列為已知堿基順序的序列；分別合 成兩條單鏈序列;將合成的兩條單鏈序列進(jìn)行特異性退火，得到雙鏈的測序接頭。
[0019] 進(jìn)一步地，測序接頭為多對，制備方法在得到雙鏈的測序接頭之后還包括:將多對 測序接頭進(jìn)行等比例混合，得到混合的測序接頭的步驟。
[0020] 根據(jù)本發(fā)明的一個方面，還提供了 一種測序接頭，該測序接頭通過上述任一種制 備方法制備而成。
[0021] 根據(jù)本發(fā)明的又一個方面，還提供了一種構(gòu)建超低頻變異測序文庫的試劑盒，該 試劑盒中包括測序接頭，該測序接頭為上述任一種測序接頭，或者上述任一種測序接頭的 制備方法制備而成的測序接頭。
[0022] 根據(jù)本發(fā)明的再一個方面，還提供了一種超低頻變異測序文庫的構(gòu)建方法，該構(gòu) 建方法包括:步驟SI,構(gòu)建含有目的片段的測序文庫;步驟S2,對測序文庫進(jìn)行雜交捕獲，得 到捕獲后文庫；W及步驟S3,對捕獲后文庫進(jìn)行擴(kuò)增，得到目的文庫;其中，步驟Sl中采用上 述構(gòu)建超低頻變異測序文庫的試劑盒構(gòu)建含有目的片段的測序文庫。
[0023] 根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，還提供了一種超低頻變異測序文庫，該超低頻變異測 序文庫采用上述超低頻變異測序文庫的構(gòu)建方法構(gòu)建而成。
[0024] 本發(fā)明還提供了一種超低頻變異的檢測方法，該檢測方法包括:對上述超低頻變 異測序文庫進(jìn)行高通量測序，獲得測序數(shù)據(jù)；W及對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行變異位點分析，獲得變異 位點數(shù)據(jù)。
[0025] 應(yīng)用本發(fā)明的技術(shù)方案，通過在目的片段測序引物的內(nèi)偵U(靠近目的片段的一側(cè)） 增設(shè)了能夠?qū)δ康哪０暹M(jìn)行標(biāo)記的具有已知堿基順序的錯誤提示序列，錯誤提示序列為每 個雙鏈的DNA模板加上特有的外源標(biāo)記，由于該外源標(biāo)記的堿基順序是已知的，便于后續(xù)得 到目的片段的測序數(shù)據(jù)后，根據(jù)測序序列是否帶有相同的錯誤提示序列篩選或剔除測序本 身或者文庫擴(kuò)增步驟中引入的突變，然后將在兩條鏈的同一位置都出現(xiàn)突變的突變確定為 真實的突變，而只有一條鏈有突變的突變認(rèn)定為實驗誤差或者測序誤差，從而實現(xiàn)提高真 實突變的檢測精度。
【附圖說明】
[0026] 構(gòu)成本申請的一部分的說明書附圖用來提供對本發(fā)明的進(jìn)一步理解，本發(fā)明的示 意性實施例及其說明用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明的不當(dāng)限定。在附圖中：
[0027] 圖1示出了根據(jù)本發(fā)明的實施例1和對照例的方法所構(gòu)建的文庫的電泳檢測結(jié)果 圖；W及
[0028] 圖2A至圖2D示出了本發(fā)明一種優(yōu)選的實施例中不同樣本所構(gòu)建的文庫的庫檢結(jié) 果；其中，圖24為文庫￥。00川0歴化0000 3 (0.1 %)的2100檢測圖；圖28為文庫 YF00CTDNA化00005(5% )的2100檢測圖；圖2C為文庫YF00CTDNA化00006(0.1% )的2100檢測 圖；圖2D為文庫YF00CTDNA化00007(5% )的2100檢測圖。
【具體實施方式】
[0029] 需要說明的是，在不沖突的情況下，本申請中的實施例及實施例中的特征可W相 互組合。下面將結(jié)合實施例來詳細(xì)說明本發(fā)明。
[0030] 需要說明的是，現(xiàn)有技術(shù)中的接頭序列通常包括文庫擴(kuò)增引物序列、目的片段擴(kuò) 增引物序列W及樣本標(biāo)簽序列（即index序列）。其中，樣本標(biāo)簽序列是位于目的片段引物擴(kuò) 增序列和文庫擴(kuò)增序列中間的，而目的片段擴(kuò)增引物序列是與目的片段直接相連的序列， 而文庫擴(kuò)增序列是目的擴(kuò)增片段最外側(cè)的序列，如Illumina測序平臺的P5和P7序列。而本 申請中的錯誤提示序列，也稱分子模板識別序列，其位置是在目的片段與目的片段擴(kuò)增引 物序列之間，即錯誤提示序列是與目的片段直接連接的序列。
[0031] 如【背景技術(shù)】部分所提到的，目前針實驗流程對超低頻變異的檢測精度不夠高，為 了改進(jìn)上述現(xiàn)狀，在本申請一種優(yōu)選的實施方式中，提供了一種測序接頭，該測序接頭包括 依次相連的文庫擴(kuò)增引物序列、目的片段擴(kuò)增引物序列W及錯誤提示序列，錯誤提示序列 位于靠近目的片段的一側(cè)，文庫擴(kuò)增引物序列位于遠(yuǎn)離目的片段的一側(cè)，其中，錯誤提示序 列為已知堿基順序的序列。
[0032] 本申請的測序接頭通過在目的片段測序引物的內(nèi)偵U(靠近目的片段的一側(cè))增設(shè) 了能夠?qū)δ康哪０暹M(jìn)行標(biāo)記的具有已知堿基順序的錯誤提示序列，錯誤提示序列為每個雙 鏈的DNA模板加上特有的外源標(biāo)記，由于該外源標(biāo)記的堿基順序是已知的，便于后續(xù)得到目 的片段的測序數(shù)據(jù)后，根據(jù)測序序列是否帶有相同的錯誤提示序列篩選或剔除測序本身或 者文庫擴(kuò)增步驟中引入的突變，然后將在兩條鏈的同一位置都出現(xiàn)突變的突變確定為真實 的突變，而只有一條鏈有突變的突變認(rèn)定為實驗誤差或者測序誤差，從而實現(xiàn)提高真實突 變的檢測精度。
[0033] 上述測序接頭與現(xiàn)有的文庫擴(kuò)增用測序接頭類似，根據(jù)具體使用的測序平臺的不 同，可W為不同的現(xiàn)有的雙鏈接頭，也可W是根據(jù)現(xiàn)有雙鏈接頭適當(dāng)改進(jìn)的雙鏈接頭，還可 W是實驗人員自行設(shè)計的雙鏈接頭。在本申請中，優(yōu)選上測序鏈接頭為應(yīng)用廣泛的Y字型接 頭。與現(xiàn)有的Y字型接頭類似，Y字型接頭中包括第一鏈和與第一鏈部分互補的第二鏈，且兩 條鏈中通常有一條鏈的長度相對較長，在本申請一種優(yōu)選的實施例中，優(yōu)選較長的那條鏈 的長度為30~67bp，優(yōu)選為40~50bp，更優(yōu)選，第一鏈的序列為：SEQ ID N0:l:5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTONNNNNT-3'，第二鏈的序列為：SEQ ID N0:2:5'- NNNNNNAGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC-3'，其中，N所形成的序列代表堿基順序已 知的錯誤提示序列。
[0034] 對于上述測序接頭中錯誤提示序列的長度是根據(jù)實際需要進(jìn)行合理調(diào)整的，并不 局限于某一特定的長度。錯誤提示序列長度越長，序列多態(tài)性就越多，能夠標(biāo)記的模板分子 就越多，但序列越長，占用產(chǎn)出的測序數(shù)據(jù)的長度也越長，實際獲得的目的DNA分子的長度 就會相應(yīng)縮短。在本申請一種優(yōu)選的實施例中錯誤提示序列的長度為4~8bp，優(yōu)選為化P。 將錯誤提示序列長度控制在4~Sbp范圍內(nèi)，基本能夠滿足所有實驗所用的模板DNA分子，而 且對實際獲得的目的DNA分子的長度的影響相對較小。
[0035] 在本申請另一種優(yōu)選的實施例中，將上述用于對目的片段測序引物序列進(jìn)行擴(kuò)增 的序列的長度控制在5~20bp范圍內(nèi)。運樣有助于縮短所構(gòu)建的測序接頭的總長度，從而減 少測序接頭在PCR擴(kuò)增、測序過程中引入的錯誤，而導(dǎo)致減少測序產(chǎn)出的有效數(shù)據(jù)量。
[0036] 在本申請另一種典型的實施方式中，還提供了一種測序接頭的制備方法，該制備 方法包括:設(shè)計測序接頭的兩條單鏈序列，每條單鏈序列中包含錯誤提示序列，且該錯誤提 示序列位于單鏈序列靠近所欲連接的目的片段的一側(cè)，錯誤提示序列為已知堿基順序的序 列；分別合成兩條單鏈序列；將合成的兩條單鏈序列進(jìn)行特異性退火，形成雙鏈的測序接 頭。
[0037] 上述制備方法中的合成是指化學(xué)合成通常是由提供化學(xué)合成服務(wù)的公司合成。而 非生物合成，即不是指通過W-條鏈為模板，另一條通過復(fù)制延伸的方式進(jìn)行合成。本申請 的上述測序接頭的制備方法，通過根據(jù)實驗需求分別合成雙鏈測序接頭中的每條單鏈序 列，然后再通過特異性退火的方式形成雙鏈的測序接頭。該接頭制作方法簡單，而且由于合 成的單鏈序列是根據(jù)預(yù)先設(shè)計好的序列進(jìn)行合成的，因而每個接頭上攜帶的錯誤提示序列 是確定。進(jìn)而在用于構(gòu)建文庫對超低頻變異進(jìn)行檢測時，能夠通過將每個模板DNA分子的正 義鏈和反義鏈上相同位置發(fā)生的堿基突變確定為真實的突變，而將單獨發(fā)生在一條鏈上的 突變或者發(fā)生在正義鏈和反義鏈上不同位置的堿基突變確定為假突變。運樣便能夠排除文 庫擴(kuò)增或者測序錯誤導(dǎo)致的突變，從而不僅能夠提高檢測的精確度，而且有助于降低假陽 性率。
[0038] 相對于常規(guī)測序接頭，本申請的上述制備方法所提供的測序接頭用于突變檢測 時，可W不僅識別出目標(biāo)片段的PCR錯誤、測序錯誤，還可W通過已知堿基序列的錯誤提示 序列，實現(xiàn)錯誤提示序列的自我矯正，從而提高檢測精度。
[0039] 上述制備方法中，通過合成單鏈W及單鏈退火形成雙鏈接頭的方式分別得到每對 測序接頭之后，根據(jù)實驗操作習(xí)慣和實驗?zāi)康牡牟煌?，在使用測序接頭時可W分成兩步來 連接兩端的接頭，也可W-步完成連接。在一步完成連接的情況下，為了進(jìn)一步提高兩端測 序接頭所攜帶的各種不同錯誤提示的均一性，在本申請一種優(yōu)選的實施例中，測序接頭有 多對，在得到雙鏈的測序接頭之后，上述制備方法還包括:將多對雙鏈接頭進(jìn)行等比例混 合，得到混合的測序接頭的步驟。
[0040] 上述優(yōu)選的實施例中，利用上述混合測序接頭對目的片段連接時，對各種不同錯 誤提示序列的利用幾率均等，使來源與基因組不同位置的相同DNA分子片段帶上不同錯誤 提示序列的多樣性增加，進(jìn)而可W排除來源于不同位置的相同模板DNA分子在第一位置的 正義鏈中某一位置的堿基突變與第二位置的反義鏈中相同位置的相同堿基突被誤認(rèn)為是 陽性突變，從而提高檢測精度。
[0041] 在本申請另一種典型的實施方式中，還提供了一種測序接頭，該測序接頭采用上 述任一種制備方法制備而成。在本申請又一種典型的實施方式中，還提供了一種構(gòu)建超低 頻變異測序文庫的試劑盒，該試劑盒中包括上述任一種測序接頭或者上述任一種制備方法 制備而成的測序接頭。上述測序接頭或試劑盒，通過預(yù)先設(shè)計的、已知的具有特定的堿基順 序形成的測序接頭，便于后續(xù)在對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析的過程中對實驗錯誤所引入的突變進(jìn) 行篩選和剔除，提局真實突變檢測的精確度。
[0042] 在本申請另一種典型的實施方式中，還提供了一種超低頻變異測序文庫的構(gòu)建方 法，該構(gòu)建方法包括:步驟Sl，構(gòu)建含有目的片段的測序文庫;步驟S2，對測序文庫進(jìn)行雜交 捕獲，得到捕獲后文庫；W及步驟S3，對捕獲后文庫進(jìn)行擴(kuò)增，得到目的文庫;其中，步驟Sl 中采用上述試劑盒構(gòu)建含有目的片段的測序文庫。
[0043] 通過利用上述測序接頭的制備方法制備而成的接頭具有序列確定性，便于區(qū)分接 頭序列在擴(kuò)增建庫或者測序過程中所引入的堿基突變，進(jìn)而能夠排除實驗操作步驟中的誤 差，同時，更利于后續(xù)分析步驟中對真陽性和假陽性突變的確定，從而有利于提高所構(gòu)建的 測序文庫對超低頻變異的檢測精度。
[0044] 在本申請又一種典型的實施方式中，還提供了一種超低頻變異測序文庫，該超低 頻變異測序文庫采用上述構(gòu)建方法構(gòu)建而成，該超低頻變異測序文庫對超低頻變異的檢出 率提高，而且假陽性率降低，檢測精度也有很大提高。
[0045] 在本申請另一種優(yōu)選的實施方式中，還提供了一種超低頻變異的檢測方法，該檢 測方法包括將上述超低頻變異測序文庫進(jìn)行高通量測序，得到測序數(shù)據(jù);對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行 變異位點分析，獲得變異位點數(shù)據(jù)。該檢測方法通過采用具有已知序列的錯誤提示序列來 標(biāo)記每個模板DNA分子，在對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行變異位點分析的過程中，不僅能夠通過同一DNA 模板分子兩端的錯誤提示序列來排除目的DNA分子在PCR擴(kuò)增中引入的錯誤、測序過程中引 入的錯誤，而且還可W通過檢測測序得到的錯誤提示序列是否與已知堿基序列一致來對錯 誤提示序列進(jìn)行自我矯正或剔除，從而提高變異檢測結(jié)果的精度。
[0046] 本申請的上述測序接頭及其在超低頻突變檢測中的應(yīng)用，能夠適用于所有物種 (如植物、微生物、動物或人）中核巧酸中存在的各種超低頻突變，包括單核巧酸突變、插入 缺失、基因融合、拷貝數(shù)變異W及染色體易位等。在應(yīng)用的過程中，所使用的樣本DNA可W是 福爾馬林固定后石蠟包埋的組織(FFPE)樣品、細(xì)胞系、血液、尿液、組織液、唾液等多種形式 的 DNA。
[0047] 下面將結(jié)合具體的實施例來進(jìn)一步說明本申請的有益效果。需要說明的是，下列 實施例中的所用試劑除特別說明外，均為市售產(chǎn)品。其中，濃度單位咖是iiM/L的縮寫。所列 序列如無特殊說明，均是指從5'端到3'端方向的序列。
[0048] 下列實施例選取兩個正常人的血漿樣本(樣本A、樣本B)，進(jìn)行常規(guī)捕獲建庫后進(jìn) 行測序W及生物信息分析，得到兩個正常樣品的陽性集，選出兩個樣本各自特有的30個純 合位點用于準(zhǔn)確性評估。
[0049] 本發(fā)明利用A樣本對B樣本進(jìn)行不同比例的稀釋，最終得到B樣本30個陽性位點頻 率分別為5%和0.1 %的兩個樣本，分別命名為樣本1和樣本2。W現(xiàn)有文獻(xiàn)方法作為對照例， 本發(fā)明對兩種突變頻率的樣本進(jìn)行檢出比例W及檢出頻率進(jìn)行統(tǒng)計分析，具體流程如下：
[(K)加]一、接頭合成
[0051] 1.對照例接頭(1)的制作方法
[0052] (1)引物合成
[005；3] S51:SEQ ID N0:3
[0054] AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT,
[0055] S55:沈Q ID N0:4
[0056] TCTTCTACAGTCAAGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACo
[0057] 備注:加粗部分為兩條鏈的反向互補區(qū)域。
[0化引 （2)退火
[0059] 使用無核酸酶水對兩條引物的粉末進(jìn)行稀釋，得到IOOuM濃度的母液，分別取等量 的2條引物于PCR管中，放置在ABI 2720PCR儀上進(jìn)行梯度退火，95°C降至25°C，每秒下降0.1 °C。反應(yīng)體系如下表1。
[0060] 表1:
[0061]
[0062] (3)延伸
[0063] 在PCR管里按下表2配置反應(yīng)液，用槍輕柔地上下吹吸混勻。放入ABI 2720PCR儀， 37°C 解育 30min。
[0064] 表2:
[00 化]
[0066]
[0067] (4)無水乙醇沉淀，純化
[006引將延伸后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至1.5ml的離屯、管中，加入化L 3M化Ac(PH 5.2)和192.化L 預(yù)冷的無水乙醇，-20°C放置30min后，12000g，4°C離屯、30min，75%乙醇洗涂一次，驚干。加 入10化L無核酸酶的水溶解。
[0069] (5)酶切
[0070] 在PCR管里按下表3配置反應(yīng)液，用槍輕柔地上下吹吸混勻。放入PCR儀，37 °C解育 16h〇
[0071] 表3:
[0072]
[0073] (6)無水乙醇沉淀，純化
[0074] 將酶切后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至新的1.5ml離屯、管中，加入20化3M NaAc(PH 5.2)和55化L 預(yù)冷的無水乙醇，-20°C放置30min后，12000g，4°C離屯、30min，75%乙醇洗涂一次，驚干。加 入40yL無核酸酶的水溶解。
[0075] 2.實施例1接頭(2)制作方法
[0076] (1)接頭序列合成
[0077] ERROR-top：ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNT(SEQ ID N0:5)；
[007引 邸ROR-bot:P*NNNNNNAGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC(沈Q ID NO:6:)。備 注:P*為憐酸化修飾
[0079] 該實施例1?？卺槍部分的錯誤提示序列進(jìn)行特異設(shè)置了 100種，ERROR-bot標(biāo)簽 序列跟對應(yīng)ERROR-top錯誤提示序列反向互補。其中，表4示出了 100種ERROR-top序列。合成 時分別邸ROR-top和對應(yīng)的邸ROR-bot進(jìn)行分別合成。其中，粗體顯示的7堿基中，除了末位 的T是為了與目的片段3'端凸出的A相連之外，其余6個堿基是錯誤提示序列。
[0080] 表4:
[0081]


[0084]
[0085] (2)使用無核酸酶水對每條引物的粉末進(jìn)行稀釋，得到IOOuM濃度的母液，分別取 等量的互補配對的引物于PCR管中，放置在ABI 2720PCR儀上進(jìn)行梯度退火，95°C降至25°C， 每秒下降0. TC。反應(yīng)體系如下表5。
[0086] 親5.
[0087]
[0088] (3)將退火好的100種雙鏈接頭序列進(jìn)行等比例混合，接頭制作完成。
[0089] 二、血漿游離DNA(CfDNA)樣本制備
[0090] 采用Qiagen血漿游離核酸提取試劑盒提取A、B兩個健康人各24ml血漿。然后將提 取好的Cf DNA按5 %和0.1 %進(jìn)行混合，得到樣本1和樣本2，樣本量都為60ng，其中30ng作為 對照例樣本，另外30ng為實施例1的樣本進(jìn)行后續(xù)的捕獲建庫測序。
[00川 S、文庫構(gòu)建：
[0095]
[0092] (I)末端修復(fù)[0093] 在PCR管里按下表6配置反應(yīng)液，用槍輕柔地上下吹吸纔勻。[0094] 圭'G.
[0096]
[0097]
[009引
[0099]
[0100]
[0101]
[0102]
[0103] 將配置好的反應(yīng)體系均分成2管，放于PCR儀上，20°C溫浴15min。最后，用1倍體積 的AMPure XP磁珠純化連接好接頭的文庫，2化L無核酸酶的水洗脫。
[0104] (4)擴(kuò)增連接上了接頭的文庫
[0105] 在PCR管里按下表9配置反應(yīng)液，用槍輕柔地上下吹吸混勻。
[0106] 表9:
[0107]
[010 引
[0109]
[0110]
[0111]
[0112] 將擴(kuò)增好的PCR產(chǎn)物用1.8倍的AMPure XP磁珠純化，3化L無核酸酶的水洗脫。再分 別取祉L中間文庫，2%瓊脂糖電泳（115V，35min)檢測接頭殘留情況，結(jié)果如下圖1所示。在 圖1中，M為IOObp分子標(biāo)記(Marker); 1為對照-樣本1; 2為對照-樣本2; 3為實施例1-樣本1; 4 為實施例1-樣本2。通過電泳圖比較發(fā)現(xiàn)，說明本申請的方法可W顯著降低接頭污染比例。
[0113] (5)文庫雜交、捕獲和洗脫
[0114] 取中間文庫于一個新的離屯、管中，用真空抽干機(jī)進(jìn)行濃縮直至文庫的體積為6.化 L。使用安捷倫公司的QXT試劑盒進(jìn)行雜交捕獲和洗脫。雜交過程中務(wù)必保證管蓋蓋緊，最小 化減少雜交混合液體積的蒸發(fā)，否則將會影響雜交效果。雜交程序如下表11。
[0115] 表11;
[0116]
[0117]
[011 引
[0119]
[0120]
[0121]
[0122] 確認(rèn)將含有磁珠的反應(yīng)液混勻后，將管子放入PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)程序如下表 13所示。
[0123] 表13:
[0124]
[012引用1.8倍體積的AMPure XP磁珠純化PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物，20化無核酸酶的水洗脫。出 庫情況如下表14所示。
[0126] 表14:
[0127]
[012引通過上表中文庫的出庫庫容來看，實施例1的文庫庫容顯著高于對照例。
[0129]四、庫檢上機(jī)
[0130] 文庫庫檢合格后上機(jī)，上機(jī)平臺選擇illumina平臺的nexseq 500測序儀，測序策 略為PE 75，每個樣本數(shù)據(jù)量為5G。文庫庫檢結(jié)果如圖2A、圖2B、圖2CW及圖2D所示。其中，圖 2A為文庫YF00CTDNA化00003(0.1 % )的2100檢測圖；圖 2B為文庫YF00CTDNA化00005 (5 % )的 2100檢測圖；圖2(：為文庫￥。00^0難化00006(0.1 %)的2100檢測圖；圖20為文庫 YF00CTDNA化00007 (5 % )的2100檢測圖。由于血漿CfDNA的是W核小體的形式進(jìn)行斷裂的， 所WcfDNA的大小一般為17化P的整數(shù)倍，2100檢測圖中就會顯示多個峰，但由于PCR擴(kuò)增過 程中小片段的擴(kuò)增效率高于長片段，文庫中小片段會居多，所W小片段的主峰是最高的。峰 圖2A中129bp為接頭自連的峰（文庫中有接頭殘留），294bp為連接上了接頭的文庫主峰 (170bp+120bp)，后面的小峰為較大的目的片段連接上了接頭的峰。
[0131] 五、數(shù)據(jù)分析結(jié)果：
[0132] 對兩個混合樣品采用常規(guī)建庫測序方法，得到兩個正常樣品的陽性集。共有30個 SNP位點。分別對現(xiàn)有方法和本申請的方法所構(gòu)建的文庫的產(chǎn)出數(shù)據(jù)進(jìn)行性能比較，比較結(jié) 果具體如下表15至表18。
[0133] (I)SNP位點分析結(jié)果
[0134] 對照例的SNP檢出統(tǒng)計結(jié)果見表15:
[0135] 表15:
[0136]
[0137] 實施例1的SNP檢出統(tǒng)計結(jié)果見表16: [013 引表 16:
[0139]
[0140] 分別對表15和表16中對照例和實施例1的檢出比進(jìn)行比較，比較結(jié)果如下表17。
[0141] 表 17:
[0143] ~從表17可W看出，實施例1胃的方法在陽性位點檢出比率優(yōu)于對照例，而且實施例1胃 檢出的突變位點的頻率與混合比率具有很好的一致性，因而在每個位點檢出SNP位點突變 頻率也優(yōu)于對比例1。
[0144] 此外，還對兩種方法對假陽性突變位點的檢出比例進(jìn)行了統(tǒng)計和比較，比較結(jié)果 見表18。
[0145] 表18:

[0147]由于實施例1中的接頭相對對比例中的接頭序列的長度較短，從上述比較結(jié)果可 W看出，截短后減少了產(chǎn)出數(shù)據(jù)中接頭的污染，因而，為了檢測接頭的長度對產(chǎn)出數(shù)據(jù)的污 染的影響，
【申請人】設(shè)計了一系列不同長度的接頭（具體見下表19,序列編號由上至下依次 為:SEQ ID NO: 107~SEQ ID NO: 114)，采用與實施例1相同的方法，W30個陽性位點頻率為 0.1 %的樣本2為處理對象進(jìn)行文庫構(gòu)建，然后對產(chǎn)出數(shù)據(jù)中的接頭污染比率進(jìn)行了比較。 [014 引表 19:
[0149]
[0150] 上述實施例2中所使用8堿基N形成的100個錯誤提示序的和實施例5中所使用的4 堿基N形成的100個錯誤提示序列分別如下表20,而實施例3和4中所使用的100個錯誤提示 序列與實施例1所用的100個錯誤提示序列相同，此處不再重述。
[0151] 表20:
[0154]
[0155] 然后對實施例2至實施例5的方法構(gòu)建的文庫測序得到的數(shù)據(jù)在接頭污染率、SNP 檢出率和假陽性率等方面進(jìn)行了統(tǒng)計，統(tǒng)計結(jié)果見表21。
[0156] 表21:
L〇158」從W上的描述中，可W看出，本發(fā)明上述的實施例實現(xiàn)了如下技術(shù)效果:通過根據(jù) 實驗需求分別合成雙鏈接頭中的單鏈序列，然后再通過特異性退火的方式形成雙鏈接頭。 該接頭制作方法簡單，而且由于合成的單鏈序列是根據(jù)預(yù)先設(shè)計好的序列進(jìn)行合成的，因 而每個接頭上攜帶的錯誤提示序列是確定。進(jìn)而在用于構(gòu)建文庫對超低頻變異進(jìn)行檢測 時，能夠通過將每個模板DNA分子的正義鏈和反義鏈上相同位置發(fā)生的堿基突變確定為真 實的突變，而將單獨發(fā)生在一條鏈上的突變或者發(fā)生在正義鏈和反義鏈上不同位置的堿基 突變確定為假突變。運樣便能夠排除文庫擴(kuò)增或者測序錯誤導(dǎo)致的突變，從而不僅能夠提 高檢測的精確度，而且有助于降低假陽性率。
[0159] 相比現(xiàn)有技術(shù)，本申請的上述接頭的制備方法及利用運種方法制備的接頭在制備 超低頻變異檢測文庫中的應(yīng)用具有如下優(yōu)勢：1)接頭制作流程大大簡化，提高接頭質(zhì)量;2) 顯著減少接頭污染，提高建庫質(zhì)量;3)提高SNP位點檢出率，提高檢測精度，可W準(zhǔn)確檢測到 0.1 %甚至更低的突變頻率。
[0160] W上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對于本領(lǐng)域的技 術(shù)人員來說，本發(fā)明可W有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修 改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。



















【主權(quán)項】
1. 一種測序接頭，其特征在于，所述測序接頭包括依次相連的文庫擴(kuò)增引物序列、目的 片段擴(kuò)增引物序列以及錯誤提示序列，所述錯誤提示序列位于靠近所述目的片段的一側(cè)， 所述文庫擴(kuò)增引物序列位于遠(yuǎn)離所述目的片段的一側(cè)，其中，所述錯誤提示序列為已知堿 基順序的序列。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的測序接頭，其特征在于，所述測序接頭為Y字型接頭。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的測序接頭，其特征在于，所述Y字型接頭包括第一鏈和與所述 第一鏈部分互補的第二鏈，所述第一鏈和所述第二鏈中較長的鏈的長度為30~67bp，優(yōu)選 為40~50bp，更優(yōu)選，所述第一鏈的序列為SEQ ID ΝΟ:1:5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNT-3'，所述第二鏈的序列為SEQ ID NO:2:5'_ NNNNNNAGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC-3 '，其中，6個沖斤形成的序列代表堿基序列 已知的所述錯誤提示序列。4. 根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項所述的測序接頭，其特征在于，所述錯誤提示序列的長 度為4~12bp，優(yōu)選為6bp。5. 根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項所述的測序接頭，其特征在于，所述文庫擴(kuò)增引物序列 的長度為15~30bp。6. -種測序接頭的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括： 設(shè)計測序接頭的兩條單鏈序列，每條所述單鏈序列中包含錯誤提示序列，且所述錯誤 提示序列位于所述單鏈序列靠近所欲連接的目的片段的一側(cè)，所述錯誤提示序列為已知堿 基順序的序列； 分別合成兩條所述單鏈序列； 將合成的兩條所述單鏈序列進(jìn)行特異性退火，得到雙鏈的所述測序接頭。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述測序接頭為多對，所述制備方法 在得到雙鏈的所述測序接頭之后還包括:將多對所述測序接頭進(jìn)行等比例混合，得到混合 的測序接頭的步驟。8. -種測序接頭，其特征在于，所述測序接頭通過權(quán)利要求6或7所述的制備方法制備 而成。9. 一種構(gòu)建超低頻變異測序文庫的試劑盒，所述試劑盒中包括測序接頭，其特征在于， 所述測序接頭為權(quán)利要求1至5中任一項所述測序接頭，或者權(quán)利要求6或7所述的制備方法 制備而成的測序接頭。10. -種超低頻變異測序文庫的構(gòu)建方法，其特征在于，所述構(gòu)建方法包括： 步驟S1，構(gòu)建含有目的片段的測序文庫； 步驟S2，對所述測序文庫進(jìn)行雜交捕獲，得到捕獲后文庫；以及 步驟S3，對所述捕獲后文庫進(jìn)行擴(kuò)增，得到目的文庫； 其中，所述步驟S1中采用權(quán)利要求9所述的構(gòu)建超低頻變異測序文庫的試劑盒構(gòu)建所 述含有目的片段的測序文庫。11. 一種超低頻變異測序文庫，其特征在于，所述超低頻變異測序文庫采用權(quán)利要求10 的構(gòu)建方法構(gòu)建而成。12. -種超低頻變異的檢測方法，其特征在于，所述檢測方法包括： 對權(quán)利要求11所述的超低頻變異測序文庫進(jìn)行高通量測序，獲得測序數(shù)據(jù)；以及 對所述測序數(shù)據(jù)進(jìn)行變異位點分析，獲得變異位點數(shù)據(jù)。
【文檔編號】C12N15/10GK105861710SQ201610342219
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年5月20日
【發(fā)明人】周曄, 劉倩, 唐宇, 徐寒黎, 李偉偉, 郭現(xiàn)超, 李箐
【申請人】北京科迅生物技術(shù)有限公司