一種檢測鯉IGF2b基因單核苷酸多態(tài)性的方法及引物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測鯉IGF2b基因單核苷酸多態(tài)性的方法及引物，該方法通過鯉IGF2b基因外顯子和內(nèi)含子的全基因組擴(kuò)增，獲得該基因的DNA全長，并劃分成不同模塊擴(kuò)增，獲得IGF2b基因不同片段的SNP信息，完成整個(gè)基因的基因組掃描。結(jié)果顯示：用這種分析方法可用于檢測與經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)的鯉IGF2b基因SNP位點(diǎn)，也可用起分析該位點(diǎn)與該基因表達(dá)量的關(guān)系等后續(xù)工作。
【專利說明】
-種檢測繩IGF化基因單核昔酸多態(tài)性的方法及引物
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于魚類分子設(shè)計(jì)育種技術(shù)領(lǐng)域，尤其設(shè)及一種經(jīng)基因組中獲取候選基因 全基因組的SNP方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 經(jīng)是我國養(yǎng)殖面積廣、抗逆性強(qiáng)、產(chǎn)量大的重要淡水經(jīng)濟(jì)魚類。據(jù)《中國漁業(yè)統(tǒng)計(jì) 年鑒》，2011年我國大宗淡水魚產(chǎn)量達(dá)1698.50萬噸，其中經(jīng)魚產(chǎn)量為271.82萬噸?？蒞看 出，經(jīng)魚的生產(chǎn)在我國占有舉足輕重的地位。
[0003] 類膜島素生長因子（insulin-like growth factor, IGF)是一種促細(xì)胞分裂的多 膚，包括IGFl和IGF2,其結(jié)構(gòu)與膜島素相類似。IGF是生長激素發(fā)揮作用的中間信使，即生長 激素首先作用于IGF，再由IGF作用于祀器官，進(jìn)而發(fā)揮其促進(jìn)生長發(fā)育的作用。目前IGF2已 經(jīng)在金頭觸、羅非魚、斑馬魚、河豚、經(jīng)、大麻哈魚中是確定表達(dá)的。值得提出的是，斑馬魚存 在IGF2a和IGF2b 2種基因。在對經(jīng)的IGF2基因進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，Tse等在2002年首先成功克隆 了經(jīng)的IGF2基因，其在經(jīng)肝臟、屯、臟、腦等組織中廣泛表達(dá)。同樣Su等2012年發(fā)現(xiàn)在經(jīng)體內(nèi) 同樣存在IGF2a、IGF化巧巾基因，并證實(shí)Tse等在2002年發(fā)現(xiàn)的為IGF2b基因。但目前為止還 未見到對該基因進(jìn)行基因組掃描尋找單核巧酸多態(tài)性（single nucleotide polymor地ism, SNP)的報(bào)道，無法從根本上、整體上檢測該基因 SNP位點(diǎn)與與經(jīng)生長性狀的 相關(guān)性。本研究為了克服運(yùn)些不足，研究透該基因 SNP位點(diǎn)與經(jīng)生長形狀的相關(guān)性，需要找 到一種可W檢測到與經(jīng)生長形狀有關(guān)的所有該基因的SNP位點(diǎn)的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 解決的技術(shù)問題:本發(fā)明的目的在于為了克服W上現(xiàn)有技術(shù)的不足，尋找與生長 性狀關(guān)聯(lián)的IGF化基因潛在SNPs的檢測手段，提供一種檢測經(jīng)IGF化基因單核巧酸多態(tài)性的 方法及引物。
[0005] 技術(shù)方案：
[0006] 一種引物組，該引物組用于擴(kuò)增經(jīng)魚IGF2b基因 CDNA序列，該引物組包括W下引 物：IGF2bi"正向引物5 ' -3 ' ： GGGGAAACTAAACCGACATT，IGF2bi"反向引物5 ' -3 ' ： GGCATTCGTATGGACCAGTA;IGF化 22#正向引物5'-3' ：tACTGGTCCATACGAATGCC，IGF化 22#反向 引物5 ' -3 ' ： GGGAAGGAAGAAGGGTTGT; IGF2b33#正向引物5 ' -3 ' ： TTTAACCCTGTCTGCCTTCG， IGF2b33#反向引物5'-3' ：ACTTGGACGTAATCCGTGGC。
[0007] -種引物組，該引物組用于擴(kuò)增經(jīng)魚IGF2b基因全序列，該引物組包括W下引物： IGF2b2# 正向引 物5'-3' ：GCGATTCGCGTAATGCA，IGF2b2# 反向引 物5'-3' ： ATCCTCAACCTCGTTCCTCT; IGF化3#正向引物5 ' -3 ' ： TCATCCTCTAGCGTTAAGCA，IGF2b3#反向引物 5 ' -3 ' ： GGCATTCGTATGGACCAGTA; IGF化4#正向引物5 ' -3 ' ： TTAACCCTGTCTGCCTTCG，IGF化4#反 向引物5 ' -3 ' ： TGAGTGTAGCCTGGGAACAT; IGF2bS#正向引物5 ' -3 ' ： AGGGAAAGTAATAGTACCCA， IGF2bS#反向引物5'-3' ：AAGAGTGGATCTGGTGCATA; IGF2bS#正向引物5'-3' ： CTGTCCACGCAACAAAAGT，IGF2bS#反向引物5 ' -3 ' ： GCACAAGTTCAGCAGAAAG; IGF2b9#正向引物 5 ' -3 ' ： CACATCCCTACAGGTCATCC，IGF化9#反向引物5 ' -3 ' ： GTGCTCCACAGAAGAAAGT; IGF化 1腳正 向引物5 ' -3 ' ： TGGAACTGCCATTACCCC，IGF2bi°#反向引物5 ' -3 ' ： ACAGATTCTACTGGATGACC; IGF2bi"正向引物5'-3' ：TGAGTTTTATAGGGTCATCC，IGF2bi"反向引物5'-3' ： TTGGACGTAATCCGTGGC。
[000引一種通過基因組掃描經(jīng)IGF2b基因單核巧酸多態(tài)性的方法，步驟如下：
[0009] (1)對待測經(jīng)魚樣本IGF化基因 CDNA序列利用權(quán)利要求1中所述引物組進(jìn)行對應(yīng)段 擴(kuò)增，得到不同待測經(jīng)魚的擴(kuò)增片段；
[0010] (2)對待測經(jīng)魚樣本IGF2b基因通過權(quán)利要求2所述的引物組進(jìn)行對應(yīng)段擴(kuò)增，得 到擴(kuò)增后的片段；
[0011] (3)將步驟(1)得到的不同待測經(jīng)魚的擴(kuò)增片段與步驟(2)得到擴(kuò)增后的片段分別 進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，然后回收、純化、測序，再按照斑馬魚基因組序列排列順序進(jìn)行拼接， 最后得到擴(kuò)增后的待測經(jīng)魚樣本IGF2b基因全基因組序列，同時(shí)通過與斑馬魚基因組序列 對比選出具有差異的目標(biāo)位點(diǎn)；
[0012] (4)將任意兩個(gè)不同的待測經(jīng)魚樣本進(jìn)行正反交組合，對子代利用權(quán)利要求1和2 所述的引物組按照步驟（1)和步驟(2)的擴(kuò)增條件進(jìn)行基因組擴(kuò)增，并按照步驟(3)中的方 式最后參照斑馬魚基因組序列排列方式進(jìn)行拼接，得到子代IGF2b基因序列；
[0013] (5)將子代IGF2b基因序列與親本原始IGF2b基因進(jìn)行比對，通過檢測進(jìn)一步確認(rèn) 目標(biāo)序列的變異位點(diǎn)，即得到單核巧酸多態(tài)性位點(diǎn)。
[0014] 所述的通過基因組掃描經(jīng)IGF2b基因單核巧酸多態(tài)性的方法，步驟（1)或（2)中擴(kuò) 增的體系均為 10Xbuffer，25mmol/L的Mg2+，各2mmol/L的dNTPs，10mmol/L的正向引物、 1 Ommo 1 /L的反向引物、模板DNA，I^qDNA聚合酶，dd出0。
[0015] 所述的通過基因組掃描經(jīng)IGF2b基因單核巧酸多態(tài)性的方法，步驟（1)或（2)中擴(kuò) 增的條件均為94°C預(yù)變性3min;94°C變性20s，溫度53~58°C退火20s，72°C延伸30s，33個(gè)循 環(huán)；72°C 延伸 lOmin。
[0016] 所述的通過基因組掃描經(jīng)IGF2b基因單核巧酸多態(tài)性的方法，步驟（1)中所述引物 組進(jìn)行對應(yīng)段擴(kuò)增過程中，引物IGF2biw的擴(kuò)增退火溫度為56°C，引物IGF2b 22#的擴(kuò)增退火 溫度為53°C，引物IGF2b33#的擴(kuò)增退火溫度為55°C。
[0017] 所述的通過基因組掃描經(jīng)IGF2b基因單核巧酸多態(tài)性的方法，步驟(2)中所述引物 組進(jìn)行對應(yīng)段擴(kuò)增過程中，引物IGF化的擴(kuò)增退火溫度為56°C，引物IGF2b 3#的擴(kuò)增退火溫 度為55°C，引物IGF2b4#的擴(kuò)增退火溫度為58°C，引物IGF2b 5#的擴(kuò)增退火溫度為55°C，引物 IGF2b8#的擴(kuò)增退火溫度為56°C，引物IGF2b9#的擴(kuò)增退火溫度為53°C，引物IGF2bW#的擴(kuò)增 退火溫度為55°C，引物IGF2bii#的擴(kuò)增退火溫度為56°C。
[0018] 所述的通過基因組掃描經(jīng)IGF2b基因單核巧酸多態(tài)性的方法，步驟(2)中瓊脂糖凝 膠電泳使用的是8%非變性聚丙締酷胺凝膠。
[0019]有益效果
[0020] 本發(fā)明提供的IGF2b基因全基因組SNPs檢測方法，可對該基因整個(gè)基因組序列進(jìn) 行掃描，提供的引物都適合直接測序或是結(jié)合酶切展開大樣本分析，也可針對某一選定區(qū) 域進(jìn)行單核巧酸位點(diǎn)檢測，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示運(yùn)種分析方法可W找出與體重相關(guān)的SNP位點(diǎn)，也 可用于分析該位點(diǎn)與該基因表達(dá)量的關(guān)系等后續(xù)工作。
[0021] 本發(fā)明提供的檢測方法應(yīng)用于魚類W分子標(biāo)記輔助選擇為基礎(chǔ)的新品種選育，也 可用于開展候選基因功能研究的科學(xué)實(shí)驗(yàn)，為研究該多態(tài)位點(diǎn)與生長性狀的關(guān)系W及為分 子輔助選擇育種奠定基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0022] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中黃河經(jīng)和建經(jīng)正反交后親代與子代IGF2b基因序列比對結(jié) 果圖；
[0023] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中IGF2b3#引物檢測到的227號多態(tài)位點(diǎn)與建經(jīng)體重的關(guān)系 圖。
【具體實(shí)施方式】
[0024] 實(shí)施例1
[0025] 從 NCBKwww.ncbi.nlm.nih.gov)數(shù)據(jù)庫中查取 IGF2b 基因 cDNA序列（AF402958)， 設(shè)計(jì)引物(見表1和表2)。
[0026] 表1經(jīng)IGF2b cDNA擴(kuò)增所需引物 r〇027l
[0029] 表2經(jīng)IGF2bDNA擴(kuò)增所需引物 「nnqn1
[0031] 對待測黃河經(jīng)和建經(jīng)各3尾的IGF化基因 cDNA序列通過表1中提供的引物進(jìn)行外顯 子擴(kuò)增，然后將W上黃河經(jīng)和建經(jīng)的IGF2b基因序列通過表2提供的引物進(jìn)行擴(kuò)增，對W上 擴(kuò)增后的產(chǎn)物分別進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，然后進(jìn)行PCR產(chǎn)物的切膠回收及純化、測序，最后 按照斑馬魚基因組序列排列順序進(jìn)行拼接，得到黃河經(jīng)和建經(jīng)的IGF2b基因全序列。
[0032] W上具體過程為:通過化KaRaDNA和RNA提取試劑盒提取黃河經(jīng)和建經(jīng)基因組DNA 模板和總RNA模板，使用TaKaRad的RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒，經(jīng)過PCR擴(kuò)增，其反應(yīng)體系和條件如 下：
[0033] W上擴(kuò)增反應(yīng)體系為10Xbufferl扣L，25mmol/L的Mg化化L，各2mmol/L的dNTPs 化L，1 Ommo 1 /L的上游引物1UL、1 Ommo 1 /L的下游引物化L、模板DNA化L (外顯子使用cDNA做 模板），化qDNA聚合酶1U，其余為dd肥0,總量25化。
[0034] W上PCR反應(yīng)程序?yàn)?94 r預(yù)變性3min; 94 r變性20s，溫度53~58 r退火20s，72 r 延伸3〇8,33個(gè)循環(huán)；72°(：延伸1〇111111。
[0035] W上瓊脂糖凝膠電泳中使用的是8%非變性聚丙締酷胺凝膠。
[0036] W上所有IGF2b基因組掃描包含經(jīng)待測全基因組DNA為模板，W引物對目標(biāo)基因組 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，然后進(jìn)行PCR產(chǎn)物的切膠回收及純化、測序和拼接， 得到待測黃河經(jīng)和建經(jīng)IGF2b基因組全序列。其中黃河經(jīng)IGF2b基因組全序列如SEQ ID NO. 23所示，其中第896位-2170位，第2322位-4146位，第4328位-5205位為內(nèi)含子序列，其余 為cDNA。
[0037] 根據(jù)擴(kuò)增到的DNA基因組序列和擴(kuò)增所需引物，W黃河經(jīng)和建經(jīng)的正反交組合為 例（正交就是黃河經(jīng)雄魚和建經(jīng)雌魚進(jìn)行雜交的后代，而反交則是黃河經(jīng)雌魚和建經(jīng)雄魚 雜交的后代，各30尾），進(jìn)行擴(kuò)增和候選SNP位點(diǎn)的篩選，擴(kuò)增采取上述表1和表帥不同片段 的引物和PCR反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選是根據(jù)測序的結(jié)果進(jìn)行多重序列比對，找出所關(guān) 注序列的變異位點(diǎn)，即篩選出的SNP位點(diǎn)。首先是直接測序法測序，然后進(jìn)行序列比對，見圖 1，黑色字體是原始序列，黑色背景白色字體分別是黃河經(jīng)作父本建經(jīng)作母本的后代和建經(jīng) 作父本黃河經(jīng)做母本的后代樣本中IGF2b的測序結(jié)果。
[0038] 在篩選到潛在的SNP位點(diǎn)后，分析所在的序列的特點(diǎn)（可采取酶切方法或直接測序 法進(jìn)行檢測），本發(fā)明采用直接測序法檢測多態(tài)性位點(diǎn)，表3為檢測到各個(gè)位點(diǎn)的位置。
[0039] 表3經(jīng)IGF2bDNA擴(kuò)增所需引物及檢測到的SNP位點(diǎn)
E。。>1。~1 [
[0042] 如果檢測多個(gè)樣本，可從關(guān)屯、的潛在SNP位點(diǎn)，尋找引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后直接測 序比對，獲得所需要的檢測信息。綜合W上步驟，我們可W得到一種通過基因組掃描經(jīng) IGF化基因 SNP的方法，該方法通過經(jīng)IGF化基因外顯子和內(nèi)含子的全基因組擴(kuò)增，獲得該基 因的DNA全長，并劃分成不同模塊擴(kuò)增，獲得經(jīng)IGF2b基因不同片段的SNP信息，完成整個(gè)基 因的基因組掃描，并通過潛在SNPs位點(diǎn)的統(tǒng)計(jì)，根據(jù)實(shí)際需要選擇對應(yīng)引物進(jìn)行該標(biāo)記位 點(diǎn)的檢測。
[0043] 基于本發(fā)明檢測到的位點(diǎn)基礎(chǔ)上，采集建經(jīng)60尾，對其進(jìn)行IGF2b3#引物多態(tài)位點(diǎn) 檢測，使用上述方法提取DNA，并用對應(yīng)的反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后進(jìn)行測序、比對，顯著 性檢測，發(fā)現(xiàn)227號位點(diǎn)處存在A至化的突變，發(fā)現(xiàn)雜合基因型AC體重比純合基因型AA大，見 圖2。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種引物組，該引物組用于擴(kuò)增鯉魚IGF2b基因 cDNA序列，其特征在于，該引物組包 括以下引物： IGF2b11#正向弓丨物5'-3' ：GGGGAAACTAAACCGACATT，IGF2b11#反向弓| 物5'-3' ： GGCATTCGTATGGACCAGTA;IGF2b 22#正向引物5'-3' ：TACTGGTCCATACGAATGCC，IGF2b 22#反向引 物5'-3' ：GGGAAGGAAGAAGGGTTGT; IGF2b33#E向引物5'-3' ：TTTAACCCTGTCTGCCTTCG，IGF2b33# 反向引物5'_3' ：ACTTGGACGTAATCCGTGGC。2. -種引物組，該引物組用于擴(kuò)增鯉魚IGF2b基因全序列，其特征在于，該引物組包括 以下引物： IGF2b2#正向弓| 物5'-3' ：GCGATTCGCGTAATGCA，IGF2b2#反向弓| 物5'-3' ： ATCCTCAACCTCGTTCCTCT; IGF2b3#E 向引物5'-3' ：TCATCCTCTAGCGTTAAGCA，IGF2b3#i向引物 5' -3' ： GGCATTCGTATGGACCAGTA; IGF2b4#E向引物5' -3' ： TTAACCCTGTCTGCCTTCG，16卩21/#反向 引物5'-3' ：TGAGTGTAGCCTGGGAACAT;IGF2b5#E 向引物5'-3' ：AGGGAAAGTAATAGTACCCA，IGF2b5# 反向引物5'_3' ：AAGAGTGGATCTGGTGCATA; IGF2b8#E向引物5'-3' ：CTGTCCACGCAACAAAAGT， IGF2b8# 反向弓| 物5'-3' ：GCACAAGTTCAGCAGAAAG; IGF2b9# 正向弓| 物5'-3' ： CACATCCCTACAGGTCATCC，IGF2b9#i向引物5'-3' ：GTGCTCCACAGAAGAAAGT; IGF2b1()#E向引物 5'-3' ： TGGAACTGCCATTACCCC，IGF2b10#i 向引物5'-3' ： ACAGATTCTACTGGATGACC; IGF2b11#正向 引物5'_3' ：Τ6Α6ΤΤΤΤΑΤΑ666??ΑΤ(Χ，Ι6Ρ21311#Η向引物5'_3' ：TTGGACGTAATCCGTGGC〇3. -種檢測鯉IGF2b基因單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于，步驟如下： (1) 對待測鯉魚樣本IGF2b基因 cDNA序列利用權(quán)利要求1中所述引物組進(jìn)行對應(yīng)段擴(kuò) 增，得到不同待測鯉魚的擴(kuò)增片段； (2) 對待測鯉魚樣本IGF2b基因通過權(quán)利要求2所述的引物組進(jìn)行對應(yīng)段擴(kuò)增，得到擴(kuò) 增后的片段； (3) 將步驟（1)得到的不同待測鯉魚的擴(kuò)增片段與步驟(2)得到擴(kuò)增后的片段分別進(jìn)行 瓊脂糖凝膠電泳，然后回收、純化、測序，再按照斑馬魚基因組序列排列順序進(jìn)行拼接，最后 得到擴(kuò)增后的待測鯉魚樣本IGF2b基因全基因組序列，同時(shí)通過與斑馬魚基因組序列對比 選出具有差異的目標(biāo)位點(diǎn)； (4) 將任意兩個(gè)不同的待測鯉魚樣本進(jìn)行正反交組合，對子代利用權(quán)利要求1和2所述 的引物組按照步驟（1)和步驟(2)的擴(kuò)增條件進(jìn)行基因組擴(kuò)增，并按照步驟(3)中的方式最 后參照斑馬魚基因組序列排列方式進(jìn)行拼接，得到子代IGF2b基因序列； (5) 將子代IGF2b基因序列與親本原始IGF2b基因進(jìn)行比對，通過檢測進(jìn)一步確認(rèn)目標(biāo) 序列的變異位點(diǎn)，即得到單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測鯉IGF2b基因單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于，步驟 (1)或（2)中擴(kuò)增的體系均為10父13肚€6廣25111111〇1/1的]\% 2+，各2111111〇1/1的(1犯1^，10 111111〇1/1的 正向引物、10 mm〇l/L的反向引物、模板DNA，TaqDNA聚合酶，dd H20。5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測鯉IGF2b基因單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于，步驟 (1)或(2)中擴(kuò)增的條件均為94°C預(yù)變性3 min;94°C變性20s，溫度53~58°C退火20s，72°C延 伸30s，33個(gè)循環(huán)；72°C延伸lOmin。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測鯉IGF2b基因單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于，步驟 (1)中所述引物組進(jìn)行對應(yīng)段擴(kuò)增過程中，引物IGF2b 11#的擴(kuò)增退火溫度為56°C，引物IGF2b 22#的擴(kuò)增退火溫度為53°C，引物16?21333#的擴(kuò)增退火溫度為55°C。7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測鯉IGF2b基因單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于，步驟 (2)中所述引物組進(jìn)行對應(yīng)段擴(kuò)增過程中，引物IGF2b 2#的擴(kuò)增退火溫度為56°C，引物 16卩2133#的擴(kuò)增退火溫度為55°C，引物IGF2b1^/·增退火溫度為58°C，引物IGF2b 5^擴(kuò)增退 火溫度為55°C，引物IGF2b8#的擴(kuò)增退火溫度為56°C，引物IGF2b 9#的擴(kuò)增退火溫度為53°C， 弓丨物IGF2b1Q^r增退火溫度為55°C，引物IGF2b n^r增退火溫度為56°C。8. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測鯉IGF2b基因單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于，步驟 (2)中瓊脂糖凝膠電泳使用的是8%非變性聚丙烯酰胺凝膠。
【文檔編號】C12Q1/68GK105861732SQ201610421692
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年6月14日
【發(fā)明人】蘇勝彥, 董在杰
【申請人】中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心