miRNA在子宮內(nèi)膜癌診療中的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了miRNA在子宮內(nèi)膜癌診療中的應(yīng)用，所述miRNA為miRNA?3926?1。通過檢測miRNA?3926?1的表達(dá)水平可用于診斷子宮內(nèi)膜癌。本發(fā)明公開了miRNA?3926?1在制備子宮內(nèi)膜癌診斷試工具中的應(yīng)用，同時公開了miRNA?3926?1在制備治療子宮內(nèi)膜癌的藥物中的應(yīng)用。
【專利說明】
mi RNA在子宮內(nèi)膜癌診療中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，設(shè)及miRNA在子宮內(nèi)膜癌診療中的應(yīng)用，具體地設(shè)及 miRNA-3926-l
【背景技術(shù)】
[0002] 子宮內(nèi)膜癌是女性中常見的生殖系統(tǒng)=大惡性腫瘤之一，在歐美地區(qū)發(fā)病率和死 亡率較高。2010年，僅在美國就增加約43470例新發(fā)病例，其中7950例死亡，發(fā)病率高居婦科 惡性腫瘤之首。子宮內(nèi)膜癌在我國婦科惡性腫瘤中的發(fā)病率僅次于宮頸癌，居第二位。子宮 內(nèi)膜癌好發(fā)于圍絕經(jīng)期婦女，合并肥胖、糖尿病、高血壓、未曾生育者W及長期不排卵者皆 是高危險族群，其中超過86%的病人年齡在50歲W上。隨著高血壓、冠屯、病、肥胖、糖尿病和 代謝綜合征等高危因素疾病發(fā)病率的提高W及人們飲食結(jié)構(gòu)的漸行改變，該病發(fā)病率逐年 增高且發(fā)病年齡年輕化。
[0003] miRNAs是一類長度為18-25個核巧酸的非編碼小RNA分子，其序列在物種間高度保 守，它們通過結(jié)合祀信使RNA的3 '非翻譯區(qū)，引起祀mRNA失活和/或轉(zhuǎn)錄后抑制，從而調(diào)控祀 基因表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs在許多腫瘤中普遍失調(diào)，它們通過影響腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)化、增殖、 遷移及調(diào)亡等生物學(xué)行為而廣泛參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，在癌癥發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著原癌 基因或抑癌基因的作用。如較早發(fā)現(xiàn)的miR-21已經(jīng)在多種實(shí)體腫瘤中表達(dá)升高，如結(jié)直腸 癌、膽管癌、淋己瘤、多發(fā)性骨髓瘤、腦膠質(zhì)瘤、肺癌、肝癌、食管癌、前列腺癌、宮頸癌、卵巢 癌、子宮肌瘤等中均不同程度的發(fā)現(xiàn)了 miR-21的表達(dá)失調(diào)，miR-21已經(jīng)被廣泛作為可開發(fā) 的癌癥相關(guān)潛在治療祀點(diǎn)。
[0004] 子宮內(nèi)膜癌發(fā)生的分子機(jī)制尚不清楚，早期發(fā)現(xiàn)和治療是改善預(yù)后、提高治愈率 的關(guān)鍵。深入研究子宮內(nèi)膜癌相關(guān)基因的異常表達(dá)機(jī)制將有助于其早期診斷、預(yù)防及治療， 具有重要的意義。本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)miRNA-3926-l的在子宮內(nèi)膜癌患者中的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于 對照正常組，miRNA-3926-l的表達(dá)異常和子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，運(yùn)為子宮內(nèi)膜癌的 miRNA的臨床治療和科學(xué)研究提供了基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供與子宮內(nèi)膜癌的診斷和治療相 關(guān)的miRNA。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案：
[0007] 本發(fā)明提供了miRNA在制備診斷子宮內(nèi)膜癌的產(chǎn)品中的應(yīng)用，所述miRNA為miRNA-3926-1或其同源物。
[000引進(jìn)一步，所述產(chǎn)品通過測定miRNA-3926-l或其同源物的水平W診斷子宮內(nèi)膜癌。
[0009] 進(jìn)一步，所述所述產(chǎn)品包括通過使用RT-PCR、印記雜交、原位雜交、陣列雜交、基因 忍片或新一代測序來檢測miRNA-3926-l或其同源物的水平W診斷子宮內(nèi)膜癌的產(chǎn)品。
[0010] 應(yīng)當(dāng)知道，本發(fā)明的miRNA-3926-l包括組成型核酸分子的功能等同物，即變體， "變體"是指，與對應(yīng)野生型miRNA基因產(chǎn)物具有少于100%的同一性并且具有對應(yīng)野生型 miRNA基因產(chǎn)物的一個或多個生物活性的miRNA。此類生物活性的實(shí)例包括但不限于，與子 宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展的細(xì)胞過程(例如，細(xì)胞分化、細(xì)胞生長、細(xì)胞死亡）的抑制。運(yùn)些變體包 括物種變體和由于miRNA基因的一個或多個突變(例如，置換、缺失、插入)而產(chǎn)生的變體。在 某些實(shí)施方案中，變體與對應(yīng)野生型miRNA基因產(chǎn)物具有至少約70%、75%、80%、85%、 90%、95%、98%或99% 的同一性。
[0011] 本領(lǐng)域人員熟知，為了保證miRNA的穩(wěn)定性，可W在miRNA的一端或者兩端增加保 護(hù)性堿基，如TT，也可對miRNA堿基進(jìn)行修飾，但是不影響miRNA的功能。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人 員熟知，在不影響miRNA-3926-l功能的條件下，對miRNA-3926-l進(jìn)行堿基修飾或者在兩端 增加堿基獲得的序列同樣包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0012] 本發(fā)明的miRNA-3926-l核酸分子可WW單鏈或雙鏈的形式存在。成熟的miRNA-3926-1主要呈單鏈形式，而miRNA-3926-l前體是部分自互補(bǔ)的，W形成雙鏈結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的 核酸分子可W是RNA、DNA、PNA、LNA的形式。
[0013] 本發(fā)明提供了一種診斷子宮內(nèi)膜癌的產(chǎn)品，所述產(chǎn)品能夠通過檢測miRNA-3926-l 或其同源物的水平來診斷子宮內(nèi)膜癌。
[0014] 進(jìn)一步，所述產(chǎn)品包括忍片或試劑盒;其中，所述忍片包括固相載體；W及固定在 所述固相載體上的寡核巧酸探針，所述寡核巧酸探針包括特異性地對應(yīng)于miRNA-3926-l的 部分或全部序列。所述試劑盒包括用于檢測miRNA-3926-l的表達(dá)水平的試劑，所述檢測 miRNA-3926-l表達(dá)水平的試劑包括針對miRNA-3926-l的引物和/或探針。
[0015] 根據(jù)SEQ ID NO. 1所示的核酸序列，可W生成用于給定miRNA基因產(chǎn)物的RNA印記 雜交的合適探針，包括但不限于，與目標(biāo)miRNA基因產(chǎn)物具有至少約70%、75%、80%、85%、 90 %、95 %、98 %、99 %或完全互補(bǔ)的探針。標(biāo)記的DNA和RNA采用常規(guī)方法制備，例如核酸探 針用下述物質(zhì)標(biāo)記，如放射性核素化、32P、 33P、i4C或35S,重金屬，能起到標(biāo)記配體的特異性結(jié) 合對成員功能的配體如生物素、抗生物素蛋白或抗體等，巧光分子，化學(xué)發(fā)光分子、酶等。
[0016] 通過切口平移法或隨機(jī)引物法，可W將探針標(biāo)記成高比放射性，后者是從單鏈DNA 或從RNA模板合成高比放射性的32P-標(biāo)記的探針的選擇方法。例如，通過根據(jù)切口平移法用 高效放射性的核巧酸替換現(xiàn)有的核巧酸，可W制備比放射性大大超過108邱m/微克的32P-標(biāo)記的核酸探針。然后通過使雜交的濾膜曝光于照相膠片，可W進(jìn)行雜交的放射自顯影檢 測。對雜交的濾膜曝光的照相膠片的光密度掃描，會提供miRNA基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物水平的精確測 量。
[0017] 進(jìn)一步，上面所述的寡核巧酸探針還可包括針對現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)報道的可用于診 斷子宮內(nèi)膜癌的miRNA的寡核巧酸探針。將多種miRNA的檢測探針放置在同一忍片上通過檢 測多種miRNA指標(biāo)聯(lián)合診斷子宮內(nèi)膜癌的情況也包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。上面所述 試劑還包括針對現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)報道的診斷子宮內(nèi)膜癌miRNA的引物和/或探針。將多種 miRNA的檢測引物和/或探針放置在同一試劑盒中通過檢測多種miRNA指標(biāo)聯(lián)合診斷子宮內(nèi) 膜癌的情況也包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0018] 所述的mi RNA忍片的制備可采用本領(lǐng)域已知的生物忍片的常規(guī)制造方法，例如，如 果固相載體采用的是修飾玻片或娃片，探針的5'端含有氨基修飾的聚dT串，可將寡核巧酸 探針配制成溶液，然后采用點(diǎn)樣儀將其點(diǎn)在修飾玻片或娃片上，排列成預(yù)定的序列或陣列， 然后通過放置過夜來固定，就可得到本發(fā)明的miRNA忍片。如果核酸不含氨基修飾，則其制 備方法也可參照：王申五主編的《基因診斷技術(shù)-非放射性操作手冊》；J.L.erisi， V.R.Iyer，P.O.BROWN.Exploring the metabolic and genetic control of gene expression on a genomic scale.Science, 1997;278:680和馬立人，蔣中華主編.生物忍 片.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2000，1-130。
[0019] 本發(fā)明提供了 miRNA-3926-l或其同源物在制備治療子宮內(nèi)膜癌藥物中的應(yīng)用。
[0020] 進(jìn)一步，所述藥物包含促進(jìn)所述miRNA-3926-l表達(dá)或增強(qiáng)miRNA-3926-l功能的試 劑。所述促進(jìn)miRNA-3926-l表達(dá)或增強(qiáng)miRNA-3926-l功能的試劑的祀標(biāo)不限于miRNA-3926-1本身，還包括miRNA-3926-l的上下游，例如：編碼miRNA-3926-l的基因組序列， miRNA-3926-l祀基因、調(diào)控miRNA-3926-l的蛋白或者基因。
[0021] 進(jìn)一步，促進(jìn)miRNA-3926-l表達(dá)或增強(qiáng)miRNA-3926-l功能的試劑包括蛋白、寡核 巧酸、小分子化合物。
[0022] 優(yōu)選地，所述的試劑是miRNA-3926-l的模擬物、miRNA-3926-l的激動劑、前體 miRNA-3926-l、攜帶 miRNA-3926-l 的載體。
[0023] 根據(jù)miRNA-3926-l序列設(shè)計出它的模擬物或激動劑，miRNA-3926-l的模擬物是化 學(xué)合成的小RNA，miRNA-3926-l的激動劑是經(jīng)過特殊標(biāo)記和化學(xué)修飾的雙鏈小RNA，將 miRNA-3926-l模擬物或者激動劑轉(zhuǎn)移到人體內(nèi)后，它們能夠明顯上調(diào)miRNA-3926-l的表 達(dá)。
[0024] 本發(fā)明提供了一種治療子宮內(nèi)膜癌的藥物，所述藥物包括上面所述的促進(jìn)miRNA-3926-1表達(dá)或增強(qiáng)miRNA-3926-l功能的試劑，所述促進(jìn)miRNA-3926-l表達(dá)或增強(qiáng)miRNA-3926-1功能的試劑的祀標(biāo)不限于miRNA-3926-l本身，還包括miRNA-3926-l的上下游，例如： 編碼miRNA-3926-l的基因組序列，miRNA-3926-l祀基因、調(diào)控miRNA-3926-l的蛋白或者基 因。
[0025] 進(jìn)一步，所述藥物還包括藥學(xué)上可接受的載體。所述載體包括但不限于:稀釋劑、 緩沖劑、混懸劑、乳劑、顆粒劑、包囊劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、噴霧劑、透皮吸收劑、濕潤 劑、崩解劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、著色劑、矯味劑或吸附載體。
[0026] 所述藥物可W制成包括但不限于顯微注射劑、適于轉(zhuǎn)染的劑型、注射液、片劑、粉 劑、粒劑、膠囊劑。上述各種劑型的藥物均可W按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法制備。對于固體藥 物，可使用常規(guī)的無毒性固體藥學(xué)上可接受的載體例如藥物級的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂 酸儀、糖精鋼、滑石粉、纖維素、葡萄糖、薦糖、碳酸儀等。例如，用于口服給藥的固體藥物可 包含上列的任何載體和賦形劑和10-95%，優(yōu)選25%-75%的至少一種11111?^4-3926-1基因產(chǎn) 物(或至少一種包含編碼它們的序列的核酸）。用于氣霧劑(吸入)給藥的藥物組合物可包含 封裝在上述脂質(zhì)體中的按重量計算0.01 %-20 %、優(yōu)選按重量計算1 %-10 %的至miRNA-3926-1基因產(chǎn)物(或至少一種包含編碼它們的序列的核酸)和噴射劑。當(dāng)需要時也可包含載 體，如用于鼻內(nèi)遞送的卵憐脂。
[0027] 本發(fā)明的藥物組合物可W進(jìn)一步包含一種或多種抗癌劑。組合物包含至少一種 miRNA-3926-l基因產(chǎn)物(或至少一種包含編碼它們的序列的核酸)和至少一種化療劑。適用 于本發(fā)明的方法的化療劑，包括但不限于，DNA-燒化劑，抗腫瘤抗生素劑，抗代謝劑，微管蛋 白穩(wěn)定劑，微管蛋白去穩(wěn)定劑，激素括抗劑，拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑，蛋白激酶抑制劑，HMG-COA 抑制劑，CDK抑制劑，細(xì)胞周期蛋白抑制劑，脫天蛋白酶抑制劑，金屬蛋白酶抑制劑，反義核 酸，S鏈螺旋DNA，核酸適體，和分子修飾的病毒、細(xì)菌和外毒素試劑。本發(fā)明的組合物試劑 包括但不限于，阿糖胞巧、甲氨噪嶺、長春新堿、依托泊巧、多柔比星、順銷、地塞米松、環(huán)憐 酷胺、沙可來新、甲基亞硝基脈、氣尿喀晚、5-氣尿喀晚、長春堿、喜樹堿、放線菌素-D、絲裂 霉素 C、過氧化氨、奧沙利銷、伊立替康、托泊替康、亞葉酸、卡莫司汀、鏈佐星，CPT-11、泰素、 他莫昔芬、達(dá)卡己嗦、利妥昔單抗、柔紅霉素、1-e-D-阿糖巧喃胞喀晚、伊馬替尼、氣達(dá)拉濱、 多西他賽。
[00%]本發(fā)明的miRNA-3926-l可W是天然的或是人工合成的，或者使用可W表達(dá)miRNA-3926-1的DNA片段的載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞獲得。所述載體包括病毒載體、真核表達(dá)載體。
[0029] 本發(fā)明的可藥用載體可包括但不限于:病毒、脂質(zhì)體、納米顆?；蚓酆衔锛捌淙我?組合。相關(guān)的遞送載劑可包括但不限于：脂質(zhì)體、生物相容性聚合物(包括天然聚合物和合 成聚合物）、脂蛋白、多膚、多糖、脂多糖、人工病毒包膜、無機(jī)(包括金屬)顆粒、W及細(xì)菌或 病毒(例如桿狀病毒、腺病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒）、隧菌體、黏?；蛸|(zhì)粒載體。
[0030] 病毒載體可W是能夠接受miRNA基因產(chǎn)物的編碼序列的任何病毒載體；，包括但不 限于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、腺病毒相關(guān)病毒載體、瘤疹病毒(例如單純瘤疹病毒、痘 苗病毒及EB病毒)載體、甲病毒載體?？赏ㄟ^用來自其他病毒的包膜蛋白或其他表面抗原假 型化載體或通過置換不同的病毒衣殼蛋白（如果合適)來改變病毒載體的趨向性。
[0031 ]真核表達(dá)載體可W是任何適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體，包括但不限于pCMV-My C表達(dá)載體、 PCDNA3.0表達(dá)載體、PCDNA3.1表達(dá)載體、pEGFP表達(dá)載體、pEF Bos表達(dá)載體、pTet表達(dá)載體、 pTRE表達(dá)載體、或者在公知表達(dá)載體的基礎(chǔ)上經(jīng)改造的載體，比如pBin438、pCAMBIA1301 等。
[0032] 可W表達(dá)miRNA-3926-l的DNA片段可W通過如下方式獲?。簭膍iRNA數(shù)據(jù)庫中 化t1:p://mic;ro;rna. sanger .ac.址/sequences/)尋找miRNA-3926-l在基因組上的位置及具 體序列信息，根據(jù)基因組序列確定miRNA-3926-l初始miRNA的位置，在miRNA-3926-l初始 miRNA位置的上下游SOO-SOObp區(qū)間內(nèi)設(shè)計特異性引物，擴(kuò)增引物中間的序列即可獲得表達(dá) miRNA-3926-l 的 DNA 片段。
[0033] 所述藥物可W單獨(dú)施用或者與其他能夠抑制子宮內(nèi)膜癌的藥物進(jìn)行組合施用。施 用有效量的miRNA-3926-l基因產(chǎn)物或其分離的變體或生物活性片段，W便受試者中癌細(xì)胞 的增殖被抑制。
[0034] 在本發(fā)明中，"陣列"或"微陣列"是雜交陣列原件有序排列在基質(zhì)上，所述雜交陣 列原件諸如聚核巧酸探針（例如寡核巧酸）或結(jié)合劑（例如抗體）。所述基質(zhì)可W是固體基 質(zhì)，例如，玻璃或二氧化娃玻片、珠、纖維光學(xué)粘結(jié)劑或半固態(tài)基質(zhì)，例如硝酸纖維素膜。核 巧酸序列可W是DNA、RNA或其中的任何排列。微陣列可從產(chǎn)生自已知miRNA序列的基因-特 異的寡核巧酸探針來制備。陣列可含有每個miRNA的巧巾不同的寡核巧酸探針，一種含有活 性的成熟序列，而另一種特異于miRNA的前體。陣列還可含有對照，諸如與人類直向同源物 僅幾個堿基不同的一種或多種小鼠序列，其可作為雜交嚴(yán)緊條件的對照。來自兩個物種的 tRNA也可印在微忍片上，提供了特異雜交的內(nèi)部、相對穩(wěn)定的陽性對照。非特異雜交的一個 或多個適當(dāng)?shù)膶φ找部砂ㄓ谖⑷唐稀?br>[0035] 在本發(fā)明中，miRNA基因產(chǎn)物的"生物活性片段"是指，具有對應(yīng)野生型miRNA基因 產(chǎn)物的一個或多個生物活性的miRNA基因產(chǎn)物的RNA片段。如上文中所述，此類生物活性的 實(shí)例包括但不限于，子宮內(nèi)膜癌的細(xì)胞增殖過程的抑制。在某些實(shí)施方案中，生物活性片段 在長度上為至少約5、7、10、12、15或17個核巧酸。在具體的實(shí)施方案中，可將分離的miRNA基 因產(chǎn)物與一種或多種另外的抗癌治療組合來給受試者施用。適當(dāng)?shù)目拱┲委煱ǖ幌?于，化學(xué)療法、放射療法W及組合(例如，放化療）。
[0036] 在本發(fā)明中，可將miRNA-3926-l基因產(chǎn)物作為裸RNA與遞送試劑一起作為核酸(如 重組質(zhì)?；虿《据d體)給受試者施用，所述核酸包含表達(dá)miRNA-3926-l基因產(chǎn)物的序列。遞 送試劑可W是親脂試劑、聚陽離子、脂質(zhì)體等。miRNA-3926-l基因產(chǎn)物的序列的重組質(zhì)粒和 病毒載體W及用于遞送此類質(zhì)粒和載體至癌細(xì)胞的技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的。
[0037] 脂質(zhì)體用于將miRNA-3926-l基因產(chǎn)物(或包含編碼它們的序列的核酸)遞送至受 試者。脂質(zhì)體可W增加基因產(chǎn)物或核酸的血液半衰期?？蓮臉?biāo)準(zhǔn)的形成小囊泡的脂質(zhì)(其通 常包括中性或帶負(fù)電荷的憐脂和固醇例如膽固醇)形成用于本發(fā)明的合適的脂質(zhì)體。通常， 通過考慮入目的脂質(zhì)體的大小和血流中直追半衰期等因素，指導(dǎo)脂質(zhì)的選擇。
[0038] 用于本發(fā)明的脂質(zhì)體可包含將脂質(zhì)體祀向細(xì)胞的配體分子。結(jié)合癌細(xì)胞中普遍存 在的受體的配體例如結(jié)合腫瘤細(xì)胞抗原的單克隆抗體是優(yōu)選的。還可對用于脂質(zhì)體進(jìn)行修 飾，W避免被單核巨隧細(xì)胞系統(tǒng)和網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)清除。此類修飾的脂質(zhì)體具有存在于表面 上或整合入脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)中的調(diào)理作用抑制部分。優(yōu)選的，脂質(zhì)體可包含調(diào)理作用抑制部分 和配體兩者。
[0039] 適用于修飾脂質(zhì)體的調(diào)理作用抑制部分優(yōu)選是具有500至約40000道爾頓和優(yōu)選 約20000道爾頓的數(shù)量平均分子量的水溶性聚合物。此類聚合物包括聚乙二醇(PEG)或聚丙 二醇(PPG)衍生物如甲氧基PEG或PPG，和PEG或PPG硬脂酸醋;合成聚合物如聚丙締酷胺或聚 N-乙締基化咯酬;線性的、分支的或樹狀聚酷胺-胺;聚丙締酸;多元醇如簇基或氨基化學(xué)連 接至其的聚乙締醇和聚木糖醇，W及神經(jīng)節(jié)巧脂。此外調(diào)理作用抑制性聚合物可W是PEG與 多聚氨基酸、多糖、聚酷胺-胺、聚乙締胺或多核巧酸的嵌段共聚物。調(diào)理作用抑制性聚合物 也可W是包含氨基酸或簇酸如半乳糖醒酸、葡萄醒酸、甘露糖醒酸、透明質(zhì)酸、果膠酸、神經(jīng) 氨酸、海藻酸、角叉菜膠的天然多糖;氨化多糖或寡糖;簇化多糖或低聚糖如與碳酸的衍生 物反應(yīng)，獲得簇基的連接。優(yōu)選的，調(diào)理作用抑制部分是陽G、PPG或其衍生物。
[0040] 本發(fā)明的藥物組合物包含對核酸酶的降解具有抗性的至少一種miRNA-3926-l基 因產(chǎn)物(或至少一種包含編碼它們的序列的核酸）。本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地合成對核酸酶 具有抗性的核酸，如通過將一個或多個在2 '位置被修飾的核糖核巧酸滲入miR基因產(chǎn)物。合 適的2'-修飾的核糖核巧酸包括在2'位置用氣、氨基、烷基、烷氧基和0-締丙基修飾的核糖 核巧酸。
[0041 ] 所述藥物可W體內(nèi)施用：將miRNA-3926-l模擬物、miRNA-3926-l的激動劑、前體 miRNA-3926-l或者miRNA-3926-l的表達(dá)載體直接導(dǎo)入體內(nèi)。運(yùn)種載體可W是病毒型或非病 毒性，甚至是裸DNA或RNA。
[0042]在本發(fā)明中，術(shù)語"治療"是指改善與疾病或病癥例如實(shí)體癌相關(guān)的癥狀，包括阻 止或延遲疾病癥狀的發(fā)作和/或減少疾病或病癥的嚴(yán)重度或頻率。術(shù)語"受試者"、"患者"或 "個體"在本文定義為包括動物如哺乳動物，包括但不限于，靈長類動物、牛、綿羊、山羊、馬、 狗、貓、兔子、豚鼠、大鼠、小鼠或其它牛族動物、羊科動物、馬科動物、犬科動物、貓科動物、 曬齒類動物或鼠類物種。優(yōu)選的，動物為人。
[0043] 術(shù)語"抑制癌細(xì)胞的增殖"是指殺死細(xì)胞或永久性地或臨時性地阻止或減緩細(xì)胞 的生長。如果在施用miR基因產(chǎn)物或抑制miR基因表達(dá)的化合物后，受試者中癌細(xì)胞的數(shù)目 保持恒定或減少，那么可推斷此類細(xì)胞的增殖被抑制。如果癌細(xì)胞的絕對數(shù)目增加但腫瘤 生長速率減小也可推斷癌細(xì)胞的增殖被抑制?？赏ㄟ^直接測量或通過從原發(fā)性或轉(zhuǎn)移腫瘤 塊的大小估計來確定受試者體內(nèi)癌細(xì)胞的數(shù)目。例如，可通過免疫組織學(xué)方法、流式細(xì)胞計 量術(shù)或設(shè)計用于檢測癌細(xì)胞的特征性表面標(biāo)記的其它技術(shù)測量受試者中的癌細(xì)胞數(shù)目。
[0044] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果：
[0045] 本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了 miRNA-3926-l表達(dá)水平與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，通過檢 巧峻試者miRNA-3926-l的表達(dá)水平，可W判斷受試者是否患有子宮內(nèi)膜癌，從而指導(dǎo)臨床 醫(yī)師給受試者提供預(yù)防方案或者治療方案。
【附圖說明】
[0046] 圖1顯示利用qRT-PCR檢測miRNA-3926-l在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)情況；
[0047] 圖2顯示利用qRT-PCR檢測miRNA-3926-l對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中的表達(dá)情況；
[004引圖3利用CCK-騎去檢巧UmiRNA-3926-l對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖的影響。
【具體實(shí)施方式】
[0049] 下面結(jié)合具體的實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，本發(fā)明的實(shí)施例僅用于解釋本發(fā)明， 并不意味著限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0050] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0051] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0052] 實(shí)施例1與子宮內(nèi)膜癌相關(guān)的miRNA的篩選
[0053] 1、樣本獲取:各收集10例正常子宮內(nèi)膜組織和子宮內(nèi)膜癌組織樣本。上述所有樣 本的取得均通過組織倫理委員會的同意。
[0化4] 2、樣本總RNA的提取
[0055] 使用QIAGEN公司的組織RNA提取試劑盒提前總RNA。具體步驟如下：
[0056] 1)在較少RNase干擾的清潔區(qū)，使用含適量液氮的研鉢稱取組織樣本約20mg，用巧 棒研磨至粉末狀；
[0057] 2)將樣本轉(zhuǎn)移到一個不含RNA酶的2ml的離屯、管中；
[0化引 3)加入300]il Lysis solution,置于勻漿器內(nèi)，充分研磨l-5min;
[0059] 4)12000旨，4。(：，離屯、10111111，轉(zhuǎn)移上清至新的1.51111的離屯、管中；
[0060] 5)加入60化1 RNase-Free Water,用縱滿器混勻；
[0061 ] 6)加入蛋白酶K，在55 °C水浴鍋中溫浴15min，不斷滿旋混勻；
[0062] 7)14000g，室溫，離屯、Imin,使細(xì)胞碎片沉淀于離屯、管底部，取上清轉(zhuǎn)移到另外一 個不含RNA酶1.5ml的離屯、管中；
[0063] 8)加入45化1的95%乙醇，滿旋混勻；
[0064] 9)取65化1含乙醇的裂解液加到離屯、柱中，14000g離屯、Imin;棄下層，將柱子重新 置于收集管中；
[0065] 10)依照裂解液的容量，重復(fù)步驟9);
[0066] 11)加入400山Wash solution，14000g離屯、2min;棄下層，將柱置于一新的收集管 中；
[0067] 12)加入lOOul Enzyme Incubation Buffer和15山 DNase I，HOOOg離屯、Imin,將 收集管中的溶液重新移入柱中，室溫放置15min;
[0068] 13)加入400山Wash solution, 14000g離屯、Imin，棄下層，將柱子重新置于收集管 中；
[0069] 14)加入400]il Wash solution, HOOOg離屯、2min，棄收集管，把柱子放入 1.7ml Elution 管中；
[0070] 15)加入30iil Elution Buffer,200g離屯、2min，使溶液充分與柱結(jié)合；
[0071] 16)14000g離屯、Imin,將RNA使用無 RNA去離子水溶解，待用。
[0072] 3、RNA樣品的質(zhì)量分析(Nano化OP1000分光光度計）
[0073] NanoDroplOOO分光光度計檢測RNA樣品，RNA-seq測序的樣品要求:0D260/0D280為 1?8-2?2d
[0074] 將上述提取的R N A進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，A g i 1 e n t T e C h n O 1 O g i e S 2100Bioanalyze;r檢測RNA樣品質(zhì)量，在凝膠成像儀上觀測、拍照，保存圖像，一般認(rèn)為28S: 18S>2可W初步判定總RNA質(zhì)量較好。
[00巧]4、miRNA的提取和標(biāo)記
[0076] 1)用Ambion公司的miRNAs抽提試劑盒抽提獲得miRNA，具體操作按照相應(yīng)說明書。 樣品用T4RNA連接酶標(biāo)記步驟依照化omson的方法。miRNA標(biāo)記方法大致如下：1.4]ig miRNA 和500ng 5 ' -憐酸鹽-胞喀晚-尿喀晚巧3-3 '（Dharmacon，畑icago，USA)及2單位T4RNA Iigase(肥B，Ipswich，USA)，于4°C解育2小時。每份miRNA樣品均設(shè)等量的相應(yīng)陰性對照。
[0077] 2)標(biāo)記的RNA用0.3M醋酸鋼和2.5倍體積的乙醇進(jìn)行沉淀，再用15 y 1含3 X S S C、 0.2%SDS和15%甲酯胺的雜交液重懸，所有的雜交重復(fù)兩次，雜交用LifterSlipTM化rie， PA USA) W保證雜交液在忍片和蓋片之間均勻流動。
[007 引 3)將雜交室放在雜交儀 BioMixerTMII 上（CapitalBio Co 巧，Beijing ,China)于 42 °(：水浴過夜，用洗液洗兩遍。
[0079] 5、miRNA 忍片操作：
[0080] miRNA忍片，采用博奧生物有限公司的miRNA表達(dá)譜忍片（單通道忍片），按照說明 書的指示進(jìn)行miRNA表達(dá)譜的檢測。
[0081] 6、結(jié)果：
[0082] 分析miRNA忍片表達(dá)譜的檢測結(jié)果，可知miRNA-3926-l在子宮內(nèi)膜癌組織和正常 子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)存在顯著差異，與正常子宮內(nèi)膜組織相比，子宮內(nèi)膜癌組織中 miRNA-3926-l的水平顯著降低。
[0083] 實(shí)施例2qRT-PCR驗證差異表達(dá)的miRNA-3926-l
[0084] 1、根據(jù)miRNA忍片的檢測結(jié)果選擇miRNA-3926-l進(jìn)行大樣本QPCR驗證。按照實(shí)施 例1中的樣本收集方式選擇子宮內(nèi)膜癌組織本和正常子宮內(nèi)膜組織樣本各60例。
[00化]2、1?^4提取過程同實(shí)施例1。
[00化]3、逆轉(zhuǎn)錄：
[0087] I)按照表1配制反應(yīng)體系
[008引表1反應(yīng)體系 「00891
[0090] 37 °C 解育化。
[0091] 2)反應(yīng)管中加入化1 O.SiigAU Oligo(dT)特異性RT引物，70°C解育5min。
[0092] 3)立即置于冰上解育2min，打斷RNA和引物的二級結(jié)構(gòu)。
[0093] 4)將上述20iU反應(yīng)混合物與4iU 5X緩沖液、化1 dNTP(10mM)，0.扣1 M-MLV逆轉(zhuǎn) 錄酶，〇.5iil核糖核酸酶（R化Se)抑制劑，IOiil POlyA反應(yīng)混合液和4iil無核糖核酸酶水 (RNase 打ee water)混合，42°C解育化。
[0094] 4、QPCR 反應(yīng)：
[00巧]1)引物設(shè)計
[0096] 擴(kuò)增 miRNA-3926-l的引物
[0097] 正向引物：TGGCCAAAAAGCAGGCAGAGA(沈Q ID N0.2)
[009引反向引物:GTGCAGGGTCCGAGGT(沈Q ID N0.3)
[0099] 擴(kuò)增USsnRNA的引物
[0100] 正向引物：CTCGCTTCGGCAGCACA(SEQ ID N0.4)
[0101] 反向引物:AACGCTTCACGAATTTGCGT(沈Q ID N0.5)
[0102] 2)按照表2配制PCR反應(yīng)體系：
[0103] 其中，SYBR Green聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系購自Invitrogen公司。
[0104] 表2PCR反應(yīng)體系 r01051
[0106」 3)PCR反應(yīng)條件：95°C3min，（95°C3s，60°C32s)X40個循環(huán)。?SYBRGreen作為巧 光標(biāo)記物，在Li曲t切Cler巧光定量PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)，WuesnRNA作為參照基因，通過 融解曲線分析和電泳確定目的條帶，A A CT法進(jìn)行相對定量。
[0107] 5、結(jié)果
[0108] 如圖1所示，與正常子宮內(nèi)膜組織樣本相比，子宮內(nèi)膜癌組織中miRNA-3926-l的表 達(dá)水平顯著降低，與miRNA忍片結(jié)果一致。
[0109] 實(shí)施例3QPCR檢測子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中miRNA-3926-l的表達(dá)
[0110] 1、miRNA-3926-l質(zhì)粒的擴(kuò)增及鑒定
[0W] 1)根據(jù)miRNA-3926-l的序列信息由大連寶生物生物技術(shù)有限公司設(shè)計合成 miRNA-3926-l模擬物質(zhì)粒和隨機(jī)對照序列的陰性對照質(zhì)粒。
[0112] 2)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化D冊a感受態(tài)菌株
[0113] ①-80°C冰箱取出D冊a感受態(tài)細(xì)菌10化1于冰上融化；
[0114] ②將IOiil pMUTeno質(zhì)粒加入10化1 D冊a感受態(tài)菌液，輕彈、旋轉(zhuǎn)管底混勻，冰浴 放置30min;
[0115] ③置于42 r水浴熱休克90s后立即冰浴90s;
[0116] ④加 Amp-LB培養(yǎng)液80化1，輕輕吹打混勻，于37 °C恒溫?fù)u床，100巧m振蕩解育化，使 細(xì)菌復(fù)蘇；
[0117] ⑤將復(fù)蘇后的菌液于4°C ,300化pm離屯、IOmin;
[011引⑥吸棄上清，使管中剩余約10化1液體，輕輕吹打混勻后將其涂于Amp-LB瓊脂平 板；
[0119] ⑦待平板菌液完全被吸收，倒置平板，于37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)16h。
[0120] 3)篩選陽性菌落
[0121] 經(jīng)16h解育，固體培養(yǎng)基長出白色菌落。取消毒離屯、管8支，用消毒牙簽小屯、挑取白 色菌落8株，吸管吸取Amp-LB液體培養(yǎng)基，分別將其沖入相應(yīng)試管，加培養(yǎng)液至5ml。置37°C 恒溫?fù)u床，W 20化pm振蕩培養(yǎng)12h，取適量培養(yǎng)物送華大基因進(jìn)行基因測序。
[0122] 4)提取陽性菌液質(zhì)粒(OMEGA公司質(zhì)粒中量提取試劑盒），按照試劑盒的說明書進(jìn) 行提取。
[0123] 5)質(zhì)粒濃度的測定
[0124] 將提取的陽性菌液的質(zhì)粒應(yīng)用微型全波長分光光度計進(jìn)行濃度的測定。
[0125] 2、細(xì)胞培養(yǎng)
[0126] 將IsMkawa細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RRMI 1640培養(yǎng)基中，于37°C、5% C〇2及飽和濕度條件下培養(yǎng)。
[0127] 3、細(xì)胞轉(zhuǎn)染
[0128] 將IsMkawa細(xì)胞分為四組，實(shí)驗組即轉(zhuǎn)染miRNA-3926-l模擬物組，陰性對照組即 轉(zhuǎn)染隨機(jī)對照序列組，脂質(zhì)體對照組即轉(zhuǎn)染Lipofectamine? 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑組，空白 對照組即不轉(zhuǎn)染組。運(yùn)用轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine? 2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染方法參照說明書。 對照組和實(shí)驗組組的工作濃度均為如M。轉(zhuǎn)染后4她收集各組細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗。
[0129] 4、QPCR 實(shí)驗
[0130] 1)細(xì)胞總RNA提取:利用QIAGEN公司的RNA提取試劑盒進(jìn)行細(xì)胞總RNA的提取，按照 說明書指示進(jìn)行。
[0131] 2)QPCR:步驟同實(shí)施例2。
[0132] 結(jié)果如圖2所示，與對照組相比，實(shí)驗組的miRNA-3926-l的表達(dá)水平顯著上升，表 明miRNA-3926-l模擬物能夠有效促進(jìn)miRNA-3926-l的表達(dá)。
[0133] 實(shí)施例4CCK-8法檢測miRNA-3926-l對細(xì)胞增殖的影響
[0134] 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染按照實(shí)施例3
[0135] 1、轉(zhuǎn)染4她后，收集IShikawa細(xì)胞:細(xì)胞計數(shù)后，每組細(xì)胞配成濃度為2 X IO4個/ml 細(xì)胞懸液；
[0136] 2、96孔板每孔0.1 ml，每組細(xì)胞設(shè)6個復(fù)孔，重復(fù)鋪5塊96孔板，邊緣孔加0.1 ml無菌 水或PBS;
[0137] 3、細(xì)胞貼壁后，連續(xù)測第Oh、24h、4化、7化時間點(diǎn)：加 CCK-8，每孔IOiil，37 °C解育 地，450nm波長測OD值，記錄各組OD平均值，根據(jù)平均值畫出生長曲線。
[013引4、結(jié)果
[0139] 結(jié)果如圖3所示，與對照組相比，實(shí)驗組IsMkawa細(xì)胞的生長速度明顯低于對照組 的細(xì)胞生長速度，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<〇.〇5)。上述結(jié)果表明miRNA-3926-l的表達(dá)不利 于子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖，通過增加 miRNA-3926-l的表達(dá)可W抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的生 長。
[0140] 實(shí)施例5FITC/PI雙染流式細(xì)胞學(xué)法檢測miRNA-3926-l對子宮內(nèi)膜癌的影響
[0141] 1、細(xì)胞培養(yǎng)步驟同實(shí)施例3。
[0142] 2、細(xì)胞轉(zhuǎn)染步驟同實(shí)施例3。
[0143] 3、步驟
[0144] 1)收集轉(zhuǎn)染72h后的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞:細(xì)胞計數(shù)后，每個樣品準(zhǔn)備0.5-1.0X10? 個/ml細(xì)胞，共4組；
[0145] 2 Mnnexin-V-門TC/PI雙染進(jìn)行染色，染色方法如下：
[0146] 空細(xì)胞不染色(校準(zhǔn)用）、空細(xì)胞單染PK校準(zhǔn)用）、空細(xì)胞單染Annexin-V-FITC(校 準(zhǔn)用）、空細(xì)胞雙染Annexin-V-門TC、PI
[0147] ①為保證上機(jī)細(xì)胞數(shù)足夠，細(xì)胞數(shù)目>5 X IO6處理，15(K)巧m離屯、5min;
[0148] ②預(yù)冷的PBS洗涂細(xì)胞沉淀，150化pm離屯、5min，棄上清；
[0149] ③加入19扣1 Annexin-V-FITC結(jié)合也重懸沉淀，空細(xì)胞和空細(xì)胞PI單染用20化1 結(jié)合液重懸沉淀
[0150] ④加入化1 Annexin-V-門TC,輕輕吹打混勻，空細(xì)胞和空細(xì)胞PI單染不加；
[0151] ⑤室溫解育1〇111111，1000邑離屯、5111111，棄上清；
[0152] ⑥加入19化1 Annexin-V-FITC結(jié)合也重懸沉淀，空細(xì)胞和空細(xì)胞PI單染用20化1 結(jié)合液重懸沉淀；
[0153] ⑦加入IOiil PI，輕輕吹打混勻，空細(xì)胞和空細(xì)胞PI單染不加冰浴避光放置，將細(xì) 胞移到流式上機(jī)管中，上機(jī)檢測。記錄雙染調(diào)亡的實(shí)驗結(jié)果
[0154] 4、結(jié)果
[01巧]實(shí)驗組的細(xì)胞調(diào)亡率為（29.12 ±0.024) %，空白對照組的細(xì)胞調(diào)亡率為(4.23 ± 0.14) %，轉(zhuǎn)染試劑組的細(xì)胞調(diào)亡率為(3.78±0.23)%，陰性對照組的細(xì)胞調(diào)亡率為(5.18 ±0.17) %，上述差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，上述結(jié)果表明，miRNA-3926-l的表達(dá)不利 于子宮內(nèi)膜癌的存活，通過促進(jìn)miRNA-3926-l的表達(dá)可W促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的調(diào)亡。 [0156]上述實(shí)施例的說明只是用于理解本發(fā)明的方法及其核屯、思想。應(yīng)當(dāng)指出，對于本 領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可W對本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn) 和修飾，運(yùn)些改進(jìn)和修飾也將落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項】
1 .miRNA在制備診斷子宮內(nèi)膜癌的產(chǎn)品中的應(yīng)用，其特征在于，所述miRNA為miRNA-3926-1或其同源物。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述產(chǎn)品通過測定miRNA-3926-l或其同源 物的水平以診斷子宮內(nèi)膜癌。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述產(chǎn)品包括通過使用qRT-PCR、印記雜 交、原位雜交、陣列雜交、基因芯片或新一代測序來檢測miRNA-3926-l或其同源物的水平以 診斷子宮內(nèi)膜癌的產(chǎn)品。4. 一種診斷子宮內(nèi)膜癌的產(chǎn)品，其特征在于，所述產(chǎn)品能夠通過檢測miRNA-3926-l或 其同源物的水平來診斷子宮內(nèi)膜癌。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的產(chǎn)品，其特征在于，所述產(chǎn)品包括芯片或試劑盒;其中，所述芯 片包括固相載體；以及固定在所述固相載體上的寡核苷酸探針;所述寡核苷酸探針包括特 異性地對應(yīng)于miRNA-3926-l的部分或全部序列;所述試劑盒包括用于檢測miRNA-3926-l表 達(dá)水平的試劑;所述試劑包括針對miRNA-3926-l的引物和/或探針。 6. miRNA-3926-l或其同源物在制備治療子宮內(nèi)膜癌藥物中的應(yīng)用。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述藥物包含促進(jìn)miRNA-3926-l表達(dá)或增 強(qiáng)miRNA-3926-l功能的試劑。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的試劑包括:miRNA-3926-l的模擬物、 miRNA-3926-l 的前體、miRNA-3926-l 的激動劑、攜帶 miRNA-3926-l 的載體。9. 一種治療子宮內(nèi)膜癌的藥物，其特征在于，所述藥物包括權(quán)利要求7或8所述的試劑。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的藥物，其特征在于，所述藥物還包括藥學(xué)上可接受的載體。
【文檔編號】C12Q1/68GK105861736SQ201610440180
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年6月17日
【發(fā)明人】楊承剛, 孫耀蘭
【申請人】北京泱深生物信息技術(shù)有限公司