一種denv i-iii型特異性檢測(cè)靶序列、質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子及其檢測(cè)試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種DENV I?III型通用特異性檢測(cè)靶序列、質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子及其核酸檢測(cè)試劑盒，所述質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子為含有具有堿基組成SEQ ID NO：1的檢測(cè)靶序列。所述核酸檢測(cè)試劑盒為：由SEQ ID NO：2?5組成的核酸檢測(cè)引物體系及SEQ ID NO：6的逆轉(zhuǎn)錄引物。本發(fā)明成功構(gòu)建了DENV I?III型特異性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子及其PCR檢測(cè)體系，為人群及媒介蚊蟲野生種群DENV I?III型攜帶背景調(diào)研與診斷建立了簡便、價(jià)廉、特異的核酸檢測(cè)體系。
【專利說明】
-種化NV I-I I I型特異性檢測(cè)卽序列、質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子及其檢 測(cè)試劑盒
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物領(lǐng)域，主要設(shè)及一種登革病毒(DENV)I-III型特異性檢測(cè)祀序列、 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子及其核酸檢測(cè)試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 登革熱近30年來在全球呈現(xiàn)快速上升及蔓延趨勢(shì)，是重要的嚴(yán)重威脅民眾健康的 蟲媒傳染病，2014年中國尤其是廣東/廣州出現(xiàn)4萬余病例的大規(guī)模疫情暴發(fā)性流行，如中 國的登革熱疫情是否已由輸入性流行轉(zhuǎn)變?yōu)楸镜亓餍?，此類科學(xué)問題的解決對(duì)疫情地的登 革疫情防控策略的制定具有重要作用，但目前仍未完全明晰，其中流行傳播鏈中非常重要 的環(huán)節(jié)即DENV的傳播媒介伊蚊攜帶DENV病毒的背景情況仍不清楚，一方面，媒介蚊蟲如白 紋伊蚊攜帶病毒的檢出率極低，另一方面，亟待優(yōu)化和發(fā)展更適用于媒介蚊蟲野生種群 DENV檢測(cè)的高度靈敏、特異且價(jià)廉、易用的檢測(cè)方法。
[0003] 目前常用蚊媒分離病毒方法有細(xì)胞培養(yǎng)分離法、乳鼠腦內(nèi)接種分離法W及媒介蚊 蟲接種分離法。細(xì)胞培養(yǎng)分離法:DENV多采用C6/36細(xì)胞、BHK21細(xì)胞，待細(xì)胞長至單層，棄去 培養(yǎng)液，將待測(cè)成蚊/幼蟲研磨制備懸液，離屯、，過濾除菌后，覆蓋細(xì)胞層吸附化，C6/36細(xì) 胞28°C，BHK21細(xì)胞37°C培養(yǎng)，次日即觀察細(xì)胞病變，一般C6/36細(xì)胞在28°C需培養(yǎng)7天， BHK21細(xì)胞于4天左右出現(xiàn)病變。若未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞病變，則繼續(xù)盲傳3代。蚊蟲胸腔接種法:埃及 伊蚊、白紋伊蚊均對(duì)DENV敏感，微量病毒接種可在短時(shí)間內(nèi)繁殖、富集，能提高DENV檢出率。 具體方法:可將采集的白紋伊蚊待測(cè)標(biāo)本制備成蚊懸液，取實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)羽化3~5日齡的白 紋伊蚊或巨蚊成蚊，W乙酸/(X)2麻醉后，自蚊胸腔注入蚊懸液0.化1，10%葡萄糖水飼養(yǎng)，1~ 2周后進(jìn)行病毒檢測(cè)。目前報(bào)道白紋伊蚊野生種群攜帶DENV的檢出率極低。
[0004] 媒介蚊蟲中DENV的分子生物學(xué)檢測(cè)手段基本與患者血清學(xué)分子生物學(xué)診斷手段 相似，近年來W普通PCR、巧光定量PCR為主，可進(jìn)行DENV通用型和多型別的擴(kuò)增鑒定，方案 的優(yōu)化W患者血清檢測(cè)的為主，針對(duì)媒介蚊蟲如白紋伊蚊等的檢測(cè)，尚需進(jìn)一步的規(guī)范流 程和優(yōu)化策略。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明需要解決技術(shù)方案之一是提供一種DENV特異性核酸檢測(cè)祀序列。
[0006] 解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案的如下： 構(gòu)建的DENV特異性檢測(cè)祀序列，具有SEQ ID NO: 1所示堿基組成。
[0007] 本發(fā)明另一目的是提供一種重組質(zhì)粒或質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子或標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或E. COli工程 菌菌株。實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下： 一種包含有上述任一所述DENV特異性檢測(cè)祀序列的重組質(zhì)?；蛸|(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子或標(biāo)準(zhǔn) 物質(zhì);進(jìn)一步W該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)菌E.COli,獲得能用于生產(chǎn)該重組質(zhì)粒的工程菌菌株。 [000引本發(fā)明的另一目的是提供登革病毒特異性核酸檢測(cè)試劑盒。
[0009] 實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下： 一種針對(duì)SEQ ID NO: 1的DENV特異性核酸檢測(cè)試劑盒，包括有:堿基組成為SEQ ID NO: 2和SEQ ID N0:3構(gòu)成的巢式PCR外引物對(duì)，SEQ ID N0:4和SEQ ID N0:5構(gòu)成的巢式PCR內(nèi)引 物對(duì)，W及由SEQ ID N0:6所示堿基構(gòu)成的逆轉(zhuǎn)錄引物。
[0010] 本發(fā)明基于大量深入的DENV基因組學(xué)生物信息學(xué)分析，其中結(jié)合部分核酸二級(jí)結(jié) 構(gòu)及功能分析，并W本實(shí)驗(yàn)室DENV分離株W及所采集的白紋伊蚊野生種群標(biāo)本進(jìn)行數(shù)次核 酸檢測(cè)體系的實(shí)踐性調(diào)校與優(yōu)化，方獲得本發(fā)明的DENVI-HI的核酸檢測(cè)體系。進(jìn)一步為杜 絕在核酸檢測(cè)試劑潛存的陽性對(duì)照污染問題，本發(fā)明在DENV病毒來源的檢測(cè)祀片段中經(jīng)過 優(yōu)選的插入位點(diǎn)插入經(jīng)過人工改造的內(nèi)含子片段mINTRON-X，構(gòu)建了可供DENVI-III核酸檢 測(cè)用的新型標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子，其具有SEQ ID NO: 1所示堿基組成。經(jīng)過白紋伊蚊野生種群標(biāo)本 測(cè)試W及對(duì)臨床DENV患者血清標(biāo)本測(cè)試，證實(shí)本發(fā)明所構(gòu)建的DENVI-III特異性的核酸檢 巧m劑盒是有效、可行、敏感特異、價(jià)廉簡便的能應(yīng)用媒介蚊蟲DENV攜帶情況檢測(cè)和臨床 DENV患者標(biāo)本的檢測(cè)體系。
【附圖說明】
[001 U 圖1是PCR擴(kuò)增電泳圖及重組質(zhì)粒地畑1的雙酶切鑒定圖； 左圖為P-0ut-F(SEQ ID N0:2)和P-0ut-R(SEQ ID N0:3)引物對(duì)DENVI型病毒分離株 PCR擴(kuò)增電泳圖Lane 1:擴(kuò)增條帶與預(yù)期大小214bp相符； 右圖為重組質(zhì)粒地畑1的雙酶切鑒定圖Lanel，2:DENVI型PCR擴(kuò)增片段插入質(zhì)粒的雙 酶切鑒定圖，其中Lane 2可見酶切片段符合預(yù)期大小214bp+73bp(載體片段)=287bp，該克 隆為構(gòu)建成功的陽性重組質(zhì)粒地RDl。
[001^ 圖視新型標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子地mRDl構(gòu)建示意圖； 其中：橫向白色箭頭所示為能檢測(cè)DENVI-HI型的特異性巢式PCR外巢引物對(duì)(P-OUt-F，沈Q ID N0:2和P-OUt-R,SEQ ID N0:3)，黑色箭頭所示為DENVI-HI型特異性內(nèi)巢引物對(duì) (P-in-F，SEQ ID N0:4和P-in-R，SEQ ID N0:5);黑色片段示意為本實(shí)驗(yàn)室DENVI病毒株分 離片段，PCR產(chǎn)物預(yù)期大小為214bp/17化P;灰色片段示插入人工改造的mINTRON-X序列片 段，為50bp的插入子，因而，所構(gòu)建的新型標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子作為陽性參照所擴(kuò)增的陽性PCR產(chǎn) 物預(yù)期大小為264bp/22化P。該標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子一方面能較好地檢測(cè)試劑體系的有效性;另一 方面，能簡易地自不同的分子量大小區(qū)分可能因用戶的操作或環(huán)境因素的影響而出現(xiàn)的來 自陽性對(duì)照的潛在污染情況。
[OOK] 圖3是A:P-Insert-F和P-OUt-R對(duì)地畑1的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Frag A電泳圖； Lane 1:PCR產(chǎn)物如預(yù)期大小117bp;B: P-OUt-F和P-Insed-R對(duì)地畑1的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 化ag B電泳圖 Lane 1:PCR產(chǎn)物如預(yù)期大小 197bp;C:P-〇ut-F 和P-OUt-R對(duì)Frag A+化ag B 連接產(chǎn)物的PCR擴(kuò)增電泳圖Lane 1:PCR產(chǎn)物如預(yù)期大小264bp;D:新型標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子 pBmRDl的雙酶切鑒定Lane 1:酶切插入子片段如預(yù)期大小337bp(克隆片段264bp+質(zhì)粒片 段73bp) ;M:DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量。
[0014] 圖4是巢式PCR擴(kuò)增地m畑1的LOD測(cè)試； A: P-OUt-F和P-OUt-R對(duì)地畑1的PCR擴(kuò)增LOD測(cè)試;M: DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量;Lanel-IO:新型標(biāo) 準(zhǔn)質(zhì)粒分子pBmRDl梯度稀釋依次為109-100copies的外巢PCR擴(kuò)增，可見外巢PCR的LOD為 104copies;Lane 11:空白對(duì)照；B:巢式PCR體系對(duì)pBRDl的LOD測(cè)試；M:DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量； Lane 1-7 :新型標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子pBmRDl分別稀釋至2000copies，400copies，SOcopies, 16copies，4copies，2copies，Icopies，可見該LOD為 16copies;Lane 8:空白對(duì)照。
[0015] 圖5是巢式PCR檢測(cè)體系對(duì)DENVI型病毒株檢測(cè)的擴(kuò)增條件優(yōu)化； A:外巢引物對(duì)(P-OUt-F和P-OUt-R)的退火溫度條件優(yōu)化;M: DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量;Lane 1 -6: 退火溫度分別為59.9 °C，61. rC，62. rC，63.2 °C，64. rC，64.8 °C ; A:內(nèi)巢引物對(duì)(P-in-F和 P-in-R)的退火溫度條件優(yōu)化;M:DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量;Lanel-6:退火溫度分別為56.9°C，58.9 °C，59.9°C，61. TC，63.2°C ,64.8°C。
[0016] 圖6是巢式PCR檢測(cè)體系對(duì)臨床DENV患者血清標(biāo)本和野外白紋伊蚊攜帶DENV的檢 (為PCR內(nèi)巢擴(kuò)增片段的電泳圖）； M:DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量;Lanel ,2:臨床DENV患者血清；Lane 3,11:標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子pBm畑1陽 性對(duì)照;Lane 4:正常人血清;Lane5-8:野外白紋伊蚊標(biāo)本DENV檢測(cè);Lane 9:實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)白 紋伊蚊（陰性對(duì)照）;Lane 10:空白對(duì)照。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 實(shí)施例一 DENVI、II、III型通用特異性核酸檢測(cè)體系生物信息學(xué)篩選與設(shè)定 篩選獲得NCBI收錄的1967條DENV全長基因，其中中國大陸DENV株70條，WMEGA6、 DNAMAN等生物信息學(xué)分析軟件進(jìn)行分析，尋找具有DENVI、II、III型特異性的保守序列區(qū) 域，且排除其他物種如DENV宿主人、蚊，其他黃病毒屬病毒核酸序列等，初步祀向DENVI-III 檢測(cè)的病毒祀標(biāo)檢測(cè)片段W及引物對(duì)，并WBeacon Designer 7.5、01igo6等軟件進(jìn)行引物 的設(shè)計(jì)與評(píng)價(jià)，初步設(shè)計(jì)合成后，W本實(shí)驗(yàn)室DENV I病毒分離株W及白紋伊蚊野生種群標(biāo) 本進(jìn)行初步測(cè)試，不斷進(jìn)行檢測(cè)體系尤其是引物序列等微調(diào)，方錯(cuò)定本發(fā)明DENV I-III特 女而會(huì)換》1化玄甘出古巧引物I對(duì)車1
[0018] 實(shí)施例二DENVI型病毒分離株祀標(biāo)檢測(cè)片段的制備 (一）DENVI病毒RNA提取 DENVI病毒株為本實(shí)驗(yàn)室自分離保存于-80°C。采用QIAamp ? Viral RNAMini Kit試 劑盒提取病毒RNA，試劑有：carrier-buffer AVE (-20°C)，AW1，AW2，AVL，AVE等。主要步驟 如下： 1. 取AVL 800山加入至2m化P管，加入祉1 carrier-buffer AVE，輕柔顛倒混勻10次； 2. 將20化1病毒液樣本加入至EP管，滿旋15秒，混勻，裂解，室溫放置IOmin，瞬時(shí)離屯、； 3. 加入80化1無水乙醇，滿旋15秒充分混勻，瞬時(shí)離屯、； 4. 取63化1上步溶液小屯、加入至層析柱山〇1111]1]1)中； 5. 離屯、SOOOrpm Imin ; 6. 可根據(jù)樣本情況重復(fù)第4步； 7. 將column放入新2ml無蓋離屯、管中； 8. 加入500山buffer AWl;SOOOrpm離屯、，:Lmin;將column放入新2ml無蓋離屯、管中； 9. 加入500山 buffer AW2, HOOOrpm離屯、3min; 10. 將column放入新的2ml無蓋離屯、管中，14000rpm離屯、Imin; 11. 將column放在1.5ml離屯、管中，加入60iU室溫的buffer AVE;室溫放置2min， 8000巧m 離屯、Imin。
[0019] (二)DENVI 病毒 RNA 逆轉(zhuǎn)錄 WP-rev-l(SEQ ID N0:6, 5'-ACCATTCCAT TTTCTGGC-3'）DENV特異性的逆轉(zhuǎn)錄引物進(jìn) 行DENVI病毒RNA的逆轉(zhuǎn)錄。主要試劑：dNTP( IOmM) ,Rnase-Free-water，5 X prime script Buffer,Rnase Inhibiter,Prime Script Rnase，主要步驟女曰下： DENVI特異型逆轉(zhuǎn)錄引物P-rev-1 liil+dNTP(l〇mM) liU+DENVI-RNA 如1，65°C保溫 5min后，冰上迅速冷卻;再依次加入： Sxprime script Buffer 4山 Rnase Inhibiter 0.5山 Rnase-Free-water 4.5山 Prime Script Rnase 3山 緩慢搖勻后，置于PCR儀42°C 30min，70°C 15min。
[0020] (S)DENVI病毒祀標(biāo)檢測(cè)片段的PCR擴(kuò)增及切膠純化 用P-〇ut-F(SEQ ID N0:2)和P-〇ut-R(SEQ ID N0:3)引物對(duì)，擴(kuò)增上述逆轉(zhuǎn)錄獲得 DENVI型病毒分離株cDNA，并將該片段克隆，重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切和測(cè)序鑒定，步驟如下：
反應(yīng)條件為:98°C預(yù)變性2min; 98 °C變性IOs，63°C退火20s，72 °C延伸30s，30個(gè)循環(huán);72 °C延伸5min。反應(yīng)結(jié)束后，取化IPCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見圖1(左圖），可見獲 得預(yù)期大小214bp的目的片段。
[0021 ]進(jìn)一步對(duì)該片段進(jìn)行切膠純化： 1. 使用新鮮配制TBE電泳緩沖液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分離目的DNA片段。電泳結(jié)束后使 用干凈的手術(shù)刀片在紫外燈下迅速割取含有目的片段的瓊脂糖膠塊放入2ml EP管，計(jì)算膠 塊質(zhì)量Mo; 2. 按照每IOOmg Mq加入200山binding buffer溶液，置于55°C水浴lOmin，每2-3min混 勻一次至凝膠完全融化，呈黃色;加入與Mo等比的100%異丙醇，充分混勻； 3. 將融化的含目的DNA片段的凝膠溶液取S(K)山加入化Bind DNA Mini柱子中，室溫14， 00化pm離屯、Imin,重復(fù)直至全部上柱； 4. 棄收集管中濾液，將柱子套回2ml收集管內(nèi)。轉(zhuǎn)移I(K)山Binding Buffer至柱子中， 14,000 巧m離屯、Imin; 5. 加入700山Wash buffer,靜置5min，14000g離屯、Imin,棄收集管中廢液； 6. 重復(fù)步驟5-次； 7. 棄去管內(nèi)廢液，14000g空管離屯、2min; 8. 將已經(jīng)結(jié)合目的DNA片段的DNA純化柱放入新的1.5ml EP管中，室溫驚干，在純化柱 的膜中屯、加入20-50山預(yù)熱至55°C的無核酶水，室溫靜置2min;室溫1000 Og離屯、Imin，1.5ml EP管內(nèi)收集的液體即為回收目的DNA片段， 9. 取化1測(cè)定濃度后，置-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0022] (四)DENVI病毒祀標(biāo)檢測(cè)片段的克隆與鑒定 將上述切膠純化后的DENVI病毒祀標(biāo)檢測(cè)片段連接進(jìn)祀ASY-Blunt Cloning Vector, 轉(zhuǎn)化hansl-Tl Phage Resis1:ant chemically Competent Cell感受態(tài)細(xì)胞，LB Amp+固體 培養(yǎng)板倒置培養(yǎng)過夜（12-16h);觀察平板中長出白色菌落，挑選白色單克隆菌落接種于LB/ Amp+3mL液體培養(yǎng)基中，37 °C搖菌12-1化;收菌，利用質(zhì)粒提取試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒的提取，進(jìn)一 步W雙酶切和測(cè)序進(jìn)行重組質(zhì)粒的鑒定。結(jié)果:酶切鑒定見圖U右圖），1%瓊脂糖凝膠電泳 30min，155V，可見Lane 2切出預(yù)期大小的片段214bp+68bp=282bp，雙向測(cè)序驗(yàn)證序列正確， 該克隆為陽性重組質(zhì)粒地RD1，保存質(zhì)粒pB畑1和重組甘油菌Tl- pBRDl于-80°C備用。測(cè)序 如下：
實(shí)施例S檢測(cè)DENVI、II、III型的新型質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子及其工程菌菌株的構(gòu)建 新型質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子地mRDl的構(gòu)建示意圖見圖2。如圖所示，所構(gòu)建的新型標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子 作為陽性參照所擴(kuò)增的陽性PCR產(chǎn)物預(yù)期大小為264bp/22化P，將有別于本發(fā)明所構(gòu)建的核 酸檢測(cè)體系應(yīng)用于DENV I-III的病毒標(biāo)本檢測(cè)所獲得病毒祀標(biāo)片段大小214bp/17化P。該 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子一方面能較好地檢測(cè)試劑體系的有效性；另一方面，能簡易自不同的分子量 大小區(qū)分可能因用戶的操作或環(huán)境因素的影響而出現(xiàn)的來自陽性對(duì)照的潛在污染情況。
[0023] 人工改造后的內(nèi)含子mINTRON-X采用Overlapping PCR構(gòu)建插入DENV I病毒株來 源的質(zhì)粒pBRDl 中，大小為50bp，mINTR0N-X序列為AGGTGAGTGCTGGC AAGCAGGTGG GTGTTCGATA GTTTGTTAGG ATGTGT。所設(shè)計(jì)的P-Insed-F和P-Insed-R的具體序列見表1。具 體插入方案：WP-Insed-F和P-OUt-R擴(kuò)增質(zhì)粒pBRDl獲得Frag A 117bp片段；WP-OUt-F 和P-Insed-R擴(kuò)增質(zhì)粒pBRDl獲得化ag B 197bp片段;進(jìn)一步WP-OUt-F和P-OUt-R擴(kuò)增 化agA和FragB的連接片段，即264bp的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子的祀標(biāo)檢測(cè)片段，克隆鑒定后獲得質(zhì)粒 標(biāo)準(zhǔn)分子及其工程菌菌株。具體實(shí)施步驟如下： 化ag A和化ag B的PCR擴(kuò)增 W質(zhì)粒pBRDl為模板，P-Insert-F和P-OUt-R PCR獲得化ag A 117bp，P-〇ut-F和P-Insert-R PCR獲得Rrag B 19化P。
[0024] ?〇?反應(yīng)條件:95°(：預(yù)變性5111111;94°(：變性3〇3,63°(：退火3〇3,72°(：延伸153,30個(gè)循 環(huán);72°C延伸8min。取扣1 PCR產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定，結(jié)果見圖3A和B，擴(kuò)增獲得 預(yù)期117bp和197bp的片段。進(jìn)一步經(jīng)過切膠純化后的片段Frag A和Frag B應(yīng)用于下一步 的連接與擴(kuò)增。
[0025] 反應(yīng)條件如下：98°(：預(yù)變性2111111;98°(：變性1〇3,68°(：退火2〇3,72°(：延伸153，15個(gè) 循環(huán)。
[00%]進(jìn)一步大量擴(kuò)增化ag A+Frag B的拼接片段，反應(yīng)體系如下表中所述，反應(yīng)條件： 98°C 預(yù)變性 2min;98°C 變性 10s，63°C 退火 20s，72°C 延伸 153，15個(gè)循環(huán)，72°(：延伸8111111。取化 1 PCR產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定，結(jié)果見圖3C，獲得預(yù)期264bp大小的祀檢測(cè)片段。
[0027] 新型標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子pBmRDl和重組甘油菌Tl- pBmRDl的構(gòu)建與鑒定 對(duì)264bp產(chǎn)物切膠回收純化后連接進(jìn)祀ASY-Blunt Cloning Vector,轉(zhuǎn)化IYansl-Tl 曲age Resistant chemically Competent Cell感受態(tài)細(xì)胞，LB Amp+固體培養(yǎng)板培養(yǎng)過 夜;挑取單克隆菌落接種于LB/Amp+液體培養(yǎng)基中，37°C搖菌過夜；W試劑盒提取質(zhì)粒，進(jìn)一 步W雙酶切和測(cè)序進(jìn)行重組質(zhì)粒的鑒定。結(jié)果:酶切鑒定見圖3D，Lane 1切出預(yù)期大小的片 段337bp(克隆片段264bp+質(zhì)粒片段73bp)，雙向測(cè)序驗(yàn)證序列正確，該克隆為陽性重組質(zhì)粒 pBmRDl，保存質(zhì)粒pBmRDl和重組甘油菌Tl- pBmRDl于-80°C備用。序列如下所示：
實(shí)施例四DENV特異性核酸檢測(cè)體系的建立與標(biāo)本測(cè)試 巢式PCR檢測(cè)體系的檢測(cè)極限化OD)測(cè)試 將標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子981111?)1梯度稀釋依次為109-10*^(3〇9163/41，^?-〇111斗和?-〇111-尺對(duì) pBm畑1進(jìn)行外巢PCR擴(kuò)增，如圖4A所示外引物對(duì)的LOD為IO4Copies/山，可檢測(cè)到264bp的預(yù) 期大小片段；進(jìn)一步將981111?01分別稀釋至2000(3〇916 3/111，400(3〇916 3/111，80(3〇916 3/111， 16copies/]il，4copies/]il，2copies/]il，Icopies/ul，卵-out-F+P-out-R /P-in-F+P-in-R 巢式PCR體系進(jìn)行測(cè)試，如圖4B所示LOD可達(dá)16copiesAil，檢測(cè)到22加 P預(yù)期大小的祀標(biāo)片 段，呈現(xiàn)較高的敏感性。
[00%]巢式PCR檢測(cè)體系檢測(cè)DENV I病毒分離株的病毒來源片段的體系優(yōu)化 模板選用本實(shí)驗(yàn)室自分離保存的DENV I病毒分離株來源的RNA所逆轉(zhuǎn)錄的cDNA，主要 試劑有：Premix TaqTM(Takapa taq version 2.0 plus dye) 〇
[0029] PCR反應(yīng)條件如下：95°C預(yù)變性5min;94°C變性3〇3,59.9-64.9°(：退火3〇3,72°(：延 伸15s，30個(gè)循環(huán);72 °C延伸Smin。如1 PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定，如圖5A所示：1-6 退火溫度分別為 59.9°(：，61.1°(：，62.1°(：，63.2°(：，64.1°(：，64.9°(：，不同的退火溫度，均能 擴(kuò)增獲得預(yù)期2i4bp的片段，條帶均很亮且沒有拖尾，選ere為后續(xù)檢測(cè)體系中外引物對(duì)擴(kuò) 增時(shí)使用的優(yōu)化退火溫度。進(jìn)一步將外巢擴(kuò)增產(chǎn)物214bp稀釋后作為內(nèi)引物對(duì)擴(kuò)增退火溫 度的優(yōu)化，主要步驟如下：
PCR 反應(yīng)條件:95 °C 預(yù)變性 Smin; 94 °C 變性 30s ,56.9-64.8 °C 退火 30s，72 °C 延伸 15s，30 個(gè)循環(huán)；72°C延伸8min?？跧 PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定，如圖5B所示：1-6退火溫 度分別為56.9°C，58.9°C，59.9°C，61. re，63.2°C，64.8°C，呈示均能獲得預(yù)期17化P的祀標(biāo) 片段，所擴(kuò)增條帶均較亮，選用ere為后續(xù)檢測(cè)體系內(nèi)引物對(duì)的優(yōu)化退火溫度。
[0030] 巢式PCR檢測(cè)體系對(duì)臨床DENV患者血清標(biāo)本和野外白紋伊蚊攜帶DENV的檢測(cè) 采集臨床肥NV患者血清、正常人血清，白紋伊蚊野生種群標(biāo)本，白紋伊蚊實(shí)驗(yàn)室保種品 系標(biāo)本，各類標(biāo)本均W試劑盒提取標(biāo)本總RNA，WP-revl DENV特異性逆轉(zhuǎn)錄引物逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA后，W所構(gòu)建并優(yōu)化的巢式PCR體系進(jìn)行檢測(cè)測(cè)試，如圖6所示，臨床DENV患者血清和 野外白紋伊蚊標(biāo)本均檢出預(yù)期17化P大小的病毒來源祀標(biāo)片段，而陽性參照檢出標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒 分子中設(shè)置的預(yù)期對(duì)照22化P片段，陰性標(biāo)本和空白對(duì)照均呈陰性，所有檢測(cè)陽性標(biāo)本的陽 性檢測(cè)片段，經(jīng)克隆后雙向測(cè)序驗(yàn)證為DENV序列，與本實(shí)驗(yàn)室病毒分離株及國際DENV標(biāo)準(zhǔn) 株的同源性為92-98%;同步克隆陽性對(duì)照的測(cè)序證實(shí)其與構(gòu)建的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子pBm畑1中的 祀標(biāo)片段100%同源。結(jié)果證實(shí)：該體系可用于臨床患者標(biāo)本的檢測(cè)和媒介蚊蟲野生種群 DENV攜帶背景的檢測(cè)，具有良好的敏感性和特異性。
[0031] W上是針對(duì)本發(fā)明的具體說明，但該實(shí)施例并非用W限制本發(fā)明的保護(hù)范圍，凡 未脫離本發(fā)明技藝精神所為的等效實(shí)施或變更，均應(yīng)包含于本發(fā)明的保護(hù)范圍中。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種DENVI-III特異性檢測(cè)靶序列，其特征是，具有SEQIDN0:1所示堿基組成。2. -種包含有權(quán)利要求1所述DENV I-III特異性檢測(cè)靶序列的重組質(zhì)?；蛸|(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分 子或標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或工程菌菌株。3. -種針對(duì)權(quán)利要求1所述特異性檢測(cè)靶序列的DENV I-III特異性檢測(cè)試劑盒，其特 征是，主要包括有：堿基組成為SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3構(gòu)成的巢式PCR外引物對(duì)、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5構(gòu)成的巢式PCR內(nèi)引物對(duì)，以及由SEQ ID NO:6所示堿基構(gòu)成的逆轉(zhuǎn) 錄引物。
【文檔編號(hào)】C12R1/93GK105861742SQ201610155973
【公開日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2016年3月17日
【發(fā)明人】周曉紅, 陳曉光, 謝甜, 謝郁, 劉轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)
【申請(qǐng)人】南方醫(yī)科大學(xué)