生存素導(dǎo)向的癌癥疫苗治療的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及治療有效的截短的生存素及其作為疫苗在脂質(zhì)體制劑中的治療應(yīng)用，其中所述生存素片段優(yōu)選是葡萄糖酸化的(gluconoylated)，并且所述脂質(zhì)體制劑引發(fā)體內(nèi)抗腫瘤活性。更具體地，本發(fā)明涉及一種癌癥疫苗，其包含人生存素的片段，該片段與脂質(zhì)佐劑聯(lián)合特別有效。更具體地，本發(fā)明涉及脂質(zhì)體疫苗遞送系統(tǒng)，該系統(tǒng)包含有活性的截短的生存素分子作為腫瘤抗原，和手性陽(yáng)離子脂質(zhì)(例如R?DOTAP)作為佐劑，其為該脂質(zhì)體制劑的部分，其中，所述脂質(zhì)體藥物遞送系統(tǒng)在其脂質(zhì)和佐劑組分、物理或物理化學(xué)參數(shù)，和釋放的截短的生存素分子的最終療效方面得到最優(yōu)化。最后，本發(fā)明涉及一種提高體內(nèi)CD4+/CD8+T細(xì)胞應(yīng)答，由此得到提高的抗腫瘤活性的方法，所述方法通過提供包含所述截短的優(yōu)選葡萄糖酸化的生存素的脂質(zhì)體制劑進(jìn)行。
【專利說明】
生存素導(dǎo)向的癌癥疫苗治療
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及治療有效的截短型生存素（survivin)及其作為疫苗在脂質(zhì)體制劑中 的治療應(yīng)用，其中所述生存素片段優(yōu)選是葡萄糖酸化的（gluconoylated)，并且所述脂質(zhì)體 制劑引發(fā)體內(nèi)抗腫瘤活性。更具體地，本發(fā)明設(shè)及一種癌癥疫苗，其包含人生存素的片段， 該片段與脂質(zhì)佐劑聯(lián)合特別有效。更具體地，本發(fā)明設(shè)及脂質(zhì)體疫苗遞送系統(tǒng)，該系統(tǒng)包含 截短型生存素分子作為腫瘤抗原，和手性陽(yáng)離子脂質(zhì)(例如R-D0TAP)作為佐劑，其為該脂質(zhì) 體制劑的部分，其中，所述脂質(zhì)體藥物遞送系統(tǒng)在其脂質(zhì)和佐劑組分、物理或物理化學(xué)參 數(shù)，和釋放的截短型生存素分子的最終療效方面得到最優(yōu)化。最后，本發(fā)明設(shè)及一種提高體 內(nèi)CD4VCD8+T細(xì)胞應(yīng)答，由此得到提高的體內(nèi)抗腫瘤活性的方法，所述方法通過提供包含所 述截短的優(yōu)選葡萄糖酸化的生存素的脂質(zhì)體制劑進(jìn)行。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 調(diào)亡是細(xì)胞自毀的遺傳程序，已經(jīng)表明調(diào)亡的抑制是通過延長(zhǎng)細(xì)胞的生命周期 (運(yùn)有利于轉(zhuǎn)化突變的累積)的癌癥形成中設(shè)及的重要機(jī)制。
[0004] 生存素，一種抑制細(xì)胞調(diào)亡并屬于調(diào)亡蛋白的抑制劑（IAP)家族的蛋白質(zhì)，于1997 年被Al tier i及其同僚發(fā)現(xiàn)并表征（參見例如WO 98/22589 ; Ambros ini等，Nature Medicine.917-921,1997;Adida等，American Journal of Pathology,152,43-49,1998; Cirino等,J Clinical Investigations,99,2446-2451,1997;Adida等,The Lancet,351, 882-883,1998)O
[0005] 生存素(survivin)是16.5kDa的胞質(zhì)蛋白，其包含單一BIR和高度荷電的簇基末端 卷曲區(qū)域，而不是RING指，其在B細(xì)胞前體中轉(zhuǎn)換時(shí)抑制由生長(zhǎng)因子（化-3)抽回 (WitMrawal)所誘導(dǎo)的調(diào)亡。生存素在多種實(shí)體瘤和血液惡性病中過表達(dá)，同時(shí)顯示在最 終分化的成人組織中具有有限的表達(dá)。已在人轉(zhuǎn)錄組中鑒定出約40個(gè)基因，其在全部癌癥 中但不在附近正常組織中過表達(dá)。在運(yùn)40個(gè)基因中，生存素基因（BIR巧)被鑒定為人癌癥中 第四最常見的過表達(dá)腫瘤相關(guān)抗原(Velcules州等，Nat Genet 23(4) :387-8,1999)。
[0006] 生存素是142個(gè)氨基酸(aa)的蛋白質(zhì)，其由Birc5基因（調(diào)亡基因抑制劑家族的成 員)編碼。人生存素的氨基酸序列由沈Q ID NO: 1表示
[0007] N--MGAP化PPAW QPFLKDHRIS TFKNWPFLEG CACWERMAE AGFIHCPTEN EPDLAQCFFC
[0008] FKELEG肥PD 孤PI邸服KH SSGCAFLSVK KQF邸LTLGE FLKLDRERAK NKIAKETNNK
[0009] 邸EF邸TAKK VRRAIE化AA MD-C.
[0010] 大多數(shù)人類癌癥中，生存素的過表達(dá)表明腫瘤進(jìn)展中的調(diào)亡抑制的一般作用，運(yùn) 是由如下觀察結(jié)果證實(shí)的概念:在結(jié)腸直腸和膀脫癌W及成神經(jīng)細(xì)胞瘤的情況中，生存素 的表達(dá)與不利預(yù)后相關(guān)聯(lián)。相反，在正常成人組織中檢測(cè)不到生存素。運(yùn)些特點(diǎn)使生存素有 資格作為合適的TAA，用于診斷和治療目的。
[0011] 生存素在大多數(shù)人類癌癥中高度過表達(dá)，包括結(jié)腸直腸癌(67%)、非小細(xì)胞肺癌 (96%)、乳腺癌(90%)、前列腺癌(83%)、腎細(xì)胞癌(79%)、卵巢癌(87%)、膀脫癌(88%)、 子宮內(nèi)膜癌(83%)等。在全部上述那些腫瘤中，生存素表達(dá)的增加與較差的臨床結(jié)果相關(guān)。
[0012] 癌癥中生存素蛋白的表達(dá)與較差預(yù)后、診斷時(shí)晚期疾病、對(duì)于治療的較高級(jí)別的 抗性，和較高復(fù)發(fā)率相關(guān)聯(lián)。生存素在確定細(xì)胞分裂和調(diào)亡之間的平衡方面具有多種功能。 首先，生存素 W細(xì)胞周期依賴性方式(G2-M檢驗(yàn)點(diǎn)）表達(dá)，并且顯示與有絲分裂紡鍵體相互 作用W促進(jìn)細(xì)胞周期的進(jìn)展。第二，生存素通過干擾脫冬酶-9加工和下游效應(yīng)物脫冬酶(例 如，脫冬酶-3)的活化，由此抑制線粒體調(diào)亡通路，來抑制調(diào)亡。第=，在細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)過程 中，生存素與分子伴侶熱激蛋白90相互作用，W促進(jìn)細(xì)胞存活。癌癥中生存素的過表達(dá)，W 及其在促進(jìn)癌細(xì)胞的存活和持續(xù)生長(zhǎng)方面的胞內(nèi)作用，使得生存素成為免疫治療的一個(gè)具 有吸引力的目標(biāo)。此外，已在腫瘤微環(huán)境中的增殖內(nèi)皮細(xì)胞中鑒定到生存素表達(dá)，運(yùn)顯示了 治療型疫苗接種的另一個(gè)目標(biāo)。
[0013] 隨著對(duì)于"免疫系統(tǒng)在生物學(xué)表現(xiàn)和癌癥發(fā)展中起主要作用"的理解的遞增，人們 對(duì)于"在癌癥治療中采用疫苗接種"的概念產(chǎn)生了興趣。癌癥疫苗開發(fā)的過程從對(duì)于抗原、 制劑和免疫方案的選擇到對(duì)其效果的評(píng)估。與預(yù)防性疫苗(其通常旨在產(chǎn)生高水平的保護(hù) 性抗體)不同，治療性疫苗旨在引發(fā)有力的T細(xì)胞應(yīng)答，其能夠介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的毀滅或至少 停止其生長(zhǎng)。治療性疫苗開發(fā)過程中的首要挾擇是關(guān)于待用的抗原類型。目前已鑒定了數(shù) 百種T細(xì)胞限定的腫瘤抗原。第二挾擇有關(guān)將抗原遞送至免疫系統(tǒng)的載劑的選擇。存在的相 對(duì)較大多樣的可能性包括裸DNA、mRNA、重組蛋白、合成的膚、重組病毒或細(xì)菌載體或樹突細(xì) 胞(其離體荷載抗原）。本發(fā)明一般設(shè)及基于蛋白質(zhì)的治療性癌癥疫苗，并且具體設(shè)及生存 素導(dǎo)向的癌癥疫苗。
[0014] 許多治療性的、基于蛋白質(zhì)或基于膚的癌癥疫苗的策略是將腫瘤抗原優(yōu)先遞送至 適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的主要組織相容性復(fù)合物類物質(zhì)，運(yùn)隨后誘導(dǎo)能夠W抗原特異性方 式識(shí)別和裂解腫瘤細(xì)胞的抗原特異性CD8+T細(xì)胞。運(yùn)在基于膚的疫苗中通過下述方法得W 實(shí)現(xiàn):采用引發(fā)來自CD4+輔助T細(xì)胞的不充分的細(xì)胞因子支持的可能限制，將抗原性庫(kù)限制 至MHC I類膚。在過去十年間，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了由生存素衍生的相當(dāng)大量的MHC I/II類膚(參見 例如US 6,245,523;EP 2 092 938;和EP 2 359 841)。運(yùn)些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)力表明，生存素作為腫瘤 排斥抗原前體，TRAP，其由細(xì)胞加工成具有TRA功能性的膚。然而，相應(yīng)的生存素衍生的9-至 15-聚體膚的免疫原性通常低于全長(zhǎng)生存素。
[0015] 在治療性癌癥疫苗中，將全長(zhǎng)腫瘤抗原呈遞給免疫系統(tǒng)的好處之一在于，可能在 接種疫苗的宿主中誘導(dǎo)加強(qiáng)的體液W及CD4+和CD8+T細(xì)胞應(yīng)答(Davis等，PNAS 101(29): 10697-702,2004)。先前已經(jīng)報(bào)道了采用基于生存素膚的DC疫苗在腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤的臨床前 模型中勒!向CD4+和CD8+T細(xì)胞表位的治療益處(Ciesielski等,Cancer Immunol Immunother 57(12):1827-35,2008)。
[0016] 膚和重組蛋白質(zhì)本身的免疫原性通常較差，因此需要將其與佐劑聯(lián)合給予。佐劑 的作用是至少兩倍。一方面，佐劑在足W允許充分引發(fā)T細(xì)胞應(yīng)答的時(shí)間長(zhǎng)度中將抗原遞送 至免疫系統(tǒng)。另一方面，佐劑觸發(fā)樹突細(xì)胞的活化和成熟。因此，載有抗原的DC遷移至附近 的淋己結(jié)，并獲得W最優(yōu)方式呈遞抗原用于重新起始T細(xì)胞應(yīng)答的能力。前一項(xiàng)佐劑功能可 通過多種試劑滿足，例如礦物油，用于乳液形成(不完全弗氏佐劑）、脂質(zhì)體或生物可降解的 微球。目前可用于人類的佐劑相對(duì)較少。運(yùn)些包括明抓和MF59。然而，越來越多的分子限定 的佐劑出現(xiàn)于臨床開發(fā)中，并用于癌癥疫苗接種的臨床試驗(yàn)中。運(yùn)些包括各種合成的或重 組TLR配體、礦物油，例如蒙塔尼(mon化nide)、皂巧類，甚至脂質(zhì)體。
[0017]用于癌癥疫苗接種且包含陽(yáng)離子脂質(zhì)和疫苗佐劑(R，S D0TAP(1，2-二油酷基-3-S甲基錠丙烷））的脂質(zhì)體納米顆粒已被建立成用于DNA、膚和蛋白質(zhì)的有效遞送系統(tǒng)。作為 脂質(zhì)組分和佐劑應(yīng)用的其它陽(yáng)離子脂質(zhì)有：0514?、0114?、0004?、0048、3,8 001]^、尺-DOTMA、S-DOTMA、R，S DOEPC、R-DOEPC和S-DOEPC。DOTAP在脂質(zhì)體制劑中的應(yīng)用提供了凈正 表面電荷，其被報(bào)道能夠促進(jìn)納米顆粒和APC之間的相互作用(Foged等，Int J化arm 298 (2): 315-22，2005)。此外，DOTAP促進(jìn)樹突細(xì)胞成熟，由此增強(qiáng)抗原交叉呈遞，運(yùn)通過反應(yīng)性 氧物質(zhì)(ROS)介導(dǎo)的機(jī)制發(fā)生(參見化n等，J Control Release 130(1) :22-8.2008)。
[001引最近顯示，W其分開的對(duì)映異構(gòu)體形式（例如R-DOTAP和S-D0TAP)使用的，包含手 性陽(yáng)離子脂質(zhì)作為脂質(zhì)組分和佐劑的脂質(zhì)體制劑在放大對(duì)于抗原的免疫應(yīng)答，W及甚至在 誘導(dǎo)、活化和導(dǎo)向性地調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答方面格外地有效（參見例如WO 2009/129227和WO 2013/039989)。
[0019] 脂質(zhì)體是公認(rèn)的藥物遞送載劑。它們是微小的、納米顆粒大小的、封閉的載劑，其 包封通過包含憐脂(優(yōu)選是組成細(xì)胞膜的憐脂部分）的雙層膜與外部介質(zhì)分隔的內(nèi)部水性 空間。脂質(zhì)體的結(jié)構(gòu)與細(xì)胞的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)高度相似。它們也相對(duì)具有生物相容性。脂質(zhì)體體現(xiàn) 將藥物遞送至身體中希望的目標(biāo)并降低系統(tǒng)毒性的潛力。因此，在改善的制劑和更好的祀 向策略將獲得更高的治療方面存在越來越多的興趣。脂質(zhì)體可基于尺寸、形貌、組成、制備 方法和功能而廣泛分類。簡(jiǎn)言之，W尺寸來看，脂質(zhì)體W兩種常見類別存在：小單層載劑 (SUV)和大單層載劑化UV)dSUV的尺寸范圍通常在20nm-100nm。尺寸范圍在10化m-20化m的 中間單層載劑（IUV)被視為在SUV之間。SUV是單殼載劑，優(yōu)選通過高強(qiáng)度超聲處理產(chǎn)生。親 水性藥物被捕獲在內(nèi)部水性核屯、中，而疏水性藥物被捕獲在雙層膜中。
[0020] 如前所述，已證明脂質(zhì)體制劑作為藥物遞送載劑的多項(xiàng)益處。然而，因?yàn)樗鼈兊陌?封率低，它們必須用于攜載極強(qiáng)力的藥物?；谥|(zhì)的載劑還面臨若干其它困難，例如，在 血流中不穩(wěn)定、許多藥物在脂質(zhì)/表面活性劑溶液中溶解性差、膽存穩(wěn)定性差，和藥物的快 速突釋。脂質(zhì)體制劑也與嚴(yán)重副作用相關(guān)聯(lián)，因?yàn)槠鋾?huì)在皮膚組織中的累積。因此，2012年， 僅12種采用脂質(zhì)體遞送系統(tǒng)的藥物獲得許可，還有五種其它脂質(zhì)體藥物處于臨床試驗(yàn)中。
[0021] 因此，目前十分需要提供高度有效且穩(wěn)定的脂質(zhì)體抗原遞送系統(tǒng)，其能夠釋放需 要在體內(nèi)引發(fā)希望的增強(qiáng)免疫應(yīng)答的選定的抗原，所述免疫應(yīng)答通過高度有效的佐劑的存 在而被加強(qiáng)。
[0022] 生存素是有利的癌癥疫苗候選物，出于如下原因，其具有用于持久腫瘤特異性免 疫應(yīng)答的潛力，和有利的安全性能：
[0023] ?在終末分化的正常組織中低表達(dá)。
[0024] ?在各種癌癥類型中高表達(dá)。
[0025] ?表達(dá)與晚期級(jí)別和治療抗斥相關(guān)聯(lián)。
[0026] ?調(diào)亡抑制劑。
[0027] ?促進(jìn)細(xì)胞分化和遷移/轉(zhuǎn)移。
[00%] ?促進(jìn)腫瘤微環(huán)境中的血管生成。
[0029] ?設(shè)及細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)。
[0030] 因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是，提供用于生存素導(dǎo)向的癌癥治療的脂質(zhì)體制劑，其至 少在強(qiáng)佐劑DOTAP或結(jié)構(gòu)類似的手性陽(yáng)離子脂質(zhì)的存在下，于體內(nèi)穩(wěn)定且充分有效。
[0031] 待解決的問題之一必定是抗原與佐劑關(guān)于其不同的永久凈電荷(R-DOTAP的正凈 電荷，和生存素的負(fù)凈電荷）的固有不相容性，運(yùn)導(dǎo)致穩(wěn)定性降低。另一個(gè)問題是各制劑中 的生存素的體內(nèi)免疫原性不足。
[0032] 通過本發(fā)明對(duì)于脂質(zhì)體制劑的脂質(zhì)組分的選擇、生存素結(jié)構(gòu)/序列的調(diào)節(jié)，和多種 物理化學(xué)參數(shù)(例如粒徑、抗原荷載、脂質(zhì)組分和DOTAP的濃度和含量）的最優(yōu)化，上述問題 能夠得到解決。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0033] 在脂質(zhì)體制劑中采用全長(zhǎng)生存素的嘗試顯示，運(yùn)些顆粒具有不盡如人意的生物物 理蛋白質(zhì)性質(zhì)?？傊?，當(dāng)與D0TAP，本發(fā)明的優(yōu)選佐劑混合時(shí)，能夠觀察到缺乏穩(wěn)定性的生存 素（圖1、圖2)。
[0034] 驚人地發(fā)現(xiàn)，通過采用C末端截短型生存素，能夠解決穩(wěn)定性問題。將生存素 C末端 截短能使該蛋白質(zhì)在溶液中穩(wěn)定，運(yùn)通過移除誘導(dǎo)蛋白質(zhì)在溶液中沉淀的疏水片來實(shí)現(xiàn)。 蛋白質(zhì)被加工成膚并呈遞至免疫系統(tǒng)的能力不需要對(duì)于蛋白質(zhì)的部分的生物活性-僅在與 抗原呈遞細(xì)胞的蛋白體復(fù)合物接觸之前需要結(jié)構(gòu)完整性。在本發(fā)明的一個(gè)方面中，C末端截 短型生存素在生物學(xué)上仍有活性且有效。
[0035] 因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是，提供C末端截短的形式，其由全長(zhǎng)生存素 (SEQ ID NO: 1)的1-119、1-120、1-121、1-122、1-123、1-124、1-125、1-126、1-127、1-128、1-129、1-130、 1 -131、1 -132、1 -133氨基酸殘基組成，自N末端計(jì)算。
[0036] 因?yàn)樯锕こ谈脑觳呗裕诒景l(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，第一個(gè)甲硫氨酸殘基可被 切割去除，提供如下截短型生存素 ：SEQ ID N0:1的2-119、2-120、2-121、2-122、2-123、2-124、2-125、2-126、2-127、2-128、2-129、2-130、2-131、2-132或2-133。
[0037] 在包含例如DOTAP(優(yōu)選R-D0TAP)作為脂質(zhì)佐劑的脂質(zhì)體制劑中，與全長(zhǎng)生存素相 比，上述運(yùn)些生存素短型序列全部顯示的改善的生物-物理性質(zhì)，同時(shí)發(fā)揮相似的藥理學(xué)性 質(zhì)，其各自與142個(gè)氨基酸殘基序列(SEQ ID N0:1)代表的全長(zhǎng)生存素相比。
[0038] 因此，本發(fā)明設(shè)及如下截短型生存素氨基酸序列： MGAP化PPAW QP化做服IS T邱層P化EG CACT陽(yáng)RMAE AGFiHCPTEN E抑LAQCFFC
[0039] F'腿LEGWE即腳PI魄服冊(cè)SSGC抑LSVK蝴F跑L化邸FLKL蛾邸地服IA陸T投NK
[0040] (SEQ ID N0:2):該序列的Gly2-K120序列部分在本發(fā)明中稱作本發(fā)明的藥物物 質(zhì)，或"dC-生存素藥物物質(zhì)"，并且與SEQ ID NO: 3的序列部分1-119相同。
[0041 ] GAP化PPAW QPFLKDHRIS TFKNWPFLEG CACWERMAE AGFIHCPTEN EPDLAQCFFC
[0042] FKELEG肥PD 孤PI邸服KH SSGCAFLSVK KQF邸LTLGE FLKLDRERAK NKIAKETNNK
[0043] (SEQ ID N0:3):該序列的Glyl-Klig序列部分在本發(fā)明中稱作本發(fā)明的藥物物質(zhì) 或dC-生存素，并且與SEQ ID N0:2的序列部分2-120相同。
[0044] 本發(fā)明優(yōu)選設(shè)及由全長(zhǎng)生存素的前120個(gè)N末端氨基酸殘基組成的截短型生存素， 其中優(yōu)選刪去位置1上的甲硫氨酸殘基(SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:3)。
[0045] 更驚人地發(fā)現(xiàn)，如上所述的截短型生存素，在葡萄糖酸化至某一程度時(shí)，與截短的 非葡萄糖酸化的生存素相比，能夠引發(fā)顯著改善的體內(nèi)藥理學(xué)性質(zhì)。
[0046] 因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是，提供一種C末端截短型生存素，其由SEQ ID No. 1代表 的全長(zhǎng)人生存素的前118-122個(gè)N末端氨基酸組成，或由與所述截短型生存素具有>90%，優(yōu) 選〉91%、〉92%、〉93%、〉94%、〉95%、〉96%、〉97%、〉98或>99% 的同源性且引發(fā)相同或幾 乎相同的生物活性的序列組成，其中所述截短型生存素在一個(gè)或多個(gè)位置處被葡萄糖酸 化。
[0047] 在一個(gè)特定方面，本發(fā)明設(shè)及C末端截短型生存素，其由SEQ ID NO: 1所代表的全 長(zhǎng)人生存素的前118-133個(gè)N末端氨基酸組成，或與所述截短型生存素具有>90 %的同源性 的序列，其中，所述截短型生存素在一個(gè)或多個(gè)位置處葡萄糖酸化。在一個(gè)優(yōu)選方面中，所 述C末端截短型生存素發(fā)揮相同的生物活性。
[0048] 本發(fā)明具體設(shè)及由全長(zhǎng)人生存素的前120個(gè)N末端氨基酸組成的相應(yīng)的C末端截短 型生存素;所述截短型生存素由氨基酸序列(SEQ ID N0:2)代表：
[0049] 鵬俾化？城W OPFL邸釀IS 邱猜巧LEGCAG件靴MAE A睞I恥PTEN E抑LAQ鄭FC 邱趾晚備PI) I3DPIE瑣跋杜親描AFLSM K臘郎LTL組化化孤煎A反MIA紙了脯肛，
[0050] 其中所述截短型生存素在一個(gè)或多個(gè)位置處葡萄糖酸化。
[0051 ]在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，至少在SEQ ID N0:2或如上所述的相應(yīng)的118-122個(gè)氨基酸殘基序列的位置2處的甘氨酸殘基被葡萄糖酸化。
[0052]本發(fā)明具體設(shè)及相應(yīng)的截短型生存素，其中，位于N末端位置1處的甲硫氨酸殘基 被移除(通常在蛋白質(zhì)表達(dá)步驟之后）；所述截短型生存素由氨基酸序列（SEQ ID N0:3)代 表：
[005；3] GAP化PPAW QPFLKDHRI S TFKNWPFLEG CACWERMAE AGFIHCPTEN EPDLAQCFFC
[0054] FKELEG肥PD 孤PI邸服KH SSGCAFLSVK KQF邸LTLGE FLKLDRERAK NKIAKETNNK
[0055] 其中所述截短型生存素在一個(gè)或多個(gè)位置處葡萄糖酸化。
[0056] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，至少在SEQ ID N0:3或相應(yīng)的118-122個(gè)氨基酸 殘基序列的位置1處的甘氨酸殘基被葡萄糖酸化。
[0057] 發(fā)明人已顯示，如果在本發(fā)明的截短型生存素的賴氨酸殘基處進(jìn)行葡萄糖酸化 (gluconoyIation)，能夠進(jìn)一步改善有利的性質(zhì)。優(yōu)選地，SEQ ID NO: 2的位置23和103處的 賴氨酸殘基，和SEQ ID NO:3的位置22和103處的賴氨酸殘基，可分別被葡萄糖酸化，優(yōu)選通 過葡糖酸-1,5-內(nèi)醋進(jìn)行，但原則上也可采用其它葡糖酸化試劑。因此，本發(fā)明的一個(gè)目的 在于，提供一種相應(yīng)截短的葡萄糖酸化的生存素，其中所述葡萄糖酸化在賴氨酸殘基處額 外地進(jìn)行，所述賴氨酸殘基優(yōu)選是位于SEQ ID N0:2的位置23和/或位置103處，或位于SEQ ID NO:3的位置22和/或102處的賴氨酸殘基。
[005引驚人地發(fā)現(xiàn)，如果對(duì)應(yīng)組合物中并非所有的截短型生存素分子均被葡萄糖酸化， 則由本發(fā)明的脂質(zhì)體制劑產(chǎn)生的體內(nèi)藥理學(xué)數(shù)據(jù)尤其有利，特別是關(guān)于活化的CD4+和/或 CD8+T細(xì)胞應(yīng)答的體內(nèi)藥理學(xué)數(shù)據(jù)。具體而言，40%的葡萄糖酸化獲得了最為平衡的生存素 特異性CD4+和CD8+T細(xì)胞應(yīng)答。較高水平的葡萄糖酸化優(yōu)先參與CD8+T細(xì)胞應(yīng)答，運(yùn)WCD4+輔 助T細(xì)胞支持為代價(jià)。因此，本發(fā)明的一個(gè)目的在于，提供一種生存素組合物，其包含如上所 述的截短型生存素，和相應(yīng)的非葡萄糖酸化的截短型生存素，其中在所述組合物中，該截短 型生存素的所述組合物中的10-80%，優(yōu)選10-60%，更優(yōu)選35-45%，最優(yōu)選約40%的截短 型生存素分子被葡萄糖酸化。
[0059] 本發(fā)明的截短型生存素的葡萄糖酸化提供如下優(yōu)勢(shì)：
[0060] 合成的葡萄糖酸化允許提供寬修飾范圍，允許對(duì)其藥理學(xué)益處進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)價(jià)。
[0061] 建立的方案為設(shè)計(jì)高效且高性價(jià)比的方法提供了基礎(chǔ)。
[0062] (截短型）生存素的葡萄糖酸化提高了本發(fā)明的治療性截短型生存素作為腫瘤 疫苗的抗原性和功效。
[0063] 認(rèn)為本發(fā)明的截短型生存素的合成葡萄糖酸化是一種優(yōu)化，其在克服與宿主細(xì) 胞葡萄糖酸化相關(guān)聯(lián)的主要不利條件的方面具有潛力。
[0064] 本發(fā)明的生存素可W是糖基化(glycosylated)的或非糖基化的。優(yōu)選地，它是非 糖基化的，并且由細(xì)菌系統(tǒng)(如大腸桿菌)制造。
[0065] 如上所述，本發(fā)明的主要目的是提供一種脂質(zhì)體制劑，其在疫苗接種后于體內(nèi)產(chǎn) 生生存素或生存素樣活性，其中所述脂質(zhì)體制劑在不同物理和藥理學(xué)參數(shù)方面被優(yōu)化，并 且包含十分有效的免疫刺激劑和佐劑DOTAP，優(yōu)選其手性組分R-DOTAP，或類似的手性脂質(zhì) 佐劑，例如R-或S-DOTMA或R，S D0EPC。因此，本發(fā)明的目的在于，提供一種脂質(zhì)體制劑，其包 含：
[0066] (i)截短型，優(yōu)選葡萄糖酸化的生存素，如上所述，例如SEQ ID N0:2的包含120個(gè) 氨基酸殘基的序列，或SEQ ID N0:3的包含119個(gè)氨基酸殘基的序列，或具有>90%，優(yōu)選〉 95%的序列同源性的相應(yīng)的經(jīng)修飾的序列，或者，相應(yīng)的截短型生存素的生存素組合物，其 中該截短型生存素分子的10-60%，優(yōu)選35-45%被葡萄糖酸化，如上所述，和
[0067] (ii)至少一種佐劑，其中所述至少一種佐劑是具有免疫調(diào)節(jié)劑作用的手性陽(yáng)離子 憐脂，優(yōu)選選自下組：R，S DOTAP、R-DOTAP、S-DOTAP、R，S DOTMA、R-DOTMA、S-DOTMA、R，S DOEPC、R-DOEPC和S-DOEPC。
[0068] 發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，如果W2-8mM，優(yōu)選3-5mM，且最優(yōu)選約4mM的濃度施加，尤其但不限 于，聯(lián)合脂質(zhì)體制劑中的R-DOTAP施加，上述手性陽(yáng)離子佐劑脂質(zhì)特別有效。脂質(zhì)體制劑中 脂質(zhì)佐劑的含量可變化，但有趣的是，15-30% (mol/mol)的含量產(chǎn)生藥理學(xué)功效方面的最 佳結(jié)果。
[0069] 發(fā)明人還顯示，除手性陽(yáng)離子脂質(zhì)的存在W外，脂質(zhì)組合物的質(zhì)和量在本發(fā)明的 脂質(zhì)體制劑的有利性質(zhì)方面也起重要作用。
[0070] 因此，本發(fā)明的另一個(gè)目的在于，提供一種脂質(zhì)體制劑，其基于截短型生存素和至 少一種手性陽(yáng)離子脂質(zhì)佐劑，例如D0TAP，如上所述，其包含膽固醇和選自下組的至少一種 憐脂:卵憐脂(PC)、憐酸乙醇胺(PE)，和憐酸甘油(PG)。
[0071] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，憐脂是選自下組的卵憐脂（PC):DLPC、DSPC、 0口口(：、01?(：、00?(：、6?(：和6?〔3。如下所示，蛋卵憐脂巧?〇(其為不同？(：的粗混物)是最為優(yōu)選 的，因?yàn)橄噍^于其它憐脂酷膽堿(例如DMPC)，其顯示最顯著的作用（例如，對(duì)于CD8+觸發(fā)的 體內(nèi)應(yīng)答）。不過，對(duì)于本發(fā)明的脂質(zhì)體組合物的制備，也可采用并測(cè)試其它已知的憐脂。
[0072] 本發(fā)明的脂質(zhì)體制劑可包含如下含量的膽固醇：10-60% (mol/mol )，優(yōu)選20-45%，更優(yōu)選30-45%，最優(yōu)選45%，和如下含量的上述卵憐脂(PC) :30-80% (mol/mol)，優(yōu) 選30-50%，最優(yōu)選約35%含量的EPC。
[0073] 本發(fā)明的脂質(zhì)體制劑包含介于40nm和500nm的不定尺寸的納米顆粒。優(yōu)選的脂質(zhì) 體組合物包含脂質(zhì)體顆粒，其中至少70%的顆粒，優(yōu)選至少80%的顆粒，的尺寸為50- 500皿，優(yōu)選100-300皿，最優(yōu)選150-25化m，因?yàn)檫\(yùn)些顆粒產(chǎn)生物理和生物性質(zhì)方面的最有 利結(jié)果。
[0074] 還顯示，當(dāng)依賴于抗原荷載的顆粒表面電荷>17mV，所述抗原荷載根據(jù)本發(fā)明是 0.5 -1.5mg/mL，優(yōu)選0.75 -1. Omg/mL時(shí)，能夠獲得尤其有利的結(jié)果。正表面電荷K電位)能增 強(qiáng)含DOTAP的脂質(zhì)體納米顆粒的免疫和抗腫瘤活性。
[0075] 根據(jù)上文可見，脂質(zhì)體納米顆粒的全部相關(guān)參數(shù)和組分均經(jīng)調(diào)節(jié)W獲得最優(yōu)化的 脂質(zhì)體制劑，其獲得較為驚人的性質(zhì)，并且在本發(fā)明中稱為本發(fā)明的藥物產(chǎn)品，或"dc-生存 素藥物產(chǎn)品"。
[0076] 因此，本發(fā)明的特定目的是，提供一種相應(yīng)的脂質(zhì)體制劑，其包含：
[0077] (i)截短型（葡萄糖酸化的）生存素和截短型生存素的組合物，所述截短型生存素 如上文和權(quán)利要求中所述，優(yōu)選SEQ ID NO:2或3的序列，
[007引 （i i)脂質(zhì)組分R-DOTAP、膽固醇和EPC，
[0079] (i i i)該制劑中的R-DOTAP濃度是3 - 5mM，
[0080] (iv)脂質(zhì)體顆粒，其中至少70%具有150-250nm的粒徑，和
[0081 ] (v)0.5mg/mL( ±0.1 mg/mL)的抗原荷載。
[0082] 在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述藥物產(chǎn)品由如下參數(shù)表征：
[0083] (i)葡萄糖酸化、非葡萄糖酸化的截短型生存素，其由SEQ ID N0:3代表，其中，約 40% (±2-5%，優(yōu)選±5%)的所述截短型生存素被葡萄糖酸化，和
[0084] Qi)所述脂質(zhì)組合物的含量為：10-30%，優(yōu)選約20% (±1%)R-D0TAP; 25-55%， 優(yōu)選約45%(±1%)膽固醇;和30-60%，優(yōu)選約35%(±1% 化PC(mol/mol)。
[0085] 本發(fā)明的脂質(zhì)體制劑的脂質(zhì)體顆粒，優(yōu)選憐脂組分可通過標(biāo)準(zhǔn)方法被PEG化。本發(fā) 明的運(yùn)些PEG化的脂質(zhì)顆粒顯示增強(qiáng)的穩(wěn)定性，和該制劑對(duì)于低鹽濃度的敏感性降低方面 的強(qiáng)趨勢(shì)，由此顯著影響并改善了蛋白質(zhì)或制劑的沉淀。然而，相較于非PEG化的顆粒，本發(fā) 明的PEG化的脂質(zhì)體制劑驚人地獲得較低的體內(nèi)功效(CD47CD8+T細(xì)胞應(yīng)答和抗腫瘤活性）。 然而，可根據(jù)本發(fā)明來采用脂質(zhì)顆粒的PEG化，W調(diào)節(jié)有需求的患者(尤其是具有過度反應(yīng) 的免疫應(yīng)答的個(gè)體）中的免疫應(yīng)答。因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種脂質(zhì)體制劑或疫苗 組合物，如上文和下文所述的，其中所述脂質(zhì)體顆粒經(jīng)PEG化，優(yōu)選介于0.5%和5% (mol/ mol總脂質(zhì)含量)之間。
[0086] 本發(fā)明還設(shè)及本發(fā)明的脂質(zhì)體和疫苗制劑，其出于膽存目的被凍干。介于2.0-2.5%(w/v)的低濃度薦糖的存在能使制劑充分穩(wěn)定化而不影響凍干制劑的藥理學(xué)功效。本 發(fā)明的制劑還可包含抗氧化劑，優(yōu)選一硫代甘油(MTG)，用于保護(hù)不受氧化破壞。
[0087] 如上下文所述的脂質(zhì)體和疫苗制劑根據(jù)本發(fā)明用于制備疫苗組合物，所述疫苗組 合物旨在用于疫苗接種治療。
[0088] 因此，本發(fā)明的一個(gè)目的在于，提供一種免疫刺激性疫苗，其包含如上下文所述的 脂質(zhì)體制劑，其還可包含運(yùn)載體、賦形劑、添加劑、稀釋劑、其它免疫增強(qiáng)劑或免疫效應(yīng)物分 子。
[0089] 本發(fā)明的疫苗組合物與其它治療有效的藥物聯(lián)合或分開使用（同時(shí)或依次給予）， 所述其它治療有效的藥物例如，抗腫瘤劑和/或其它治療形式，例如福照。
[0090] 在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述脂質(zhì)體疫苗制劑與化療劑(例如環(huán)憐酷胺、卡銷，或 紫杉醇)聯(lián)合，或與抗腫瘤抗體或抗體-細(xì)胞因子融合蛋白（例如NHS-IL12)聯(lián)合，如下所述。 運(yùn)些組合顯示增強(qiáng)的體內(nèi)功效(圖21-24)。因此，更具體地，本發(fā)明的進(jìn)一步目的是，提供一 種藥物組合物，其包含脂質(zhì)體制劑或免疫刺激性疫苗組合物，在本文所述的每種情況中，聯(lián) 合選自下組的抗腫瘤劑:環(huán)憐酷胺、卡銷、紫杉醇和NHS-IL12。在一個(gè)優(yōu)選的方面，本發(fā)明設(shè) 及所述藥物組合物，其用于人個(gè)體的預(yù)防或治療，其中所述個(gè)體患有癌癥或癌癥相關(guān)的疾 病。
[0091] 最后，本發(fā)明設(shè)及所述通過疫苗接種來進(jìn)行人個(gè)體的預(yù)防或治療的免疫刺激性疫 苗或脂質(zhì)體制劑，其中所述個(gè)體患有癌癥或癌癥相關(guān)的疾病，或有運(yùn)種傾向。本發(fā)明尤其設(shè) 及:通過疫苗接種來治療患有癌癥或具有患癌傾向的患者的相應(yīng)的方法，其中所述疫苗接 種觸發(fā)所述個(gè)體中的生存素特異性免疫應(yīng)答，例如，通過調(diào)節(jié)，優(yōu)選通過攻擊患者的免疫系 統(tǒng)來增強(qiáng)CD4+和/或CD8+T細(xì)胞應(yīng)答，并由此抑制或防止該患者中的腫瘤生長(zhǎng)。
[0092] 根據(jù)本發(fā)明，對(duì)于制劑優(yōu)化了疫苗的如下參數(shù)，從而相較于全長(zhǎng)生存素，增強(qiáng)免疫 應(yīng)答：
[0093] .生存素蛋白質(zhì)修飾：10-80%,優(yōu)選10-60%的受控合成的葡萄糖酸化影響生存 素特異性CD4+和CD8+T細(xì)胞應(yīng)答的最優(yōu)誘導(dǎo)。
[0094] ? R-DOTAP濃度:3.5-4.5mM DOTAP包括了生存素特異性CD4+和CD8+T細(xì)胞應(yīng)答的最 優(yōu)平衡。
[0095] ?顆粒表面電荷:C電位〉17mV，優(yōu)選約為1 SmV，運(yùn)誘導(dǎo)生存素特異性CD4+和CD8+T細(xì) 胞應(yīng)答之間的最優(yōu)平衡。
[0096] ?粒徑:較大納米顆粒，優(yōu)選〉200nm，運(yùn)增強(qiáng)生存素特異性CD8+T細(xì)胞IFN- 丫生成。
[0097] ?脂質(zhì)組合物:在發(fā)展細(xì)胞免疫應(yīng)答方面，EPC輔助脂質(zhì)一致地勝過合成的輔助脂 質(zhì)，例如DMPC等。
[009引 ?用于低溫保存的賦形劑:2-3%薦糖支持穩(wěn)定且有活性的凍干疫苗制劑。
[0099] 本發(fā)明的制劑能增強(qiáng)截短型生存素的水性穩(wěn)定性，并通過轉(zhuǎn)而采用所述截短型生 存素克服了 R-DOTAP和全長(zhǎng)生存素固有的不相容性。通過施用如上所述的截短的葡萄糖酸 化的生存素，與全長(zhǎng)的原先的生存素對(duì)比，藥理學(xué)活性得到了保持，并且，相對(duì)于非葡萄糖 酸化的截短型生存素而言有所增加(參見圖2-圖14)。
[0100] 附圖簡(jiǎn)述
[0101] 圖lA:8mM脂質(zhì)濃度、具有遞增量的生存素的DOTAP脂質(zhì)體。從左至右:0蛇/mL蛋白 質(zhì)、4化g/mL蛋白質(zhì)、3. Img/mL蛋白質(zhì)。由遞增的蛋白質(zhì)濃度誘導(dǎo)了DOTAP-蛋白質(zhì)復(fù)合物的 沉淀。
[0102] 圖IB:在多種抑和鹽條件的基質(zhì)中，全長(zhǎng)生存素對(duì)比C末端截短型生存素的穩(wěn)定性 評(píng)估。綠色指示有利，紅色為不利條件。對(duì)于1-120個(gè)氨基酸的生存素，觀察到蛋白質(zhì)相容的 條件的相對(duì)延伸趨向于較低的鹽和較低的pH。
[0103] 圖2:對(duì)于包含D0TAP/CH0/DMPC或D0TAP/C冊(cè)/DPPC的S元混合物的脂質(zhì)組合物的 滴定和粒徑(顆粒尺寸)分布(96w形式）的影響，樣品在to和在2-8°C膽存1周后檢測(cè)。在匯集 并檢測(cè)=份制備物后獲得多個(gè)值。
[0104] 圖3:關(guān)于不同的PC組合（96w形式）的脂質(zhì)體組合物的滴定：DMPC+DPPC、D0PC+ DPPC、D0PC+DSPC，當(dāng)采用D0PC+DPPC或DPPC+DMPC的組合時(shí)獲得合適的粒徑分布。值代表S 個(gè)小瓶各自值的匯集。
[01化]圖4:關(guān)于不同比例的DPPC和DOPC、具有固定含量的D0TAP(20%mol/mol)和膽固醇 (45 % mo 1 /mo 1)的脂質(zhì)體組合物的滴定（96w形式），在寬范圍的比例中獲得合適的粒徑分 布。值代表=個(gè)小瓶各自值的匯集。
[0106] 圖5:關(guān)于不同的PC組合(96w形式）的脂質(zhì)體組合物在降低的鹽含量（IOOmM KCl) 條件下的滴定。在使載有生存素的脂質(zhì)體穩(wěn)定的方面，顯示DMPC優(yōu)于DPPC和DSPC。也顯示 DOTAP含量的減少使脂質(zhì)體穩(wěn)定。值代表S個(gè)孔各自值的匯集。
[0107] 圖6:在存在減少的KCl含量(50nM)的條件下的脂質(zhì)體組合物(96w形式）的滴定。關(guān) 于制劑可行性和在4°C放置一周的短期穩(wěn)定性，研究了不同比例的DSPE-PEG2000(l-5% mol/mol)和不同的輔助脂質(zhì)。采用DMPC、DPPC和DOPC作為憐脂。值代表S個(gè)孔各自值的匯 集。
[010引圖7:佐劑濃度的影響。C57化/6小鼠2次疫苗接種之后的CD4和CD8讀出值，疫苗組 合物：1 OOnm DOTAP脂質(zhì)體，0.5mg/mL抗原荷載，脂質(zhì)：20 %DOTAP、35 %EPC、45 %膽固醇。
[0109] A:T細(xì)胞記憶應(yīng)答暗示約2mM DOTAP條件下的增殖最大值。
[0110] B:相反，在制劑中DOTAP的最高濃度條件下觀察到產(chǎn)生CD8+T細(xì)胞的SVN特異性 IFN-T的最高頻率。
[0111] 對(duì)照例：非特異性的免疫活化通過如下方式定量：用MHC I類限制性卵清蛋白膚 (SIINFEKL)刺激從疫苗接種的小鼠分離的CD8+T細(xì)胞。
[0112] 圖8:DOTAP濃度的影響-2mM對(duì)比4mM R-D0TAP。
[0113] A:CD4+T細(xì)胞增殖，和
[0114] B:在巧7BL/6小鼠中進(jìn)行2次疫苗接種之后的CD8+IFN-丫生成，疫苗組合物：100皿 DOTAP脂質(zhì)體，0.5mg/mL抗原荷載，脂質(zhì)：20 %DOTAP、35 %EPC、45 %膽固醇。
[0115] 對(duì)照例：非特異性的免疫活化通過如下方式定量：用MHC I類限制性卵清蛋白膚 (SIINFEKL)刺激從疫苗接種的小鼠分離的CD8+T細(xì)胞。
[0116] 4mM DOTAP誘導(dǎo)了生存素特異性CD4+和CD8+T細(xì)胞應(yīng)答的最優(yōu)平衡。
[0117] 圖9:C電位和疫苗荷載對(duì)生存素特異性CD4+和CD8+T細(xì)胞應(yīng)答的作用。2次疫苗接種 后C57BL/6小鼠的CD4和CD8讀出值，疫苗組合物：IOmM脂質(zhì)濃度，脂質(zhì)：20%DOTAP，35%EPC， 45 %膽固醇。
[011引A:SVN特異性CD4+T細(xì)胞增殖，其根據(jù)通過用純化的全長(zhǎng)生存素蛋白質(zhì)脈沖處理的 抗原呈遞細(xì)胞刺激的分離的CD4+T細(xì)胞中的3H-胸巧攝取來檢測(cè)。
[0119] B: SVN特異性CD8+T細(xì)胞IFN-丫生成，其通過采用經(jīng)M肥I類限制性SVN膚脈沖處理 的抗原呈遞細(xì)胞刺激的分離的CD8+T細(xì)胞的ELISPOT分析來檢測(cè)。
[0120] 顆粒表面電荷:-6mV~+33mV。疫苗荷載導(dǎo)致顆粒表面電荷的荷載。+ 18.3mV的C電 位誘導(dǎo)生存素特異性CD4+和CD8+T細(xì)胞應(yīng)答的最優(yōu)平衡。
[0121 ] :粒徑對(duì)細(xì)胞毒性免疫應(yīng)答的影響。制劑由20 % R-D0TAP/35 % EPC/45 %膽固 醇(mol/mol似IOmM的總脂質(zhì)濃度，各藥物載量為0.5mg/mL組成。較大的納米顆粒(200nm) 增強(qiáng)了生存素特異性CD8+T細(xì)胞IFN- 丫生成。EPC輔助脂質(zhì)在發(fā)展細(xì)胞免疫應(yīng)答方面一致地 優(yōu)于合成的輔助脂質(zhì)(例如，DMPC)。
[0122] 圖11: DMPC對(duì)比EPC作為憐脂組分的比較。脂質(zhì)體的組成如下：20 % DOTAP/25 % EPC/45% 膽固醇(mol/mol)或20%0014口/50%01口(：/30%膽固醇，脂質(zhì)濃度：10111]\1，藥物載 量:0.5mg/mL，尺寸：105皿化PC)對(duì)比129皿(DMPC)，數(shù)據(jù)在每周兩次疫苗接種之后采集，N = 10只小鼠/組。
[0123] 圖12:載有下述物質(zhì)的PEG化的脂質(zhì)體的細(xì)胞毒性免疫應(yīng)答:
[0124] A:兩次疫苗接種。
[0125] B:四次疫苗接種，脂質(zhì)濃度：IOmM,尺寸:50-60nm，抗原荷載:0.5mg/mL，n=10只小 鼠/組。
[0126] 3和5 % PEG化。
[0127] 圖13: PEG化的生存素脂質(zhì)體(3%，5% )對(duì)比非PEG化的制劑(0 % )的比較，脂質(zhì)體 組成:20mM脂質(zhì)濃度(app)。200nm尺寸，抗原載量0.5mg/mL，數(shù)據(jù)顯示非PEG化制劑優(yōu)越的細(xì) 胞毒性作用。
[01%]圖14:液體化PC液體形式）和凍干化PC凍干形式）脂質(zhì)體重建后的比較，脂質(zhì)體組 成:20mM，20 % D0TAP/35 % EPC/45 % 膽固醇，尺寸:200nm，抗原載量:0.5mg/mL，EPC 凍干形式 額外包含lOOmg/mL薦糖。
[0129] 圖15A:葡萄糖酸化方案。
[0130] 圖15B:通過使用葡萄糖酸-1,5-內(nèi)醋試劑產(chǎn)生的生存素葡萄糖酸化范圍。
[0131] 圖15C:反應(yīng)參數(shù)及其對(duì)生存素葡萄糖酸化的作用的評(píng)價(jià)。
[0132] 圖16:生存素葡萄糖酸化對(duì)生存素特異性CD4+和CD8+T細(xì)胞應(yīng)答的作用。
[0133] 圖17:生存素葡萄糖酸化對(duì)dC-生存素在皮下MC38/SVN腫瘤模型中的抗腫瘤功效 的作用。
[0134] 圖18:根據(jù)本發(fā)明的l-120aa截短型生存素的合成的基因。表達(dá)質(zhì)粒AL37包含編碼 該截短型生存素 （SEQ ID N0:2;l-120aa)的DNA序列。表達(dá)之后，SEQ ID N0:3(對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0:2的2-120,省略了第一個(gè)甲硫氨酸殘基)的截短型生存素被釋放進(jìn)入培養(yǎng)基。
[013引圖19: PAL37中的限制性位點(diǎn)。
[0136] 圏或:包含編碼沈Q ID NO:2/3的截短型生存素 DNA的表達(dá)質(zhì)粒pAL37(沈Q ID NO: 4)的DNA序列和特征。
[0137] 圖21:本發(fā)明的截短型生存素 (SEQ ID N0:3的2-120aa)與環(huán)憐酷胺(CPA)的組合。
[0138] 圖22:本發(fā)明的截短型生存素 （SEQ ID N0:3的2-120aa)與抗體-細(xì)胞因子融合蛋 白畑S-IL12的組合。
[0139] 圖23:在荷載卵巢腫瘤的SVN.Tg小鼠中，本發(fā)明的截短型生存素 (SEQ ID N0:3的 2 -120aa)與紫杉醇的組合。
[0140] 圖24:在荷載卵巢腫瘤的SVN.Tg小鼠中，本發(fā)明的截短型生存素 (SEQ ID N0:3的 2-120aa)與卡銷的組合。
[0141] 發(fā)明詳述
[0142] 根據(jù)本發(fā)明的定義，術(shù)語(yǔ)"藥物物質(zhì)"指的是"dC-生存素"（2-120aa二聚生存素構(gòu) 建體，在C末端截短），簡(jiǎn)稱為本發(fā)明的截短型生存素(基于SEQ ID N0:3)，其中，截短型生存 素至少在SEQ ID NO:3的Glyl被特定地葡萄糖酸化。
[0143] 根據(jù)本發(fā)明的定義，術(shù)語(yǔ)"藥物產(chǎn)品"指的是包含如上所述的"藥物物脈'的脂質(zhì)體 制劑，并且優(yōu)選地如本文上下文所述。更具體地，本發(fā)明的"藥物產(chǎn)品"是：（i)由SEQ ID NO: 3表示且非糖基化的截短型生存素，其中所述截短型生存素的40% (±0.5%)被葡萄糖酸 化，和（ii)脂質(zhì)組合物的含量為：10-30%,優(yōu)選約20%(±1%)R-DOTAP;25-55%，優(yōu)選約 45%(±1%)膽固醇；和30-60%，優(yōu)選約35%(±1%化口(：(111〇1/111〇1)。
[0144] 表達(dá)系統(tǒng)的選擇
[0145] 小尺寸，W及產(chǎn)生缺乏翻譯后修飾的多膚的意圖，使截短型生存素成為用于在原 核表達(dá)系統(tǒng)(例如大腸桿菌）中生成的特別合適的候選物。歸因于其天然的胞質(zhì)定位，生存 素適應(yīng)還原環(huán)境。在發(fā)展過程中，它變得明顯，從而生存素蛋白需要連續(xù)的抗氧化保護(hù)W維 持結(jié)構(gòu)完整。該要求顯然有利于用于重組生成的胞內(nèi)祀向。此外，在畢赤(Pichia)系統(tǒng)中進(jìn) 行的可行性研究掲示生存素的失效的分泌性質(zhì)。運(yùn)些考量使大腸桿菌被選擇成為生成宿 主，同時(shí)保持胞內(nèi)蛋白質(zhì)產(chǎn)物。還決定采用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子系統(tǒng)（Iaclq/T7)，聯(lián)合附加體載 體?；谫|(zhì)粒的系統(tǒng)具有如下優(yōu)勢(shì):在項(xiàng)目進(jìn)展過程中便于對(duì)表達(dá)盒進(jìn)行修飾。通過誘導(dǎo)來 控制表達(dá)，允許調(diào)節(jié)并優(yōu)化轉(zhuǎn)錄本水平。其還避免了細(xì)胞庫(kù)加工中，W及發(fā)酵培養(yǎng)物的生長(zhǎng) 期過程中的負(fù)選擇壓力。
[0146] 大腸桿菌產(chǎn)生的生存素的質(zhì)譜分析掲示，兩種物質(zhì)的質(zhì)量相對(duì)于主要形式增加了 + 178和+25細(xì)a。該模式指示通過反應(yīng)性糖衍生物進(jìn)行的蛋白質(zhì)修飾，產(chǎn)生所謂的憐酸-葡萄 糖酸化。其產(chǎn)生自具有憐酸-葡萄糖酸內(nèi)醋的蛋白質(zhì)中的伯胺基團(tuán)的自發(fā)反應(yīng)，該具有憐 酸-葡萄糖酸內(nèi)醋的蛋白質(zhì)是處于糖酵解和戊糖憐酸通路的界面處的代謝中間體。在初始 憐酸-葡糖酸基蛋白質(zhì)加合物(+258Da)形成后，存在對(duì)葡糖酸基形式的部分水解(+178Da) (參見Geoghegan等，Anal Biochem 267(1): 169-84,1999)。在生存素的情況中，該反應(yīng)被限 制于Gly2處的a-氨基基團(tuán)。在測(cè)試的表達(dá)條件的范圍下，多達(dá)12%的生存素蛋白質(zhì)基于該 機(jī)制被修飾。該修飾是不希望的，并且被評(píng)價(jià)為生產(chǎn)控制方面的風(fēng)險(xiǎn)。還觀察到其可能引起 管控方面的關(guān)注。然而，對(duì)于去除純化過程中的經(jīng)修飾物質(zhì)或避免其通過合適的發(fā)酵設(shè)置 而產(chǎn)生所做的多項(xiàng)努力均不成功。
[0147] 隨著宿主細(xì)胞積累代謝物憐酸-葡萄糖酸內(nèi)醋，會(huì)出現(xiàn)失控的憐酸-葡萄糖酸化。 因此，本發(fā)明的目的是提供一種大腸桿菌菌株，其中不發(fā)生葡萄糖酸化，然而，通過運(yùn)些研 究令人吃驚地發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的葡萄糖酸化的截短型生存素相比非葡萄糖酸化的生存素具有 更多的藥理學(xué)活性。
[0148] 因此，發(fā)明人開發(fā)出一種表達(dá)宿主，其本身不使表達(dá)的截短型生存素(憐酸)-葡萄 糖酸化。而是，（憐酸)-葡萄糖酸化應(yīng)在表達(dá)之后通過合成的手段和受控的方式進(jìn)行。然而， 應(yīng)注意，本發(fā)明包括其中葡萄糖酸化是通過天然的或生物工程改造的表達(dá)宿主系統(tǒng)獲得 的，截短的葡萄糖酸化的生存素。
[0149] 根據(jù)本發(fā)明可用于本發(fā)明的截短型生存素的表達(dá)的合適且優(yōu)選的大腸桿菌菌株 是大腸桿菌化21(DE3)(諾瓦基公司（Novagen))。然而，該菌株天然地具有內(nèi)醋酶活性方面 的不足，并將該反應(yīng)性中間體水解成惰性葡糖酸。運(yùn)一可購(gòu)得的菌株根據(jù)本發(fā)明經(jīng)生物工 程改造，所述工程改造通過將(憐酸)-葡萄糖酸內(nèi)醋酶基因引入該表達(dá)菌株的基因組來進(jìn) 行。運(yùn)一方案完全廢除了憐酸-葡萄糖酸化的和葡萄糖酸化的生存素物質(zhì)的出現(xiàn)，并且為W 受控的方式通過本領(lǐng)域通曉的合成的手段引入葡萄糖酸化提供了可能。因此，原則上，也可 對(duì)內(nèi)醋酶活性方面不足的其它細(xì)菌菌株進(jìn)行工程改造，進(jìn)而可用于產(chǎn)生本發(fā)明的截短型生 存素。
[0150] 根據(jù)本發(fā)明，采用由上述生物工程改造大腸桿菌菌株(優(yōu)選大腸桿菌化21(DE3)) 而產(chǎn)生的菌株，用于用包含本發(fā)明的截短型生存素的表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)化。本發(fā)明的特異性 的菌株被稱為大腸桿菌T7E2(#1)。
[0151] 為了產(chǎn)生本發(fā)明的非糖基化且原始地非葡萄糖酸化的截短生存素，構(gòu)建質(zhì)粒，并 通過該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌T7E2。該質(zhì)粒稱為PAL37,并且序列和特征示于圖19和20。當(dāng)然，本 發(fā)明原則上包括該質(zhì)粒構(gòu)建體的變體和修飾形式，尤其是帶有先導(dǎo)序列、啟動(dòng)子序列、限制 性位點(diǎn)、抗生素抗性等的那些。應(yīng)指出，（合成地)糖基化的截短型生存素（W修飾生存素的 生物和物理性質(zhì)）的應(yīng)用也涵蓋在本發(fā)明的要點(diǎn)中。
[0礎(chǔ)修飾反應(yīng)(葡萄糖酸化)
[0153] 通過細(xì)菌表達(dá)宿主表達(dá)時(shí)，本發(fā)明的截短型生存素優(yōu)選是非葡萄糖酸化的。為了 使生物工程改造的截短型生存素具有受控和所需的葡萄糖酸化率，通過標(biāo)準(zhǔn)方法合成地進(jìn) 行葡糖酸基殘基的引入。葡萄糖酸化通過使游離氨基基團(tuán)與標(biāo)準(zhǔn)葡糖酸化試劑(例如葡萄 糖酸-1,5-內(nèi)醋)反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)（圖15A)。本發(fā)明的截短型生存素中的可能的游離氨基殘基是： 切割掉甲硫氨酸殘基之后的SEQ ID N0:2的位置2的甘氨酸，和SEQ ID N0:3的位置1的甘氨 酸。此外，用于葡萄糖酸化的候選物是截短的分子中的所有賴氨酸殘基，盡管賴氨酸23和賴 氨酸103(SEQ ID NO 2)或賴氨酸22和賴氨酸102(SEQ ID N0:3)是優(yōu)選的賴氨酸殘基，因?yàn)?運(yùn)些位置處的葡萄糖酸化產(chǎn)生具有最佳藥理學(xué)性質(zhì)的生存素。
[0154] 根據(jù)本發(fā)明，具有本發(fā)明的葡萄糖酸化的截短型生存素的疫苗觸發(fā)的體內(nèi)免疫應(yīng) 答強(qiáng)于具有相同但非修飾的生存素的相應(yīng)疫苗。
[0155] 宿主細(xì)胞介導(dǎo)的生存素的葡萄糖酸化作為采用的大腸桿菌菌株(例如化2UDE3)) 中的次優(yōu)代謝情況的不希望的后果而產(chǎn)生。觀察到低可及程度的修飾(至多12%)和對(duì)于該 事件的受限的控制不利于利用該機(jī)制。為了進(jìn)行較寬修飾范圍下的生存素葡萄糖酸化的電 位藥理學(xué)益處的系統(tǒng)性評(píng)估，已設(shè)計(jì)一種合成方案作為替代。使源自表達(dá)菌株T7E2#1的非 修飾的生存素 DS批次與葡萄糖酸-1,5-內(nèi)醋反應(yīng)。修飾程度隨著葡萄糖酸-1,5-內(nèi)醋提供的 量而增加。實(shí)現(xiàn)的修飾水平高達(dá)80%，優(yōu)選65%-80% (圖15B)。
[0156] 該反應(yīng)保持了對(duì)于位于Gly2(SEQ ID N0:2)或GlyUSEQ ID N0:3)處的a-氨基基 團(tuán)顯著的選擇性，運(yùn)可能歸因于其獨(dú)特的地a性質(zhì)。然而，觀察到低于兩種處于低水平的賴 氨酸殘基的提高的內(nèi)醋濃度修飾?？捎貌捎谜粰z測(cè)原則的兩種方法來定量生存素的葡萄 糖酸化水平(基于電荷的cIEF，基于質(zhì)量的ESI-MS，基于固定相相互作用性質(zhì)的RP-HPLC)。 歸因于內(nèi)醋在水性溶液中的自發(fā)水解，其必須W粉末形式添加，并且摩爾量相對(duì)蛋白質(zhì)組 分顯著過量。除了葡萄糖酸化試劑的量W外，還評(píng)價(jià)了關(guān)鍵反應(yīng)參數(shù)如溫度、反應(yīng)時(shí)間和抑 的影響（圖15C)。
[0157] 所用緩沖系統(tǒng)、包括的抗氧化劑的制劑可行性
[0158] 在本發(fā)明的截短型生存素的開發(fā)的構(gòu)架中，進(jìn)行了對(duì)緩沖介質(zhì)的調(diào)整。具有優(yōu)化 的特點(diǎn)的一種合適的配制緩沖劑包含50mM化-P、150mM化Cl、lmMDTT，pH7.5。由于DTT未 被衛(wèi)生當(dāng)局批準(zhǔn)，需要根據(jù)批準(zhǔn)的抗氧化劑重新設(shè)計(jì)緩沖組合物。此外，探索了緩沖鹽系統(tǒng) 的類型、抑和單價(jià)鹽濃度，W確定生存素構(gòu)建體的最優(yōu)穩(wěn)定性范圍。結(jié)果可匯總?cè)缦拢?br>[0159] 乙醇和叔下醇在5-20%的范圍中測(cè)試。采用遞增的溶劑濃度，在25°C下5天之后觀 察到增加的氧化二聚作用。至少采用5%叔下醇檢測(cè)到二聚作用。
[0160] 截短型生存素顯示pi為6.1。當(dāng)在4-9的范圍內(nèi)進(jìn)行抑滴定時(shí)，在5.0<抑<6.0檢測(cè) 到穩(wěn)定性最低值，且在運(yùn)些抑值下對(duì)應(yīng)于凈分子電荷時(shí)出現(xiàn)沉淀。在不添加抗氧化劑的情 況下檢測(cè)時(shí)，化學(xué)穩(wěn)定性(氧化)在>7.0的較高抑值下顯著地降低。通過向制劑導(dǎo)入150mM 化Cl，pH 6下的抑穩(wěn)定性驚人地增強(qiáng)。在最優(yōu)鹽濃度，API可在6-8的pH范圍中被穩(wěn)定化，其 中，最優(yōu)穩(wěn)定性出現(xiàn)在抑6-6-5。顯示化Cl在接近dC-生存素的Pl附近的抑值下使該分子穩(wěn) 定。此外，還證明其在在載藥的含R-DOTAP的脂質(zhì)體的加工過程中是關(guān)鍵組分。在不具有或 具有不足的NaCl濃度(<150mM)的情況下，蛋白質(zhì)在陽(yáng)離子脂質(zhì)體的存在下沉淀。
[0161] 最終優(yōu)選的緩沖組合物確定為由如下賦形劑組成：20mM K2HP化、150mM KCUlOmM MTG，pH 7，然而，組成和含量的變化形式也在本發(fā)明范圍內(nèi)。
[0162] 在保護(hù)本發(fā)明的截短型生存素不受氧化損傷方面，測(cè)試了如下抗氧化劑:抗壞血 酸、亞硫酸鐘、亞硫酸鋼、硫代硫酸鋼、半脫氨酸、甲硫氨酸、單硫代甘油、甲醒橫酸鋼，和沒 食子酸丙醋。所有運(yùn)些賦形劑W根據(jù)FDA成分列表的市售胃腸外產(chǎn)品形式使用?？寡趸瘎┬?能在25°C解育5天后測(cè)試。結(jié)果顯示了單硫代甘油(MTG)優(yōu)于其它抗氧化劑的優(yōu)越性。僅 MTG、甲硫氨酸和硫代硫酸鋼在測(cè)試方案中防止了氧化。沒食子酸丙醋和抗壞血酸造成了不 希望的反應(yīng)并且導(dǎo)致測(cè)試樣品變色。MTG濃度WO-IOmM在20mM K2HP化、150mM KCl，pH 7.0中 滴定。氧化的防止(25°C下5天)依賴于MTG濃度。
[01創(chuàng)用于本發(fā)明的脂質(zhì)體制劑中的脂質(zhì)和憐脂
[0164] 多種脂質(zhì)化合物和衍生物可用于制備本發(fā)明的脂質(zhì)體顆粒的脂質(zhì)組分。所述脂質(zhì) 體制劑通常包含脂質(zhì)化合物，例如膽固醇或O-生育酪、陽(yáng)離子憐脂和中性憐脂。陽(yáng)離子組分 是本發(fā)明必需的，W抵消用于本發(fā)明的脂質(zhì)體制劑中的生存素片段的負(fù)電荷。
[0165] (A)手性陽(yáng)離子憐脂
[0166] 陽(yáng)離子憐脂組分優(yōu)選具有手性性質(zhì)，因?yàn)榉蛛x的對(duì)映體形式顯示增加的生物學(xué)和 藥學(xué)功效。它們可W優(yōu)選自：R，S D0TAP、R-DOTAP、S-D0TAP、R,S DOTMA、R-DOTMA、S-DOTMA、 R，S DOEPC、R-DOEPC和S-DOEPC，但不限于運(yùn)些試劑。
[0167] 截短型生存素脂質(zhì)體的制劑可行性由截短型生存素和佐劑組分(優(yōu)選R-D0TAP)的 固有的不相容性主導(dǎo)。圖1給出了關(guān)于該現(xiàn)象的示意，其歸因于生理?xiàng)l件下DOTAP的永久正 電荷與生存素的凈負(fù)電荷之間的不受控的相互作用。在制劑開發(fā)的過程中，一項(xiàng)主要目標(biāo) 是抑制不希望的靜電相互作用，同時(shí)使每脂質(zhì)體的DOTAP含量最大化。DOTAP的作用不只是 作為脂質(zhì)體雙層的部分的脂質(zhì)組分，還作為佐劑在疫苗接種方案和設(shè)定(本文中，關(guān)于截短 型生存素）中發(fā)揮強(qiáng)力作用。
[0168] 通過在0-50% (mol/mol)范圍中滴定D0TAP，能夠證明可在0-30% (mol/mol)D0TAP 的范圍內(nèi)控制電荷相互作用。此外，能夠顯示DOTAP和一種中性脂質(zhì)組分的混合物不導(dǎo)致設(shè) 想的目標(biāo)尺寸的顆粒。將D0TAP、膽固醇和一種PCW獨(dú)特的比例混合時(shí)，獲得優(yōu)選的結(jié)果，所 述比例例如：10-30%，優(yōu)選約20%(±1%)3-0014?;25-55%，優(yōu)選約45%(±1%)膽固醇； 和30-60%，優(yōu)選約35% ( ± 1 % 化PC(mol/mol)。
[0169] (B)其它脂質(zhì)和憐脂
[0170] 發(fā)現(xiàn)電荷相互作用的控制可通過向脂質(zhì)體雙層導(dǎo)入中性脂質(zhì)組分(憐脂酷膽堿 (PC)，包括卵P(XEPC)、膽固醇和生育酪)來實(shí)現(xiàn)。合適的中性憐脂的示例有:憐脂酸(憐脂酸 鹽KPA)、憐脂酷乙醇胺(腦憐脂）（PE)、卵憐脂(蛋黃素）（PC)、憐脂酷絲氨酸(PS)、憐脂酷肌 醇(PI)、憐脂酷肌醇憐酸(PIP)、憐脂酷肌醇二憐酸(PIP2)，和憐脂酷肌醇=憐酸(PIP3)。
[0171] 此外，合成的憐脂衍生物可用于本發(fā)明：
[0172] ?憐脂酸(DMPA、DPPA、DSPA)
[0173] ?卵憐脂（DHPC、DLPC、DMPC、DPPC、DSPC、DOPC、POPC、DEPC)
[0174] ?憐脂酷甘油(DMPG、DPPG、DSPG、POPG)
[0175] ?憐脂酷乙醇胺(DMPE、DP陽(yáng)、DSPE DOPE)
[0176] .憐脂酷絲氨酸(DOPS)
[0177] ^給出了優(yōu)選用于本發(fā)明來制備本發(fā)明的脂質(zhì)體制劑的脂質(zhì)的概況。
[017 引
[0179] 除了 S元混合物，還研究了 D0TAP、膽固醇和一種憐脂更復(fù)雜系統(tǒng)的混合物，尤其 著重于模擬和替代制劑組分類脂EPC中的脂肪酸組成。作為主要PC，該混合物包含DSPC、 DPPC、POPC和DOPC。兩種限制復(fù)雜EPC被運(yùn)些制劑組分中的兩種的混合物替代。圖2、3和4示 例了輔助脂質(zhì)組合物對(duì)脂質(zhì)體的制劑可行性和穩(wěn)定性的影響。盡管DSPC在在制劑特點(diǎn)方面 顯示有限的合適性，DOPC和DPPC或DMPC和DPPC的混合物顯示良好的制劑穩(wěn)定性。DPPC和 DOPC在相關(guān)濃度范圍內(nèi)滴定，并且，當(dāng)分別滴定2-32% (mol/mol)的DOPC和3-32%的DPPC 時(shí)，僅顯示PSD的微小變化。
[0180] 糖基化的脂質(zhì)體和鹽濃度減少
[0181] 在初步試驗(yàn)中，證明單價(jià)離子的濃度對(duì)于分散穩(wěn)定性而言是重要的。盡管在液體 制劑中不那么重要，但凍干或冷凍制劑在150mM KCl的鹽含量處存在凝固點(diǎn)的問題。發(fā)現(xiàn)-與標(biāo)準(zhǔn)PC不同-脂質(zhì)體雙層中PEG化憐脂的存在降低了制劑對(duì)于減少的鹽含量的敏感度。圖 5顯示，在IOOmM KCl(標(biāo)準(zhǔn)150mM)下的制劑試驗(yàn)，和在該條件下對(duì)于蛋白質(zhì)/制劑沉淀的驚 人效果。相反，圖6顯示在50mM KCl鹽含量下的制劑選擇的概況?？梢姡谥苿┲幸氲椭?3% (mo 1/mo 1)的DS陽(yáng)-PEG2000允許產(chǎn)生載有生存素的脂質(zhì)體。在1 -2%DS陽(yáng)-PEG2K，制劑顯 示沉淀和粒徑分布(PSD)的顯著增加。
[0182] 運(yùn)些結(jié)果顯示（圖6)，如前所述，憐脂或脂質(zhì)體顆粒的PEG化在本發(fā)明的截短型生 存素的可能的沉淀方面促進(jìn)了脂質(zhì)體制劑的穩(wěn)定性。然而，不利的是，相較于具有相同含量 和組成的非PEG化顆粒，包含生存素的PEG化脂質(zhì)體顆粒顯示降低的抗腫瘤功效和減小的 CD47CD8+T細(xì)胞活性。
[。側(cè)脂質(zhì)體的冷凍和凍干
[0184] 測(cè)試了 S種不同的制劑在-70°C的冷凍和凍干：
[01 化]D0TAP/EPC/CH0 20/35/45( % 比例）
[01 化]D0TAP/C冊(cè)/D0PC/DS陽(yáng)-PEG2K 20/45/32/3( % 比例）
[0187] D0TAP/C冊(cè)/D0PC/DS陽(yáng)-PEG2K 20/45/30/5( % 比例）
[0188] 不同的冷凍保護(hù)劑(例如，海藻糖或薦糖）的可行性測(cè)試顯示薦糖在凍干后維持脂 質(zhì)體尺寸分布方面的優(yōu)越性。因此，滴定了不同的薦糖濃度，W確定最優(yōu)尺寸維持的范圍。 設(shè)定濃度為0%、2.5%、5%、7.5%和10%薦糖(巧八）。
[0189] 發(fā)現(xiàn)約10%的薦糖是最優(yōu)的，但干擾體內(nèi)功效。因此，基于脂質(zhì)組分D0TAP/CH0/ EPC和2-3%薦糖(w/w)，優(yōu)選約2.5%薦糖的冷凍分散物脂質(zhì)體引發(fā)最優(yōu)物理化學(xué)和體內(nèi)藥 學(xué)活性。
[0190] 此外，發(fā)現(xiàn)在免疫應(yīng)答方面，包含PEG2K的制劑劣于非PEG化形式。
[019。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)
[0192] (i)DOTAP濃度的影響
[0193] 為了研究DOTAP濃度/疫苗接種丸劑的影響，脂質(zhì)體數(shù)量W及由此的DOTAP的濃度 在0.7mM~TmM DOTAP范圍內(nèi)變化。圖7顯示疫苗接種了安慰劑脂質(zhì)體(P丄.）或包封了生存 素蛋白質(zhì)的脂質(zhì)體的小鼠的相應(yīng)的CD4+和CD8+T細(xì)胞應(yīng)答。然而，在佐劑含量和CD8+T細(xì)胞應(yīng) 答之間觀察到劑量依賴性關(guān)系（圖7A)，注意到在最高的DOTAP濃度損失了SVN特異性CD4+T 細(xì)胞增殖。該結(jié)果指示，2~7mM R-DOTAP的DOTAP濃度是最優(yōu)的，其在最高DOTAP濃度(7mM) 具有朝向SVN特異性CD8+T細(xì)胞的優(yōu)先偏斜。此外，圖7中的數(shù)據(jù)顯示，在疫苗制劑中的DOTAP 中等濃度(例如，2mM)處同時(shí)存在CD4+和CD8+SVN特異性T細(xì)胞應(yīng)答。為了進(jìn)一步說明相關(guān)的 濃度范圍，將第二研究設(shè)定為比較2mM和4mM R-DOTAP(圖8)。結(jié)果指示，在誘導(dǎo)SVN特異性 CD4+T細(xì)胞增殖（圖8A)和產(chǎn)生IFN-丫的CD8+T細(xì)胞（圖8B)方面，4mM的DOTAP濃度優(yōu)于2mM。
[0194] (ii)抗原荷載的影響
[01巧]本發(fā)明的脂質(zhì)體（例如，IOOnm脂質(zhì)體、IOmM脂質(zhì)、20%0014口、35%6口(：、45%膽固 醇)載有不同程度的生存素(0、0.1 mg/血、0.5mg/血、1. Omg/mL和1.5mg/mL)和SC(截短的）生 存素 (SEQ ID NO 3)dCD4/CD8應(yīng)答表明，荷載最優(yōu)值在0.5-10.〇111邑/1111^之間（圖94)，而細(xì)胞 毒性效果的穩(wěn)定階段似乎在0.1-0.5mg/mL抗原之間達(dá)到（圖9B)。尤其，安慰劑脂質(zhì)體和純 的蛋白質(zhì)均不引發(fā)任何顯著的免疫作用。
[0196] (iii)粒徑的影響
[0197] 本發(fā)明的脂質(zhì)體(例如aOOnm對(duì)比2(K)nm脂質(zhì)體)在不同的粒徑在疫苗生物活性的 影響方面進(jìn)行比較。圖10顯示，在兩次疫苗接種后，CD8+活化的差異。粒徑為180-350nm，優(yōu) 選200-25化m的脂質(zhì)體在測(cè)試設(shè)定中顯著地增大了免疫應(yīng)答。該結(jié)果表明，約20化m的粒徑 非常適用于疫苗應(yīng)用。
[0198] (iv)脂質(zhì)組合物的影響
[0199] 出于項(xiàng)目歷史原因，所有早期試驗(yàn)均采用包含20%D0TAP/35%EPC/45%膽固醇 (mol/mol)的脂質(zhì)體進(jìn)行。EPC是不同的憐脂酷膽堿的相當(dāng)粗制的混合物，主要由具有C16、 C18和C18:1脂肪酸的PC組成。在確定其它制劑組成W獲得脂質(zhì)體的優(yōu)越物理化學(xué)穩(wěn)定性和 降低制劑的復(fù)雜度方面做出了很多努力。EPC能夠被作為憐脂組分的DMPC有效替代，同時(shí)能 夠保持所有其它制劑參數(shù)，例如尺寸、表面電荷和抗原荷載。建議的制劑由20mM 20 % D0TAP/50 %DMPC/30 %膽固醇(mol/mol)組成，并且經(jīng)過免疫學(xué)動(dòng)物研究。數(shù)據(jù)顯示，當(dāng)用合 成的輔助脂質(zhì)替代EP別寸，完全損失免疫活性(圖11)。
[0200] 在第二組實(shí)驗(yàn)中，評(píng)價(jià)PEG化脂質(zhì)體的免疫原性。脂質(zhì)體由20%D0TAP/45%膽固 醇/32 %D0PC/3%DSPE-PEG2000組成，或由 20 %D0TAP/45 %膽固醇/30%D0PC/5 %DSPE-PEG2000組成，并且其針對(duì)標(biāo)準(zhǔn)含EPC的脂質(zhì)體進(jìn)行測(cè)試（圖12)。在2次和4次疫苗接種之后 記錄CD8應(yīng)答。數(shù)據(jù)表明，1)在引發(fā)特異性的細(xì)胞毒性應(yīng)答方面，3%PEG化具有優(yōu)越性，和2) 在4次疫苗接種之后，免疫應(yīng)答進(jìn)一步增大。與含DMPC的脂質(zhì)體相類似，CD8+T細(xì)胞的頻率遠(yuǎn) 低于用含EPC的脂質(zhì)體進(jìn)行疫苗接種之后的情況。當(dāng)引入低量的DSPE-PEG2000時(shí)，脂質(zhì)體小 得多。尚不清楚活性的損失主要由顆粒表面上的PEG遮蔽介導(dǎo)還是由減小的粒徑(可能會(huì)導(dǎo) 致從免疫系統(tǒng)的識(shí)別下逃逸)介導(dǎo)。因此，進(jìn)行采用最優(yōu)化的粒徑（約200nm)和DOTAP濃度 (4mM R-DOTAP)的另一組實(shí)驗(yàn)(參見圖13)。同樣地，在PEG化制劑僅能檢測(cè)到溫和的免疫活 化，而對(duì)于具有0 % PEG化的基于陽(yáng)離子EPC的制劑而言觀察到強(qiáng)應(yīng)答。
[0201] (V)凍干制劑的性能
[0202] 歸因于生存素蛋白質(zhì)在水性環(huán)境中固有的穩(wěn)定性，需要確定用于長(zhǎng)期膽存產(chǎn)品的 替代形式。開發(fā)了用于保持脂質(zhì)體的物理化學(xué)性質(zhì)的凍干方案。其包括向制劑添加冷凍保 護(hù)劑。制劑緩沖液中，約25-150mg/mL，優(yōu)選100-150mg/mL的薦糖濃度顯示能夠有效地保持 相關(guān)疫苗的參數(shù)(粒徑、電荷、藥物荷載）。圖14說明疫苗接種方案，W及重建的凍干制劑相 較于同等脂質(zhì)組合物的液體制劑的相應(yīng)的CD8+讀出值?？梢?，凍干制劑的細(xì)胞毒性降低。
[0203] 上述結(jié)果清楚地顯示，能夠在陽(yáng)離子脂質(zhì)體中配制120aa(源自SEQ ID N0:1)的截 短型生存素變體。該制劑允許具有強(qiáng)且可再生的佐劑能力，如果采用DOTAP(優(yōu)選R-D0TAP)， 運(yùn)取決于脂質(zhì)顆粒的尺寸和組成。制劑試驗(yàn)掲示，脂質(zhì)體穩(wěn)定性和特點(diǎn)取決于對(duì)制劑組分 的謹(jǐn)慎選擇。盡管純的R-DOTAP不適于配制敏感抗原，但D0TAP、膽固醇和憐脂酷膽堿組分的 混合物允許產(chǎn)生根據(jù)目標(biāo)概況穩(wěn)定的脂質(zhì)體。特殊的相關(guān)性在于脂質(zhì)體基質(zhì)中引入的PEG 化脂質(zhì)，因?yàn)檫\(yùn)些顯著地降低了生存素和R-DOTAP之間的不希望的靜電反應(yīng)，并且允許W減 少含量的單價(jià)離子進(jìn)行產(chǎn)生和膽存。
[0204] 體內(nèi)結(jié)果強(qiáng)調(diào)了制劑參數(shù)對(duì)于疫苗的佐劑性能的重要性。在約2(K)nm(150-300nm) 的粒徑下，3-5mM，優(yōu)選3.5-4.5mM，更優(yōu)選4mM R-DOTAP被鑒定為最優(yōu)佐劑濃度。并且，證明 脂質(zhì)組合物對(duì)于疫苗而言具有最外部(outmost)的重要性。引入作為制劑組分的DMPC使疫 苗失活，而采用D0TAP、EPC和膽固醇的混合物能檢測(cè)到強(qiáng)且穩(wěn)健的作用。PEG化脂質(zhì)和薦糖 的添加降低了疫苗的功效。但甚至在lOOmg/mL薦糖的情況下仍能記錄到細(xì)胞毒性作用。通 過將薦糖濃度減少至50-25mg/mL，增強(qiáng)了體內(nèi)性能。
[02化]組合治療
[0206]在另一方面，免疫治療劑的給予有利于同時(shí)或依次與本發(fā)明的脂質(zhì)體疫苗接種組 合物聯(lián)用。本發(fā)明的合適的免疫治療劑有，例如，抗癌癥抗體，例如抗VEGF(R)抗體，抗EGFR 抗體如貝伐單抗、西妥昔單抗、帕尼單抗、埃羅替尼、吉非替尼和阿法替尼，或抗PDLl抗體， 例如如WO 2013/079174中所公開?？贵w可優(yōu)選通過其C末端重鏈融合至細(xì)胞因子，例如IL- 2^冊(cè)日、伴佩和比12。
[0207] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，已知的融合蛋白NHS-IL12和NHS-IL2 (Selectikine),優(yōu)選NHS-IL12,與本發(fā)明的脂質(zhì)體制劑聯(lián)用。NHS-IL12是融合蛋白，其包含 通過核細(xì)胞結(jié)合至腫瘤的壞死核屯、（"TNT"抗體，參見WO 2000/001822)的已知人抗體NHS76 的重鏈，其中所述抗體在其C末端共價(jià)融合至IL-12的p40和/或p30亞基(經(jīng)修飾），并且具有 潛在的免疫刺激和抗腫瘤活性。給予后，免疫細(xì)胞因子NHS-IL12的抗體部分結(jié)合至從主要 定位于壞死的固體腫瘤的核屯、處的壞死的腫瘤細(xì)胞釋放的DNA，由此遞送IL-12部分。進(jìn)而， 該試劑的IL-12部分刺激宿主免疫系統(tǒng)增加針對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答，由此抑制腫瘤生長(zhǎng)。 比-12是促炎性細(xì)胞因子，其具有多種免疫調(diào)節(jié)功能，并且可增大宿主對(duì)于腫瘤細(xì)胞的免疫 應(yīng)答。通過祀向腫瘤細(xì)胞，NHS-比-12可W降低與重組人IL-12的全身性給予相關(guān)聯(lián)的毒性。
[0208] 基于本發(fā)明的截短型生存素的，用于治療多種癌癥(優(yōu)選卵巢癌癥)的優(yōu)選的組合 療法包括(圖21-24):
[0209] ?與低劑量環(huán)憐酷胺(CPA)組合:發(fā)現(xiàn)低劑量CPA增強(qiáng)了免疫應(yīng)答，并且已知運(yùn)通 過CD4_25-Treg細(xì)胞的消耗介導(dǎo)。在數(shù)個(gè)癌癥疫苗臨床試驗(yàn)中也觀察到了CPA活性。在DPX-Survivac I期研究中，還顯示節(jié)律式低劑量CPA可直接增強(qiáng)DPX-Survivac的免疫原性。
[0210] ?與抗PD-Ll組合:疫苗的常規(guī)基本原理是對(duì)APC的活化和對(duì)抗原特異性CTL介導(dǎo) 的免疫應(yīng)答的刺激。然而，在慢性腫瘤抗原刺激的設(shè)定中，CD8T細(xì)胞經(jīng)歷耗竭，使它們變得 功能失調(diào)。盡管多種機(jī)制會(huì)促進(jìn)耗竭過程，但PD-Ll是最為成熟表征的上調(diào)的抑制性分子， 并且與疾病進(jìn)展和免疫功能失調(diào)相關(guān)聯(lián)。PD-Ll的阻塞已顯示對(duì)于在臨床試驗(yàn)中增加腫瘤 清除率的有效性。因此，認(rèn)為本發(fā)明與抗PD-Ll的組合將會(huì)促進(jìn)CTL應(yīng)答。此外，已在至少于 一線化療中失敗的卵巢癌癥患者中研究了抗PD-LU18%的卵巢癌癥患者(n = 17)能夠達(dá)到 疾病穩(wěn)定至少6個(gè)月。
[0211] ?與NHS-IL12的組合:NHS-IL12是IL-12的祀向遞送，其經(jīng)建議W使該細(xì)胞因子成 為更安全、更有效的癌癥療法?；?12設(shè)及原初T細(xì)胞向Thl細(xì)胞的分化，其可刺激T細(xì)胞的生 長(zhǎng)和功能。其刺激從T和NK細(xì)胞產(chǎn)生IFN- 丫和TNF-a，并減少化-4介導(dǎo)的IFN- 丫抑制?；?12 還具有抗血管生成活性，運(yùn)意味著其能夠阻斷新血管生成。因此，建議將本發(fā)明的截短型生 存素與上述藥物或其它抗癌癥藥物組合W增強(qiáng)總體抗腫瘤活性。
[0212] 本發(fā)明的疫苗組合物還可額外包含其它化合物，所述化合物已知具有免疫刺激 性，例如CpG或環(huán)憐酷胺。CpG核酸優(yōu)選包含至少一種或多種(促有絲分裂的)胞喀晚/鳥嚷嶺 二核巧酸序列(CpG基序）。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的脂質(zhì)體制劑或疫苗組合物的功能與 促進(jìn)免疫應(yīng)答的效應(yīng)物分子相呼應(yīng)。例如，所述效應(yīng)物分子可W是細(xì)胞因子部分，包括但不 限于，比-2、比-7、化-12、比-18、比-21、化-23、GM-CSF或任何其它細(xì)胞因子，尤其是能夠激 活化I免疫應(yīng)答的因子。所述效應(yīng)物分子還可W是抑制免疫系統(tǒng)的細(xì)胞因子的抑制劑，例 如，STAT3抑制劑。
[0213] 治療應(yīng)用
[0214] 在一個(gè)方面中，本發(fā)明設(shè)及本文所述的脂質(zhì)體制劑或本文所述的免疫刺激性疫苗 在制備用于預(yù)防或治療癌癥或癌癥相關(guān)的疾病的藥物中的應(yīng)用，其中所述癌癥或癌癥相關(guān) 的疾病基于生存素特異性腫瘤細(xì)胞的存在。在一個(gè)優(yōu)選方面中，所述脂質(zhì)體制劑與選自下 組的抗癌劑聯(lián)用:環(huán)憐酷胺、卡銷、紫杉醇和NHS-IL12。
[0215] 在一個(gè)方面中，本發(fā)明設(shè)及預(yù)防或治療有需要的個(gè)體中的癌癥或癌癥相關(guān)的疾病 的方法，其中所述癌癥或癌癥相關(guān)的疾病基于所述個(gè)體中生存素特異性腫瘤細(xì)胞的存在， 所述方法通過給予所述個(gè)體治療有效劑量的本文所述的免疫刺激性疫苗來進(jìn)行。在一個(gè)優(yōu) 選方面中，本發(fā)明設(shè)及通過額外給予選自下組的抗腫瘤劑:環(huán)憐酷胺、卡銷、紫杉醇和NHS-IL12來進(jìn)行治療的方法。
[0216] 因?yàn)樯嫠厮坪踉诖蠖鄶?shù)癌癥形式中表達(dá)，本發(fā)明的疫苗組合物或脂質(zhì)體制劑很 可能能夠用于控制其中表達(dá)生存素的任何類型的癌癥疾病。
[0217] 因此，作為示例，本發(fā)明的組合物和制劑針對(duì)惡性血液病(包括慢性淋己性白血病 和慢性骨髓性白血?。?、黑素瘤、乳腺癌、宮頸癌、卵巢癌、肺癌、結(jié)腸癌、膜腺癌和前列腺癌 具有免疫活性。該治療應(yīng)用包括給予患有所述疾病的患者有效量的本發(fā)明的藥物組合物。
[0218] 根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的疫苗組合物或脂質(zhì)體制劑還可包含藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體 和/或其它輔助物質(zhì)和添加劑和/或佐劑。
[0219] 本發(fā)明制劑通常包含安全且有效的量的上述截短型生存素多膚。本文中所用的" 安全且有效的量"指，一定量的本發(fā)明的截短型生存素，其足W顯著誘導(dǎo)對(duì)于癌癥(例如，肺 癌或卵巢癌）的積極改善。然而，同時(shí)，"安全且有效的量"足夠小W避免嚴(yán)重副作用，即，允 許在優(yōu)勢(shì)和風(fēng)險(xiǎn)之間存在一個(gè)合適的關(guān)系。對(duì)于運(yùn)些限制的確定通常處于合理醫(yī)學(xué)判斷的 范圍內(nèi)。關(guān)于本發(fā)明的藥物物質(zhì)，表述"安全且有效的量"優(yōu)選指一定量的本發(fā)明的截短型 生存素，其適于W如下方式刺激適應(yīng)性免疫系統(tǒng):不造成過度或破壞性的免疫反應(yīng)，但優(yōu)選 地，也沒有處于可檢測(cè)水平W下的免疫反應(yīng)。"安全且有效的量"還關(guān)于如下因素而變化:待 治療的具體病癥W及待治療患者的年齡和身體狀況、病癥的嚴(yán)重程度、治療時(shí)長(zhǎng)、伴隨性治 療的性質(zhì)，所用的具體藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體，和類似因素，運(yùn)可根據(jù)隨診醫(yī)生所掌握的知 識(shí)和經(jīng)驗(yàn)來確定。本發(fā)明的脂質(zhì)體或疫苗制劑可根據(jù)本發(fā)明用于人，也可用于獸醫(yī)學(xué)目的， 作為藥物組合物用于疫苗接種。
[0220] 本文所用的表述"藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體"優(yōu)選包括本發(fā)明脂質(zhì)體或疫苗制劑的 液體或非液體基質(zhì)。如果本發(fā)明的脂質(zhì)體制劑或疫苗組合物W液體形式提供，該運(yùn)載體將 通常是無(wú)熱原的水;等張鹽水或帶緩沖的（水性）溶液，例如，憐酸鹽或巧樣酸鹽緩沖的溶 液。
[0221] 本發(fā)明的免疫原性疫苗組合物的量可根據(jù)具體應(yīng)用而變化。然而，在各種情況中， 單劑量疫苗優(yōu)選是約IOyg-約5000yg，更優(yōu)選約50yg-約2500yg，例如，約IOOiig-約lOOOiig。 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，脂質(zhì)體制劑的單一劑量根據(jù)本發(fā)明可包含500-1，20化g 的所述脂膚，更優(yōu)選700-90化g。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，通過本發(fā)明的脂質(zhì)體制 劑進(jìn)行的疫苗接種伴隨著給予100-400mg/m 2,優(yōu)選250mg/m2的環(huán)憐酷胺，通過運(yùn)種方式能夠 激活或增強(qiáng)患者的免疫系統(tǒng)。通常，在疫苗接種開始之前，一般1~5天，優(yōu)選2~5天的單劑 量應(yīng)足夠有效，然而其它不同的方案也是可用的。
[0222] 給予模式包括皮內(nèi)、皮下和靜脈內(nèi)給予、W時(shí)間控釋制劑形式植入等。本文涵蓋本 領(lǐng)域抑制的任何和所有給予形式。還涵蓋適于配制可注射的免疫原性膚組合物的本領(lǐng)域已 知的任何和所有常規(guī)劑型，例如凍干形式和溶液、懸液或乳液形式，其必要時(shí)包含常規(guī)的藥 學(xué)上可接受的運(yùn)載體、稀釋劑、防腐劑、佐劑、緩沖組分等。
[0223] 在本發(fā)明的另一個(gè)方面中，本發(fā)明的疫苗組合物和脂質(zhì)體制劑可與其它藥學(xué)上有 效的制劑和藥物聯(lián)合，運(yùn)在下文中將做詳細(xì)描述。
[0。4] 化療/放療
[0225] 本發(fā)明的疫苗接種方法還包括"化-放療"。本發(fā)明的化-放療包括"化療"。化-放療 也包括通過按照標(biāo)準(zhǔn)方法福照進(jìn)行或通過給予帶放射性標(biāo)記的化合物進(jìn)行的"放療"。根據(jù) 本發(fā)明，福照是優(yōu)選的。
[0226] 本文所用的術(shù)語(yǔ)"細(xì)胞毒性試劑"指的是一種物質(zhì)，其通過造成細(xì)胞損毀來抑制或 阻止細(xì)胞功能。該術(shù)語(yǔ)意在包括放射性同位素、化療劑、免疫治療劑，和毒素，例如具有酶促 活性的細(xì)菌、真菌、植物或動(dòng)物源性的毒素，或其片段。該術(shù)語(yǔ)還可包括細(xì)胞因子家族的成 員，優(yōu)選IFN 丫，W及還具有細(xì)胞毒性活性的抗腫瘤試劑。
[0227] 術(shù)語(yǔ)"抗癌劑"或"抗腫瘤劑"描述有效于癌癥/腫瘤治療的所有試劑。該術(shù)語(yǔ)包括， 細(xì)胞毒性劑、化療劑，和免疫治療劑。
[0228] 本發(fā)明的化-放療通常W化療起始，隨后是放療。然而，W放療起始治療也是可行 的?；熗ㄟ^給予至少一種"化療劑"，優(yōu)選基于銷的藥物，例如順銷或卡銷來進(jìn)行。根據(jù)本 發(fā)明，化療劑每天、每周或每2~5周給予，運(yùn)取決于給藥時(shí)程和給予的次數(shù)。
[0229] 本發(fā)明的化療包括給予化療劑，其根據(jù)本發(fā)明的理解是細(xì)胞毒性劑類別的一員， 并且包括直接對(duì)腫瘤細(xì)胞，且不間接通過其它機(jī)制（例如生物反應(yīng)調(diào)節(jié)）發(fā)揮抗腫瘤作用 (即，防止腫瘤細(xì)胞的發(fā)育、成熟或擴(kuò)散)的化學(xué)劑。
[0230] W本發(fā)明的化-放療設(shè)定給予的本發(fā)明優(yōu)選的化療劑有:基于銷的試劑，例如J員 銷或卡銷。然而，也可使用如下所述的其它化療劑。
[0231] 此外，可給予額外化療劑或其它抗癌劑W促進(jìn)請(qǐng)求保護(hù)的治療的功效。市售應(yīng)用、 臨床評(píng)價(jià)和臨床前開發(fā)中存在大量的抗腫瘤試劑，其可包括在本發(fā)明中，用于通過聯(lián)合治 療來治療腫瘤/腫瘤形成。應(yīng)指出，化療劑可任選地與上述脂質(zhì)體制劑一同給予?；熁蚧?療劑的示例包括烷基化試劑，例如，氮芥、乙亞胺化合物、烷基橫酸醋/鹽和具有烷基化作用 的其它化合物，例如亞硝基脈、順銷和達(dá)卡己嗦;抗代謝物，例如，葉酸、嚷嶺或喀晚括抗劑； 有絲分裂抑制劑，例如，長(zhǎng)春花生物堿和足葉草毒素的衍生物;細(xì)胞毒性抗生素和喜樹堿衍 生物。優(yōu)選的化療劑或化療包括氨憐汀巧thyol)、卡己他賽、順銷、達(dá)卡己嗦(DTIC)、放線菌 素 D、多西他賽、二氯甲基二乙胺、鏈脈菌素、環(huán)憐酷胺、卡莫司?。˙CNU)、環(huán)己亞硝脈 (CCNU)、阿霉素（亞德里亞霉素）、阿霉素脂質(zhì)體(Doxil)、吉西他濱(健擇）、道諾霉素、道諾 霉素脂質(zhì)體(Daunoxome)、甲基節(jié)阱、酬康挫、絲裂霉素、阿糖抱巧、依托泊巧、甲氨蝶嶺、五 氣尿喀晚(5-FU)、長(zhǎng)春花堿、長(zhǎng)春新堿、博來霉素、紫杉醇（紫杉酪）、多西他賽(泰素帝）、阿 地白介素、天冬酷胺酶、白消安、卡銷、克拉屈濱、喜樹堿、CPT-lUlO-徑基-7-乙基-喜樹堿 (SN38)、達(dá)卡己嗦、氣尿巧、氣達(dá)拉濱、徑基脈、異環(huán)憐酷胺、伊達(dá)比星、美司鋼、干擾素 a、干 擾素 e、伊立替康、米托蔥釀、拓?fù)涮婵怠⒘帘鹆?、甲地孕酬、美法侖、琉嚷嶺、普卡霉素、米 托坦、培口冬酶、噴司他下、贓泊漠燒、普卡霉素、鏈脈菌素、它莫西芬、替尼泊巧、睪內(nèi)醋、硫 鳥嚷嶺、嚷替派、烏拉莫司汀、長(zhǎng)春瑞濱、瘤可寧，及其組合。
[0232] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，提供脂質(zhì)體制劑，其中化療劑選自下組:順銷或 卡銷，并且非銷基的化療劑選自下組:長(zhǎng)春瑞濱、依托泊巧、紫杉醇、多西他賽、長(zhǎng)春地辛、吉 西他濱、異環(huán)憐酷胺和培美曲塞，優(yōu)選紫杉醇。
[0233] 根據(jù)本發(fā)明施加化療，通常通過至少兩個(gè)周期，優(yōu)選2-8個(gè)周期，更優(yōu)選2-5個(gè)周期 來進(jìn)行。一個(gè)周期為21~35天，優(yōu)選21~28天。化療劑的給藥方案取決于不同可能的患者和 藥物相關(guān)的狀況與性質(zhì)。通常，順銷W每周期50-120mg/m2的劑量施用?？ㄤN或紫杉醇可根 據(jù)本發(fā)明W每周期和每單劑量IOO-ISOOmg施用。
[0234] 放療根據(jù)本發(fā)明通過標(biāo)準(zhǔn)福照進(jìn)行，其中施加總計(jì)40-120Gy，優(yōu)選至少50Gy，更優(yōu) 選50~75Gy。放療通常分級(jí)進(jìn)行，其中1.5-3.5Gy每天施加持續(xù)至少四天，優(yōu)選依次5-7天。 根據(jù)本發(fā)明待施加的總福照劑量在21-35天范圍內(nèi)，優(yōu)選28天內(nèi)。必要時(shí)或有利時(shí)，可在福 照開始時(shí)或在中間間隔時(shí)施加3.5- 15Gy，優(yōu)選5- IOGee的加強(qiáng)劑量。
[0235] W下實(shí)施例W更具體的方式描述本發(fā)明，但不限制本發(fā)明的范圍。 實(shí)施例
[0236] 實(shí)施例1:材料
[0237] 本發(fā)明中施用的憐脂物質(zhì)列于表KDOTAP獲自默克密理博公司（Merck Millipore)，且膽固醇購(gòu)自西格瑪奧德里奇公司（Sigma Al化ich)。所有其它脂質(zhì)獲自德國(guó) 脂質(zhì)有限公司化ipoid AGKdC-生存素如下所述制備并由在C末端截短的人生存素的氨基 酸序列組成，W獲得更優(yōu)的穩(wěn)定性特點(diǎn)和更好的可制造性。其包含人生存素的氨基酸2-120 (SEQ ID N0:3)，并且具有如下特點(diǎn):分子量13.81^)曰，等電點(diǎn)6.0和烙點(diǎn)48°(：。
[0238] 實(shí)施例2:來源菌株大腸桿菌化21 (DE3)的工程改造和大腸桿菌T7E2菌株作為用于 本發(fā)明的截短型生存素的表達(dá)菌株的制備
[0239] 來源菌株大腸桿菌化21 (DE3)(諾瓦基)工程改造如下：
[0240] ?大腸桿菌BL21(DE3)的引入（incoming)分析
[0241] ?改變大腸桿菌化21 (DE3)基因組巧SL基因 W獲得鏈霉素抗性表型
[0242] ?用大腸桿菌化21(DE3)STR基因組背景中的loxP-cmR-loxP盒替代非必要的DE3 原隧菌體區(qū)
[0243] ?用大腸桿菌化21(DE3)STR L'lDE3:loxP-cmR-loxP遺傳背景中的合成的Pgl基 因替代Rac原隧菌體
[0244] ?移除IoxP-偵賠的氯霉素標(biāo)志物
[0245] 大腸桿菌化21 (DE3)的基因組序列[gb#CP00 1509.3巧日Artemi S軟件（Rutherford 等，Bioinformatics 16(10):944-5,2000)用于計(jì)算機(jī)虛擬（in-siIico)菌株工程改造。大 腸桿菌化2UDE3)在補(bǔ)充有心亮氨酸（0.04mg/mL)的LB Vegitone肉湯和瓊脂或麥芽糖M9-小板(0.4% )上有氧增殖。必要時(shí)，氨節(jié)青霉素(Ap)、氯霉素（Cm)、卡那霉素化m)、鏈霉素 (Str)和四環(huán)素(Tc)分別添加至最終濃度 50flg/mL、15flg/mL、15flg/mL、50flg/mUP3flg/ ITlL O
[0246] 為了確保來源菌株大腸桿菌化21(DE3)(購(gòu)自諾瓦基）不具有葡萄糖酸化作用，生 物工程改造菌株基因組DNAdBL21(DE3)基因組包含多種原隧菌體。存在潛在的風(fēng)險(xiǎn)，即在某 些生理?xiàng)l件下，運(yùn)些中的一些可能會(huì)變得具有活性W產(chǎn)生感染性隧菌體顆粒。ADE3隧菌體 的存在退回到T7聚合酶(T7-RNAP)向細(xì)菌基因組的導(dǎo)入。為了進(jìn)一步減少活動(dòng)的機(jī)會(huì)，已在 表達(dá)菌株中刪除了位于T7-RNAP基因上游的38.3千堿基的DE3原隧菌體序列。此外，在引入 憐酸-葡萄糖酸內(nèi)醋酶基因拷貝的過程中刪除Rac原隧菌體基因座。根據(jù)本發(fā)明的所得菌株 是大腸桿菌T7E2(#1)并且特征為具有如下遺傳特點(diǎn)：（i)鏈霉素抗性，運(yùn)歸因于基因組rpsL 中的點(diǎn)突變，導(dǎo)致Lys43Arg交換（后續(xù)基于rpsL的逆選擇的先決條件），（ii)無(wú)標(biāo)記移除 89.1 %的DE3-原隧菌體，不破壞T7RNA-聚合酶基因和功能，和（i i i )用源自大腸桿菌MG 1655基因組序列的合成的口旨^基因替代Rac-原隧菌體。
[0247] 實(shí)施例3:用表達(dá)質(zhì)粒PAL37轉(zhuǎn)化大腸桿菌T7E
[0248] 來源質(zhì)粒是祀T42(諾瓦基），其通過PAL28最終設(shè)計(jì)成最終表達(dá)質(zhì)粒pAL37dpLA37 的質(zhì)粒DNA完全示于圖20并且由SEQ ID NO: 4代表。相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶的限制性位點(diǎn)示于 圖19。質(zhì)粒AL37包含編碼截短型生存素序列SEQ ID N0:2(SEQ ID N0:1的l-120aa)的DNA， 該截短型生存素從其表達(dá)后釋放進(jìn)入介質(zhì)，第一甲硫氨酸殘基被切割掉，由此得到代表性 的截短型生存素沈Q ID N0:3(SEQ ID N0:1的2-120aa)。
[0249] 對(duì)于轉(zhuǎn)化，大腸桿菌T7E2#1細(xì)胞在冰上溶解，添加化I的質(zhì)粒al37并在冰上解育30 分鐘，在42°C解育30秒，并再次于冰上解育2分鐘。然后，添加25化1無(wú)抗生素的LB Vegitone 肉湯，并在37°C解育60分鐘，W45化pm振蕩。培養(yǎng)物鋪板于補(bǔ)充有卡那霉素和鏈霉素的LB Vegitone瓊脂板并在37°C解育過夜。
[0250] 來自該板的細(xì)胞用于產(chǎn)生通過=重劃線而具有單個(gè)集落的瓊脂板。在28°C解育兩 天后，采用小型單個(gè)集落來接種具有擋板的IL搖瓶中的200mL化學(xué)確定的培養(yǎng)基，W28°C和 16化pm保持過夜用于一次培養(yǎng)物。二次預(yù)培養(yǎng)物采用1.44mL的一次培養(yǎng)物接種，供于光學(xué) 密度為OD 578皿=0.001。培養(yǎng)物在281：，160巧111下解育約20小時(shí)。添加17%甘油和21111甜菜 堿，并使細(xì)胞懸液分散在IOxlmL冷凍管中，蓋上蓋子，并將所述管在液氮中速凍，并膽存在 上述液氮中。
[0251 ]為了產(chǎn)生研究工作細(xì)胞庫(kù)，在各例中，解凍一管第一細(xì)胞儲(chǔ)液。采用17化1的儲(chǔ)液 接種具有擋板的IL搖瓶中的200mL化學(xué)確定的培養(yǎng)基，W28°C，160巧m解育過夜。添加17% 甘油和2mM甜菜堿，并使培養(yǎng)物分散于SOxlmL冷凍管(供于第一 RWCB)和IOOxlmL管(供于第 二RWCB)中。蓋上蓋子并將管置于細(xì)胞冷凍裝置Planer K巧O 10中并冷凍。冷凍之后，處理 結(jié)束，并將管小屯、置于冷凍罐中。分析所得物質(zhì)的特性、純度、活力、革蘭氏染色和污染的隧 菌體。符合所有可接受的標(biāo)準(zhǔn)。
[0252] 實(shí)施例4:本發(fā)明的截短型生存素的葡萄糖酸化的方案
[0253] .獲自實(shí)施例3的截短型生存素經(jīng)凝膠過濾進(jìn)入緩沖液
[0254] ? 125mg生存素（5mg/mL)在25°C水浴中攬拌
[02W] ?添加固體葡萄糖酸-1,5-內(nèi)醋，200mM終濃度
[0256] ?時(shí)程0-20h，主反應(yīng)在45分鐘后撤回
[0257] .凝膠過濾 [0巧引.濃縮
[0 巧 9] ?通過 cIEF、ESI-MS、沈+RP-HPLC 分析
[0260].產(chǎn)出約100mg(80%)，其中總葡萄糖酸化的部分為約65%
[0261 ].反應(yīng)物在約60分鐘后獲取(抑指示(；L完全水解）
[0262] ?該分辨率下，單和雙修飾動(dòng)力學(xué)之間無(wú)差異
[0263] 實(shí)施例5:脂質(zhì)體生成方法
[0264] 向96孔板的各孔添加 22化1的緩沖液或蛋白質(zhì)溶液。首先將脂質(zhì)溶解于乙醇，然后 W33iU/孔注射進(jìn)入含有緩沖液的孔。各制劑重復(fù)=次。各孔通過吹打混合。脂質(zhì)注射通過 Eppendod多吸管分液器W分配模式和速度水平5進(jìn)行，運(yùn)對(duì)應(yīng)于約0.5mL/分鐘的水性溶 液。最終混合步驟通過Biohit Proline 12-通道吸管，WP模式和速度水平1進(jìn)行，運(yùn)是約 SOmL/分鐘。用于混合的每次吹打體積為10化1，且各孔吹打一次。除非另有說明，最終脂質(zhì) 濃度為ImM,且生存素濃度為O.lmg/mL。各制劑重復(fù)S次。
[02化]實(shí)施例6:連續(xù)乙醇注射脂質(zhì)體生產(chǎn)方法
[0266] 采用2mm內(nèi)徑的娃酬管，WSOmL/分鐘的流速，將緩沖液或蛋白質(zhì)溶液累入樣品容 器。脂質(zhì)先溶解于乙醇，然后Wl2mL/分鐘的流速注射進(jìn)入緩沖流。最終脂質(zhì)體溶液收集于 樣品容器中。除非另有說明，最終制劑顯示IOmM的脂質(zhì)濃度和Img/mL的總蛋白質(zhì)含量。各制 劑重復(fù)=次。
[0267] 實(shí)施例7:粒徑和C電位檢測(cè)
[0268] 脂質(zhì)體的尺寸測(cè)量通過動(dòng)態(tài)光散射采用Malvern Zetasizer化no-ZS儀器進(jìn)行。 檢測(cè)在25°C下W固定的173°反向散射角進(jìn)行。通過相同的Malvern Ze化sizer化no-ZS儀 器檢測(cè)脂質(zhì)體的C電位。脂質(zhì)體溶液Wl: 100在水中稀釋。檢測(cè)在25°C采用斯莫路科夫斯基 (Smoluchowski)模型進(jìn)行。
[0269] 實(shí)施例8:產(chǎn)生本發(fā)明的藥物產(chǎn)品的藥物物質(zhì)的配制
[0270] 脂質(zhì)體分散于由如下組分組成的緩沖介質(zhì)：
[0271] ?脂質(zhì)組合物：20%R-D0TAP，35%高純度EggPC化?〇,45%膽固醇（全部％111〇1/ mol)
[0272] ?分散物中的總體脂質(zhì)組合物:20mM
[0273] ?分散介質(zhì):20mM憐酸鐘抑7、150mM KCiaOmM單硫代甘油(MTG)
[0274] ?含量dC-生存素:0.8-1. Omg/mL總含量，藥物載量0.6mg/mL
[0275] 包含77mM脂質(zhì)的憐脂的乙醇溶液通過如下方式制備：稱取107.6mg DOTAP， 207. Img EPC和134.Omg膽固醇于合適的玻璃燒杯中，并用乙醇（>99%純度）添加至lOmL。 API在包含20mM K2HP〇4、150mM KCl、10mM MTG的緩沖液中稀釋。
[0276] 脂質(zhì)體通過如下方式制備:在t型混合裝置中控制混合乙醇和緩沖溶液。乙醇相的 流速為12mL/分鐘且緩沖液相的流速為SOmL/分鐘。所得的脂質(zhì)體分散物通過在Slide-A-Lyzer透析盒(MWCO IOkDa，PES)中透析24h(采用5x緩沖液交換）來純化。在最后一步中，月旨 質(zhì)體通過滲濾法濃縮2x。所得的脂質(zhì)體通過化S檢測(cè)并顯示平均粒徑為約120nm且PDK 0.15。供于進(jìn)一步處理，脂質(zhì)體在2.5% (w/v)薦糖的存在下經(jīng)冷凍或凍干。所得的顆粒顯示 平均粒徑為200-300nm，PDI〉0.15。藥物載量分析掲示有0.6mg/mL的抗原結(jié)合至脂質(zhì)體顆 粒。
[0277] 為了允許凍干樣品，緩沖組合物變成20mM K2HP化。還要求陽(yáng)離子根據(jù)單價(jià)鹽中的 鐘進(jìn)行調(diào)整。在由20mM K2HP化、IOmM MTG組成的pH 7.0的緩沖液中進(jìn)行從0到150mM的KCl滴 定。需要最少30mM KCl來保持DS緩沖液中的蛋白質(zhì)。為了確保脂質(zhì)體存在下的可加工性，濃 度提高至150mM KC1。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種C末端截短型生存素，其由如SEQ ID N0:1所示的全長(zhǎng)人生存素的前118-133N末 端氨基酸組成，或與所述截短型生存素具有>90%的同源性的序列，其中，所述截短型生存 素在一個(gè)或多個(gè)位置經(jīng)葡萄糖酸化。2. 如權(quán)利要求1所述的C末端截短型生存素，其中存在的賴氨酸殘基中的至少一個(gè)被葡 萄糖酸化。3. 如權(quán)利要求1或2所述的C末端截短型生存素，其由全長(zhǎng)人生存素的前120個(gè)N末端氨 基酸組成，其中所述截短型生存素如氨基酸序列（SEQ ID NO:2)所示： MGAPTLPPAff QPFLKDHRIS TFKNWPFLEG CACTPERMAE AGFIHCPTEN EPDLAQCFFC FKELEGWEPD DDPIEEHKKH SSGCAFLSVK KQFEELTLGE FLKLDRERAK NKIAKETNNK〇4. 如權(quán)利要求1或2所述的C末端截短型生存素，其中，N末端位置1處的甲硫氨酸殘基被 移除。5. 如權(quán)利要求4所述的C末端截短型生存素，其由全長(zhǎng)人生存素的前120個(gè)N末端氨基酸 組成，其中所述截短型生存素如氨基酸序列（SEQ ID NO:3)所示： GAPTLPPAff QPFLKDHRIS TFKNWPFLEG CACTPERMAE AGFIHCPTEN EPDLAQCFFC FKELEGWEPD DDPIEEHKKH SSGCAFLSVK KQFEELTLGE FLKLDRERAK NKIAKETNNK。6. 如權(quán)利要求4所述的C末端截短型生存素，其中位置1處的甘氨酸殘基被葡萄糖酸化。7. 如權(quán)利要求6所述的截短型生存素，其中位置1處的甘氨酸殘基和位置22和/或位置 102處的賴氨酸殘基被葡萄糖酸化。8. 如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的截短型生存素，其中所述葡萄糖酸化以合成方式通 過葡萄糖酸-1，5-內(nèi)酯來實(shí)現(xiàn)。9. 如權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的截短型生存素，其中所述截短型生存素是非糖基化 的。10. -種生存素組合物，其包含如權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的截短型生存素，和相應(yīng) 的非葡萄糖酸化的截短型生存素，其中在所述組合物中，10-80%的所述截短型生存素分子 被葡萄糖酸化。11. 如權(quán)利要求10所述的生存素組合物，其中，35-45%的所述截短型生存素分子被葡 萄糖酸化。12. -種脂質(zhì)體制劑，其包含如權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的截短型生存素，或如權(quán)利 要求10或11所述的生存素組合物，和至少一種佐劑，其中，所述至少一種佐劑是起免疫調(diào)節(jié) 劑作用的手性陽(yáng)離子磷脂。13. 如權(quán)利要求12所述的脂質(zhì)體制劑，其中，所述手性陽(yáng)離子磷脂是DOTAP。14. 如權(quán)利要求13所述的脂質(zhì)體制劑，其中，所述脂質(zhì)體制劑中的D0TAP的濃度是2 - 8mM〇15. 如權(quán)利要求13或14所述的脂質(zhì)體制劑，其中，所述手性陽(yáng)離子脂質(zhì)是R-DOTAP。16. 如權(quán)利要求12-15中任一項(xiàng)所述的脂質(zhì)體制劑，其包含膽固醇和選自下組的至少一 種磷脂:卵磷脂(PC)、磷酸乙醇胺(PE)和磷酸甘油(PG)。17. 如權(quán)利要求16所述的脂質(zhì)體制劑，其中，所述磷脂是選自下組的卵磷脂(PC): DLPC、DSPC、DPPC、DMPC、DOPC、EPC和EPC3。18. 如權(quán)利要求17所述的脂質(zhì)體制劑，其中，所述卵磷脂是蛋卵磷脂(EPC)。19. 如權(quán)利要求12-18中任一項(xiàng)所述的脂質(zhì)體制劑，其中，所述手性陽(yáng)離子磷脂佐劑是 R-DOTAP，且其在所述脂質(zhì)制劑中的含量是15~30%(mol/mol)。20. 如權(quán)利要求12-19中任一項(xiàng)所述的脂質(zhì)體制劑，其包含含量為25-55% (mol/mol)的 膽固醇。21. 如權(quán)利要求12-20中任一項(xiàng)所述的脂質(zhì)體制劑，其包含含量為30-80% (mol/mol)的 卵磷脂(PC)。22. 如權(quán)利要求12-21中任一項(xiàng)所述的脂質(zhì)體制劑，其中所述制劑的脂質(zhì)體顆粒的顆粒 表面電荷2 17mV。23. 如權(quán)利要求12-22中任一項(xiàng)所述的脂質(zhì)體制劑，其中抗原荷載是0.5-1.5mg/mL。24. 如權(quán)利要求12-23中任一項(xiàng)所述的脂質(zhì)體制劑，其中所述制劑中至少70%的脂質(zhì)體 顆粒的粒徑為50~500nm。25. 如權(quán)利要求12-24中任一項(xiàng)所述的脂質(zhì)體制劑，其包含 (i)如權(quán)利要求10所述的生存素組合物， (i i)脂質(zhì)組分R-D0TAP、膽固醇和EPC， (i i i)在所述制劑中具有3 - 5mM的濃度的R-D0TAP， (i v)脂質(zhì)體顆粒，其中至少70 %的所述顆粒的粒徑是50 - 2 50nm，和 (v)0.5mg/mL( ±0. lmg/mL)的抗原荷載。26. 如權(quán)利要求25所述的脂質(zhì)體制劑，其中 (i) 所述截短型生存素如SEQ ID N0:3所示并且是非糖基化的，其中40%(±5%)的所 述截短型生存素被葡萄糖酸化，和 (ii) 脂質(zhì)組合物的含量是： 10-30%R-D0TAP、 25-55%膽固醇，和 30-60%EPC(mol/mol)。27. -種免疫刺激性疫苗，其包含如權(quán)利要求12-26中任一項(xiàng)所述的脂質(zhì)體制劑，任選 地還包含藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體、賦形劑、添加劑或稀釋劑。28. 如權(quán)利要求27所述的免疫刺激性疫苗，其通過疫苗接種在人個(gè)體的預(yù)防或治療中 應(yīng)用，其中所述個(gè)體患有癌癥或癌癥相關(guān)的疾病，或具有患癌癥或癌癥相關(guān)疾病的傾向，其 中所述癌癥或癌癥相關(guān)的疾病基于生存素特異性腫瘤細(xì)胞的存在。29. 用于如權(quán)利要求28所述應(yīng)用的免疫刺激性疫苗，其用于治療人個(gè)體，其中，所述疫 苗接種觸發(fā)所述個(gè)體中的生存素特異性免疫應(yīng)答。30. 用于如權(quán)利要求29所述的應(yīng)用的免疫刺激性疫苗，其中CD4+和/或CD8+T細(xì)胞應(yīng)答被 引發(fā)。31. 用于如權(quán)利要求28-30中任一項(xiàng)所述應(yīng)用的免疫刺激性疫苗，其中采用所述疫苗進(jìn) 行的疫苗接種抑制或阻止腫瘤生長(zhǎng)。32. -種藥物組合物，其包含如權(quán)利要求12-26中任一項(xiàng)所述的脂質(zhì)體制劑，或如權(quán)利 要求27所述的免疫刺激性疫苗，和選自下組的抗腫瘤劑：環(huán)磷酰胺、卡鉑、紫杉醇和NHS-IL12〇
【文檔編號(hào)】C07K14/435GK105873941SQ201480068752
【公開日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2014年12月16日
【發(fā)明人】S·蓋斯勒, P·伯尼福特, J·普拉什克, M·維岡特, S·杰克爾, R·凱爾納, T·里斯奧克, D·穆勒-珀帕拉, K·漢斯
【申請(qǐng)人】默克專利有限公司