一種分離、純化重組蛋白的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種分離、純化重組蛋白的方法。該方法包括：在大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)目的蛋白的包涵體，用PEG沉淀法對變性包涵體進(jìn)行純化后，再進(jìn)行變性、復(fù)性過程，并進(jìn)一步采用色譜純化技術(shù)，最終獲得高純度、高活性的重組蛋白產(chǎn)品。該方法提供了一種快速、低成本、高質(zhì)量的重組蛋白的分離純化方法。本發(fā)明提供的方法可用于表達(dá)、純化生物大分子目的蛋白，具體包括細(xì)胞因子、酶、抗菌肽、抗體或抗體片段，尤其包括人IL?15。本發(fā)明操作簡便，成本低，可應(yīng)用于大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)。
【專利說明】
一種分離、純化重組蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種分離純化重組蛋白的方法，具體公開了一種運(yùn)用PEG沉淀與色譜 技術(shù)，從大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)純化重組蛋白如細(xì)胞因子包括人IL-15的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 重組蛋白是應(yīng)用重組DNA或RNA技術(shù)，在大腸桿菌、酵母、昆蟲細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞 等系統(tǒng)獲得的蛋白質(zhì)。目前，生物醫(yī)藥領(lǐng)域的大多數(shù)產(chǎn)品均為重組蛋白類產(chǎn)品，例如酶、重 組細(xì)胞因子、單克隆抗體及其衍生產(chǎn)品等。由于大腸桿菌系統(tǒng)具有周期短、成本低、操作方 便等優(yōu)點(diǎn)，成為重組蛋白的首選表達(dá)系統(tǒng)。然而大腸桿菌胞內(nèi)缺乏合適的氧化還原環(huán)境，且 表達(dá)系統(tǒng)的高效率使得外源蛋白累積速率較快，使得這些蛋白不能及時(shí)折疊，從而極易形 成不可溶的包涵體。據(jù)報(bào)道，只有10%左右的哺乳動(dòng)物細(xì)胞來源的蛋白在大腸桿菌系統(tǒng)能 夠獲得可溶性表達(dá)，其余大部分蛋白都以包涵體形式表達(dá)。為提高蛋白表達(dá)的可溶性，人們 嘗試將麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP)、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)等促溶性純化標(biāo)簽與目的蛋白進(jìn)行融 合表達(dá)，并在標(biāo)簽與目的蛋白之間添加蛋白酶識別位點(diǎn)，如凝血酶（Thrombin)，腸激酶 (Enterokinase)，Xa因子，煙草蝕紋病毒蛋白酶(TEV)等，在純化后采用相應(yīng)的蛋白酶將促 溶標(biāo)簽切除。該方案雖然能夠促進(jìn)表達(dá)產(chǎn)物的可溶性，但酶的添加、去除及相應(yīng)的驗(yàn)證步驟 都大大增加生產(chǎn)成本，因此不適合大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)。根據(jù)已上市的生物藥物的生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)， 大腸桿菌系統(tǒng)生產(chǎn)的產(chǎn)品仍主要以包涵體形式表達(dá)，因此包涵體的純化及其變性、復(fù)性過 程直接關(guān)系到大規(guī)模生產(chǎn)的效率及生產(chǎn)成本，發(fā)展新型的純化技術(shù)，提高包涵體的純化效 率具有重要意義。
[0003] 重組人白細(xì)胞介素15(IL-15)是一個(gè)114個(gè)氨基酸的細(xì)胞因子，含有2對分子內(nèi)二 硫鍵。它與IL-2、IL-7在激活T細(xì)胞活化和增殖、增強(qiáng)免疫力方面具有類似的作用，而在刺激 記憶性T細(xì)胞、D8效應(yīng)細(xì)胞及NK細(xì)胞方面更有優(yōu)勢。因此，IL-15作為腫瘤免疫治療及疫苗佐 劑，具有非常好的臨床應(yīng)用前景，目前，世界范圍內(nèi)已有多項(xiàng)IL-15相關(guān)的臨床I期及II期試 驗(yàn)處于研究中。但I(xiàn)L-15蛋白的單體不穩(wěn)定，表達(dá)和純化工藝都較困難。目前已有報(bào)道的臨 床級樣品采用大腸桿菌系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)，產(chǎn)物以包涵體形式存在，大量宿主雜蛋白參與了包 涵體的形成過程，這些雜蛋白的存在不但對后續(xù)的色譜純化造成難度，且對IL-15變性后的 復(fù)性效率造成影響，進(jìn)一步降低IL-15的收率。因此，為提高IL-15重組蛋白的純化效率，必 須首先解決包涵體的純化問題。現(xiàn)有的包涵體純化策略為高濃度鹽酸胍變性條件下進(jìn)行S-200分子篩層析。由于分子篩的上樣量一般不超過柱體積的5%，該方法需要大量的S-200介 質(zhì)，相應(yīng)的緩沖液中含有高濃度的變性劑，使得操作過程費(fèi)時(shí)費(fèi)力，成本高昂，成為重組人 IL-15生產(chǎn)工藝的瓶頸。因此，改善包涵體的純化工藝，對于提高重組人IL-15的生產(chǎn)水平具 有重要意義。本說明中以重組IL-15為例對本發(fā)明進(jìn)行闡述，具有一定的代表性和推廣價(jià) 值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，采用PEG沉淀的方法將目的蛋白從包涵 體中進(jìn)行純化，經(jīng)過復(fù)性后，結(jié)合色譜分離技術(shù)，獲得高純度和高活性的重組蛋白產(chǎn)品，包 括細(xì)胞因子，治療用酶，單克隆抗體及抗體片段等。
[0005] 具體為，本發(fā)明提供一種PEG沉淀與色譜技術(shù)結(jié)合從大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)和純化重 組細(xì)胞因子的方法，所述方法包括如下步驟：
[0006] (1)構(gòu)建目的蛋白表達(dá)載體:將目的蛋白編碼基因序列插入到原核表達(dá)質(zhì)粒上，構(gòu) 建獲得目的蛋白表達(dá)載體；
[0007] (2)將步驟(1)中所得目的蛋白表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌的宿主細(xì)胞，獲得轉(zhuǎn)化的 宿主，并在表達(dá)條件下，培養(yǎng)和誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化的宿主，從而表達(dá)目的蛋白；
[0008] (3)收集步驟(2)中表達(dá)目的蛋白的宿主菌，采用高壓均質(zhì)或超聲波等方法破碎菌 體，并采用過濾或離心等方法分離不可溶成分，采用緩沖液洗滌后得到含有目的蛋白的包 涵體成分；
[0009] (4)在步驟(3)所得包涵體中加入變性劑進(jìn)行變性，高速離心后取上清部分，得到 目的蛋白包涵體的變性液；
[0010] (5)在步驟(4)中所得溶液中加入一定濃度的PEG，使所述變性液濃度達(dá)到1 %到 25%，攪拌均勻后靜置離心，大部分宿主雜蛋白存在于上清中，目的蛋白存在于沉淀中從而 得到分離；
[0011] (6)將步驟(5)中PEG沉淀后的蛋白重新溶解在變性液中，獲得純化后的目的蛋白 變性液；
[0012] (7)將步驟(6)所得目的蛋白變性液通過復(fù)性手段進(jìn)行復(fù)性，得到目的蛋白的復(fù)性 溶液，所述復(fù)性手段包括稀釋、透析及柱上復(fù)性；
[0013] (8)將步驟(7)中含有復(fù)性后目的蛋白依次進(jìn)行疏水作用層析、離子交換層析及分 子篩層析等分離過程，除去雜蛋白，獲得終產(chǎn)品。
[0014] 優(yōu)選的，在上述步驟(4)中，首先對目的蛋白的包涵體進(jìn)行變性。
[0015] 優(yōu)選的，所述PEG的分子量范圍為2000-20000。
[0016] 優(yōu)選的，所述PEG的濃度范圍為1 %-25%。
[0017] 優(yōu)選的，所述變性劑為尿素或鹽酸胍，所述變性劑的用量為4-8M。
[0018] 本發(fā)明另一方面還公開一種上述方法在表達(dá)、純化生物大分子目的蛋白中的應(yīng) 用。
[0019] 優(yōu)選的，所述生物大分子目的蛋白為基因重組藥物產(chǎn)品，包括細(xì)胞因子、酶、抗菌 肽、抗體或抗體片段，其中，所述細(xì)胞因子包括人IL-15。
[0020] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明采用PEG沉淀方法特異性地沉淀目的蛋白，由于宿主蛋白 仍存在于溶液中，從而可通過離心的方法使目的蛋白得到純化，具體在以下幾個(gè)方面表現(xiàn) 出優(yōu)異的效果：
[0021] 1)現(xiàn)有的分子篩技術(shù)用于純化變性的蛋白，受限于分子篩的分辨率較低，仍有較 多與目的蛋白分子量接近的雜蛋白不能去除，而PEG沉淀所采用的PEG分子量、溶液鹽濃度 等得到優(yōu)化，沉淀中目的蛋白純度較高；
[0022] 2)現(xiàn)有技術(shù)中的分子篩柱層析，由于上樣量一般不高于柱體積的5%，因此處理樣 品時(shí)需大體積的層析柱及大量介質(zhì)，成本高昂，而PEG價(jià)格便宜，用量小，因此本發(fā)明具有試 劑耗材的成本優(yōu)勢；
[0023] 3)現(xiàn)有技術(shù)中的分子篩柱層析需經(jīng)過平衡，上樣，洗脫的多個(gè)步驟，隨著處理量的 增加所需時(shí)間也線性增加;而PEG沉淀所需的沉淀時(shí)間固定，離心速度較快，因此本發(fā)明能 夠節(jié)省時(shí)間，降低成本。
【附圖說明】
[0024] 圖1是本發(fā)明中分離、純化重組蛋白方法的流程圖。
[0025]圖2是采用本發(fā)明技術(shù)表達(dá)重組人IL-15的SDS-PAGE及Western鑒定。目的蛋白分 子量約12kDa，Western Blot使用anti-human IL-15的單克隆抗體。
[0026]圖3是不同濃度PEG沉淀后，所得到上清與沉淀的SDS-PAGE。
[0027] 圖4是PEG沉淀后重組人IL-15蛋白的復(fù)性SDS-PAGE分析。
[0028]圖5是經(jīng)過PEG沉淀純化及復(fù)性的IL-15蛋白進(jìn)行疏水作用層析的色譜圖。
[0029]圖6是重組人IL-15疏水作用層析的SDS-PAGE分析。
[0030]圖7是IL-15蛋白進(jìn)行陰離子交換層析的色譜圖。
[0031]圖8是IL-15蛋白進(jìn)行陰離子交換層析的SDS-PAGE分析。
[0032]圖9是IL-15蛋白進(jìn)行分子篩層析的色譜圖。
[0033]圖10是IL-15蛋白進(jìn)行分子篩層析的SDS-PAGE分析。
[0034]圖11是對本方法純化的重組人IL-15產(chǎn)品進(jìn)行RP-HPLC分析。。
[0035]圖12是對本方法純化的重組人IL-15產(chǎn)品進(jìn)行淋巴細(xì)胞瘤CTLL-2細(xì)胞增殖的活性 檢測。
【具體實(shí)施方式】
[0036]以下結(jié)合附圖與具體實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。
[0037]本發(fā)明所述分離、純化重組蛋白方法的流程可如圖1所示。具體如下：
[0038] 實(shí)施例
[0039] 1.重組人IL-15的表達(dá)
[0040] (1)重組人IL-15表達(dá)載體和宿主菌的構(gòu)建
[0041]人白介素_15(IL-15)的編碼基因序列如SEQ ID N0.1所示，擴(kuò)增片段并插入到 pET28b載體的Nco I與Xho I酶之間，轉(zhuǎn)化DH5a菌株，得到表達(dá)載體pET28b/IL-15。通過測序 驗(yàn)證載體構(gòu)建正確后，將質(zhì)粒按照堿裂解法抽提并轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌BL21(DE3)，獲得轉(zhuǎn)化的 宿主菌。
[0042] (2)重組人IL-15的表達(dá)
[0043]將含有重組質(zhì)粒pET28b/IL-15的表達(dá)宿主菌單菌落接種于Kan+的LB液體培養(yǎng)中， 37 °C 200rpm條件下培養(yǎng)12小時(shí)，作為種子菌。取種子菌，按1:100體積比接種于無菌的Kana+ LB培養(yǎng)基中，37 °C 200rpm條件下培養(yǎng)3小時(shí)，0D600達(dá)到1左右。加入終濃度為ImM的IPTG誘導(dǎo) 重組人IL-15的表達(dá)，在誘導(dǎo)前及誘導(dǎo)的1、2、3小時(shí)分別收集菌液，制備還原的蛋白電泳樣 品，采用4_20%SDS_PAGE進(jìn)行電泳，并用anti-human IL-15的一抗進(jìn)行Western鑒定。
[0044]結(jié)果如圖2所示。泳道1:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道2:重組人IL-15蛋白標(biāo)準(zhǔn)品lyg; 泳道3:大腸桿菌BL21(DE3)誘導(dǎo)前全菌蛋白；泳道4:誘導(dǎo)lh后全菌蛋白；泳道5:誘導(dǎo)2h后全 菌蛋白；泳道6:誘導(dǎo)3h后全菌蛋白。從圖2中可見，經(jīng)誘導(dǎo)后目的蛋白得到迅速表達(dá)。
[0045] 2.重組人IL-15包涵體的PEG沉淀純化
[0046] 將誘導(dǎo)后的菌液進(jìn)行離心收集，經(jīng)過高壓均質(zhì)破碎后，離心獲得含有重組人IL-15 的包涵體。取洗滌干凈的包涵體約5g，在50m 1變性液（5OmM Tr i s-HC1，5mM EDTA，10OmM DTT，7M鹽酸胍，pH 8.0)中溶解（1 OmL/g包涵體），4°C孵育2小時(shí)溶解包涵體。再23000rpm，4 °C，離心30min，上清液即IL-15變性液。將該上清分為6份，分別在磁力攪拌器上流加等體積 的預(yù)冷的2 %、5 %、10 %、20 %、30 %、40 %的roG6000，使作用體系中PEG的終濃度分別為 1%、2.5%、5%、10%、15%、20%，靜置沉淀1小時(shí)后，離心分別收集上清和沉淀，進(jìn)行SDS-PAGE分析，如圖3所示。從圖中可見，在所檢測的濃度范圍內(nèi)，PEG沉淀后都能夠使大量雜蛋 白留在上清中，沉淀中的IL-15得到顯著純化。
[0047] 3.重組人IL-15蛋白的復(fù)性
[0048]采用終濃度5%的PEG沉淀后，離心收集經(jīng)過純化的蛋白，再次溶解在變性液中 (50mM Tris-HCl，5mM EDTA，7M鹽酸胍，pH 8.0,新鮮添加6mM DTE)。低速搖動(dòng)溶解2小時(shí)后， 12000rpm，4°C，離心30min，取上清轉(zhuǎn)移到干凈容器中，待進(jìn)行下一步的稀釋復(fù)性。
[0049] 準(zhǔn)備預(yù)冷的復(fù)性液（100禮1^8,2!111^0了4,0.511^精氨酸，？!19.5)，新鮮添加谷 胱甘肽GSSG、GSH各ImM，采用蠕動(dòng)栗將變性液緩慢滴加到50倍體積的復(fù)性液中進(jìn)行稀釋復(fù) 性。在滴加結(jié)束后調(diào)整復(fù)性液的pH值至7.4，添加 NaCl濃度至1.2M，待進(jìn)行下一步的疏水作 用層析。由于IL-15復(fù)性后若正確折疊能夠恢復(fù)高級結(jié)構(gòu)，在電泳過程，與未折疊的線性IL-15 在 SDS-PAGE 中泳動(dòng)速度有差異， 因此可觀察到兩條帶，如圖 4 所示。泳道 1 為還原后的重組 人IL-15標(biāo)準(zhǔn)品對照。泳道2為復(fù)性后樣品。從圖中可見，重組人IL-15達(dá)到部分復(fù)性，未正確 折疊的部分可在后續(xù)純化過程中去除。
[0050] 4.重組人IL-15蛋白的柱層析純化
[0051 ] 重組人IL-15經(jīng)過PEG沉淀純化及復(fù)性后，經(jīng)過三步純化制得純品，分別為Butyl HP疏水作用層析，Source 15Q陰離子層析，Superdex 75分子篩層析。詳細(xì)過程如下：
[0052] (1)疏水作用層析
[0053]采用GE的Butyl HP填料，將層析柱首先用 100mM Tris-HCl，2mM EDTA，0.5M L-精 氨酸，1.2M NaCl，pH7.4的緩沖液進(jìn)行平衡，上樣后再采用1.2M NaCl，20mM Tris-HCl， pH7.4的緩沖液洗柱至基線平，再采用線性洗脫，10個(gè)柱體積過渡到洗脫緩沖液100mM鹽酸 胍，20mM Tris-HCl，pH7.4。監(jiān)測電導(dǎo)值及280nm紫外吸收值，如圖5所示。收集紫外峰值處的 蛋白溶液，進(jìn)行非還原的SDS-PAGE電泳分析，如圖6所示。泳道R為重組人E-15標(biāo)準(zhǔn)品對照， 泳道P為復(fù)性液，泳道1-4對應(yīng)色譜圖中的1-4位置。圖中箭頭指示位置為正確折疊的IL-15， 可見復(fù)性后的IL-15被富集，絕大部分未復(fù)性的IL-15被去除。
[0054] (2)陰離子交換層析
[0055] 采用GE的Source 15Q填料，將層析柱首先用采用50mM Tris，lmM EDTA，100mM 恥(：1，？!17.4的緩沖液進(jìn)行平衡，上樣后5〇111]\11^8，1111]\^0了4，1]\1恥(：1，？!17.4的緩沖液作 為洗脫緩沖液，40個(gè)柱體積進(jìn)行線性洗脫，監(jiān)測電導(dǎo)值及280nm紫外吸收值，如圖7所示。收 集紫外峰值處的蛋白溶液，進(jìn)行還原樣品的SDS-PAGE電泳分析，如圖8所示，泳道a-j對應(yīng)圖 7色譜圖中的位置?？梢娪镜纄、f所對應(yīng)的的峰值處重組人IL-15得到純化，可去除高分子量 的雜蛋白。
[0056] (3)分子篩層析
[0057]采用GE公司的Superdex 75pg填料，將前步純化的蛋白濃縮后進(jìn)一步去除二聚體 等高分子量雜質(zhì)。監(jiān)測電導(dǎo)值及280nm紫外吸收值，如圖9所示。收集紫外峰值處的蛋白溶 液，進(jìn)行非還原樣品的SDS-PAGE電泳分析，如圖10所示，泳道Μ為分子量Marker;泳道R為重 組人IL-15標(biāo)準(zhǔn)品對照;泳道C為陰離子交換洗脫蛋白；泳道P為陰離子交換純化蛋白濃縮后 樣品；泳道1-4對應(yīng)圖10色譜圖中的位置。從圖中可見，重組人IL-15具有很高的純度，可采 用高分辨率的RP-HPLC進(jìn)一步分析。
[0058] 5.重組人IL-15蛋白的HPLC純度分析
[0059]將本發(fā)明方法制備的重組人IL-15產(chǎn)品采用RP-HPLC方法進(jìn)行純度檢測，具體方法 為:A相:去離子水(0.08%TFA，0.02%FA)
[0060] B相：乙腈ACN(0 · 08 % TFA，0 · 02 % FA)
[0061 ]柱子:XBridge 8冊300(：18,3.54111，250臟，此^6^;雙柱串聯(lián)
[0062]柱溫：20 Γ [0063] 檢測波長：210nm
[0064] 流速：0· 14mL/min
[0065] 方法：
[0067]以重組人IL-15標(biāo)準(zhǔn)品及其進(jìn)行脫酰胺處理后的樣品作為對照，根據(jù)保留時(shí)間分 析本方法所純化的IL-15產(chǎn)品的純度，其色譜圖如圖11所示。根據(jù)分析，重組人IL-15產(chǎn)品的 純度達(dá)到95%以上，脫酰胺部分少于5%。
[0068] 6.重組人IL-15蛋白的活性分析
[0069]采用本發(fā)明方法制備的重組人IL-15產(chǎn)品采用CTLL-2細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)進(jìn)行產(chǎn)品生物 學(xué)活性檢測，具體方法為:CTLL-2細(xì)胞以20000細(xì)胞/1 OOyL/孔接種到96孔板，加入不同濃度 梯度的重組人IL_15(從0.01ng/mL到lng/mL)，37°C培養(yǎng)48小時(shí)后，每孔加入CCK-8試劑10μ L，繼續(xù)在37°C孵育1小時(shí)，檢測450nm的光吸收值，采用GraphPad軟件繪制四參數(shù)非線性擬 合曲線，并計(jì)算EC50的值。以重組人IL-15標(biāo)準(zhǔn)品作為對照，如圖12所示。軟件計(jì)算得到標(biāo)準(zhǔn) 品的EC50為0.1176ng/mL，本方法產(chǎn)品的EC50為0.1104ng/mL，說明本方法所獲得的重組人 IL-15的生物學(xué)活性與對照品相當(dāng)。
[0070]應(yīng)當(dāng)注意的是，本發(fā)明的實(shí)施例有較佳的實(shí)施性，且并非對本發(fā)明作任何形式的 限制，任何熟悉該領(lǐng)域的技術(shù)人員可能利用上述揭示的技術(shù)內(nèi)容變更或修飾為等同的有效 實(shí)施例，但凡未脫離本發(fā)明技術(shù)方案的內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對以上實(shí)施例所作的 任何修改或等同變化及修飾，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種分離、純化重組蛋白的方法，所述方法具體包括如下步驟： (1) 在大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)目的蛋白的包涵體； (2) 將步驟（1)所得包涵體成份中加入變性劑進(jìn)行變性，得到目的蛋白包涵體的變性 液； (3) 使用PEG沉淀法，純化步驟（3)所得目的蛋白包涵體變相液，得到純化后的目的蛋 白； (4) 在步驟(3)所得純化后的目的蛋白中，再次加入變性液進(jìn)行變性，獲得純化后的目 的蛋白變性液； (5) 將步驟(4)所得目的蛋白變性液通過復(fù)性手段進(jìn)行復(fù)性，得到目的蛋白的復(fù)性溶 液； (6) 將步驟(5)所得復(fù)性后目的蛋白依次進(jìn)行色譜純化，得到終產(chǎn)品。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述純化步驟包括:在步驟(3)所得蛋白包 涵體的變性液中，加入PEG溶液，攪拌均勻后靜置一段時(shí)間，離心，沉淀，得到純化后的目的 蛋白。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述PEG的分子量根據(jù)所純化目的蛋白 的特征進(jìn)行優(yōu)化。4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述PEG在變性溶液中的終濃度范圍為 1%-25%〇5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述變性劑選自尿素或鹽酸胍，所述變性 劑的用量為4-8M。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(5)中所述復(fù)性手段包括稀釋、透析及 柱上復(fù)性。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(6)中所述色譜純化包括疏水作用層 析、離子交換層析及分子篩層析步驟。8. -種如權(quán)利要求1-7任一所述的方法在表達(dá)、純化生物大分子目的蛋白中的應(yīng)用。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述生物大分子目的蛋白為基因重組藥物 產(chǎn)品，包括細(xì)胞因子、酶、抗菌肽、抗體或抗體片段，所述細(xì)胞因子包括人IL-15。
【文檔編號】C07K1/30GK105884859SQ201610281661
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年4月29日
【發(fā)明人】朱建偉, 路慧麗, 李寧環(huán), 陳歡歡, 江華, 謝躍慶, 史斯瑋, 張蕾, 丁凱
【申請人】上海交通大學(xué), 美國杰科實(shí)驗(yàn)室有限公司, 杰科（天津）生物醫(yī)藥有限公司