耐輻射絲狀真菌f35及其在吸附鉛生物處理中的應用
【專利摘要】本發(fā)明公開一種耐輻射絲狀真菌F35及其在吸附鉛生物處理中的應用，通過在新疆和碩縣周邊干旱荒漠地區(qū)采集的土壤樣品中分離、篩選、選育、馴化，獲得一株對鉛離子具有高吸附特性的耐輻射單格孢屬真菌（Ulocladium sp.）F35 CGMCC No.11006，與常見真菌菌種有明顯的生理生化特性差異和分子水平的差異性，篩選出的菌株F35能在Pb2+濃度為100mg/L、菌體添加量為0.01g/ml、pH=5、溫度為60℃、吸附時間為10min的情況下，對Pb2+具有最佳吸附效果，作為處理低濃度鉛污染廢水的生物菌，既可以利用菌體的生長吸附鉛離子，也可以直接使用菌體吸附，具有去除率高、反應速度快、無二次污染、操作簡便等優(yōu)點。CGMCC No. 1100620150709
【專利說明】
耐輻射絲狀真菌F35及其在吸附鉛生物處理中的應用
技術領域
[0001]本發(fā)明涉及環(huán)境生物治理技術領域，具體涉及一種耐輻射絲狀真菌在重金屬生物吸附中應用的技術領域。
【背景技術】
[0002]隨著人類活動的加劇，工業(yè)化、城市化、農業(yè)集約化的快速發(fā)展，越來越多的重金屬污染物通過工業(yè)“三廢”、大氣沉降、未經處理的固體廢棄物、污水灌溉向農田轉移，累積到一定程度就會對生態(tài)系統(tǒng)產生危害。目前，在我國土壤重金屬污染中鉛污染分布最廣，其具有強蓄積性和非移動性的環(huán)境污染物，已成為目前水體和土壤污染的主要元素之一。農田土壤被鉛污染后，會對農作物和地下水產生次級污染，直接危害土壤微生物多樣性，并通過食物鏈影響人類健康。因此對重金屬鉛污染水體和土壤修復再利用的研究越來越受到人們的重視。
[0003]當前對于重金屬水污染的治理主要包括物理、化學和生物的修復技術，各有優(yōu)缺點，但總體上目前的修復技術存在效果緩慢，修復需要時間長，成本高等缺點。如何提高現(xiàn)有技術的修復能力是人們關心的問題之一。隨著技術的快速發(fā)展，生物修復技術由于其特殊的優(yōu)越性受到重視，而其中微生物修復是利用細菌、真菌等微生物表面生物大分子吸收轉運、細胞代謝、生物吸附以及氧化還原反應等途徑對重金屬離子進行吸收、沉淀、氧化還原等作用從而降低重金屬離子毒性的方法。相對于物理和化學方法對鉛的修復作用，微生物修復具有修復時間短、菌株繁殖快、相對處理費用低、對環(huán)境影響小、效率高、可就地進行處理等優(yōu)點，但也存在微生物易受環(huán)境影響，不穩(wěn)定等缺點。
[0004]微生物對含鉛廢水的修復作用，主要是通過吸附法、載體結合法、膜包法、共價結合法等。微生物對鉛的吸附作用主要取決于細胞壁的特殊結構，可以與重金屬離子發(fā)生定量的結合作用。目前吸附重金屬的微生物菌株主要集中在含有大量負電荷官能團(如羧基、磷?；?、羥基等)，有很高絡合特性的絲狀真菌等;分泌一些如多糖、蛋白質和核酸類物質，能通過離子交換或絡合作用與重金屬結合形成無毒或低毒金屬-有機化合物的細菌；以及通過菌絲體吸附作用來減少環(huán)境中存在的重金屬的內生菌根和外生菌根。而耐輻射微生物是一類能夠在高輻射劑量下生存的極端微生物資源，對重金屬具有較強的耐受性和吸附性，在重金屬污染治理方面有著極大的應用潛力。
[0005]盡管目前有許多利用微生物修復治理壞境的報道，但是有關能夠篩選出性能穩(wěn)定且對鉛污染水體具有較高耐受性和較強的吸附性能的優(yōu)良菌種鮮見報道，因此需要進一步探究微生物對重金屬鉛的吸附能力，為微生物修復重金屬鉛污染提供具有相對高吸附能力且性能穩(wěn)定的抗性菌株，對于治理鉛污染環(huán)境具有現(xiàn)實意義。

【發(fā)明內容】

[0006]針對現(xiàn)有技術中未見有關耐輻射絲狀真菌及其在吸附重金屬鉛中應用的相關報道，且分離篩選的菌種對重金屬具有較強的耐受性和吸附性的技術現(xiàn)狀，本發(fā)明旨在為微生物修復鉛污染提供具有相對高吸附能力且性能穩(wěn)定的抗性菌株。本發(fā)明通過在土壤樣品中分離篩選出一株對鉛離子有較高吸附特性的耐福射單格孢屬真菌(Ulocladium sp.)F35CGMCC N0.11006，利用分離出的菌種對鉛污染水體進行生物處理，并提供一種利用該菌進行鉛污染水體生物處理中應用技術方案。
[0007]本發(fā)明采用的主要技術方案:
本發(fā)明土壤樣品由新疆農業(yè)科學院微生物應用研究所采自新疆和碩縣周邊干旱荒漠地區(qū)，將采集的土壤樣品放置6qCo經5000 KGy輻照后，以加鏈霉素的PDA培養(yǎng)基為分離培養(yǎng)基，大量篩選優(yōu)選出一批生長良好的耐輻射真菌菌株，從中篩選出一株對鉛離子具有高吸附特性的真菌菌株F35。利用本發(fā)明分離篩選出的編號為F35的真菌菌株對鉛污染水體進行生物處理，該菌株在Pb2+濃度為100 mg/L、菌體添加量為0.01 g/ml、pH=5、溫度為60°C、吸附時間為10 min的情況下，對Pb2+具有最佳吸附效果。
[0008]本發(fā)明具體提供一種耐輻射單格孢屬真菌(Ulocladium sp.)F35 CGMCCN0.11006，通過提供確定的的篩選方法，在采集的土壤樣品中分離篩選和培養(yǎng)，獲得一批真菌類微生物菌株，從中篩選出一株對鉛離子具有高吸附特性的真菌菌株F35，經微生物學分類與鑒定，屬于單格孢屬真菌(Ulocladium sp.)菌株，暫命名為Ulocladium sp.35。
[0009]具體的，本發(fā)明通過對采集土壤樣品放置6QCo5000KGy輻照后，進行分離、篩選和培養(yǎng)，從中篩選出一株編號為F35的菌株，經微生物學分類與鑒定，該菌株屬于單格孢屬真菌(Ulocladium sp.)菌株。該菌株已于申請日前保藏于布達佩斯條約微生物國際保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)。地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編:100101。保藏日期2015年7月9日，菌種保藏號為CGMCC N0.11006。經微生物學鑒定為單格孢屬真菌(Ulocladium sp.)F35。該菌株最適生長條件為:溫度30°C，培養(yǎng)基采用PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯200g/L、葡萄糖20g/L、瓊脂15g/L、蒸餾水lL，pH自然)，培養(yǎng)時間48h;經48h培養(yǎng)后，在PDA培養(yǎng)基表面，菌落呈暗褐色至黑色，中部隆起絨狀，邊緣整齊清晰。將菌種F35通過插片和水壓片的鏡檢觀察，該菌株初生菌絲白色，分生孢子梗短小，菌絲狀，具分枝、分隔。分生孢子成簇生于產孢梗頂端，橢圓形，磚格狀分隔，黑褐色。根據以上形態(tài)特征，參照《真菌鑒定手冊》對F35菌株進行形態(tài)學，生理生化鑒定，并結合分子生物學測序，初步鑒定該菌株為子囊菌門座囊菌綱格孢腔目格孢腔菌科單格孢屬的一個種，暫命名為耐福射單格孢屬真菌Ulocladium sp.F35。
[0010]提取菌株F35總DNA，采用真菌ITS區(qū)通用引物，進行PCR擴增，PCR產物經切膠純化，進行生工測序。將實驗菌株的所得ITS區(qū)序列與GenBank數據庫中的已知序列進行BLAST比較，確定實驗菌株親緣關系最近的種屬。從GenBank數據庫，并結合真菌生物多樣性研究中心數據庫獲得相關種屬的序列，利用MEGA 5.0軟件包采用鄰接法(Neighbor- Joiningmethod)進行聚類分析和系統(tǒng)進化樹構建。
[0011 ] 通過序列比對發(fā)現(xiàn)，菌株F35歸屬于單格孢屬(Ulocladium)，系統(tǒng)進化樹構建顯示菌株F35單獨分枝，與目前已知菌株UlocIadium atrum UAMH 7840、Uloc ladiumcucurbitae HSAUP_XF030282、Ulocladium chartarum UAMH 7842、Ulocladium botrytisUB32、Ulocladium consortiale BMP 3151001、Ulocladium botrytis ATCC 18043具有最大同源性，相似性99.17%，與其余種相似性都在98.33%以下，尚不能確定其確切分類，暫命名為Ulocladium sp.F350
[0012]分子測序結果表明，耐輻射真菌F35 CGMCC N0.11006的ITSl基因序列為547bp。本發(fā)明提供的耐福射單格孢屬真菌(Ulocladium sp.)F35與常見的真菌菌種有明顯的生理生化特性差異和分子水平的差異性，依據菌種生理生化特性分析，分子水平分析及系統(tǒng)分類學的綜合鑒定，編號為F35的菌種盡管與常見的單格孢屬真菌菌種相比，具有共性的一些屬性，但是依據與常見的單格孢屬真菌菌種有明顯的生理生化特性差異和分子水平的差異性，表明F35菌株是一種典型的新菌種，其對重金屬鉛離子的耐受能力、吸附能力更強，從分類學將F35菌株鑒定為耐福射單格孢屬真菌(Ulocladium sp.)。
[0013]通過上述各試驗對編號為F35的菌種與常見的單格孢屬真菌菌種相比，具有共性的一些屬性，但是依據與常見的單格孢屬真菌菌種有明顯的生理生化特性差異和分子水平的差異性，表明F35菌株是一種典型的新菌種，初步鑒定該菌株為子囊菌門座囊菌綱格孢腔目格孢腔菌科單格孢屬的一個種，從菌種分類角度將菌種編號為F35的菌株綜合鑒定為耐福射單格孢屬真菌(Ulocladium sp.)F35。
[0014]本發(fā)明進而提供耐輻射單格孢屬真菌(Ulocladium sp.)F35 CGMCC N0.11006的分尚和培養(yǎng)方法。
[0015]1.分離培養(yǎng)基采用:PDA培養(yǎng)基，每10ml培養(yǎng)基加1%鏈霉素溶液0.3ml，同時加入鉛離子溶液，使其濃度達2000mg/L。
[0016]2.分離和篩選條件:采取梯度稀釋法，稱取1g輻照后的采集土壤樣品于90ml無菌生理鹽水中，30°C活化30min后進行梯度稀釋，選取原液、10—\ 10—2、10—3稀釋液分別涂布于分離培養(yǎng)基平板上，每個處理3個重復，置30°C培養(yǎng)，待長出真菌菌落后挑取形狀、大小、顏色等不同的菌落分別劃線接種于相應的平板，直至無雜菌落。
[0017]經培養(yǎng)篩選確定的耐輻射單格孢屬真菌(Ulocladium sp.)F35 CGMCC N0.11006在TOA培養(yǎng)基上菌株菌落呈暗褐色至黑色，中部隆起絨狀，邊緣整齊清晰;PDA培養(yǎng)基選用馬鈴薯200g/L、葡萄糖20g/L、瓊脂15g/L、蒸餾水IL，pH自然。
[0018]進一步，本發(fā)明提供一種耐福射單格孢屬真菌(Ulocladium sp.)F35 CGMCCN0.11006在鉛污染水體生物處理中應用。通過研究在不同鉛離子濃度、溫度、pH值、接種量和吸附時間條件下對菌體吸附的影響，得到F35對Pb2+的最佳吸附條件是Pb2+濃度100mg/L、菌體添加量0.0I g/ml、pH=5、溫度60 °C、吸附時間I Omin。
[0019]通過實施本發(fā)明具體技術指標，實現(xiàn)本
【發(fā)明內容】
，可以達到以下有益效果:
(I)本發(fā)明提供的耐輻射單格孢屬真菌(Ulocladium sp.)F35 CGMCC N0.11006，具有培養(yǎng)條件簡單，繁殖快的優(yōu)點。
[0020](2)本發(fā)明分離篩選的編號為F35的耐輻射單格孢屬真菌菌株能夠在能在Pb2+濃度為100mg/L、菌體添加量為0.01g/ml、pH=5、溫度為60°C、吸附時間為1min的情況下，對Pb2+具有最佳吸附效果，是一種典型的耐輻射真菌。
[0021](3)本發(fā)明在處理低濃度鉛污染廢水過程中，既可以利用菌體的生長吸附鉛離子，也可以直接使用菌體吸附，具有去除率高、反應速度快、無二次污染、操作簡便等優(yōu)點。
【附圖說明】
[0022]圖1所不為耐福射單格抱屬真菌(Ulocladium sp.)F35 CGMCC N0.11006的菌落和菌體照片，其中，A-菌落照片，B-菌體照片。
[0023]圖2所示為所示為耐福射單格孢屬真菌(Ulocladium sp.)F35 CGMCC N0.11006系統(tǒng)發(fā)育樹狀圖。
[0024]圖3所示為耐福射單格孢屬真菌(Ulocladiumsp.)F35 CGMCC N0.11006鉛離子濃度對吸附效果的影響圖。
[0025]圖4所示為耐福射單格孢屬真菌(Ulocladiumsp.)F35 CGMCC N0.11006鉛離子初始pH對吸附效果的影響圖。
[0026]圖5所不為耐福射單格抱屬真菌(Ulocladiumsp.)F35 CGMCC N0.11006菌體用量對吸附效果的影響圖。
[0027]圖6所示為耐輻射單格孢屬真菌(Ulocladium sp.)F35 CGMCC N0.11006吸附溫度對吸附效果的影響圖。
[0028]圖7所示為耐福射單格孢屬真菌(Ulocladiumsp.)F35 CGMCC N0.11006的吸附時間對吸附效果的影響圖。
[0029]圖8所不為耐福射單格抱屬真菌(Ulocladiumsp.)F35 CGMCC N0.11006吸附鉛離子前紅外光譜圖。
[0030]圖9所不為耐福射單格抱屬真菌(Ulocladiumsp.)F35 CGMCC N0.11006吸附鉛離子后紅外光譜圖。
【具體實施方式】
[0031]下面，舉實施例說明本發(fā)明，但是，本發(fā)明并不限于下述的實施例。本發(fā)明中選用的所有原輔材料，以及選用的菌種培養(yǎng)方法都為本領域熟知選用的，本發(fā)明中涉及到的%都為重量百分比，除非特別指出除外。
[0032]實施例一:耐福射單格抱屬真菌(Ulocladium sp.)F35 CGMCC N0.11006的分離、篩選及鑒定
1、菌種的分離和篩選
本發(fā)明所使用的單格孢屬真菌(Ulocladium sp.F35)由新疆農業(yè)科學院微生物應用研究所從新疆和碩縣周邊干旱荒漠地區(qū)大量采集土壤中取樣，經5000 KGy鈷源進行輻照后分離，利用傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)法分離出土層中的真菌，平板劃線法純化菌株，以不同的培養(yǎng)溫度、PH值、培養(yǎng)基為富集條件，經過優(yōu)化篩選出一批生長良好的真菌菌株，從中優(yōu)選出一株編號為F35的菌株。
[0033]分離步驟:
(I)分離培養(yǎng)基采用:PDA培養(yǎng)基，按照每10ml的PDA培養(yǎng)基加1%鏈霉素溶液0.3ml，同時加入鉛離子溶液，使其濃度達2000mg/L。
[0034](2)分離和篩選條件:采取梯度稀釋法，稱取1g輻照后的土壤樣品于90ml無菌生理鹽水中，30°C活化30min后進行梯度稀釋，選取原液、10—\10—2、10—3稀釋液分別涂布于分離培養(yǎng)基平板上，每個處理3個重復，置30°C培養(yǎng)。待長出真菌菌落后挑取形狀、大小、顏色等不同的菌落分別劃線接種于相應的平板，直至無雜菌落。
[0035]2、菌株的培養(yǎng)條件
(I)編號為F35的菌株的生長培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯200g/L、葡萄糖20g/L、瓊脂15g/L、蒸餾水IL，pH自然，經30 °C、48 h培養(yǎng)。
[0036](2)編號為F35的菌株在28-30°C條件下均能生長，最適生長溫度為30°C，培養(yǎng)時間為 48h。
[0037](3)編號為F35的菌株的生長pH自然。
[0038](4)編號為F35菌株的重金屬耐受能力實驗。
[0039]將該菌種分別接種于含8種重金屬離子，Pb2+濃度范圍在1500-3500mg/L、Cd2+的濃度范圍在50-250mg/L、Hg2+的濃度范圍在400-1200mg/L、Cu2+的濃度范圍在700-1500mg/L、Cr2+的濃度范圍在700-1500mg/L、Co2+的濃度范圍在400-1200mg/L、Zn2+的濃度范圍在800-2000mg/L、Ni2+的濃度范圍在700-1500mg/L的平板上，于30°C進行培養(yǎng)，7d后觀察其生長狀況。耐福射單格孢屬真菌Ulocladium sp.F35對不同重金屬離子的耐受性檢測結果為:本發(fā)明所用的菌種對8種重金屬離子Pb2+、Cd2+、Hg2+、Cu2+、Cr2+、Co2+、Zn2+、Ni2+均具有較高的耐受特性，分別能耐受 3500mg/L、250mg/L、400mg/L、700mg/L、1500mg/L、1200mg/L、2000mg/L、1300mg/L濃度的重金屬離子溶液，結果表明，該菌種對于重金屬離子Pb2+的耐受性最高，在重金屬生物處理中具有良好的應用前景。
[0040]具體的，本發(fā)明通過對采集土壤樣品以5000KGy鈷源進行輻照，進行分離、篩選和培養(yǎng)，從中篩選出一株編號為F35的菌株，經微生物學分類與鑒定，該菌株屬于單格孢屬真菌(Ulocladium sp.)菌株。該菌株已于申請日前保藏于布達佩斯條約微生物國際保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)。地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編:100101。保藏日期2015年7月9日，菌種保藏號為CGMCC N0.11006。經微生物學鑒定為耐輻射單格孢屬真菌Ulocladium sp.F35。該菌株最適生長條件為:溫度30°C，培養(yǎng)基采用I3DA培養(yǎng)基，馬鈴薯200g/L、葡萄糖20g/L、瓊脂15g/L、蒸餾水IL，pH自然，培養(yǎng)時間48h;經48h培養(yǎng)后，在I3DA培養(yǎng)基表面，菌落呈暗褐色至黑色，中部隆起絨狀，邊緣整齊清晰。將菌種F35通過插片和水壓片的鏡檢觀察，該菌株初生菌絲白色，分生孢子梗短小，菌絲狀，具分枝、分隔。分生孢子成簇生于產孢梗頂端，橢圓形，磚格狀分隔，黑褐色。根據以上形態(tài)特征，參照《真菌鑒定手冊》對F35菌株進行形態(tài)學，生理生化鑒定，并結合分子生物學測序，初步鑒定該菌株為子囊菌門座囊菌綱格孢腔目格孢腔菌科單格孢屬的一個種，暫命名為耐福射單格孢屬真菌(Ulocladium sp.)F35。
[0041 ] 分子測序結果表明，耐輻射單格孢屬真菌(Ulocladium sp.)F35 CGMCC N0.11006的ITSl基因序列為547bp，本發(fā)明提供的耐輻射單格孢屬真菌(Ulocladium sp.)F35 CGMCCN0.11006與常見真菌菌種有明顯的生理生化特性差異和分子水平的差異性，依據菌種生理生化特性分析，分子水平分析及系統(tǒng)分類學的綜合鑒定，編號為F35的菌種盡管在生理生化特性和分子水平方面與常見的單格孢屬真菌菌種具有明顯的差異，與常見的真菌菌種相比，其對重金屬鉛離子的耐受能力、吸附能力更強，但是依據分類學鑒定為單格孢屬真菌(Ulocladium sp.)。
[0042]3、菌株F35的生理生化鑒定
形態(tài)特征:該菌種F35經TOA培養(yǎng)基分離培養(yǎng)，在I3DA培養(yǎng)基上菌落呈暗褐色至黑色，中部隆起絨狀，邊緣整齊清晰，挑取疑似單格孢屬真菌菌落進行插片和水壓片的鏡檢觀察，該菌株初生菌絲白色，分生孢子梗短小，菌絲狀，具分枝、分隔。分生孢子成簇生于產孢梗頂端，橢圓形，磚格狀分隔，黑褐色，耐福射單格孢屬真菌(Ulocladium sp.)F35菌落和菌體形態(tài)參見附圖1。
[0043]生理生化特征:對該菌進行了糖發(fā)酵、碳源同化、氮源同化鑒定，該菌株F35在PDA培養(yǎng)基上生長良好，經B1log FF鑒定板試驗，結果表明菌株F35可以利用N-乙?；?β-D-葡萄糖胺、杏苷、D-阿拉伯糖、L-阿拉伯糖、熊果苷、D-纖維二糖、糊精、赤藻糖醇、D-果糖、D-半乳糖、龍膽二糖、a-D-葡萄糖、a-D-葡萄糖-1-磷酸鹽、D-葡萄醛酸、丙三醇、肝糖、2_酮-D-葡萄糖酸、a-D-乳糖、乳果糖、麥芽糖醇、麥芽糖、麥芽三糖、D-甘露糖、D-松三糖、D-蜜二糖、a-甲基-D-半乳糖苷、甲基-D-葡萄糖苷、6-0-D-吡喃葡萄糖酰-D-呋喃果糖、D-蜜三糖、D-核糖、水楊苷、D-山梨醇、水蘇糖、蔗糖、D-海藻糖、松二糖、木糖醇、D-木糖、y-氨基丁酸、反丁烯二酸、a-酮戊二酸、L-蘋果酸、奎尼酸、D-葡萄糖二酸、琥珀酰胺酸、琥珀酸、琥珀酸甲基酯、L-丙胺酸酰胺、L-丙胺酸、L-丙胺酰氨基乙酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、鳥氨酸、L-苯基丙氨酸、脯氨酸、L-絲氨酸、2-氨基乙醇。
[0044]通過上述菌種耐福射單格抱屬真菌Ulocladium sp.F35 CGMCC N0.11006的菌體形態(tài)、培養(yǎng)特征觀察及生理生化指標測定，即通過菌體形態(tài)觀察、菌株培養(yǎng)特征觀察、生長溫度測定、耐性試驗等試驗，與常見的菌種相比，對8種重金屬離子Pb2+、Cd2+、Hg2+、Cu2+、Cr2+、Co2+、Zn2+、Ni2+均具有較高的耐受特性，參照《真菌鑒定手冊》的方法進行，編號為F35的菌種盡管與常見的單格孢屬真菌菌種相比，具有共性的一些屬性，但是依據與常見的單格孢屬真菌菌種有明顯的生理生化特性差異和分子水平的差異性，表明F35菌株是一種典型的新菌種，初步鑒定該菌株為子囊菌門座囊菌綱格孢腔目格孢腔菌科單格孢屬的一個種，從菌種分類角度將菌種編號為F35的菌株綜合鑒定為耐輻射單格孢屬真菌(Ulocladium sp.)F35 ο
[0045]實施例二:耐福射單格抱屬真菌(Ulocladium sp.)F35 CGMCC N0.11006分子水平鑒定
1.DNA提取:真菌提取方法如下:
(l)200mg菌體，液氮研磨，加入3ml 3% CTAB提取緩沖液，65°C水浴45min，4°C4000r/min 離心 20mino
[0046](2)取上清轉到離心管中，加入4μ1 10mg/ml蛋白酶，37°C，水浴lh。
[0047](3)加入800μ1 Tris飽和酚，搖勻13000r/min離心1min;取上清。
[0048](4)加入等體積的氯仿/異戊醇，搖勻，13000r/min離心lOmin，取上清。
[0049 ] (5 )加10mg/ml的RNA酶，37 °C水浴過夜處理。
[0050](6)加入800μ1氯仿/異戊醇，搖勻，13000r/min離心lOmin，取上清。
[0051 ] (7)加600μ1異戊醇，-20 V沉淀30min，收集沉淀，75%酒精，沖洗，超凈臺真空干燥。
[0052](8) 100μ1 TE 溶解DNA，_20 °(:保存?zhèn)溆?。加入Ι?的RNA酶，37°C水浴lh，加入400μ?氯仿/異戊醇(24:1)，12000r/min離心lOmin，重復2次。
[0053]2.1TS基因基因擴增及測序，用真菌ITS基因基因通用引物進行擴增:
引物 ITS11:5 ’ -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3 ’
ITS14: 5 ’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’
PCR 擴增反應體系為5(^1^，反應條件為:95°(:，5111丨11;95°(:，458，57°(:，30s，72°C，90s，30cycles，72° C，7min。擴增產物(約547bp)，PCR擴增產物以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將擴增產物進行測序，將菌株F35的ITSl基因序列進行測定，經測定，耐輻射單格孢屬真菌(Ulocladium sp.)F35 CGMCC N0.11006基因序列為547bp，參見附后提供的基因序列表SEQUENCE LISTING。
[0054]3.1TSl序列比對及系統(tǒng)發(fā)育分析
本發(fā)明通過總DNA的提取、ITSI基因基因的PCR擴增產物進行測序，獲得547bp序列，經GenBank \ Blast同源序列比對分析，其與現(xiàn)有技術所報道的單格孢屬(Ulocladium sp.)同源性較高。從GenBank中獲取標準菌株ITSl基因序列，進行同源進化分析、CLUSTAL X進行多序列比對，并采用MEGA 5.0軟件中的Saitou和Nei的鄰接法(Neighbor Joining)進行系統(tǒng)進化樹的構建，結果參見附圖2。從樹狀圖中可以看出，本發(fā)明提供的耐輻射單格孢屬真菌(Ulocladium sp.)F35 CGMCC N0.11006與常見真菌菌種有明顯的生理生化特性差異和分子水平的差異性，依據菌種生理生化特性分析，分子水平分析及系統(tǒng)分類學的綜合鑒定，編號為F35的菌種盡管在生理生化特性和分子水平方面與常見的單格孢屬真菌菌種具有明顯的差異，與常見的真菌菌種相比，其對重金屬鉛離子的耐受能力、吸附能力更強，但是依據分類學鑒定為單格孢屬真菌(Ulocladium sp.)。
[0055]
實施例三:耐福射單格孢屬真菌Ulocladium sp.F35 CGMCC N0.11006菌體的制備將經活化的本發(fā)明菌株耐福射單格孢屬真菌(Ulocladium sp.)F35 CGMCC N0.11006接種于裝有100ml PDA液體培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，于30°C培養(yǎng)，200rpm振蕩培養(yǎng)72h。利用真空栗抽濾的方式收集菌體，用無菌水洗滌三次后待用。
[0056]實施例四:一種耐輻射單格孢屬真菌Ulocladium sp.F35 CGMCC N0.11006在吸附鉛生物處理中的應用
將該菌株接種于不含鉛離子的液體PDA培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3-5天后，收集菌絲體，進行菌體吸附試驗，研究在不同鉛離子濃度、溫度、PH值、接種量和吸附時間條件下對菌體吸附的影響。
[0057](I)不同鉛離子濃度對耐輻射單格孢屬真菌(Ulocladium sp.)F35 CGMCCN0.11006吸附的影響
稱取菌體各0.lg，分別置于1ml鉛離子濃度為50mg/L、100mg/L、250mg/L、500mg/L、750mg/L、1000mg/L的Pb2+溶液中，靜置吸附3 h后，測定不同鉛溶液濃度對菌體吸附的影響。結果見附圖3，隨著Pb2+濃度的降低吸附率逐漸升高，在Pb2+達到100mg/L時吸附率最高，達66.19%，隨后下降，因此在鉛溶液濃度為100 mg/L時，體現(xiàn)了該菌體對鉛離子的吸附能力最強。
[0058](2)不同鉛離子初始pH值對耐輻射單格孢屬真菌(Ulocladium sp.)F35 CGMCCN0.11006吸附的影響
稱取菌體各0.lg，分別置于1ml鉛離子濃度為100mg/L，pH值為3、4、5、6、7、8、9的Pb2+溶液中，靜置吸附3h后，測定不同pH值對菌體吸附的影響。結果見附圖4，pH值在5時菌株對Pb2+溶液吸附率最高，達70.66%。當pH值升高和降低時吸附率均降低，因此，溶液pH值為5時，體現(xiàn)了該菌體對鉛離子的吸附能力最強。
[0059](3)不同菌體用量對耐福射單格抱屬真菌(Ulocladium sp.)F35 CGMCC N0.11006吸附的影響
分別稱取不同質量的菌體(0.18，0.38，0.58，0.78，1.(^)分別置于101111鉛離子濃度為lOOmg/L的溶液中，靜置吸附3 h后，測定不同質量菌體對吸附的影響。結果見附圖5，菌體用量在0.5 g-1.0 g時吸附率差異不大，1.0g時吸附率最高，達92.19%。但考慮菌體用量過大，成本較高，實際操作困難，因此選取吸附率也較高的0.1g菌體做后續(xù)試驗。
[0060] (4)不同吸附溫度對耐輻射單格孢屬真菌(Ulocladium sp.)F35 CGMCC N0.11006吸附的影響
稱取菌體各0.lg，震蕩懸浮于1ml鉛離子濃度為100mg/L的Pb2+溶液中，分別置于20-80°C水浴中靜置吸附3h后，測定不同溫度對菌體吸附的影響。結果見附圖6，溫度在60°C時菌株對Pb2+溶液吸附率最高，達81.91%，說明該菌株在較高溫度條件下也具有很高的吸附能力。
[0061 ] (5)不同吸附時間對耐輻射單格孢屬真菌(Ulocladium sp.)F35 CGMCC N0.11006吸附的影響
稱取菌體各0.lg，分別震蕩懸浮于1ml鉛離子濃度為100 mg/L的Pb2+溶液中，每間隔5min取樣，測定不同時間對菌體吸附的影響。結果見附圖7，該菌在1min內即完成吸附，1min后吸附率變化不大，趨于飽和，說明該菌株在1min時對鉛離子的吸附率最高。
[0062]綜合以上步驟，可知F35對Pb2+的最佳吸附條件是Pb2+濃度為100mg/L、菌體添加量為0.0I g/ml、pH=5、溫度為60 °C、吸附時間為I Omin。
[0063]實施例五:紅外光譜分析
將F35在含0mg/L和100mg/L的Pb2+的TOA液體培養(yǎng)基培養(yǎng)后，分別用去離子水洗滌3次，后抽濾收集菌體，烘干，與KBr研磨混勾，在10t/cm2下壓成薄片并維持Imin，用紅外光譜儀測定并記錄其光譜。參見附圖8可知，耐福射單格孢屬真菌(Ulocladium sp.)F35 CGMCCN0.11006吸附Pb2+前后的紅外光譜變化明顯。
[0064]由附圖8，附圖9顯示，耐輻射單格孢屬真菌(Ulocladium sp.)F35 CGMCCN0.11006吸附前后紅外圖譜呈現(xiàn)出明顯的差異，說明吸附前后菌體的結構和功能基團發(fā)生了改變。3229cm—1的N-H酰胺或O-H伸縮振動偏移至3402cm—1處，且吸收峰變寬，但吸收強度變化不大;2924cm—1和2855cm—1的C-H飽和振動沒有發(fā)生明顯的偏移，但吸收強度增幅變大；1742cm—1的C=O酯基振動也沒有發(fā)生明顯的偏移，但吸收強度明顯增大；1646cm—1的C=O酰胺振動略有偏移，且吸收強度增幅變大；1554cm—1的N-H振動偏移至1545cm—1處，且吸收強度增幅變大；1456cm—1和1385cm—1的伯酰胺振動偏移不大，但吸收強度增幅變大。吸收前1160cm—1至1031cm—1為伯醇C-O和OH振動;吸收后1315cm—1和1239cm—1為伯醇O-H振動，發(fā)生了較大的偏移，1077cm—1和1038cm—1為伯醇C-O振動，偏移較小；同時這幾個吸收峰的吸收強度增幅變大。由此表明，細胞表面的這些官能團在吸附鉛離子的過程中起到了配位絡合作用。
[0065]上述實施例僅僅是為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例，而并非對實施方式的限定。對于所屬領域的普通技術人員來說，在上述說明的基礎上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這里無需也無法對所有的實施方式予以窮舉。而由此所延伸出的顯而易見的變化或變動仍處于本發(fā)明的保護范圍之中。
【主權項】
1.一種耐福射單格孢真菌(Ulocladiumsp.)F35，其特征在于，所述的耐福射單格孢真菌(Ulocladium sp.)F35 的CGMCC保藏號為N0.11006。2.如權利要求1所述耐福射單格孢真菌(Ulocladiumsp.)F35在吸附鉛生物處理中的應用。
【文檔編號】C12N1/14GK105886407SQ201610061361
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年1月28日
【發(fā)明人】顧美英, 譚慧林, 張志東, 宋素琴, 王瑋, 朱靜, 唐琦勇, 謝玉清, 張麗娟, 王博
【申請人】新疆農業(yè)科學院微生物應用研究所