枯草芽孢桿菌by7及其降解殘餌和氨氮的應(yīng)用
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一株枯草芽孢桿菌BY7及其降解殘餌和氨氮的應(yīng)用；一株枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)BY7，已于2015年9月29日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCC M 2015585；其16s rDNA如SEQ.ID.NO 1所示?？莶菅挎邨U菌BY7或BY7菌懸液可降解污染水體或水產(chǎn)養(yǎng)殖水體中氨氮和降解飼料中的殘餌。本發(fā)明提供的枯草芽孢桿菌可應(yīng)用于如下方面：(1)由于其具有很強(qiáng)的氨氮降解能力，可用于改善水體的氨氮污染問(wèn)題；可用于降低水產(chǎn)養(yǎng)殖池塘中的氨氮含量；(2)由于其可分解飼料殘餌中的蛋白質(zhì)，可用于降解水產(chǎn)養(yǎng)殖池塘中的殘餌和池底的有機(jī)質(zhì)。本發(fā)明在夏季高溫季節(jié)的養(yǎng)殖池塘中應(yīng)用前景廣闊。CCTCC NO: M201558520150928
【專(zhuān)利說(shuō)明】
枯草芽孢桿菌BY7及其降解殘餌和氨氮的應(yīng)用 一、
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及枯草芽孢桿菌BY7及其降解殘餌和氨氮的應(yīng)用，屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域。 二、
【背景技術(shù)】
[0002] 在水產(chǎn)養(yǎng)殖池塘中，大量投餌所致池底殘餌、糞便等含氮有機(jī)物難以完全被天然 的微生物氧化分解，剩余的有機(jī)物日積月累在池底堆積，污染了池塘的底質(zhì)和水質(zhì)。因此， 人為地施加能大量降解殘餌等的微生物菌種來(lái)加速池底有機(jī)質(zhì)的分解是非常重要的。此 外，由于殘餌、糞便等含氮有機(jī)物被分解后多以氨氮(NH4+-N)的形式被釋放到水體中，導(dǎo)致 水體氨氮含量過(guò)高，影響?zhàn)B殖水產(chǎn)動(dòng)物的生長(zhǎng)，甚至危及養(yǎng)殖動(dòng)物的生命，因此，篩選能降 低水體氨氮的微生物菌種應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)意義重大。
[0003] 枯草芽孢桿菌是我國(guó)農(nóng)業(yè)部允許使用的益生菌之一，由于其作用效果較為明顯， 現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖過(guò)程中的底質(zhì)和水質(zhì)改良。目前使用的枯草芽孢桿菌菌種多是 從自然養(yǎng)殖水體分離的。在溫泉養(yǎng)殖水體中，由于養(yǎng)殖用水直接取自地下溫泉，其微生物菌 種與自然養(yǎng)殖水體中的差異較大。 三、

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明涉及一株枯草芽孢桿菌BY7及其降解殘餌和氨氮的應(yīng)用。是從溫泉養(yǎng)殖水 體中分離篩選出一株高溫下高產(chǎn)蛋白酶、高效降解飼料和氨氮的枯草芽孢桿菌，該菌株在 夏季高溫季節(jié)的養(yǎng)殖池塘中應(yīng)用前景廣闊。
[0005] 枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)BY7，已于2015年9月29日保藏于中國(guó)典型培 養(yǎng)物保藏中心(簡(jiǎn)稱(chēng)CCTCC，地址為:湖北省武漢市武昌區(qū)八一路299號(hào)武漢大學(xué)），保藏號(hào)為 CCTCC Μ 2015585;其 16s rDNA如SEQ.ID.N0 1所示。
[0006] 本發(fā)明還涉及適宜枯草芽孢桿菌BY7生長(zhǎng)的發(fā)酵培養(yǎng)基配方。
[0007] 本發(fā)明還涉及枯草芽孢桿菌BY7的菌懸液。所述菌懸液可用無(wú)菌生理鹽水或PBS重 懸菌體得到。所述菌懸液0D6QQ值可達(dá)到2.0。
[0008] 本發(fā)明還涉及枯草芽孢桿菌BY7或BY7菌懸液在降解污染水體或水產(chǎn)養(yǎng)殖水體中 氨氮的應(yīng)用，包括如下步驟:根據(jù)水體氨氮污染程度將適量的枯草芽孢桿菌BY7或BY7菌懸 液施加于水產(chǎn)養(yǎng)殖水體或氨氮污染水體中，利用枯草芽孢桿菌BY7具有的降解氨氮的能力 來(lái)降低水體中的氨氮。水產(chǎn)養(yǎng)殖水體或污染水體的pH值最好在5.0-8.0之間；水產(chǎn)養(yǎng)殖水體 或污染水體中要有一定的碳源和氮源，C/N在3-7之間均可，最好為6。
[0009] 本發(fā)明還保護(hù)枯草芽孢桿菌BY7或BY7菌懸液在降解飼料殘餌中的應(yīng)用，包括如下 步驟:將適量的枯草芽孢桿菌BY7或BY7菌懸液施加于水產(chǎn)養(yǎng)殖水體中，利用枯草芽孢桿菌 BY7具有的降解蛋白的能力來(lái)降解飼料殘餌。水產(chǎn)養(yǎng)殖水體的pH值最好在5.0-8.0之間均 可;水產(chǎn)養(yǎng)殖水體中要有一定的碳源和氮源，C/N在3-7之間均可，最好為6。
[0010] 本發(fā)明提供的枯草芽孢桿菌，培養(yǎng)方法簡(jiǎn)單、生長(zhǎng)速度快、能耐受高濃度的氨氮、 環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)、安全性高。本發(fā)明提供的枯草芽孢桿菌可應(yīng)用于如下方面：（1)由于其具有 很強(qiáng)的氨氮降解能力，可用于改善水體的氨氮污染問(wèn)題;可用于降低水產(chǎn)養(yǎng)殖池塘中的氨 氮含量；（2)由于其可分解飼料殘餌中的蛋白質(zhì)，可用于降解水產(chǎn)養(yǎng)殖池塘中的殘餌和池底 的有機(jī)質(zhì)。本發(fā)明具有較好的應(yīng)用前景。 四、
【附圖說(shuō)明】
[0011]圖1為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)BY7與同批分離所得菌株分解酪素透明 圈直徑比較。
[0012] 圖1說(shuō)明：將BY7及其他菌株涂布于酪素培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)24h后用游標(biāo)卡尺分別 測(cè)量透明圈直徑及菌落直徑，計(jì)算透明圈直徑與菌落直徑的比值，根據(jù)比值大小可判斷各 菌種分解蛋白的能力。
[0013] 圖2A為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)BY7菌落照片，B為顯微鏡下菌體形態(tài) 照片。
[0014] 圖2中A圖和B圖從形態(tài)學(xué)上對(duì)BY7進(jìn)行了分類(lèi)鑒定。
[0015] 圖3A為枯草芽孢桿菌BY7 16S rDNA電泳圖，B為基于分離菌株和Genbank中收錄的 其他相關(guān)菌株的16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。
[0016]圖3說(shuō)明：基于各菌株16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)可初步鑒定其分類(lèi)學(xué)地位。 [0017] 圖4為培養(yǎng)基C/N(A)、pH值(B)和溫度（C)對(duì)枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) BY7生長(zhǎng)的影響。
[0018] 圖4的目的是確定枯草芽孢桿菌BY7的適宜培養(yǎng)條件。
[0019] 圖5為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)BY7與本實(shí)驗(yàn)室保藏菌株BS2的產(chǎn)蛋白 酶活性比較。
[0020] 圖5的目的是精確比較枯草芽孢桿菌BY7與本實(shí)驗(yàn)室保藏的枯草芽孢桿菌BS2的產(chǎn) 蛋白酶活性差異。
[0021] 圖6為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)BY7對(duì)飼料蛋白的降解效果。
[0022]圖6的目的是檢測(cè)枯草芽孢桿菌BY7降解飼料蛋白的能力。
[0023] 圖7為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)BY7對(duì)水體中氨氮的降解效果。
[0024]圖7的目的是檢測(cè)枯草芽孢桿菌BY7對(duì)水體中氨氮的降解能力。 五、
【具體實(shí)施方式】
[0025] 以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn) 方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自 常規(guī)化試劑商店購(gòu)買(mǎi)得到的。下述實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均 值。以下實(shí)施例中，用于制備各個(gè)培養(yǎng)基的水均為去離子水。以下實(shí)例中，培養(yǎng)基配制完成 后均在121°C溫度下濕熱滅菌20min。以下實(shí)施例中用OD600值表征菌體生長(zhǎng)量。C/N即碳氮質(zhì) 量比，又稱(chēng)碳氮比。
[0026] 基礎(chǔ)培養(yǎng)基:蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化鈉10g，固體另加15g的瓊脂，水1000mL，調(diào) pH 6.0〇
[0027]發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖15g，酵母粉5g，蛋白胨10g，磷酸二氫鉀4.5g，碳酸鈉2g，氯化 鈉5g，硫酸鎂0.2g，微量元素溶液(硫酸鋅0.22g/L，硫酸銅0.08g/L，硫酸錳2.03g/L，硫酸亞 鐵Ο · 2g/L，硼酸 2 · 86g/L，鉬酸銨Ο · 02g/L) Ο · 5mL，水lOOOmL，調(diào)節(jié)pH至6 · 0。
[0028]酪素培養(yǎng)基：分別配制Α液和Β液。Α液：稱(chēng)取磷酸氫二鈉1.07g，干酪素5g，加約 100mL水，加熱溶解。B液:稱(chēng)取磷酸二氫鉀0.36g，加約100mL水溶解。A、B液混合后，加瓊脂 20g，最后用水定容至lOOOmL，調(diào)節(jié)pH至6.0。
[0029]無(wú)色培養(yǎng)基:檸檬酸鈉作為唯一碳源，氯化銨作為唯一氮源，氯化鈉5g，磷酸二氫 鉀0.7g，硫酸鎂lg，微量元素溶液(硫酸鋅0.22g/L，硫酸銅0.08g/L，硫酸錳2.03g/L，硫酸亞 鐵0 · 2g/L，硼酸 2 · 86g/L，鉬酸銨0 · 02g/L) 0 · 5mL，水1000mL，調(diào)節(jié)pH至6 · 0。
[0030] 微量元素溶液：硫酸鋅0.22g，硫酸銅0.08g，硫酸錳2.03g，硫酸亞鐵0.2g，硼酸 2.86g，鉬酸銨0.02g，水1000mL，調(diào)節(jié) pH至6.0。
[0031] 100yg/mL酪氨酸溶液:精確稱(chēng)取在105°C烘至恒重的酪氨酸100yg，逐步加入6mL的 lmol/L的鹽酸使溶解，用0.2mol/L鹽酸定容至100mL，其濃度為1000yg/mL，再吸取此液 1 OmL，以0.2mo 1/L鹽酸定容至100mL，即配成100yg/mL酪氨酸溶液，冰箱內(nèi)保存。
[0032] 2 %酪蛋白溶液:準(zhǔn)確稱(chēng)取干酪素2g，加入0 . lmol/L NaOH溶液10mL，水浴加熱溶 解，然后用pH 7.2的磷酸鹽緩沖液定容至100mL即可，冰箱內(nèi)保存。
[0033]氨氮(NH4+-N)含量通過(guò)ET99732多參數(shù)水質(zhì)快速測(cè)定儀測(cè)定。
[0034]實(shí)例1枯草芽孢桿菌BY7的分離純化及鑒定
[0035] 一、菌種的分離純化
[0036] 1、降蛋白和氨氮菌株的富集
[0037]在岱岳區(qū)溫泉水產(chǎn)養(yǎng)殖試驗(yàn)場(chǎng)的羅非魚(yú)養(yǎng)殖池、淡水白鯧養(yǎng)殖池、烏鱧養(yǎng)殖池、鯉 魚(yú)養(yǎng)殖池、金鯽養(yǎng)殖池中各取水樣100mL，將各養(yǎng)殖池的水樣混合后取5mL接種于裝有100mL 富集培養(yǎng)基(在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加 NH4CI，將氨氮濃度調(diào)至50mg/L得到富集培養(yǎng)基）的錐形瓶 中，37°C、200r/min振蕩培養(yǎng)1天;取培養(yǎng)1天后的培養(yǎng)液lmL再次接種于100mL富集培養(yǎng)基 中，如此反復(fù)富集培養(yǎng)6代。
[0038] 2、降蛋白和氨氮菌株的篩選、分離
[0039]取富集培養(yǎng)至第6代的培養(yǎng)液（OD600值為1.5)lmL于1.5mL的離心管中，80°C煮 15min，處理后的培養(yǎng)液用無(wú)菌水分別稀釋至10-5、10-6、1〇Λ?0-8倍，分別取上述四種稀釋后 的培養(yǎng)液50yL涂布于LB平板，37°C培養(yǎng)14h后觀察菌落形態(tài)特征，挑取形態(tài)上類(lèi)似枯草芽孢 桿菌且生長(zhǎng)快、菌落大、數(shù)量多的菌落，采用三線法進(jìn)行純化，純化3代后，分別進(jìn)行4°C斜面 保存。
[0040]將上述單菌落分別接種于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)12h，然后取適量涂布于酵 素培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)24h，用游標(biāo)卡尺分別測(cè)量透明圈直徑及菌落直徑，計(jì)算其比值，根據(jù) 比值評(píng)價(jià)其分泌蛋白酶的能力，最后獲得生長(zhǎng)迅速且高產(chǎn)蛋白酶的8株菌，分別命名為 BY 1 - BY8 (即 BY 1、BY2、BY3、BY4、BY5、BY7、BY7、BY8)。BY 1 - BY8的透明圈直徑/菌落直徑結(jié)果 見(jiàn)圖1，其中BY7的透明圈直徑與菌落直徑比值最高，達(dá)到了 5.4。
[00411將分離純化的BY1 - BY8分別接種于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)12-16h，分別取 培養(yǎng)物4000rpm離心10min，棄去上清液，用PBS重懸沉淀制成菌懸液，再分別接種于100mL的 篩選培養(yǎng)基(在所述無(wú)色培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上調(diào)整NH 4C1的濃度，調(diào)節(jié)氨氮濃度至300mg//L得到 篩選培養(yǎng)基）中，200r/min振蕩培養(yǎng)1天后測(cè)定氨氮含量，結(jié)果顯示降解氨氮效果最好的菌 株為BY7。
[0042]二、菌種的鑒定 [0043] 1、形態(tài)觀察
[0044]將BY7菌株接種在LB固體培養(yǎng)基平板上，觀察菌落形態(tài)特征。BY7菌株的菌落照片 見(jiàn)圖2A，100倍顯微鏡放大照片見(jiàn)圖2BAY7菌落呈點(diǎn)狀，乳白色，半透明，邊緣光滑，凸起，培 養(yǎng)后期出現(xiàn)褶皺。
[0045] 2、生化鑒定
[0046] 采用Biolog微平板對(duì)BY7菌株進(jìn)行生理生化鑒定，鑒定結(jié)果為Bacillus subtilis。
[0047] 菌株BY7的生理生化反應(yīng)結(jié)果匯總?cè)绫?所示：
[0050] 注："+"表示生長(zhǎng)或陽(yáng)性反應(yīng)；表示不生長(zhǎng)或陰性反應(yīng)。
[0051 ] 3、分子生物學(xué)鑒定
[0052]以BY7菌液為模板進(jìn)行16S rDNA部分序列的PCR擴(kuò)增：
[0053] 正向引物：5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'（如SEQ.ID.N0 2所示），
[0054] 反向引物：5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'（如SEQ.ID.N0 3所示）。
[0055] ?0財(cái)廣增程序:94°(：預(yù)變性41^11，94°(：變性3〇8,56°(：復(fù)性458,72°(：延伸9〇8,35個(gè)循 環(huán)后于72°C延伸7min，4°C保存。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)，電泳結(jié)果 見(jiàn)圖3A。將純化的PCR產(chǎn)物連接到PMD-18T載體上，然后轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，PCR 鑒定為陽(yáng)性的克隆送公司測(cè)序，得到BY7 16s rDNA序列，序列結(jié)果見(jiàn)SEQ.N0.1。將測(cè)序結(jié)果 進(jìn)行13]^81:比對(duì)，利用16831丨811軟件構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)（圖313)，發(fā)現(xiàn)1^7與1^1〇;[11118 811131:;[1丨8聚為 1支。
[0056] 綜合形態(tài)鑒定、生化鑒定和分子生物學(xué)鑒定的結(jié)果，BY7菌株被鑒定為枯草芽孢桿 菌(Bacillus subtilis)，命名為枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)BY7〇
[0057] 枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)BY7，已于2015年9月29日保藏于中國(guó)典型培 養(yǎng)物保藏中心（簡(jiǎn)稱(chēng)CCTCC，地址為：湖北省武漢市武昌區(qū)八一路299號(hào)武漢大學(xué)校內(nèi)，武漢 大學(xué)保藏中心），保藏號(hào)為CCTCC Μ 2015585。
[0058] 三、菌種的安全性評(píng)價(jià)
[0059] 將生長(zhǎng)狀況良好，體重為80g左右的90尾尼羅羅非魚(yú)分為9個(gè)組(每組10尾魚(yú)），分 別設(shè)為:枯草芽孢桿菌BY7組4個(gè)，灌服的枯草芽孢桿菌BY7濃度分別為106、107、10 8、109cfu/ mL;無(wú)乳鏈球菌組4個(gè)，灌服的無(wú)乳鏈球菌濃度分別為106、107、108、10 9〇如/1^;生理鹽水組1 個(gè)，灌服無(wú)菌生理鹽水。每尾魚(yú)灌服lmL菌液或無(wú)菌生理鹽水。結(jié)果如表2所示，飼養(yǎng)10天后 發(fā)現(xiàn)，灌服枯草芽孢桿菌和生理鹽水的死亡率均為〇，而灌服無(wú)乳鏈球菌的尼羅羅非魚(yú)死亡 率在10-30%之間，這說(shuō)明我們分離的枯草芽孢桿菌BY7是安全的。
[0060]表2菌種安全性評(píng)價(jià)結(jié)果
[0062]實(shí)例2枯草芽孢桿菌BY7生長(zhǎng)條件的研究 [0063] 一、C/N對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響
[0064] 1、挑取枯草芽孢桿菌BY7單克隆，接種于10mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，37°C、200r/min振蕩 培養(yǎng)12h(使培養(yǎng)體系中的菌液OD600值達(dá)到1.0)，4000rpm離心10min，收集菌體，用無(wú)菌生理 鹽水洗滌3次。
[0065] 2、將上述菌體用無(wú)菌生理鹽水重懸，各取2mL菌懸液分別接種于9個(gè)盛有100mL無(wú) 色培養(yǎng)基的錐形瓶中（pH為6.0)，分別調(diào)整各錐形瓶培養(yǎng)基中檸檬酸鈉和氯化銨的濃度，使 9個(gè)錐形瓶培養(yǎng)基中的C/N分別為1、3、4、5、6、7、9和11，接著37°C、200r/min振蕩培養(yǎng)，每隔 2h采樣1次測(cè)定菌液OD600值，培養(yǎng)12h后發(fā)現(xiàn)，當(dāng)C/N為6時(shí)，枯草芽孢桿菌BY7生長(zhǎng)最好，C/N 較高或較低時(shí)，枯草芽孢桿菌BY7的生長(zhǎng)都受到一定程度的抑制（圖4A)。因此，適宜枯草芽 孢桿菌BY7生長(zhǎng)的C/N為6。
[0066] 二、pH對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響
[0067] 1、挑取枯草芽孢桿菌BY7單克隆，接種于10mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，37°C、200r/min振蕩 培養(yǎng)12h(使培養(yǎng)體系中的菌液0D6(X)值達(dá)到1.0)，4000rpm離心10min，收集菌體，用無(wú)菌生理 鹽水洗滌3次。
[0068] 2、將上述菌體用無(wú)菌生理鹽水重懸，各取2mL菌懸液分別接種于7個(gè)盛有l(wèi)OOmL無(wú) 色培養(yǎng)基的錐形瓶中（C/N為6)，分別將各錐形瓶中培養(yǎng)基的pH調(diào)整為3.0、4.0、5.0、6.0、 7.0、9.0和11.0，接著37 °C、200r/min振蕩培養(yǎng)，每隔3h采樣1次，測(cè)定菌液OD6QQ值，培養(yǎng)15h 后發(fā)現(xiàn)，pH在5.0-7.0范圍內(nèi)，枯草芽孢桿菌BY7都能保持較好的生長(zhǎng)狀態(tài)（圖4B)，pH為6.0 時(shí)生長(zhǎng)最好。
[0069]結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌BY7具有較強(qiáng)的環(huán)境耐受性，其適宜的C/N和pH與養(yǎng)殖水 體中的環(huán)境基本一致，利于其生長(zhǎng)，具有在水產(chǎn)養(yǎng)殖水體中應(yīng)用的潛力。
[0070] 三、溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響
[0071] 1、挑取枯草芽孢桿菌BY7單克隆，接種于10mL活化培養(yǎng)基中，37°C、200r/min振蕩 培養(yǎng)12h(使培養(yǎng)體系中的菌液0D 6QQ值達(dá)到1.0)，4000rpm離心10min，用無(wú)菌生理鹽水洗滌 沉淀3次，接著將沉淀用無(wú)菌生理鹽水重懸制成菌懸液。
[0072] 2、各取2mL菌懸液分別接種于5個(gè)盛有l(wèi)OOmL無(wú)色培養(yǎng)基(pH 6.0)的錐形瓶中，分 別于20 °C、25 °C、30 °C、35 °C和40 °C下200r/min振蕩培養(yǎng)24h后測(cè)定菌液0D6QQ值，結(jié)果顯示在 25-30 °C下枯草芽孢桿菌BY7生長(zhǎng)最好(圖4C)。
[0073]實(shí)例3枯草芽孢桿菌BY7產(chǎn)蛋白酶活性分析 [0074] 一、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
[0075] 1、按表3配制各種不同濃度的酪氨酸溶液
[0076] 表3配制各種不同濃度的酪氨酸溶液
[0078] 2、取6支試管，標(biāo)為1-6號(hào)，分別加入O-lOmL濃度為lOOyg/mL酪氨酸，配制成表3所 述酪氨酸最終濃度的溶液，再各加入濃度為〇.4mol/L的碳酸鈉溶液5mL和福林試劑lmL。用 混勻器充分混勻后，置37°C恒溫水浴中反應(yīng)20min。
[0079] 3、以1號(hào)管做對(duì)照，分別比色測(cè)定各管A68Q，測(cè)三次，取平均值。
[0080] 4、以酪氨酸濃度為橫坐標(biāo)，凈A68Q值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立回歸方程計(jì)算 出當(dāng)吸光度為1時(shí)的酪氨酸量(yg)，即為吸光常數(shù)K值。
[0081]二、蛋白酶活性測(cè)定
[0082] 1、分別挑取枯草芽孢桿菌BY7與本實(shí)驗(yàn)室保藏的枯草芽孢桿菌BS2單克隆，接種于 10mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，37°C、200r/min振蕩培養(yǎng)12h(使菌液0D6QQ值達(dá)到1.0)，4000rpm離心 lOmin，用無(wú)菌生理鹽水洗滌沉淀3次，接著用無(wú)菌生理鹽水重懸沉淀制成菌懸液。
[0083] 2、將BY7和BS2的菌懸液以體積比5 %的接種量分別接種于1 OOmL的發(fā)酵培養(yǎng)基中， 接著37°C、200r/min振蕩培養(yǎng)48h后取發(fā)酵液各5mL，12000rpm離心5~lOmin，取上清液用pH 7.5的緩沖液稀釋至適當(dāng)濃度，供測(cè)試用。
[0084] 3、取15 X 100mm試管6支并編號(hào)，分為BY7和BS2兩組，每組三個(gè)重復(fù)。每管內(nèi)加入稀 釋后的上清液lmL，置于37°C恒溫水浴中預(yù)熱5min。再各加入同樣預(yù)熱的酪蛋白溶液lmL，搖 勻，精確保溫1 Omin。到時(shí)間后，立即再各加入0.4mo 1/L的三氯乙酸2mL，以終止反應(yīng)，繼續(xù)置 于水浴中保溫lOmin，使殘余蛋白質(zhì)沉淀后離心或過(guò)濾。
[0085] 4、另取15 X 150mm試管6支并編號(hào)，分為BY7和BS2兩組，每組三個(gè)重復(fù)。每管內(nèi)加入 濾液lmL，再加濃度為0.4mol/L的碳酸鈉5mL和福林試劑lmL，搖勻，37°C水浴保溫發(fā)色20min 后進(jìn)彳ΤΑ680測(cè)定。
[0086] 5、空白試驗(yàn)也取三支試管，編號(hào)1、2、3，測(cè)定方法同上，唯在加酪蛋白溶液之前先 加濃度為〇. 4mol/L的三氯乙酸2mL，使酶失活，再加入酪蛋白。
[0087] 6、酶活力的計(jì)算
[0088] 蛋白酶活力(U/mL) = (樣品A68q -對(duì)照A68q) XKXV/TXN
[0089] K:標(biāo)準(zhǔn)曲線中光吸收度為"Γ時(shí)的酪氨酸微克數(shù)；
[0090] V:酶促反應(yīng)總體積；
[0091] T:酶解反應(yīng)時(shí)間(min);
[0092] N:酶液的稀釋倍數(shù)。
[0093]結(jié)果顯示，BS2菌株的產(chǎn)蛋白酶活力為16.61U/mL，而B(niǎo)Y7菌株的產(chǎn)蛋白酶活力為 43.28U/mL(圖5)』Y7的產(chǎn)蛋白酶活力顯著高于BS2，BY7能在水解蛋白質(zhì)方面發(fā)揮作用，可 應(yīng)用于降解水產(chǎn)養(yǎng)殖池塘中的殘餌和池底的有機(jī)質(zhì)。
[0094]實(shí)例4枯草芽孢桿菌BY7降解飼料能力分析
[0095] 1、制備2 %蝦飼料培養(yǎng)基:蝦飼料2g，磷酸二氫鉀4.5g，氯化鈉5g，硫酸鎂0.2g，加 水定容至lOOmL后調(diào)節(jié)pH至6.0。
[0096] 2、挑取枯草芽孢桿菌BY7單克隆接種于10mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，37°C、200r/min振蕩培 養(yǎng)12h(使菌液0D6QQ值達(dá)到1.0)，4000rpm離心10min，用無(wú)菌生理鹽水洗滌沉淀3次，接著用 無(wú)菌生理鹽水重懸沉淀制成菌懸液。
[0097] 3、以體積比2%的接種量將菌懸液接種到含有300mL 2%蝦飼料培養(yǎng)基的三角瓶 中，37°C，200r/min連續(xù)振蕩培養(yǎng)5天，接著5000rpm離心10min分別得到上清和沉淀，沉淀冷 凍干燥后，上清和冷凍干燥的沉淀分別用凱氏定氮法測(cè)定蛋白含量?？瞻捉M僅不接種菌懸 液，其他與加入菌懸液的BY7組操作完全相同。根據(jù)公式:N= (Vi-V〗）X CX 0.0140 X 6.25/m 計(jì)算出各樣品的蛋白質(zhì)含量，其中乂:是加入菌懸液的BY7組滴定時(shí)消耗鹽酸的量(mL)，乂2是 空白組所消耗的鹽酸量(mL)，C是鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液濃度(mol/L)，m是樣品質(zhì)量(g)，6.25為氮換算 為蛋白質(zhì)的平均系數(shù)。
[0098] 結(jié)果顯示，與空白組相比，加入菌懸液的BY7組固體狀態(tài)的蛋白質(zhì)含量明顯降低， 而液體狀態(tài)的蛋白質(zhì)含量則明顯升高（圖6)，即BY7能有效地將固體飼料中的蛋白質(zhì)降解為 液態(tài)形式，降解率高達(dá)66%。由于枯草芽孢桿菌BY7可分解飼料中的蛋白質(zhì)，可用于降解水 產(chǎn)養(yǎng)殖池塘中的殘餌和池底的有機(jī)質(zhì)。
[0099]實(shí)例5枯草芽孢桿菌BY7降解氨氮特性研究
[0100] 1、制備培養(yǎng)基甲：在無(wú)色培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上調(diào)整碳源和氮源的濃度，使氨氮濃度為 300mg/L，C/N為6，pH為6·0。
[0101] 2、挑取枯草芽孢桿菌BY7單克隆，接種于10mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，37°C、200r/min振蕩 培養(yǎng)12-16h(使菌液OD600值達(dá)到1.0)，4000rpm離心10min，用無(wú)菌生理鹽水洗滌沉淀3次，接 著用無(wú)菌生理鹽水重懸沉淀制成菌懸液。
[0102] 4、將lmL菌懸液接種于100mL培養(yǎng)基甲中，37°C、200r/min振蕩培養(yǎng)，每隔24h采樣 一次，檢測(cè)離心后培養(yǎng)基中氨氮濃度并計(jì)算氨氮降解率。氨氮濃度由ET99732多參數(shù)水質(zhì)測(cè) 定儀測(cè)定得到?？瞻捉M僅不接種菌懸液，其他與加入菌懸液的BY7組操作完全相同。
[0103] 氨氮降解率=(初始時(shí)刻培養(yǎng)體系中的氨氮濃度-培養(yǎng)24h后體系中的氨氮濃度)/ 初始時(shí)刻培養(yǎng)體系中氨氮濃度X 100%。
[0104] 結(jié)果顯示，與空白組相比，加入菌懸液的BY7組24h內(nèi)氨氮含量明顯降低，即BY7菌 株可有效分解培養(yǎng)基中的氨氮，120h后的降解率高達(dá)60% (圖7)。由于枯草芽孢桿菌BY7具 有很強(qiáng)的氨氮降解能力，可用于降低水產(chǎn)養(yǎng)殖池塘中的氨氮含量。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一株保藏號(hào)為CCTCC M 2015585的枯草芽孢桿菌BY7;其16s rDNA如SEQ.ID.NO 1所 不。2. 如權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌BY7在降解污染水體或水產(chǎn)養(yǎng)殖水體氨氮中的應(yīng) 用。3. 如權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌BY7在降解水產(chǎn)養(yǎng)殖飼料殘餌中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C02F3/34GK105886422SQ201510854901
【公開(kāi)日】2016年8月24日
【申請(qǐng)日】2015年11月30日
【發(fā)明人】季相山, 王慧, 王曉云, 趙燕, 陳紅菊, 劉洪軍
【申請(qǐng)人】山東農(nóng)業(yè)大學(xué)