一種機械法提取雞胚成肌細胞的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種生物工程技術(shù)領(lǐng)域的細胞提取方法，具體涉及的是一種雞胚成肌細胞的提取方法，包括如下步驟：第一步，雞胚滅菌，取胸大肌放入加D?Hank’s的培養(yǎng)皿中；第二步，修剪肌肉；第三步，用漩渦振蕩器振蕩懸浮胸大?。坏谒牟?，過濾、離心；第五步，細胞鋪板，差速貼壁；第六步，消化獲得成肌細胞；第七步，計數(shù)、種板。本發(fā)明雞胚成肌細胞提取方法，即用機械振蕩法提取雞胚成肌細胞的技術(shù)，保證所提取成肌細胞的純度、數(shù)量、純度及活力均較其他方法高，為進一步開展家禽肌肉發(fā)育調(diào)控機理實驗打下基礎(chǔ)。
【專利說明】
一種機械法提取雞胚成肌細胞
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種生物工程技術(shù)領(lǐng)域的細胞提取方法，具體的說，涉及的是一種雞胚成肌細胞的提取方法。
【背景技術(shù)】
[0002]肌肉組織中含有不同的細胞亞群，包括成肌細胞(Vanden et al.，2004)、肌衛(wèi)星細胞(Mauro et al., 1961)、多能性前體細胞(Jiang et al., 2002)、多潛能干細胞(Caseet al., 2005)等。肌源干細胞目前已被廣泛證明具有橫向分化潛能，能夠分化為3個胚層的組織細胞類型，包括(脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、內(nèi)皮細胞和神經(jīng)膠質(zhì)細胞及血細胞)(Sun et al., 2004；Hwang et al., 2004；Farace et al., 2004)。成肌細胞是主要的肌干細胞，是肌再生修復(fù)的主要種子細胞，起源于胚胎中胚層的干細胞。成肌細胞包括胚胎中的成肌細胞和成熟肌肉組織中的衛(wèi)星細胞，在成熟肌肉組織中，這些衛(wèi)星細胞位于肌膜與肌纖維基底膜之間。在肌肉胚胎發(fā)育過程中先由間充質(zhì)細胞分化為成肌細胞，然后成肌細胞分裂、融合成多核肌纖維，從而形成肌小管(Ehrhardt et al., 2007)。成肌細胞具有與宿主肌肉細胞融合的能力，這也是其移植后的主要歸宿，可以在肌纖維中長期存活，有利于目的基因穩(wěn)定、持續(xù)地表達(Ehrhardt et al.，2007)。成肌細胞具有自我更新和促進肌纖維再生的能力，是體外研究肌肉發(fā)育調(diào)控機理的理想載體。1961年至今，肌干細胞的研究已近半個世紀(jì)(Mauro et al., 1961 )，但是成肌細胞的分離與鑒定的方法仍然具有不確定性。
[0003]由于相關(guān)肌源干細胞的特異標(biāo)志還不清楚，所以目前主要是利用細胞的物理特性來進行純化。目前常用的分離方法有組織塊貼壁、雙酶消化、差速貼壁、percoll分離等(李俊玲等，2007) ο由于分離方法與間充質(zhì)細胞分離方法類似，所以分離得到的細胞系中容易摻雜間充質(zhì)細胞和脂肪細胞等(焦?jié)扇A等，2011)，且耗時長，細胞得率和純度較低。
[0004]深入了解成肌細胞體外的分化過程，能相應(yīng)地調(diào)控對應(yīng)的體內(nèi)肌肉發(fā)育形成過程。有關(guān)家禽成肌細胞的體外培養(yǎng)及生物學(xué)特性方面的研究國內(nèi)少有報道。因此，建立有效的分離、純化和培養(yǎng)方法，是成肌細胞應(yīng)用的前提條件。因此如何將成肌細胞高效分離，純度高，且價格低廉，易于推廣，對更深入研究家禽種質(zhì)資源特性與探究肌肉發(fā)育調(diào)控機理有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種雞胚成肌細胞提取方法，即用機械振蕩法提取雞胚成肌細胞的技術(shù)，保證所提取成肌細胞的純度、數(shù)量、純度及活力均較其他方法高，為進一步開展家禽肌肉發(fā)育調(diào)控機理實驗打下基礎(chǔ)。
[0006]本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的，一種雞胚成肌細胞提取方法，包括如下步驟:
第一步，雞胚滅菌，取胸肌。
[0007]選取12胚齡發(fā)育良好的雞胚，用75%酒精噴灑雞胚蛋殼，用鑷子鈍頭輕輕敲破氣室后，再換用彎頭小鑷子輕輕將氣室處蛋殼捏走，掀走白膜，用彎頭小鑷子將雞胚取出放入超凈臺(放在紫外殺菌的濾紙上)，換用新的彎頭鑷子用鈍面將雞腹部皮膚抹去，將兩側(cè)胸肌都暴露后用直剪刀取出胸大肌，放入已加D-Hank’s的培養(yǎng)皿中。
[0008]第二步，修剪肌肉
把剪下來的胸大肌用D-Hank’s洗三遍，然后把D-Hank’s吸掉，用一個鑷子按住肌肉，另一個彎頭鑷子撕拉肌肉，使其破碎成糜散狀，再用彎頭剪刀剪碎胸大肌，向剪碎后的肌肉里加入2-3ml細胞培養(yǎng)液，將剪碎的胸大肌和細胞培養(yǎng)液一起轉(zhuǎn)移到50ml離心管中，加細胞培養(yǎng)液至10ml。
[0009]第三步，用漩渦振蕩器振蕩懸浮胸大肌
用漩渦振蕩器(功率12W，振蕩頻率>2600次/分鐘)振蕩懸浮胸大肌，振蕩時間為I分鐘(期間振蕩1-2秒停止I秒)，靜置3分鐘后，用移液器收集上清細胞培養(yǎng)液(如此振蕩懸浮4至5次)。
[0010]第四步，過濾、離心
選用100目、400目和600目濾篩放置于直徑為1cm的培養(yǎng)皿上進行過濾，將懸液倒入100目濾篩，去除肉糜和雜質(zhì)，之后將過濾后的細胞懸液再400目和600目逐級過濾，將過濾后的細胞懸液加入新離心管中，將過濾后的細胞懸液加入新離心管中，1200轉(zhuǎn)離心7min，用移液器吸掉上清，加入D-Hanks吹打清洗，重懸后再1000轉(zhuǎn)離心4min，吸掉上清，下層沉淀即為細胞。
[0011]第五步，細胞鋪板，差速貼壁
在所得細胞的離心管中加入5ml細胞培養(yǎng)液，將細胞吹打重懸，吹打時動作要輕柔，以免損傷細胞，將細胞懸液移入直徑為1cm的細胞培養(yǎng)皿中，加細胞培養(yǎng)液至1ml后放入培養(yǎng)箱正常培養(yǎng)。40分鐘后將細胞培養(yǎng)液移入新的細胞培養(yǎng)皿中，如此差速貼壁2次后，隔夜培養(yǎng)。
[0012]第六步，消化獲得成肌細胞
第二天早上，將培養(yǎng)皿中的上層細胞及細胞培養(yǎng)液吸掉，在培養(yǎng)皿表面加入2ml胰酶，I分鐘后細胞基本脫落，加入5ml細胞培養(yǎng)液終止消化，將細胞重懸后加入離心管中，1000轉(zhuǎn)離心4分鐘，用移液器吸掉上清，下層沉淀即為所需成肌細胞。
[0013]第七步，計數(shù)、種板
在離心管中加入2ml細胞培養(yǎng)液，將成肌細胞吹打重懸，取1yL細胞懸液加入200ulPCR管中，再加入10此臺盼藍細胞活性染料，混勻后滴入細胞計數(shù)板計數(shù)。根據(jù)計數(shù)結(jié)果，將細胞懸液按照15?16的密度種板，之后加入適量細胞培養(yǎng)液(六孔板每孔2 mL，96孔板每孔200 yL)輕輕吹打均勻，注意種板一定要均勻。
[0014]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點是:利用漩渦振蕩器振蕩雞胚胸肌，在較短的時間內(nèi)迅速釋放大量的成肌細胞，且在短時間內(nèi)的不連續(xù)振蕩不會對細胞造成損傷，成活率較高，達到95%以上，另外結(jié)合了差速貼壁法，使細胞的純度進一步提高，保證了成肌細胞后續(xù)試驗的順利進行。另外，此方法免去了percoll分離法和雙酶消化法的繁瑣步驟及時間，且省去percoll和酶的費用，價格低廉。
【具體實施方式】
[0015]下面結(jié)合實施例做詳細說明:本實施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程。
[0016]實施例中所用的D-Hank’S為不含|丐離子和鎂離子的平衡鹽溶液，購自BeijingSolarb1 Science & Technology C0., Ltd ;DMEM為含2.5mM L-glutamine、15mM HEPESBuffer、0.IuM sterile Filtered，購自HyClone;膜酶為0.25% Trypsin-EDTA，雙抗含量為10000 Units/ml Penicillin、10000ug/ml streptomycin，胎牛血清均購自gibco。
[0017]實施例中所用的細胞培養(yǎng)液配置如下(以50ml量為例):
胎牛血清:1ml
DMEM:40ml
雙抗:5ul
實施例:
取6個發(fā)育良好的12胚齡雞胚，75%酒精噴灑雞胚蛋殼，用鑷子鈍頭輕輕敲破氣室后，再換用彎頭小鑷子輕輕將氣室處蛋殼捏走，掀走白膜，用彎頭小鑷子將雞胚取出放入超凈臺(放在紫外殺菌的濾紙上)，用彎頭鑷子的鈍面將雞腹部皮膚抹去，將兩側(cè)胸肌都暴露后用直剪刀取出胸大肌，放入已加D-Hank’s的培養(yǎng)皿中。把剪下來的胸大肌用D-Hank’s洗三遍，然后把D-Hank’s吸掉，用一個鑷子按住肌肉，另一個彎頭鑷子撕拉肌肉，使其破碎成糜散狀，再用剪刀剪碎胸大肌，向剪碎后的肌肉里加入2-3ml細胞培養(yǎng)液，將剪碎的胸大肌和細胞培養(yǎng)液一起轉(zhuǎn)移到50ml離心管中，加細胞培養(yǎng)液至10ml。
[0018]用漩渦振蕩器(功率12W，振蕩頻率>2600次/分鐘)振蕩懸浮胸大肌，振蕩時間為I分鐘(期間振蕩1-2秒停止I秒)，懸浮液靜置3分鐘后，用移液器收集上清細胞培養(yǎng)液(如此振蕩懸浮4至5次)。
[0019]選用100目、400目和600目濾篩放置于直徑為1cm的培養(yǎng)皿上進行過濾，將懸液倒入100目濾篩，去除肉糜和雜質(zhì)，之后將過濾后的細胞懸液再400目和600目逐級過濾，將過濾后的細胞懸液加入新離心管中，1200轉(zhuǎn)離心7min，用移液器吸掉上清，加入2ml D-Hank's吹打清洗，重懸后1000轉(zhuǎn)離心4min，然后吸掉上清，下層沉淀即為細胞。
[0020]在所得細胞的離心管中加入5ml細胞培養(yǎng)液，將細胞吹打重懸，吹打時動作要輕柔，以免損傷細胞，將細胞懸液移入直徑為1cm的細胞培養(yǎng)皿中，加細胞培養(yǎng)液至1ml后放入培養(yǎng)箱正常培養(yǎng)。40分鐘后將細胞培養(yǎng)液移入新的細胞培養(yǎng)皿中，如此差速貼壁2次后，隔夜培養(yǎng)。
[0021]第二天早上，將培養(yǎng)皿中的上層細胞及細胞培養(yǎng)液吸掉，在培養(yǎng)皿表面加入2ml胰酶，I分鐘后細胞基本脫落，加入5ml細胞培養(yǎng)液終止消化，將細胞重懸后加入離心管中，1000轉(zhuǎn)離心4分鐘，用移液器吸掉上清，下層沉淀即為所需成肌細胞。
[0022]在離心管中加入2ml細胞培養(yǎng)液，將細胞吹打重懸，取1yL細胞懸液加入200ulPCR管中，再加入10 yL臺盼藍細胞活性染料，混勻。將血球計數(shù)板及蓋片擦拭干凈，并將蓋片蓋在計數(shù)板上；將混合液吸出少許，滴在蓋片邊緣，使細胞懸液充滿蓋片和計數(shù)板之間(中間不能有氣泡)，在顯微鏡下觀察，用細胞計數(shù)器計算計數(shù)板四大格細胞總數(shù)，壓線細胞只計左側(cè)和上方的。之后按照:細胞數(shù)/ml=4大格細胞總數(shù)/4 X 10000。再取一滴細胞懸液于載玻片上，用甲醛固定5min，瑞士染液染色，鏡檢(10 X 40)。計算得:單位體積細胞數(shù)為8.746 X 107±0.047/ml，成活率為98.14%±0.21。
[0023]根據(jù)計數(shù)結(jié)果，將細胞懸液按照15-1O6的密度種板，之后加入適量細胞培養(yǎng)液(六孔板每孔2 mL，96孔板每孔200 yL)輕輕吹打均勻，注意種板一定要均勻。
[0024]本發(fā)明在操作時一定要注意在漩渦振蕩器上振蕩時不可連續(xù)I分鐘振蕩，要振蕩I，2秒后間歇I秒再繼續(xù)振蕩，這樣可以保證細胞的活性。整個振蕩過程重復(fù)4至5次可以保證細胞的得率較高，過濾的次數(shù)和濾篩目數(shù)較高時可以得到較純的原代細胞。因此，用本方法獲得的成肌細胞活性、成活率和純度都保證了后續(xù)實驗的順利進行，減少了實驗誤差。
【主權(quán)項】
1.一種雞胚成肌細胞提取方法，其特征是，包括如下步驟: 第一步，雞胚滅菌，取胸大肌放入加D-Hank，s的培養(yǎng)皿中； 第二步，修剪肌肉 把胸大肌用0-他111^洗三遍，然后把0-他111^吸掉，剪碎胸大肌，向剪碎后的肌肉里加入2-3ml細胞培養(yǎng)液，將剪碎的胸大肌和細胞培養(yǎng)液一起轉(zhuǎn)移到50ml離心管中，加細胞培養(yǎng)液至1ml ； 第三步，用漩渦振蕩器振蕩懸浮胸大肌 用漩渦振蕩器振蕩懸浮胸大肌，振蕩時間為I分鐘，靜置3分鐘后，用移液器收集上清細胞培養(yǎng)液，振蕩懸浮次數(shù)為4-5次； 第四步，過濾、離心 選用100目、400目和600目的濾篩放置于培養(yǎng)皿上進行過濾，將步驟三得到的懸液倒入100目濾篩，去除肉糜和雜質(zhì)，之后將過濾后的細胞懸液再400目和600目逐級過濾，將過濾后的細胞懸液加入新離心管中，1200轉(zhuǎn)離心7min，用移液器吸掉上清，加入D-Hanks吹打清洗，重懸后再1000轉(zhuǎn)離心4min，吸掉上清，下層沉淀即為細胞； 第五步，細胞鋪板，差速貼壁 在步驟四所得細胞的離心管中加入5ml細胞培養(yǎng)液，將細胞吹打重懸，將細胞懸液移入直徑為1cm的細胞培養(yǎng)皿中，加細胞培養(yǎng)液至1ml后放入培養(yǎng)箱正常培養(yǎng);40分鐘后將細胞培養(yǎng)液及沒有貼壁的細胞移入新的細胞培養(yǎng)皿中，如此差速貼壁2次后，隔夜培養(yǎng)；第六步，消化獲得成肌細胞 第二天早上，將培養(yǎng)皿中的上層細胞及細胞培養(yǎng)液吸掉，在培養(yǎng)皿表面加入2ml胰酶，I分鐘后細胞基本脫落，加入5ml細胞培養(yǎng)液終止消化，將細胞重懸后加入離心管中，1000轉(zhuǎn)離心4分鐘，用移液器吸掉上清，下層沉淀即為所需成肌細胞； 第七步，計數(shù)、種板 在步驟六得到的含有成肌細胞的離心管中加入2ml細胞培養(yǎng)液，將成肌細胞吹打重懸，取1yL細胞懸液加入200ul PCR管中，再加入10 yL臺盼藍細胞活性染料，混勻后滴入細胞計數(shù)板計數(shù);根據(jù)計數(shù)結(jié)果，將細胞懸液種板，之后加入細胞培養(yǎng)液。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雞胚成肌細胞提取方法，其特征是，所述雞胚滅菌，取胸大肌的具體操作方法為:選取12胚齡發(fā)育良好的雞胚，用75%酒精噴灑雞胚蛋殼，用鑷子鈍頭輕輕敲破氣室后，再換用彎頭小鑷子輕輕將氣室處蛋殼捏走，掀走白膜，用彎頭小鑷子將雞胚取出放入超凈臺，用彎頭鑷子的鈍面將雞腹部皮膚抹去，將兩側(cè)胸肌都暴露后用直剪刀取出胸大肌。3.根據(jù)權(quán)利要求1、2所述的雞胚成肌細胞提取方法，其特征是，所述漩渦振蕩器功率12W，振蕩頻率>2600次/分鐘，漩渦振蕩器振蕩期間振蕩1-2秒停止I秒。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的雞胚成肌細胞提取方法，其特征是，所述吹打重懸細胞時吹打時動作要輕柔，以免損傷細胞。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的雞胚成肌細胞提取方法，其特征是，所述步驟七中的種板按照15?16的密度進行，細胞培養(yǎng)液的加入量是六孔板每孔2 mL，96孔板每孔200 yL。
【文檔編號】C12N5/077GK105886458SQ201610396066
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年6月7日
【發(fā)明人】趙振華, 李春苗, 黃華云, 黎壽豐, 王錢保, 梁忠, 劉帆, 劉一帆, 趙東偉, 盧建, 李新
【申請人】江蘇省家禽科學(xué)研究所