用于ADSCs培養(yǎng)的組合物及ADSCs培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)的組合物，所述組合物包括：人血白蛋白、維生素C、白藜蘆醇、氫化可的松、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、孕酮和谷胱甘肽。本發(fā)明還公開了一種脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)方法，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加本發(fā)明的上述組合物，然后對(duì)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。采用本發(fā)明的方法培養(yǎng)脂肪干細(xì)胞，不但能促進(jìn)脂肪干細(xì)胞的生長增殖速度，又能抑制其過早分化成熟和早衰，保持脂肪干細(xì)胞的分化潛能，十分適合脂肪干細(xì)胞的培養(yǎng)。
【專利說明】
用于ADSCs培養(yǎng)的組合物及ADSCs培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，尤其涉及一種脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)液及培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（adipose-derived stem cells, ADSCs)，是脂肪組織中一類多 能性干細(xì)胞。由于脂肪組織來源廣泛、取材容易、不涉及倫理問題、便于自體移植、給患者帶 來的痛苦較小，因此日益受到研究者的重視。目前，研究人員已成功地在體內(nèi)、體外條件下， 將其誘導(dǎo)分化形成脂肪、骨、軟骨、肌肉等組織類型細(xì)胞。
[0003] 脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞在來源、獲取及本身分化增殖潛力等方面的優(yōu)勢(shì)，預(yù)示著其作 為組織工程種子細(xì)胞，有著很好的應(yīng)用前景。目前脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞已引起科學(xué)界 廣泛關(guān)注，開展了大量的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究，在臨床治療中也有部分應(yīng)用。骨、軟骨、神經(jīng)、肌肉 等組織缺損，一直是一個(gè)難以解決的難題，但以干細(xì)胞為基礎(chǔ)的組織工程的出現(xiàn)為這些疾 病的治療帶來了新希望。脂肪來源的干細(xì)胞在組織工程及臨床上的應(yīng)用有以下幾方面：① 細(xì)胞治療：直接將脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞移植入體內(nèi)，修復(fù)缺損組織、器官，或體外培養(yǎng) 再生組織和器官，這將是醫(yī)學(xué)史上的又一次革命。②作為基因治療載體：聯(lián)合基因轉(zhuǎn)染技 術(shù)，攜帶靶基因或生長因子基因，治療遺傳性疾病。③種子細(xì)胞的最佳選擇，以其多項(xiàng)獨(dú)特 優(yōu)勢(shì)，成為組織工程的種子庫來源，同時(shí)與可降解支架材料聯(lián)合培養(yǎng)，體外構(gòu)建有生命的種 植體，修復(fù)組織缺損或替代器官的部分功能，治療難治性疾病。④未來可籌建干細(xì)胞庫，用 于免疫缺陷性疾病，或?qū)碜泽w病損組織和器官的修復(fù)，也可配型成功后，用于同種異體移 植治療。
[0004] 目前，常用的ADSCs分離培養(yǎng)方法大多是從脂肪組織分離細(xì)胞，經(jīng)機(jī)械、酶處理去 除紅細(xì)胞等成熟細(xì)胞，然后利用飼養(yǎng)層細(xì)胞與含10%胎牛血清的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。這種培 養(yǎng)干細(xì)胞方法的缺點(diǎn)是方法復(fù)雜，提取的干細(xì)胞數(shù)量少，純度不高，繼代增殖緩慢、細(xì)胞過 早衰老。因此本領(lǐng)域技術(shù)人員致力于開發(fā)一種能夠提高ADSCs繼代增殖效率的技術(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種提高ADSCs繼代增殖效率的技術(shù)。
[0006] 本發(fā)明提供了一種用于脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)的組合物，包括：人血白蛋白、維生 素 C、白藜蘆醇、氫化可的松、堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF)、孕酮和谷胱甘肽。
[0007] 優(yōu)選地，所述組合物中人血白蛋白10_30mg/ml、維生素 C 10-50μ g/ml、白藜蘆醇 10_20μ g/ml、氫化可的松3_6ng/ml、堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF)O. 1-0. 5ng/ml、孕酮 3_6ng/ml 和谷胱甘肽 30-50 μ g/ml。
[0008] 更優(yōu)選地，所述組合物中人血白蛋白20mg/ml、維生素 C 40 μ g/ml、白藜蘆醇 15 μ g/ml、氫化可的松4ng/ml、堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF) 0. 3ng/ml、孕酮4ng/ml和 谷胱甘肽40 μ g/ml。
[0009] 優(yōu)選地，所述組合物中還包括維生素 E，較佳地維生素 E含量為15-20 μ g/ml。
[0010] 優(yōu)選地，所述組合物中還包括抗生素，所述抗生素可以是青霉素和/或鏈霉素。
[0011] 優(yōu)選地，所述組合物中青霉素的含量為20-250單位/ml和鏈霉素的含量為20-250 單位/ml。
[0012] 上述各組分的含量均為各組分在培養(yǎng)基中的最終含量。
[0013] 本發(fā)明的第二方面提供了一種脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)方法，其中，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基 中添加本發(fā)明第一方面所述的組合物，然后對(duì)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。
[0014] 優(yōu)選地，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基是DMEM/F12培養(yǎng)基。
[0015] 本發(fā)明的有益效果是：
[0016] 1、本發(fā)明的培養(yǎng)液組合物，配方成分確定具有較高的安全性，適合臨床治療應(yīng) 用；
[0017] 2、采用本發(fā)明的方法培養(yǎng)脂肪干細(xì)胞，不但能促進(jìn)脂肪干細(xì)胞的生長增殖速度， 又能抑制其過早分化成熟和早衰，保持脂肪干細(xì)胞的分化潛能，十分適合脂肪干細(xì)胞的培 養(yǎng)。
【附圖說明】
[0018] 圖1顯示了本發(fā)明實(shí)施例2中活細(xì)胞技術(shù)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 實(shí)施例1
[0020] 以DMEM/F12培養(yǎng)基（購自TAKARA BIO INC.)為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，加入青霉素 200單 位/ml，加入鏈霉素200單位/ml。按照下表配制，各組分含量為各組分在培養(yǎng)基中的最終 含量。
[0021]
[0022] 上述各組培養(yǎng)基配制完成后，調(diào)節(jié)pH7. 2備用，臨用前加入體積分?jǐn)?shù)10%的小牛 血清。
[0023] 對(duì)照組為基礎(chǔ)培養(yǎng)基加小牛血清（基礎(chǔ)培養(yǎng)基：小牛血清為9 : 1，體積比）。
[0024] 實(shí)施例2
[0025] 用上述各組培養(yǎng)基培養(yǎng)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，檢測(cè)培養(yǎng)效果。
[0026] 在裝有實(shí)施例1中各組培養(yǎng)基的培養(yǎng)基皿中，分別接種基礎(chǔ)量為1 X 106個(gè)的脂肪 干細(xì)胞，置于37°C，5% C02的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)；每隔3天用移液管吸去上層培養(yǎng)基，加入 新的培養(yǎng)基，倒置式顯微鏡觀察。
[0027] 自培養(yǎng)皿中取樣后，PBS緩沖液洗滌2次，加入胰蛋白酶復(fù)合體Trypsin-EDTAlmL， 輕搖至貼壁細(xì)胞分離，加入4mL含有10 %牛血清FBS的基礎(chǔ)培養(yǎng)基終止胰酶作用。使用臺(tái) 盼藍(lán)染色后血細(xì)胞計(jì)數(shù)板統(tǒng)計(jì)活細(xì)胞數(shù)。培養(yǎng)至第8天，對(duì)照組的活細(xì)胞數(shù)約為60 X 106， 實(shí)驗(yàn)組活細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果如圖1所示，從圖中可以看出A組培養(yǎng)基的細(xì)胞增殖效果最好；B組 培養(yǎng)基中未添加白藜蘆醇，細(xì)胞增殖效果最差，與對(duì)照組相當(dāng)，說明白藜蘆醇能夠顯著地促 進(jìn)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖；C組中雖然添加了白藜蘆醇，但是沒有添加維生素 C，細(xì)胞增 殖效果雖然優(yōu)于B組，但是仍然沒有達(dá)到A組的水平，說明維生素 C和白藜蘆醇具有協(xié)同的 促進(jìn)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的作用。D組的計(jì)數(shù)情況可以看出，谷胱甘肽對(duì)脂肪間充質(zhì)干細(xì) 胞的增殖有正面的影響但是影響較不顯著。
[0028] 在實(shí)驗(yàn)中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，采用上述培養(yǎng)基培養(yǎng)的脂肪干細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)梭形 及纖維細(xì)胞狀形態(tài)，細(xì)胞形態(tài)一致性較差，經(jīng)反復(fù)驗(yàn)證，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中添加 15-20 μ g/ml的維生素 E可明顯提高細(xì)胞形態(tài)的均一性。
[0029] 實(shí)施例3表面抗原分析
[0030] 取培養(yǎng)8天的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞，棄培養(yǎng)液，消化液消化后（2. 5%的胰蛋白酶溶 液和0.02%EDTA溶液混合成消化液，體積比1 : 1)，用含1%牛血清白蛋白（BSA)的PBS 洗滌后制成每l〇〇ul含有1X 106個(gè)細(xì)胞的單細(xì)胞懸液，分別加入7個(gè)Ep管中，每管加入細(xì) 胞懸液lOOuL，對(duì)照管加入共20yL的FITC Mouse IgGl、APC-CY7Mouse IgG2b和染色緩沖 液用于檢測(cè)由于抗體非特異性結(jié)合產(chǎn)生的背景，其他試管分別加入⑶29、⑶34、⑶44、⑶45、 CD105、HLA. DR單克隆抗體（單抗購自TAKARA BIO INC.)各20 μ L，室溫孵育25min，用含 1 % BSA的PBS洗滌后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。
[0031] 流式細(xì)胞儀分析人脂肪干細(xì)胞表型，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。
[0032] 表1人脂肪干細(xì)胞表型分析
[0033]
[0034] 從上表中可以看出，實(shí)驗(yàn)組A、B、C、E、F和對(duì)照組中培養(yǎng)的細(xì)胞均具有干細(xì)胞特 性。但是，D組中的HLA. DR表達(dá)量較高，說明未添加谷胱甘肽的培養(yǎng)液，雖然也能促進(jìn)有效 促進(jìn)細(xì)胞增殖，但是增殖的細(xì)胞具有成纖維細(xì)胞化的傾向，此實(shí)驗(yàn)說明，在本發(fā)明的細(xì)胞培 養(yǎng)液中添加谷胱甘肽能夠有效防止脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的成纖維細(xì)胞化。
[0035] 以上詳細(xì)描述了本發(fā)明的較佳具體實(shí)施例。應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員無 需創(chuàng)造性勞動(dòng)就可以根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)思作出諸多修改和變化。因此，凡本技術(shù)領(lǐng)域中技術(shù) 人員依本發(fā)明的構(gòu)思在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上通過邏輯分析、推理或者有限的實(shí)驗(yàn)可以得到的 技術(shù)方案，皆應(yīng)在由權(quán)利要求書所確定的保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)的組合物，其特征在于，所述組合物包括：人血白 蛋白、維生素 C、白藜蘆醇、氫化可的松、堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF)、孕酮和谷胱甘 肽。2. 如權(quán)利要求1所述的組合物，其中，所述組合物中人血白蛋白10_30mg/ml、維生素 (：10-5(^8/1111、白藜蘆醇10-2(^8/1111、氫化可的松3-61^/1111、堿性成纖維細(xì)胞生長因子 (bFGF) 0.1-0· 5ng/ml、孕麗 3_6ng/ml 和谷脈甘膚 30-50 μ g/ml。3. 如權(quán)利要求1所述的組合物，其中，所述組合物中人血白蛋白20mg/ml、維生素 C 40μg/ml、白藜蘆醇15μg/ml、氫化可的松4ng/ml、堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF) 0.3ng/ml、孕酮 4ng/ml 和谷胱甘肽 40μg/ml。4. 如權(quán)利要求1所述的組合物，其中，所述組合物中還包括維生素 E，較佳地維生素 E 含量為 15-20μ g/ml。5. 如權(quán)利要求1所述的組合物，其中，所述組合物中還包括抗生素，所述抗生素可以是 青霉素和/或鏈霉素。6. 如權(quán)利要求1所述的組合物，其中，所述組合物中青霉素的含量為20-250單位/ml 和鏈霉素的含量為20-250單位/ml。7. -種脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征在于，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加本發(fā)明權(quán)利要 求1所述的組合物，然后對(duì)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。8. 如權(quán)利要求7所述的方法，其中，優(yōu)選地所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基是DMEM/F12培養(yǎng)基。
【文檔編號(hào)】C12N5/0775GK105886462SQ201410442734
【公開日】2016年8月24日
【申請(qǐng)日】2014年8月27日
【發(fā)明人】楊鐘華
【申請(qǐng)人】瑞安市普羅生物科技有限公司