一種高效誘導(dǎo)γδT細(xì)胞的方法及應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種用于培養(yǎng)γδT細(xì)胞的培養(yǎng)基，γδT細(xì)胞的培養(yǎng)方法，通過(guò)該方法獲得的高效誘導(dǎo)的γδT細(xì)胞及其制劑，以及所述高效誘導(dǎo)的γδT細(xì)胞在制備提高患者基礎(chǔ)免疫功能、提高抵抗腫瘤和抗感染能力的藥物中的用途。
【專利說(shuō)明】
一種高效誘導(dǎo)Υ δ T細(xì)胞的方法及應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域：
[0001] 本發(fā)明涉及免疫細(xì)胞體外培養(yǎng)領(lǐng)域，具體是指一種高效誘導(dǎo)γ δ τ細(xì)胞的制備方 法以及細(xì)胞制劑。
【背景技術(shù)】：
[0002] 人體內(nèi)Τ淋巴細(xì)胞根據(jù)Τ細(xì)胞受體（TCR)雙鏈肽的構(gòu)成不同，可以分為TCR α β Τ 細(xì)胞（簡(jiǎn)稱α β Τ細(xì)胞）和TCRy δ Τ細(xì)胞（簡(jiǎn)稱γ δ Τ細(xì)胞），其中γ δ Τ細(xì)胞以主要組 織相容性復(fù)合物（Major histocompatibility complex，MHC)非限制的方式直接識(shí)別并結(jié) 合抗原分子，并通過(guò)穿孔素-顆粒酶、Fas/FasL、IFN- γ分泌以及TNF相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體受 體TRAILR等途徑殺傷腫瘤細(xì)胞及病毒感染細(xì)胞。γ δ Τ細(xì)胞除能有效殺傷腫瘤細(xì)胞外，還 可以通過(guò)分泌IFN-γ等細(xì)胞因子，促進(jìn)其他免疫細(xì)胞的活化，因此在天然免疫和適應(yīng)性免 疫應(yīng)答中發(fā)揮重要的免疫監(jiān)視和免疫調(diào)節(jié)作用，被認(rèn)為是聯(lián)系天然免疫與適應(yīng)性免疫的重 要橋梁。γ ST細(xì)胞具有ΝΚ細(xì)胞與Τ細(xì)胞的雙重特征，表面除表達(dá)TCRy δ外，還高水平表 達(dá)ΝΚ細(xì)胞的活化性重要功能受體NKG2D，這兩種受體分子在γ δ Τ細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷 過(guò)程中發(fā)揮重要作用。其中，單一的TCRy δ即可使γ δΤ細(xì)胞活化，而NKG2D在此過(guò)程中 則起到共刺激作用，使得γ ST細(xì)胞在識(shí)別抗原后快速活化并產(chǎn)生相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)，在 機(jī)體抵御腫瘤或感染時(shí)快速活化，從而發(fā)揮抗腫瘤或抗感染的重要作用。此外，研究發(fā)現(xiàn)由 于 γ δΤ細(xì)胞具有無(wú) MHC限制性的殺瘤作用，對(duì)多種自體、同種異體或異種腫瘤細(xì)胞均表現(xiàn) 出顯著的殺傷活性，因此γ ST細(xì)胞作為一類重要的腫瘤過(guò)繼免疫治療的候選細(xì)胞引起越 來(lái)越多國(guó)內(nèi)、外學(xué)者的關(guān)注。但是另一方面，由于γ δ τ細(xì)胞在人體外周血僅占1-5%，要獲 得大量高細(xì)胞毒活性的γ ST細(xì)胞是十分困難的，因而限制了其臨床應(yīng)用。雖然已有技術(shù) 多采用抗TCRy δ抗體或非肽膦酸類抗原獲得大量γ δ τ細(xì)胞，但因費(fèi)用相對(duì)昂貴且擴(kuò)增 倍數(shù)有限而未得到廣泛應(yīng)用。
[0003] 因此，為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種經(jīng)濟(jì)實(shí)用、高效快速擴(kuò)增人體外 周血γ δ Τ細(xì)胞的方法，用以提高患者基礎(chǔ)免疫功能、提供患病機(jī)體抵抗腫瘤和抗感染能 力。同時(shí)對(duì)于人外周血γ δτ細(xì)胞制備后需要對(duì)其進(jìn)行細(xì)胞數(shù)量、純度、免疫表型檢測(cè)，確 保其能有效發(fā)揮一定的臨床治療效果。

【發(fā)明內(nèi)容】
：
[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種經(jīng)濟(jì)實(shí)用、高效快速擴(kuò)增人體外周血γ δ τ細(xì)胞的方 法，提高γ ST細(xì)胞的數(shù)量、純度和殺傷活性以確保臨床應(yīng)用。
[0005] -方面，本發(fā)明提供了一種專門用于培養(yǎng)γ δτ細(xì)胞的培養(yǎng)基，由培養(yǎng)基組分 I、γ st細(xì)胞特異性培養(yǎng)基組分π構(gòu)成，其中所述培養(yǎng)基組分I包括以下含量的成分： RPMI-1640培養(yǎng)基，其中添加有濃度為Ι-lOmM的L-谷氨酰胺，濃度為5-20mg/L的重組 人轉(zhuǎn)鐵蛋白，濃度為l-l〇g/L的重組人白蛋白，濃度為l-10mg/L的重組人胰島素，濃度為 10-100mg/L的維生素 PP，濃度為10-50mg/L的維生素 C，濃度為l-50ng/mL的氫化可的 松，濃度為l-l〇mg/L微量元素；所述γ δΤ特異性培養(yǎng)基組分II是由以下濃度的組分構(gòu) 成：ΡΜΑ 濃度為 10-50ng/ml，離子霉素濃度為 0. 5-5ug/ml，rhIL-2 濃度為 100-1000IU/ml， rhIL-18 濃度為 5_20ng/ml。
[0006] 本發(fā)明上述專用γ δ τ細(xì)胞培養(yǎng)基還可以進(jìn)一步含有體積比為1-10%的血清，優(yōu) 選自體血清，更優(yōu)選含有5 %自體血清。在本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案中，所述培養(yǎng)基組分I是 無(wú)血清培養(yǎng)基：所述微量元素選自硒。
[0007] 同現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的專用于培養(yǎng)γ δ τ細(xì)胞的培養(yǎng)基中包含了一些能促進(jìn) γ S τ細(xì)胞特異性增殖及分化的組分，從而能夠得到數(shù)量更多，純度更高且殺傷活性更強(qiáng)的 γ ST細(xì)胞。
[0008] 本發(fā)明的專用于培養(yǎng)γ δ τ細(xì)胞的培養(yǎng)基具有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0009] 1)避免由于在γ δ Τ細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中使用動(dòng)物血清對(duì)患者帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)以及動(dòng)物 血清中的不確定成分對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)造成的不利影響；2)增加了 γ δ Τ細(xì)胞得率，提高了純度， 并降低了細(xì)胞培養(yǎng)的生產(chǎn)成本。
[0010] 另一方面，本發(fā)明提供了一種高效誘導(dǎo)γ δ Τ細(xì)胞的方法，即一種新的制備γ δ Τ 細(xì)胞的方法，其特征在于將外周血單個(gè)核細(xì)胞用培養(yǎng)基組分I重懸至lX106_5X106/ml，所 述培養(yǎng)基組分I包括以下含量的成分：RPMI_1640培養(yǎng)基，其中添加有濃度為Ι-lOmM的 L-谷氨酰胺，濃度為5-20mg/L的重組人轉(zhuǎn)鐵蛋白，濃度為l-10g/L的重組人白蛋白，濃度 為l-10mg/L的重組人胰島素，濃度為10-100mg/L的維生素 PP，濃度為10-50mg/L的維生 素 C，濃度為l-50ng/mL的氫化可的松，濃度為l-10mg/L微量元素，每2-3天更換培養(yǎng)基， 所用培養(yǎng)基為培養(yǎng)基組分I，在孵育箱中培養(yǎng)，同時(shí)加入γ ST特異性培養(yǎng)基組分II，所述 γ δ Τ特異性培養(yǎng)基組分II由以下濃度的組分構(gòu)成：ΡΜΑ濃度為10-50ng/ml，離子霉素濃 度為 0· 5-5ug/ml，rhIL-2 濃度為 100-1000IU/ml，rhIL-18 濃度為 5-20ng/ml。
[0011] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)基組分I是無(wú)血清培養(yǎng)基；所述微量 元素選自硒。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，上述本發(fā)明制備γ st細(xì)胞的方法中，所 述培養(yǎng)基組分I或者γ s τ特異性培養(yǎng)基組分π可以進(jìn)一步含體積比為ι-?ο %的血清。 更優(yōu)選地，含有體積比為5 %的自體血清。
[0012] 在實(shí)施本發(fā)明時(shí)，為了對(duì)比，使用optimizer培養(yǎng)基作為對(duì)照組培養(yǎng)基，包括 A頂-V培養(yǎng)基。在將外周血單個(gè)核細(xì)胞用γ δΤ細(xì)胞培養(yǎng)基將細(xì)胞重懸至lX106-5X106/ml 之后，根據(jù)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況，每2-3天更換培養(yǎng)基，所用γ δΤ細(xì)胞培養(yǎng)基分別為兩種不同 γ δ Τ細(xì)胞培養(yǎng)基（即本發(fā)明的上述γ δ Τ細(xì)胞專用培養(yǎng)基或者optimizer培養(yǎng)基作為對(duì) 照組培養(yǎng)基，后者包括AIM-V培養(yǎng)基），在孵育箱中培養(yǎng)，同時(shí)補(bǔ)充全量各種細(xì)胞因子（即本 發(fā)明γ δ T特異性培養(yǎng)基組分II)，持續(xù)培養(yǎng)，獲得大量較高濃度的γ δ T細(xì)胞。
[0013] 第三方面，本發(fā)明提供了通過(guò)本發(fā)明培養(yǎng)基制備的γ δ τ細(xì)胞，含有本發(fā)明方法 制備的γ st細(xì)胞的細(xì)胞制劑以及該制劑的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了本發(fā)明培養(yǎng)基制備的 γ s τ細(xì)胞在制備提高患者基礎(chǔ)免疫功能、提高抵抗腫瘤和抗感染能力的藥物中的用途。
[0014] 附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明：
[0015] 圖1是本發(fā)明培養(yǎng)基制備的γ δ τ細(xì)胞增殖倍數(shù)與對(duì)照組的比較。
[0016] 圖2是本發(fā)明培養(yǎng)基制備的γ δ Τ細(xì)胞培養(yǎng)終密度與對(duì)照組的比較。
[0017] 圖3是本發(fā)明γ δ Τ細(xì)胞流式檢測(cè)結(jié)果。
[0018] 圖4是本發(fā)明γ δ T細(xì)胞殺瘤活性檢測(cè)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但是不應(yīng)該理解是對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的 限制。
[0020] 實(shí)施例1 : γ δ τ細(xì)胞的培養(yǎng)
[0021] 將采集的外周血15ml，通過(guò)密度梯度離心獲得外周血單個(gè)核細(xì)胞。使用本發(fā)明無(wú) 血清培養(yǎng)基組分I將獲得的外周血單個(gè)核細(xì)胞重懸至lXl〇 6/ml。所述無(wú)血清培養(yǎng)基組分I 是由以下濃度的組分構(gòu)成的：RPMI-1640培養(yǎng)基（購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，貨號(hào)：31800-105)， 其中添加有濃度為5mM的L-谷氨酰胺，濃度為10mg/L的重組人轉(zhuǎn)鐵蛋白，濃度為5g/L的 重組人白蛋白，濃度為5mg/L的重組人胰島素，濃度為50mg/L的維生素 PP，濃度為30mg/L 的維生素 C，濃度為30ng/mL的氫化可的松，濃度為5mg/L的硒。根據(jù)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況，每 2-3天更換培養(yǎng)基，在37°C、5% 0)2的孵育箱中培養(yǎng)，同時(shí)補(bǔ)充全量各種細(xì)胞因子，即加入 含有PMA濃度為30ng/ml ;離子霉素濃度為2ug/ml，rhIL-2濃度為500IU/ml，rhIL-18濃度 為10ng/ml的本發(fā)明γ δ T特異性培養(yǎng)基組分II。
[0022] 作為對(duì)照，根據(jù)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況，每2-3天更換培養(yǎng)基，所用培養(yǎng)基為Α頂-V培養(yǎng) 基作為對(duì)照組培養(yǎng)基，在37°C、5% 0)2的孵育箱中培養(yǎng)，同時(shí)補(bǔ)充全量各種細(xì)胞因子，SP加 入含有PMA濃度為30ng/ml ;離子霉素濃度為2ug/ml，rhIL-2濃度為500IU/ml，rhIL-18濃 度為10ng/ml的本發(fā)明γ δΤ特異性培養(yǎng)基組分II，分別在第0、5、10、15、20天對(duì)γ δΤ細(xì) 胞用臺(tái)盼藍(lán)染色后計(jì)數(shù)。
[0023] 實(shí)施例2 : γ δ Τ細(xì)胞的培養(yǎng)
[0024] 將采集的外周血20ml，通過(guò)密度梯度離心獲得外周血單個(gè)核細(xì)胞。使用含體積 比5%自體血清的培養(yǎng)基組分I將獲得的外周血單個(gè)核細(xì)胞重懸至lX10 6/ml。所述培養(yǎng) 基組分I是由以下濃度的組分構(gòu)成的：RPMI-1640培養(yǎng)基（購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，貨號(hào)： 31800-105)，其中添加有濃度為5mM的L-谷氨酰胺，濃度為10mg/L的重組人轉(zhuǎn)鐵蛋白，濃 度為5g/L的重組人白蛋白，濃度為5mg/L的重組人胰島素，濃度為50mg/L的維生素 PP，濃 度為30mg/L的維生素 C，濃度為30ng/mL的氫化可的松，濃度為5mg/L的硒。根據(jù)細(xì)胞的 生長(zhǎng)狀況，每2-3天更換培養(yǎng)基，在37°C、5% 0)2的孵育箱中培養(yǎng)，同時(shí)補(bǔ)充全量各種細(xì)胞 因子，即加入含有PMA濃度為30ng/ml ;離子霉素濃度為2ug/ml，rhIL-2濃度為500IU/ml， rhIL-18濃度為10ng/ml的本發(fā)明γ δ T特異性培養(yǎng)基組分II。
[0025] 作為對(duì)照，根據(jù)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況，每2-3天更換培養(yǎng)基，所用培養(yǎng)基為含5%自體 血清的Α頂-V培養(yǎng)基作為對(duì)照組培養(yǎng)基，在37°C、5% 0)2的孵育箱中培養(yǎng)，同時(shí)補(bǔ)充全量 各種細(xì)胞因子，即加入含有PMA濃度為30ng/ml ;離子霉素濃度為2ug/ml，rhIL-2濃度為 500IU/ml，rhIL-18濃度為10ng/ml的本發(fā)明γ δ T特異性培養(yǎng)基組分II，分別在第0、5、 10、15、20天對(duì)γ δΤ細(xì)胞用臺(tái)盼藍(lán)染色后計(jì)數(shù)。
[0026] 實(shí)施例3細(xì)胞增殖效果比較
[0027] 分別在第0、5、10、15、20天對(duì)實(shí)施例1制備的γ δ Τ細(xì)胞用臺(tái)盼藍(lán)染色后計(jì)數(shù)。將 計(jì)數(shù)當(dāng)天的細(xì)胞總數(shù)除以培養(yǎng)前的細(xì)胞數(shù)（即第〇天），其數(shù)值即為細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)。與對(duì) 照組培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞增殖效果比較。
[0028] 通過(guò)動(dòng)態(tài)比較兩組細(xì)胞的擴(kuò)增情況發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)的第5、10、15、20天，兩組γ δ T 細(xì)胞均在擴(kuò)增，在第20天時(shí)兩組均達(dá)到擴(kuò)增最高點(diǎn)，但每個(gè)時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組的擴(kuò)增情況均好 于對(duì)照組。
[0029] 結(jié)果顯示，由本發(fā)明γ δ Τ細(xì)胞專用培養(yǎng)基獲得的γ δ Τ細(xì)胞，與對(duì)照組培養(yǎng)基相 比較，其增殖倍數(shù)明顯升高（見(jiàn)圖1)，同時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)終密度更高（見(jiàn)圖2)。
[0030] 實(shí)施例4 γ δ Τ細(xì)胞流式檢測(cè)
[0031] 將實(shí)施例1獲得的γ δ Τ細(xì)胞用PBS緩沖液洗滌后，用PBS緩沖液重懸，取兩份 50 μ 1細(xì)胞懸液（約3Χ105細(xì)胞）分別加入2支流式管中，加入熒光標(biāo)記的抗體（分別為 抗CD3-FITC :購(gòu)自BD公司，貨號(hào)555274 :抗TCR γ δ -APC :購(gòu)自BD公司，貨號(hào)：555718)染 色，4°C避光孵育30min，緩沖液洗滌后，懸浮細(xì)胞在500 μ 1 PBS緩沖液中，用流式細(xì)胞儀進(jìn) 行分析、檢測(cè)。
[0032] 結(jié)果顯示，通過(guò)本發(fā)明培養(yǎng)基制備γ δτ細(xì)胞可以檢測(cè)到制備的細(xì)胞制劑中 ⑶3+Τ細(xì)胞高度富集，純度可以達(dá)到97%，γ δ Τ細(xì)胞從第14天到第20天達(dá)到峰值，平均 為89. 6% (見(jiàn)圖3)。
[0033] 實(shí)施例5 γ δ Τ細(xì)胞殺瘤活性檢測(cè)
[0034] 分別取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Κ562腫瘤細(xì)胞作為靶細(xì)胞，以5Χ103細(xì)胞/孔鋪96孔板，第 二天加入本發(fā)明實(shí)施例1獲得的實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)14天的γ δ Τ細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，將實(shí)驗(yàn)組和 對(duì)照組相比較，以效靶比10 : 1、20 : 1和50 : 1的濃度共同孵育72h，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè) 平行孔；棄上清液，PBS洗滌2次后，加入CCK-8(Cell Counting Kit，CCK-8,購(gòu)自日本同仁 CCK8試劑盒，產(chǎn)品型號(hào)：CK04)細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒中應(yīng)用液繼續(xù)培養(yǎng)4h，96孔細(xì)胞培養(yǎng)板放入 酶標(biāo)儀中檢測(cè)在450nm處吸光度0D值，按下列公式計(jì)算細(xì)胞殺傷率：
[0035] 殺傷率（％ ) = [1_(實(shí)驗(yàn)孔0D值-效應(yīng)孔0D值/靶細(xì)胞孔0D值）]X100%
[0036] 細(xì)胞毒作用的檢測(cè)：對(duì)各實(shí)驗(yàn)組采用t檢驗(yàn)，以P < 0. 05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0037] 結(jié)果如圖4所示，表明：無(wú)論是在10 : 1、20 : 1和50 : 1的不同效靶比條件下， 還是在同一個(gè)效靶比濃度下，實(shí)驗(yàn)組對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷率均高于對(duì)照組，且差異具有統(tǒng)計(jì) 學(xué)意義（P < 0.05)。
[0038]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于培養(yǎng)γ δτ細(xì)胞的培養(yǎng)基，其特征在于由培養(yǎng)基組分I和γ δτ細(xì)胞特異 性培養(yǎng)基組分II構(gòu)成，其中所述培養(yǎng)基組分I包括以下含量的成分：RPMI-1640培養(yǎng)基， 其中添加有濃度為I-IOmM的L-谷氨酰胺，濃度為5-20mg/L的重組人轉(zhuǎn)鐵蛋白，濃度為 l-l〇g/L的重組人白蛋白，濃度為l-10mg/L的重組人胰島素，濃度為10-100mg/L的維生素 PP，濃度為10_50mg/L的維生素 C，濃度為l-50ng/mL的氫化可的松，濃度為l-10mg/L微量 元素，所述γ S T特異性培養(yǎng)基組分II由以下濃度的組分構(gòu)成：PM濃度為10-50ng/ml，離 子霉素濃度為 〇· 5-5ug/ml，rhIL-2 濃度為 100-1000IU/ml，rhIL-18 濃度為 5-20ng/ml。2. -種權(quán)利要求1的用于培養(yǎng)γ δ T細(xì)胞的培養(yǎng)基，其特征在于其中所述微量元素是 硒。3. -種權(quán)利要求1或2的用于培養(yǎng)γ δ T細(xì)胞的培養(yǎng)基，其特征在于進(jìn)一步含有體積 比為1-10 %的血清。4. 一種制備γ δ T細(xì)胞的方法，其特征在于將外周血單個(gè)核細(xì)胞用培養(yǎng)基組分I重懸 至lX106-5X106/ml，所述培養(yǎng)基組分I包括以下含量的成分：RPMI-1640培養(yǎng)基，其中添加 有濃度為I-IOmM的L-谷氨酰胺，濃度為5-20mg/L的重組人轉(zhuǎn)鐵蛋白，濃度為l-10g/L的 重組人白蛋白，濃度為l-l〇mg/L的重組人胰島素，濃度為10-100mg/L的維生素 PP，濃度為 10-50mg/L的維生素 C，濃度為l-50ng/mL的氫化可的松，濃度為l-10mg/L微量元素，每2-3 天更換培養(yǎng)基，所用培養(yǎng)基為培養(yǎng)基組分I，在孵育箱中培養(yǎng)，同時(shí)加入γ S T特異性培養(yǎng) 基組分II，所述γ δ T特異性培養(yǎng)基組分II由以下濃度的組分構(gòu)成：PM濃度為10-50ng/ ml，離子霉素濃度為 0· 5-5ug/ml，rhIL-2 濃度為 100-1000IU/ml，rhIL-18 濃度為 5-20ng/ ml 〇5. -種權(quán)利要求4的制備γ δΤ細(xì)胞的方法，其特征在于所述培養(yǎng)基組分I或者γ δΤ 特異性培養(yǎng)基組分II進(jìn)一步含體積比為1-10%的血清。6. -種根據(jù)權(quán)利要求4或5的方法制備的γ δ T細(xì)胞。7. -種含有權(quán)利要求6的γ δ T細(xì)胞的制劑。8. 根據(jù)權(quán)利要求6的γ δ T細(xì)胞在制備提高患者基礎(chǔ)免疫功能、提高抵抗腫瘤和抗感 染能力的藥物中的用途。
【文檔編號(hào)】C12N5/0783GK105886468SQ201510270659
【公開(kāi)日】2016年8月24日
【申請(qǐng)日】2015年5月22日
【發(fā)明人】盧戌, 劉靜維, 王躍, 楊照敏
【申請(qǐng)人】北京康愛(ài)瑞浩生物科技股份有限公司空港分公司