辣椒疫霉病菌幾丁質(zhì)合酶及其基因和應(yīng)用【專利摘要】本發(fā)明涉及辣椒疫霉病菌(Phytophthoracapsici)中的幾丁質(zhì)合酶。其氨基酸序列為與如SEQIDNo.4所示的氨基酸序列在相似性在90％以上，優(yōu)選在95％以上，更優(yōu)選在98％以上且具有與如SEQIDNo.4所示的氨基酸序列相同功能的氨基酸序列。所述辣椒疫霉病菌的幾丁質(zhì)合酶的活性水平能夠調(diào)節(jié)活性孢子囊和活性游動(dòng)孢子的產(chǎn)量從而影響辣椒疫霉病菌的致病力或寄主的發(fā)病程度?！緦＠f(shuō)明】辣椒疫霉病菌幾丁質(zhì)合酶及其基因和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域：
[0001]本發(fā)明涉及幾丁質(zhì)合酶，特別涉及辣椒疫霉病菌(Phytophthoracapsici)中的幾丁質(zhì)合酶?！?br>背景技術(shù)：
】[0002]卵菌門（Oomycota)中存在很多重要的植物病原卵菌，可以侵染多種寄主植物，如辣椒疫霉病菌(Phytophthoracapsici)可以侵染前科植物辣椒與番前，豆科植物青豆與菜豆以及萌蘆科中的大多數(shù)植物，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。其中辣椒疫病是辣椒種植與生產(chǎn)中的一種毀滅性卵菌病害，在我國(guó)大部分地區(qū)均有發(fā)生，辣椒疫病具有侵染途徑多，病程短，蔓延速度快等特點(diǎn)，發(fā)病條件適宜時(shí)，短期內(nèi)可造成辣椒大量萎蔫死亡，甚至絕產(chǎn)。而大豆疫霉病菌(Phytophthorasojae)侵染引起的大豆根腐病是嚴(yán)重危害大豆生產(chǎn)的重要病害之一，每年導(dǎo)致的經(jīng)濟(jì)損失超過(guò)10億美元。1989年，中國(guó)東北地區(qū)首次發(fā)現(xiàn)大豆疫霉根腐病，現(xiàn)已在中國(guó)大豆的主產(chǎn)區(qū)黑龍江省和安徽省、內(nèi)蒙古自治區(qū)、福建省及北京市、山東省等地發(fā)現(xiàn)。[0003]卵菌門的無(wú)性生殖可以產(chǎn)生孢子囊與游動(dòng)孢子。孢子囊呈梨形或是檸檬形。在發(fā)生植物病害時(shí)，病原孢子囊通常在植株發(fā)病部位表面形成。孢子囊可以隨風(fēng)、雨水以及灌溉用水進(jìn)行遠(yuǎn)距離的傳播。孢子囊與寄主植株接觸后可以直接萌發(fā)進(jìn)行侵染。而在低溫潮濕的條件下，孢子囊也可以釋放出單核，無(wú)細(xì)胞壁，雙鞭毛的游動(dòng)孢子。每個(gè)孢子囊會(huì)釋放20-40個(gè)游動(dòng)孢子，一般可以持續(xù)游動(dòng)數(shù)個(gè)小時(shí)到幾天，以螺旋方式在水中運(yùn)動(dòng)，游動(dòng)距離為6cm或更長(zhǎng)。游動(dòng)孢子的游動(dòng)具有自主性并有趨向性，可以使其侵染寄主成功的概率提高。游動(dòng)孢子易受到外界環(huán)境的刺激而休止轉(zhuǎn)變?yōu)樾葜规撸⒑芸煨纬杉?xì)胞壁后萌發(fā)形成芽管，在遇到寄主之后分泌胞外酶用來(lái)破壞寄主植物的表皮并迅速形成侵染釘，也可以通過(guò)自然孔口進(jìn)行侵入。游動(dòng)孢子作為病害循環(huán)中主要的再侵染源，在病害大規(guī)模流行中起著重要的作用。[0004]綜上所述，病原孢子囊的形成和游動(dòng)孢子的產(chǎn)生是卵菌侵染寄主所必需的過(guò)程。而且寄主病害的嚴(yán)重度與孢子囊和游動(dòng)孢子的產(chǎn)量呈正相關(guān)。如果能阻斷孢子囊的形成和游動(dòng)孢子的產(chǎn)生，就可以控制卵菌侵染引起的病害如辣椒疫病和大豆疫霉等的發(fā)生?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0005]通過(guò)發(fā)明人的研究發(fā)現(xiàn)，辣椒疫霉病菌(Phytophthoracapsici)中的幾丁質(zhì)合酶與辣椒疫霉病菌產(chǎn)生活性的孢子囊和活性的游動(dòng)孢子的產(chǎn)量密切相關(guān)，而寄主病害的嚴(yán)重度又與孢子囊和游動(dòng)孢子的產(chǎn)量呈正相關(guān)。因此可以通過(guò)調(diào)控幾丁質(zhì)合酶來(lái)阻斷孢子囊的形成和游動(dòng)孢子的產(chǎn)生，可以達(dá)到控制辣椒疫霉病菌侵染引起的病害的發(fā)生。[0006]因此，本發(fā)明之一提供了一種辣椒疫霉病菌（Phytophthoracapsici)幾丁質(zhì)合酶，其氨基酸序列為與如SEQIDNo.4所示的氨基酸序列相似性在93%以上，優(yōu)選在95%以上，更優(yōu)選在98%以上且具有與如SEQIDNo.4所示的氨基酸序列相同功能的氨基酸序列。一般來(lái)講，在同一物種中都包括同源且功能相同或相似的氨基酸序列(或蛋白質(zhì)序列)或核酸序列，特別是必要氨基酸序列（必要蛋白質(zhì)序列)或必要核酸序列，它們不一定序列100%相同的原因在于同一物種不同菌株受地理?xiàng)l件，外在環(huán)境如溫濕度以及栽培品種等因素的影響，容易發(fā)生包括無(wú)義突變?cè)趦?nèi)的各種突變，但因?yàn)槠涔δ軐?duì)該物種的存活或生長(zhǎng)的重要性，上述突變不會(huì)或基本不會(huì)影響其功能的行駛。因此即使在同一物種中，允許與本發(fā)明的幾丁質(zhì)合酶的如SEQIDNo.4所示的氨基酸序列在一定范圍內(nèi)存在差異。[0007]其中，所本發(fā)明的氨基酸序列可以是如SEQIDNo.4所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與如SEQIDNo.4所示的氨基酸序列功能相同的氨基酸序列。本發(fā)明的幾丁質(zhì)合酶一般來(lái)源于自然界中辣椒疫霉病菌中，即一般來(lái)講，其為天然產(chǎn)物。但其也可以通過(guò)構(gòu)建含有幾丁質(zhì)合酶基因的重組表達(dá)載體，在特定的宿主中，例如在常見(jiàn)的芽孢桿菌(Bacillus)、假單胞菌(Pseudomonas)、腸桿菌(Escherichia)和酵母(Saccharomyces)中的至少一種等生物中進(jìn)行重組表達(dá)。[0008]在本發(fā)明中，所述幾丁質(zhì)合酶的氨基酸序列可以具體地如SEQIDNo.4所示。[0009]本發(fā)明之二提供了一種能夠編碼如上任意一種幾丁質(zhì)合酶的DNA序列。優(yōu)選DNA序列為與如SEQIDNo.3所示的DNA序列的相似性在75%以上，進(jìn)一步優(yōu)選在85%以上，更優(yōu)選在95%以上且具有與如SEQID如.3所示的0嫩序列相同功能的0嫩序列。如〇0嫩或重組DNA。例如在本發(fā)明中，所述幾丁質(zhì)合酶的DNA序列包括存在于辣椒疫霉病菌不同菌株(例如辣椒疫霉病菌LT1534菌株）中的幾丁質(zhì)合酶的DNA序列。再如本發(fā)明的DNA序列在嚴(yán)格條件下與如SEQIDNo.3所示DNA序列能夠進(jìn)行分子雜交且編碼如上任意一種幾丁質(zhì)合酶的DNA序列。上述嚴(yán)格條件可為用6XSSC，0.5%SDS的溶液，在65°C下雜交，然后用2XSSC，0.1%SDS和1XSSC，0·1%SDS各洗膜一次。[0010]在本發(fā)明中，幾丁質(zhì)合酶的DNA序列可以具體地如SEQIDNo.3所示。[0011]本發(fā)明之三提供了如上任意一種DNA序列轉(zhuǎn)錄得到的RNA序列。如mRNA等。優(yōu)選RNA序列為與如SEQIDNo.3所示的DNA序列轉(zhuǎn)錄的RNA序列的相似性在75%以上，進(jìn)一步優(yōu)選在85%以上，更優(yōu)選在95%以上且具有與如SEQIDNo.3所示的DNA序列轉(zhuǎn)錄的RNA序列相同功能的RNA序列。最優(yōu)選RNA序列為如SEQID如.3所示的0嫩序列轉(zhuǎn)錄的1?嫩序列。[0012]本發(fā)明之四提供了一種能夠抑制和/或殺滅辣椒疫霉病菌生長(zhǎng)的方法，所述方法包括通過(guò)抑制如上任意一種DNA序列的轉(zhuǎn)錄，或抑制如上任意一種RNA序列的翻譯，或抑制和/或失活如上任意一種幾丁質(zhì)合酶的活性來(lái)抑制和/或殺滅所述辣椒疫霉病菌生長(zhǎng)。[0013]在本發(fā)明中，所述辣椒疫霉病菌包括辣椒疫霉病菌LT1534菌株。[0014]在本發(fā)明中，所述方法可用于抑制和/或殺滅辣椒疫霉病。[0015]本發(fā)明之五提供了一種篩選辣椒疫霉病菌抑菌和/或殺菌劑的方法，所述方法包括將待檢測(cè)物應(yīng)用于所述辣椒疫霉病菌，當(dāng)所述待檢測(cè)物能夠抑制如上任意一種DNA序列轉(zhuǎn)錄，或抑制如上任意一種RNA序列翻譯，或抑制和/或失活如上任意一種幾丁質(zhì)合酶的活性，則所述待檢測(cè)物為所述辣椒疫霉病菌的抑菌和/或殺菌劑。所述辣椒疫霉病菌包括辣椒疫霉病菌LT1534菌株。[0016]本發(fā)明之六提供了一種降低辣椒疫霉病菌侵染寄主能力的方法，其包括通過(guò)抑制如上任意一種DNA序列的轉(zhuǎn)錄，或抑制如上任意一種RNA序列的翻譯，或抑制和/或失活如上任意一種幾丁質(zhì)合酶的活性來(lái)降低所述辣椒疫霉病菌侵染所述寄主的能力。所述辣椒疫霉病菌包括辣椒疫霉病菌LT1534菌株。[0017]本發(fā)明之七提供了一種檢測(cè)辣椒疫霉病菌中幾丁質(zhì)合酶轉(zhuǎn)達(dá)水平的方法，其包括選取如上任意一種DNA序列中的任意一段80-300bp，特別是150-200bp長(zhǎng)的靶標(biāo)序列來(lái)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR檢測(cè)；優(yōu)選還包括內(nèi)參序列。所述辣椒疫霉病菌包括辣椒疫霉病菌LT1534菌株。[0018]本發(fā)明之八提供了一種用于擴(kuò)增辣椒疫霉病菌中幾丁質(zhì)合酶表達(dá)水平的引物序列，即用于擴(kuò)增靶標(biāo)序列的引物序列，優(yōu)選所述引物序列如SEQIDNo.5和SEQIDNo.6所示;更優(yōu)選所述內(nèi)參序列的引物序列如SEQIDNo.7-12所示。所述辣椒疫霉病菌包括辣椒疫霉病菌LT1534菌株。[0019]另外，含有上述任意一種DNA序列的重組載體、表達(dá)盒或重組菌也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述重組載體可為重組表達(dá)載體，也可為重組克隆載體。在本發(fā)明中，所述重組表達(dá)載體具體為在PT0R載體的酶切位點(diǎn)Xbal和EcoRI中間正向插入序列表中如SEQIDNo.3所示的DNA片段后得到的重組質(zhì)粒。[0020]在本發(fā)明中，所述重組菌具體為向目的大豆疫霉中導(dǎo)入了如SEQIDNo.3所示的DNA片段后得到的重組大豆疫霉。其中，如SEQIDNo.3所示的DNA片段是以重組載體的形式導(dǎo)入的；所述重組載體具體為在PT0R載體酶切位點(diǎn)Xbal和EcoRI中間正向插入如SEQIDNo.3所示的DNA片段后得到的重組質(zhì)粒。所述目的大豆疫霉具體為大豆疫霉菌株P(guān)S6。[0021]擴(kuò)增編碼如上任意一種幾丁質(zhì)合酶的DNA序列全長(zhǎng)或其上的任意一段DNA序列的一條引物和/或引物對(duì)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。[0022]實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明所提供的幾丁質(zhì)合酶在辣椒疫霉病菌自身生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起作用，利用PEG_CaCl2介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)獲得的沉默轉(zhuǎn)化子的生長(zhǎng)發(fā)育較野生型有明顯變化，主要包括孢子囊形成數(shù)量減少，游動(dòng)孢子產(chǎn)量下降等;通過(guò)游動(dòng)孢子接種離體的寄主的葉片后發(fā)現(xiàn)沉默轉(zhuǎn)化子接種的病斑面積顯著小于野生型，進(jìn)一步通過(guò)游動(dòng)孢子接種活體的寄主的黃化苗發(fā)現(xiàn)沉默轉(zhuǎn)化子接種的植株病斑直徑也顯著低于野生型。因此，辣椒疫霉病菌中幾丁質(zhì)合酶的活性水平可以調(diào)節(jié)活性孢子囊和活性游動(dòng)孢子的產(chǎn)量，從而影響辣椒疫霉病菌的致病力或寄主的發(fā)病程度。本發(fā)明為進(jìn)一步研制辣椒疫霉病菌病菌發(fā)育過(guò)程和分子檢測(cè)技術(shù)，以及辣椒疫霉病菌所導(dǎo)致的多種植物病害的防治與研究提供了技術(shù)基礎(chǔ)。【附圖說(shuō)明】[0023]圖1為辣椒疫霉PCCHS基因的PCR鑒定結(jié)果，其中從左到右依次為以菌絲階段的總DNA、以休止孢階段cDNA和以游動(dòng)孢子階段的cDNA為模板的PCR產(chǎn)物和DNA分子量參照物。[0024]圖2為PCCHS基因在辣椒疫霉不同發(fā)育階段(橫坐標(biāo)從左向右依次為:菌絲(MY)、孢子囊(SP)、游動(dòng)孢子(Z0)、休止孢(CY)、侵染大豆葉片1.5h、3h、6h、12h、24h、48h)的表達(dá)模式分析圖。[0025]圖3為pTOR-PCCHS重組沉默載體示意圖。[0026]圖4為野生型辣椒疫霉(Phytophthoracapsici)菌株LT1534(WT)、空載體對(duì)照轉(zhuǎn)化子CK及PCCHS基因的沉默轉(zhuǎn)化子T22、T33、T62中PCCHS的相對(duì)表達(dá)量。[0027]圖5為野生型辣椒疫霉(Phytophthoracapsici)菌株LT1534(WT)、空載體對(duì)照轉(zhuǎn)化子CK及PCCHS基因的沉默轉(zhuǎn)化子T33和T62的孢子囊形態(tài)照片。[0028]圖6為野生型辣椒疫霉(Phytophthoracapsici)菌株LT1534(WT)、空載體對(duì)照轉(zhuǎn)化子CK及PCCHS基因的沉默轉(zhuǎn)化子T22、T33、T62的孢子囊數(shù)量。[0029]圖7為野生型辣椒疫霉(Phytophthoracapsici)菌株LT1534(WT)、空載體對(duì)照轉(zhuǎn)化子CK及PCCHS基因的沉默轉(zhuǎn)化子T33和T62的孢子囊形態(tài)掃描電鏡結(jié)果。[0030]圖8為野生型辣椒疫霉(Phytophthoracapsici)菌株LT1534(WT)、空載體對(duì)照轉(zhuǎn)化子CK及PCCHS基因的沉默轉(zhuǎn)化子T22、T33和T62的游動(dòng)孢子數(shù)量。[0031]圖9為野生型辣椒疫霉(Phytophthoracapsici)菌株LT1534(WT)、空載體對(duì)照轉(zhuǎn)化子CK及PCCHS基因的沉默轉(zhuǎn)化子T33和T62對(duì)辣椒葉片的致病效果。[0032]圖10為野生型辣椒疫霉(Phytophthoracapsici)菌株LT1534(WT)、空載體對(duì)照轉(zhuǎn)化子CK及PCCHS基因的沉默轉(zhuǎn)化子T33、T62對(duì)辣椒植株的致病效果。【具體實(shí)施方式】[0033]以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。[0034]辣椒疫霉菌株LT1534:由美國(guó)田納西大學(xué)KurtLamour教授饋贈(zèng)，記載于"GenomeSequencingandMappingRevealLossofHeterozygosityasaMechanismforRapidAdaptationintheVegetablePathogenPhytophthoracapsici"，MolPlantMicrobeInteract，2012，公眾可從中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。[0035]裂解酶、纖維素酶、甘露醇均購(gòu)買自Sigma-Aldrich公司，貨號(hào)分別為：L1412、C8546、M1902。[0036]培養(yǎng)基配方：[0037]PDA固體培養(yǎng)基:稱取馬鈴薯200g，削皮切塊后置于1L蒸餾水中加熱30分鐘，用四層紗布過(guò)濾收集濾液后再次定容至1L，加入14g瓊脂粉和18g葡萄糖煮沸，121°C濕熱滅菌20分鐘，即得。[0038]V8固體培養(yǎng)基：100mlV8蔬菜汁，1500轉(zhuǎn)/分(5000g)下離心10min，取上清液與去離子水1:9比例稀釋（100ml的上清液加入900ml去離子水），加入lg碳酸鈣，15g瓊脂，高壓蒸汽滅菌（121°C)20min。[0039]NPB液體及NPBA固體培養(yǎng)基：125g青豌豆，1L去離子水，高壓蒸汽滅菌（121°C)20min后，4層紗布過(guò)濾，取濾液，添加下表所示的各物質(zhì)，并用去離子水定容至1L。高壓蒸汽滅菌（121°C)20min。[0042]PM液體培養(yǎng)基：125g青豌豆，1L去離子水，高壓蒸汽滅菌（121°C)20min后，4層紗布過(guò)濾，取濾液，加入91.lg甘露醇，lgCaCh，2g碳酸媽，并用去離子水定容至1L。高壓蒸汽滅菌（121°C)20min。若制備PM固體培養(yǎng)基，1LPM液體培養(yǎng)基中添加10.5gAgar高壓蒸汽滅菌即可。[0043]MMg培養(yǎng)液：0.4MD-甘露醇，15mMMgCl2,4mM2-(N-嗎啡啉）乙磺酸（MES)，pH5.7;高壓蒸汽滅菌（121°〇2〇111；[11。[0044]pTOR載體:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)王源超實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)，記載于"邵菁亢，辣椒疫霉游動(dòng)孢子群體效應(yīng)的研究。2014年，中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，碩士學(xué)位論文"一文，公眾可從中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。[0045]實(shí)施例[0046]1.辣椒疫霉幾丁質(zhì)合酶PCCHS(Phytophthoracapsicichitinsynthase)基因的克隆[0047]1.1辣椒疫霉總RNA的提取[0048]辣椒疫霉菌株LT1534在固體培養(yǎng)基PDA上在25°C下黑暗培養(yǎng)4天后，從菌落邊緣打取直徑為5mm的菌餅接種在鋪有玻璃紙的TOA平板上，25°C黑暗培養(yǎng)4天后刮取菌絲，取30mg左右的菌絲，至于無(wú)RNase的2ml離心管中，并加入兩顆直徑5mm的鋼珠，液氮冷凍后使用球磨儀研磨至粉末狀。采用Promega公司的SVTotalRNA提取試劑盒提取大豆疫霉RNA，具體方法步驟參考試劑盒中植物組織RNA提取的說(shuō)明。[0049]1.2辣椒疫霉反轉(zhuǎn)錄第一鏈cDNA的合成[0050]第一鏈cDNA合成米用Takara公司的PHmerScriplS.RTreagentKitwithgDNAEraser(PerfectRealTime)試劑盒進(jìn)行。具體步驟如下：[0051](1)去除基因組DNA(10μ1反應(yīng)體系）：5XgDNAEraserBuffer2μ1;gDNAEraserΙμL;總RNA2μ1;無(wú)RNase的超純水5μ1。[0052](2)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（20μ1反應(yīng)體系）：步驟（1)的反應(yīng)液10μ1;5x丨YimcScriptiCBuffer24yl;PfimeScrip丨(i.RTEnzymeMixIlyl;RTPrimerMixΙμL;無(wú)RNase的超純水4μ1〇[0053]反應(yīng)條件：37°(：151^11;851€58;4°(：保存。將獲得的〇0財(cái)稀釋4倍用于1^&1^1116PCR反應(yīng)。[0054]1.3PCCHS基因克隆[0055]設(shè)計(jì)克隆辣椒疫霉幾丁質(zhì)合酶PCCHS基因的引物，PCCHS-F(SEQIDNo.l):ATGAGCGGCGCCCCGCCCCCGT;PCCHS-R:(SEQIDNo·2):TTAGGCCGCCGAGGAGACGTCGTT。以步驟2獲得的辣椒疫霉基因組cDNA為模板，用上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如圖1所示，將擴(kuò)增產(chǎn)物回收后分別與Tl-simpleVector(全式金，北京)連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌T1，通過(guò)藍(lán)白斑篩選、質(zhì)粒DNA的酶切鑒定篩選出陽(yáng)性克隆，提取陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明PCCHS基因由2745個(gè)脫氧核苷酸組成（見(jiàn)SEQIDNo.3)，其編碼914個(gè)氨基酸（序列見(jiàn)SEQIDNo·4)〇[0056]2.PCCHS基因在辣椒疫霉不同發(fā)育階段的表達(dá)模式分析[0057]將不同發(fā)育階段（即菌絲(MY);孢子囊(SP);游動(dòng)孢子(Z0);休止孢(CY);菌絲侵染大豆葉片后1.511、311、611、1211、2411和4811)的辣椒疫霉菌株1^1534的總8祖(提取方法參照1.1辣椒疫霉總RNA的提取)反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA(參照1.2辣椒疫霉反轉(zhuǎn)錄第一鏈cDNA的合成來(lái)合成cDNA)為模板，對(duì)PCCHS基因進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。以辣椒疫霉40S核糖體蛋白S3A基因(WS21)、UBC基因和β-tublin基因中的部分脫氧核苷酸片段作為內(nèi)參。其中靶標(biāo)PCCHS基因中的脫氧核苷酸片段用引物PCCHS-RT-F和PCCHS-RT-R擴(kuò)增;WS21中的脫氧核苷酸片段用引物WS21-F和WS21-R擴(kuò)增；β-tublin基因中的脫氧核苷酸片段用引物β-tublin-F和0_tublin-R擴(kuò)增。[0058]由RealtimePCR反應(yīng)米用Takara公司的SYBR.?PremixExTaqTM(PerfectRealTime)試劑盒，反應(yīng)體系如下所示：[0064]使用ABIPRISM?7500進(jìn)行RealtimePCR反應(yīng)，每個(gè)樣品做三次重復(fù)，采用2-AACt的方法計(jì)算PCCHS基因的相對(duì)表達(dá)量。[0065]結(jié)果如圖2所示，目的基因PCCHS的表達(dá)量從辣椒疫霉孢子囊形成階段開始出現(xiàn)上調(diào)，且PCCHS在辣椒疫霉侵染大豆葉片階段表達(dá)量也顯著上調(diào)，因此將這兩個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育階段作為研究重點(diǎn)。[0066]3.辣椒疫霉PCCHS基因的沉默轉(zhuǎn)化子的獲得[0067]3.1辣椒疫霉PCCHS基因的沉默表達(dá)載體的獲得[0068]以辣椒疫霉菌株LT1534的cDNA為模板，采用引物PCCHS-XbaI-F(SEQIDNo.13):TCTAGAATGAGCGACCTTCCACCT(下劃線部分為Xbal的識(shí)別酶切位點(diǎn)）和PCCHS_ClaI_R(SEQIDNo.14):ATCGATTTACGCGACCGAGGAGAT(下劃線部分為Clal的識(shí)別酶切位點(diǎn))進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將擴(kuò)增產(chǎn)物回收后分別與Tl-simpleVector(全式金，北京)連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌T1，通過(guò)藍(lán)白斑篩選、質(zhì)粒DNA的酶切鑒定篩選出陽(yáng)性克隆，提取陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，并擴(kuò)繁pTOR質(zhì)粒用于酶切。酶切體系如下(酶購(gòu)買自NEB):[0069][0070]在37Γ水浴中酶切5-15min。[0071]將酶切后的PCCHS基因連接至酶切后的pTOR質(zhì)粒中，連接體系如下（T4ligase購(gòu)買自NEB):[0072][0073]置于25°C條件下連接30min，轉(zhuǎn)化大腸桿菌T1，通過(guò)抗性標(biāo)記篩選、質(zhì)粒DNA的酶切鑒定篩選出陽(yáng)性克隆，提取陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。[0074]利用載體引物pT0R-F(SEQIDNo.l5)TCACTCTCACGTGCCCAAGTCC和pT0R-R(SEQIDNo.16)TTGTATTAAATGCATAGACACA進(jìn)行測(cè)序，在pTOR載體的酶切位點(diǎn)EcoRI和Xbal處反向插入如SEQIDNo.3所示的序列的重組質(zhì)粒即為辣椒疫霉PCCHS基因的沉默表達(dá)載體pTOR-PCCHS(圖3)。[0075]3.2辣椒疫霉PCCHS基因的沉默轉(zhuǎn)化子的獲得[0076]采用CaCl2_PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法制備辣椒疫霉PCCHS基因的沉默轉(zhuǎn)化子和過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)化子。具體步驟如下：[0077]第一步，辣椒疫霉菌株LT1534的培養(yǎng)，如下：[0078](1)將辣椒疫霉菌株LT1534在V8固體培養(yǎng)基平板上于25°C下黑暗培養(yǎng)4天，從菌落邊緣切取直徑5mm的菌絲塊重新轉(zhuǎn)移到NPBA平板上，在NPBA平板25°C下黑暗培養(yǎng)3-4天。[0079](2)菌株培養(yǎng)3-4天后，從菌落邊緣切取2X2mm的菌絲塊10塊左右，放入裝有60mlNPB的三角瓶中，共培養(yǎng)3瓶。在NPBA固體培養(yǎng)基中25°C條件下黑暗靜止培養(yǎng)2天。[0080]第二步，辣椒疫霉的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化[0081](1)靜止培養(yǎng)2天后，1層紗布過(guò)濾，收集菌絲至50ml的離心管中，用約40ml的0.8MD-甘露醇漂洗菌絲，再次用約40ml的0.8MD-甘露醇漂洗菌絲。室溫下75rpm的水平搖床上漂洗lOmin。[0082](2)配制酶液:0.15g裂解酶，0.06g纖維素，10ml0.8MD-甘露醇，8mlddH20,800y10.5Μκα，800μ10.5ΜMES，400yl0.5ΜCaCl2。并過(guò)濾滅菌。[0083](3)向盛有步驟(2)配制的酶液的離心管中加已漂洗好的菌絲，室溫下75rpm裂解菌絲35_50min。[0084](4)配置40%的PEG4000(6gPEG4000,3.75ml0.8MD-甘露醇，3ml0.5MCaCl2，3mlH2O)，室溫下磁力攪拌至完全溶解，過(guò)濾滅菌后，盛于50ml的滅菌小燒杯中，放在冰上備用。[0085](5)酶解充分時(shí)，用事先包扎好2層聚酯人造纖維濾布(mira-cloth)的50ml燒杯來(lái)過(guò)濾菌絲以收集原生質(zhì)體。然后將收集好的原生質(zhì)體倒入50mlFalcon離心管中，4°C，524g，離心3min。[0086](6)原生質(zhì)體離心收集后，棄上清，用30ml左右預(yù)冷的W5洗滌沉淀。4°C，524g，離心4min〇[0087](7)棄上清，用10ml左右W5溶液懸浮原生質(zhì)體，并在冰上擱置30min。[0088](7)4°C，524g，離心4min。棄上清，加入MMg培養(yǎng)液以懸浮原生質(zhì)體，并使原生質(zhì)體的終濃度達(dá)到2X106/ml左右。[0089](8)室溫放置lOmin，分裝質(zhì)粒（步驟一獲得的辣椒疫霉PCCHS基因的沉默表達(dá)載體)至5〇1111的？&1〇〇11離心管中，每管4(^8的質(zhì)粒0嫩。[0090](9)用剪過(guò)的槍頭吸取lml原生質(zhì)體加入上述Falcon離心管中，并將質(zhì)粒與原生質(zhì)體輕輕混勻，然后置于冰上l〇min。[0091](10)加入40%PEG4000溶液，每管加入1740μ1，輕柔混勻。PEG分3次加，每次加入580μ1〇[0092](11)PEG加入混勻后，放在冰上靜止20min。[0093](12)20min后，每管中加入2mlPM培養(yǎng)基，混勻后冰上靜置2min。[0094](13)靜置2min后再加入8mlPM培養(yǎng)基，再靜置2min。[0095](14)置2min后再加入10ml左右的PM培養(yǎng)基，混勻后，室溫下靜置培養(yǎng)14h，使原生質(zhì)體再生。[0096](15)在699g下離心5min，棄去上清液。[0097](16)PM固體培養(yǎng)基冷卻至一定溫度時(shí)，加入終濃度為30μg/ml的G418，混勻后，將培養(yǎng)基倒入上述50ml的離心管中，與再生菌絲混勾。[0098](17)將混勻后的PM培養(yǎng)基和菌絲混合物倒入9cm培養(yǎng)皿中，晾干。25°C下黑暗培養(yǎng)3-4天，觀察有無(wú)菌落長(zhǎng)出。若是有菌落長(zhǎng)出，則為疑似轉(zhuǎn)化子，提取保存后用于下游的鑒定和分析實(shí)驗(yàn)。[0099]實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)置向辣椒疫霉菌株LT1534中僅轉(zhuǎn)入pTOR標(biāo)記質(zhì)粒的對(duì)照。[0100]3.3辣椒疫霉PCCHS基因的沉默轉(zhuǎn)化子的鑒定[0101]將經(jīng)過(guò)上述3.2小節(jié)操作得到的轉(zhuǎn)化子經(jīng)遺傳霉素(G418)抗性V8固體培養(yǎng)基平板25°C培養(yǎng)再次篩選，從菌落邊緣打取菌絲塊接種在鋪有玻璃紙的TOA平板上，25°C黑暗培養(yǎng)4天后刮取菌絲，參照前文方法提取轉(zhuǎn)化子樣品的RNA。經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA之后，進(jìn)行熒光定量PCR驗(yàn)證。以辣椒疫霉40S核糖體蛋白S3A基因（WS21)、UBC基因和β-tublin基因?yàn)閮?nèi)參，以野生型辣椒疫霉菌株LT1534及轉(zhuǎn)化pTOR標(biāo)記質(zhì)粒的辣椒疫霉菌株LT1534為對(duì)照。具體引物和操作參見(jiàn)本實(shí)施例的第2小節(jié)。[0102]使用ABIPRISM?7500進(jìn)行RealtimePCR反應(yīng)，每個(gè)樣品做三次重復(fù)，采用2-AACt的方法計(jì)算PCCHS基因的相對(duì)表達(dá)量。[0103]辣椒疫霉PCCHS基因的沉默轉(zhuǎn)化子的鑒定結(jié)果顯示，作為對(duì)照的野生型辣椒疫霉菌株LT1534及轉(zhuǎn)化pTOR標(biāo)記質(zhì)粒的辣椒疫霉菌株均擴(kuò)增出目的條帶，而辣椒疫霉PCCHS基因的沉默轉(zhuǎn)化子幾乎擴(kuò)增不到目的條帶。從辣椒疫霉PCCHS基因的沉默轉(zhuǎn)化子隨機(jī)挑選三個(gè)分別標(biāo)記為T22、T33和T62。辣椒疫霉PCCHS基因的沉默轉(zhuǎn)化子的具體鑒定結(jié)果如圖4所示，PCCHS的沉默效率介于60%-80%之間。[0104]4.辣椒疫霉PCCHS基因的沉默轉(zhuǎn)化子的生物學(xué)形狀分析[0105]4.1菌絲生長(zhǎng)速率檢測(cè)[0106]將野生型辣椒疫霉(Phytophthoracapsici)菌株LT1534(WT)、空載體對(duì)照轉(zhuǎn)化子CK和沉默轉(zhuǎn)化子T22、T33和T62接種于加有15mlV8固體培養(yǎng)基的9cm培養(yǎng)皿中央上，25°C黑暗條件下培養(yǎng)4天，用十字交叉法測(cè)量各菌株的菌落直徑，每個(gè)菌株3次重復(fù)。由此得到菌絲生長(zhǎng)速率。[0107]結(jié)果顯示，與野生型辣椒疫霉(Phytophthoracapsici)菌株LT1534(WT)、空載體對(duì)照轉(zhuǎn)化子CK相比，PCCHS基因的沉默轉(zhuǎn)化子T22、T33和T62的菌落直徑并無(wú)明顯變化。[0108]4.2孢子囊數(shù)量和形態(tài)檢測(cè)[0109]將野生型辣椒疫霉(Phytophthoracapsici)菌株LT1534(WT)、空載體對(duì)照轉(zhuǎn)化子CK和沉默轉(zhuǎn)化子T22、T33和T6接種于V8培養(yǎng)基上，光照培養(yǎng)5天。待辣椒疫霉形成大量孢子囊后，進(jìn)行顯微鏡觀察。同時(shí)，切取在V8固體培養(yǎng)基不同位置的樣品，用2.5%(體積分?jǐn)?shù))戊二醛4°C固定過(guò)夜后送樣至電鏡室，進(jìn)行掃描電鏡觀察。[0110]結(jié)果顯示，沉默轉(zhuǎn)化子T22、T33、T62與野生型辣椒疫霉(Phytophthoracapsici)菌株LT1534(WT)和空載體對(duì)照轉(zhuǎn)化子CK相比，孢子囊數(shù)量顯著下降（圖5和圖6)。進(jìn)一步借助掃描電鏡觀察，結(jié)果如圖7所示沉默轉(zhuǎn)化子T22、T33和T62形成的少量孢子囊形態(tài)發(fā)生了畸形，乳突更加明顯，且孢子囊內(nèi)形成的內(nèi)含物顯著減少。[0111]4.3游動(dòng)孢子數(shù)量檢測(cè)[0112]將野生型辣椒疫霉(Phytophthoracapsici)菌株LT1534(WT)、空載體對(duì)照轉(zhuǎn)化子CK和沉默轉(zhuǎn)化子T22、T33、T62接種于V8培養(yǎng)基上，25°C條件下黑暗培養(yǎng)3天，光照培養(yǎng)5天。待辣椒疫霉形成大量孢子囊，加入適量無(wú)菌蒸餾水置于4°C條件下30min，25°C條件下30min后，收集孢子懸浮液，鏡檢濃度。[0113]結(jié)果顯示，沉默轉(zhuǎn)化子T22、T33、T62與野生型辣椒疫霉(Phytophthoracapsici)菌株LT1534(WT)和空載體對(duì)照轉(zhuǎn)化子CK相比，如圖8所示，游動(dòng)孢子數(shù)量顯著下降，這與上文提到的沉默轉(zhuǎn)化子孢子囊數(shù)量顯著下降，孢子囊形態(tài)發(fā)生畸形密切相關(guān)。[0114]4.4轉(zhuǎn)化子的離體葉片致病力[0115]采用上述方法制備野生型辣椒疫霉(Phytophthoracapsici)菌株LT1534(WT)、空載體對(duì)照轉(zhuǎn)化子CK、沉默轉(zhuǎn)化子T22、T33、T62的孢子懸浮液。配制孢子懸浮液并在顯微鏡下計(jì)數(shù)，計(jì)算每ml孢子懸浮液中的游動(dòng)孢子數(shù)量。將孢子懸浮液的濃度稀釋到1XlOVr1。收集孢子懸浮液后，取兩層吸水紙鋪在Φ15cm的培養(yǎng)皿中，倒入適量去離子水后放入玻璃支架，采健壯、等位、同齡的大豆葉片置于玻璃支架上面。將稀釋后的孢子懸浮液接種于辣椒葉片，每片葉片接種10滴，每滴1〇μ1，每組接種5片葉片。將培養(yǎng)皿封口后置于溫度為25°C，濕度為70%條件下，12h光暗交替培養(yǎng)3d。每天觀察癥狀，拍照記錄。[0116]結(jié)果顯示，接種野生型辣椒疫霉(Phytophthoracapsici)菌株LT1534(WT)孢子懸浮液的葉片發(fā)病較快，在接種第2天時(shí)接種位點(diǎn)就出現(xiàn)壞死腐爛斑，并且病斑有擴(kuò)大趨勢(shì)，在接種第三天時(shí)病斑面積可達(dá)到3.8cm2。接種空載體對(duì)照轉(zhuǎn)化子CK孢子懸浮液的葉片出現(xiàn)了相同癥狀，無(wú)菌水接種的辣椒葉片沒(méi)有出現(xiàn)病斑（圖9);而用沉默轉(zhuǎn)化子T22、T33和T62的孢子懸浮液接種的辣椒葉片在接種第3天在接種位點(diǎn)出現(xiàn)壞死性腐爛斑，強(qiáng)度顯著減弱(病斑顏色比對(duì)照淺，面積比對(duì)照?。l(fā)病面積顯著小于接種辣椒疫霉野生型菌株LT1534(WT)的葉片，在接種第三天時(shí)病斑面積僅介于〇.2cm2-l.4cm2(圖9)。[0117]4.5轉(zhuǎn)化子的活體植株致病力[0118]采用上述方法制備野生型辣椒疫霉(Phytophthoracapsici)菌株LT1534(WT)，空載體對(duì)照轉(zhuǎn)化子CK，沉默轉(zhuǎn)化子T22、T33和T62的孢子懸浮液。配制孢子懸浮液并在顯微鏡下計(jì)數(shù)，計(jì)算每ml孢子懸浮液中的游動(dòng)孢子數(shù)量。將孢子懸浮液的濃度稀釋到1XlOVr1。收集孢子懸浮液后，選取含有50個(gè)穴的穴盤種植辣椒，每個(gè)穴中播種2粒辣椒種子，將辣椒置于溫室中培養(yǎng)，待辣椒長(zhǎng)到六葉期時(shí)，進(jìn)行活體接種試驗(yàn)。采用灌根的方法接種孢子懸浮液，每個(gè)穴接種3ml孢子懸浮液，每組接種30株辣椒幼苗，每天觀察癥狀，拍照記錄，7天后觀察統(tǒng)計(jì)結(jié)果。[0119]病情參照以下標(biāo)準(zhǔn)劃分為0-5級(jí)。[0122]結(jié)果顯示，接種野生型辣椒疫霉(Phytophthoracapsici)菌株LT1534(WT)孢子懸浮液的植株發(fā)病較快，在接種第3-4天時(shí)接種位點(diǎn)就出現(xiàn)莖部壞死，并且壞死有擴(kuò)大趨勢(shì)，在接種第七天時(shí)病情指數(shù)可達(dá)2-3級(jí)。接種空載體對(duì)照轉(zhuǎn)化子CK孢子懸浮液的植株出現(xiàn)了相同癥狀，無(wú)菌水接種的辣椒植株沒(méi)有出現(xiàn)病斑（圖10);而用實(shí)施例3得到的沉默轉(zhuǎn)化子T22、T33和T62的孢子懸浮液接種的辣椒植株在接種第5-6天在接種位點(diǎn)出現(xiàn)壞死，病情指數(shù)顯著低于接種辣椒疫霉野生型菌株LT1534(WT)的葉片，在接種第七天時(shí)病情指數(shù)介于0-1級(jí)。[0123]上述實(shí)驗(yàn)按說(shuō)明PCCHS基因參與了辣椒疫霉侵染寄主及導(dǎo)致辣椒疫霉病程發(fā)生的過(guò)程，是重要的致病因子?！局鳈?quán)項(xiàng)】1.一種辣椒疫霉病菌(Phytophthoracapsici)幾丁質(zhì)合酶，其氨基酸序列為與如SEQIDNo.4所示的氨基酸序列在相似性在在93%以上，優(yōu)選在95%以上，更優(yōu)選在98%以上且具有與如SEQIDNo.4所示的氨基酸序列相同功能的氨基酸序列。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的幾丁質(zhì)合酶，其特征在于，所述幾丁質(zhì)合酶的氨基酸序列如SEQIDNo.4所示。3.-種能夠編碼如權(quán)利要求1或2所述的幾丁質(zhì)合酶的DNA序列；優(yōu)選所述DNA序列為與如SEQIDNo.3所示的DNA序列的相似性在75%以上，進(jìn)一步優(yōu)選在85%以上，更優(yōu)選在95%以上且具有與如SEQIDNo.3所示的DNA序列相同功能的DNA序列；最優(yōu)選所述DNA序列如SEQIDNo.3所示。4.如權(quán)利要求3所述的DNA序列轉(zhuǎn)錄得到的RNA序列；優(yōu)選所述RNA序列為與如SEQIDNo.3所示的DNA序列轉(zhuǎn)錄的RNA序列的相似性在75%以上，進(jìn)一步優(yōu)選在85%以上，更優(yōu)選在95%以上且具有與如SEQIDNo.3所示的DNA序列轉(zhuǎn)錄的RNA序列相同功能的RNA序列；最優(yōu)選RNA序列為如SEQIDNo.3所示的DNA序列轉(zhuǎn)錄的RNA序列。5.-種能夠抑制和/或殺滅辣椒疫霉病菌(Phytophthoracapsici)生長(zhǎng)的方法，所述方法包括通過(guò)抑制如權(quán)利要求3所述的DNA序列的轉(zhuǎn)錄，或抑制如權(quán)利要求4所述的RNA序列的翻譯，或抑制和/或失活如權(quán)利要求1或2所述的幾丁質(zhì)合酶的活性來(lái)抑制和/或殺滅所述辣椒疫霉病菌生長(zhǎng)。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法用于抑制和/或殺滅辣椒疫霉病菌。7.-種篩選辣椒疫霉病菌(Phytophthoracapsici)抑菌和/或殺菌劑的方法，所述方法包括將待檢測(cè)物應(yīng)用于所述辣椒疫霉病菌，當(dāng)所述待檢測(cè)物能夠抑制如權(quán)利要求3所述的DNA序列轉(zhuǎn)錄，或抑制如權(quán)利要求4所述的RNA序列翻譯，或抑制和/或失活如權(quán)利要求1或2所述的幾丁質(zhì)合酶的活性，則所述待檢測(cè)物為所述辣椒疫霉病菌的抑菌和/或殺菌劑。8·-種降低辣椒疫霉病菌(Phytophthoracapsici)侵染寄主能力的方法，其包括通過(guò)抑制如權(quán)利要求3所述的DNA序列的轉(zhuǎn)錄，或抑制如權(quán)利要求4所述的RNA序列的翻譯，或抑制和/或失活如權(quán)利要求1或2所述的幾丁質(zhì)合酶的活性來(lái)降低所述辣椒疫霉病菌侵染所述寄主的能力。9.一種檢測(cè)辣椒疫霉病菌(Phytophthoracapsici)中幾丁質(zhì)合酶轉(zhuǎn)錄水平的方法，其包括選取如權(quán)利要求3所述的DNA序列中的任意一段80-300bp，特別是150-200bp長(zhǎng)的靶標(biāo)序列來(lái)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR檢測(cè);優(yōu)選還包括內(nèi)參序列。10.-種用于擴(kuò)增如權(quán)利要求9所述方法中的所述靶標(biāo)序列的引物序列，優(yōu)選所述引物序列如SEQIDNo.5和SEQIDNo.6所示；更優(yōu)選用于擴(kuò)增所述內(nèi)參序列的引物序列如SEQIDNo.7-12所示?！疚臋n編號(hào)】C12Q1/68GK105886482SQ201610322494【公開日】2016年8月24日【申請(qǐng)日】2016年5月16日【發(fā)明人】劉西莉,張燦,王為鎮(zhèn),刁永朝,牟文君,劉利,遲源冬,劉鵬飛,張文華【申請(qǐng)人】中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)