一種用于FTO基因分型的ARMS-qPCR檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及一種用于FTO基因分型的ARMS?qPCR檢測(cè)試劑盒，本發(fā)明還涉及一種基于本試劑盒的FTO基因分型ARMS?qPCR檢測(cè)方法。本試劑盒包括qPCR反應(yīng)體系，所述qPCR反應(yīng)體系包括qPCR混合反應(yīng)液、參照引物、ARMS引物和陽(yáng)極對(duì)照樣品；所述qPCR混合反應(yīng)液包括PCR緩沖液、dNTP、MgCl2、Tag酶、PCR下游引物和TaqMan探針；所述qPCR反應(yīng)體系中，各組分的終濃度分別為：PCR緩沖液為1X；dNTP為0.1～1.5mM；MgCl2為0.5～5mM；Tag酶為0.05～0.1U/μl；PCR下游引物為0.1～1μM；TaqMan探針為0.1～1μM；參照引物為0.5μM；ARMS引物為0.5μM；陽(yáng)性對(duì)照樣品為1～10ng/μl。與直接測(cè)序等基因分型的技術(shù)相比，本發(fā)明用于FTO基因分型有特異性強(qiáng)、靈敏度高，操作簡(jiǎn)單快速、高通量、判讀結(jié)果可靠，簡(jiǎn)便等優(yōu)勢(shì)。
【專利說明】
-種用于FTO基因分型的ARMS-qPCR檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方 法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種用于FT0基因分型的ARMS-qPCR檢測(cè) 試劑盒，本發(fā)明還涉及一種FT0基因分型ARMS-qPCR檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 肥胖癥是一種慢性病，據(jù)世界衛(wèi)生組織估計(jì)，是人類目前面臨最容易被忽視，但發(fā) 病率卻在急劇上升的一種疾病。肥胖癥能導(dǎo)致多種生理和心理疾病，比如糖尿病、癌癥、心 血管疾病以及社交障礙等。造成肥胖癥的原因很多，比如過量的能量攝入和靜止型的生活 方式等。越來越多的研究表明，遺傳因素在肥胖癥發(fā)病過程中扮演著重要的角色（Frayling et al. 2007, Gerken et al. 2007, Dina et al. 2007, Chu et al. 2008)〇
[0003] FTO基因位于人第16號(hào)染色體，編碼3' mT的去甲基化酶（Jia et al. 2011)。有 研究表明，F(xiàn)T0的不同基因型與肥胖癥的發(fā)病率緊密相關(guān)（Frayling et al.2007，）。FT0 rs9939609AT和AA基因型的人比rs9939609TT基因型的人具有顯著地肥胖癥發(fā)病風(fēng)險(xiǎn) (Speakman et al.2008)。更有趣的是，F(xiàn)T0基因不同基因型與肥胖癥之間顯著地相關(guān)性具 有性別差異，男性rs9939609 AT和AA基因型肥胖癥發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)顯著地高于rs9939609 TT基 因型的人，而在女性中卻沒有差異。因此rs9939609不同的基因型是一個(gè)極好的男性肥胖 癥風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)指標(biāo)，對(duì)于肥胖癥的預(yù)防以及其后的治療具有重要的指導(dǎo)意義。
[0004] 可用于FTO rs9939609分型的技術(shù)很多，包括如DNA直接測(cè)序法、雜交芯片法、焦 磷酸測(cè)序法以及變性高效液相色譜法等。其中，DNA測(cè)序法為基因分型的金標(biāo)準(zhǔn)，該方法 存在如下缺點(diǎn)：檢測(cè)的靈敏度不高，只有大于15%的突變才能檢測(cè)到；費(fèi)時(shí)，操作復(fù)雜，對(duì) 操作人員要求高；非閉管操作，涉及PCR擴(kuò)增后的操作，因此易被污染，造成結(jié)果的不理想； 通量太小，一次最多只能做24個(gè)，很難大規(guī)模開展。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對(duì)技術(shù)現(xiàn)狀提供一種靈敏度高、特異性強(qiáng)的用于 FT0基因分型的ARMS-qPCR檢測(cè)試劑盒。
[0006] 本發(fā)明所要解決的第二個(gè)技術(shù)問題是提供一種FT0基因分型的ARMS-qPCR檢測(cè)方 法，該檢測(cè)方法靈敏度高、特異性強(qiáng)，而且操作簡(jiǎn)單。
[0007] 本發(fā)明解決上述第一個(gè)技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為：一種用于FT0基因分型的 ARMS-qPCR檢測(cè)試劑盒，包括qPCR反應(yīng)體系，所述qPCR反應(yīng)體系包括qPCR混合反應(yīng)液、參 照引物、ARMS引物和陽(yáng)極對(duì)照樣品；所述qPCR混合反應(yīng)液包括PCR緩沖液、dNTP、MgCl 2、 Tag酶、PCR下游引物和TaqMan探針；
[0008] 所述qPCR反應(yīng)體系中，各組分的終濃度分別為：PCR緩沖液為IX ;dNTP為0. 1~ 1.5禮；1%(：12為0.5~51111汀&8酶為0.05~0.11]/^1屮0?下游引物為0.1~14]\1汀39]\&111 探針為0. 1~1 μ Μ ;參照引物為0. 5 μ M ;ARMS引物為0. 5 μ Μ ;陽(yáng)性對(duì)照樣品為1~10ng/ μ 1〇
[0009] 其中，所述PCR下游引物的序列如FT0-R所示；
[0010] 所述TaqMan探針的序列如FT〇-TaqMan所示；
[0011] 所述參照引物的序列如FT0-C所示，能夠擴(kuò)增所有不同F(xiàn)T0基因型；
[0012] 所述ARMS引物為兩種上游引物中的任意一種，分別對(duì)應(yīng)FTO AArS9939609、 TTrs9939609型基因型，這兩種上游引物的序列如FT0-F1、FT0-F2所示；這兩種ARMS引物 分別在3'末端與不同的基因型堿基匹配，同時(shí)在其3'末端倒數(shù)第2、3位增加一個(gè)或者兩 個(gè)堿基錯(cuò)配，以增加其特異性；用于特異性擴(kuò)增的FTO rs9939609位基因型為AA/TT/AT ;
[0013] 所述陽(yáng)極對(duì)照樣品分別為FT0不同基因型堿基置換的質(zhì)?；蚪MDNA。
[0014] 各引物序列列舉如下：
[0015] FT0-R : 5 ' -ATCTTATGTCCAAACAGTAG-3 '
[0016] FTO-TaqMan :5, -FAM-TAGGTAACAGTCAGAAATGG-3，
[0017] FT0-C : 5 ' -AGTTATGCATTTAGAATGTC-3 '
[0018] FT0-F1 :5, -TTGCGACTGCTGTGAATGCT-3'
[0019] FT0-F2 :5' -TTGCGACTGCTGTGAATGCA-3'
[0020] 其中，所述 Tag 酶為 Takara Tag 酶或 Goldstar Best Tag 酶。
[0021] 本發(fā)明解決上述第二個(gè)技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為：基于上述試劑盒的FTO基 因分型ARMS-qPCR檢測(cè)方法，該方法先是針對(duì)FT0基因設(shè)計(jì)一對(duì)參照引物、TaqMan探針，針 對(duì)rs9939609位點(diǎn)的不同基因型設(shè)計(jì)ARMS引物，反應(yīng)體系中加入qPCR混合反應(yīng)液，參照引 物或者ARMS引物、TaqMan引物和待測(cè)模板DNA進(jìn)行熒光定量PCR的檢測(cè)，具體包括如下步 驟：
[0022] (1)設(shè)計(jì)并篩選含有FT0基因 rs9939609位不同基因型通用的參照引物、TaqMan 探針及兩種ARMS引物；
[0023] (2)從細(xì)胞體系或血液中提取到基因組DNA作為模板DNA ;
[0024] (3)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，每個(gè)樣本的檢測(cè)分3管進(jìn)行，每個(gè)管加入相同的 qPCR混合反應(yīng)液，TaqMan探針和模板DNA，每管分別加入?yún)⒄找锖蛢煞NARMS引物中的一 種，進(jìn)行FT0基因 rs9939609位基因分型的qPCR檢測(cè)；
[0025] (4)結(jié)果判讀：
[0026] 參照引物管擴(kuò)增曲線陽(yáng)性，F(xiàn)T0-F1管擴(kuò)增曲線陽(yáng)性，F(xiàn)T0-F2管擴(kuò)增曲線陰性或者 其與參照引物管的擴(kuò)增曲線Δ CT > 10,該樣本結(jié)果判定為rs9939609AA基因型；
[0027] 參照引物管擴(kuò)增曲線陽(yáng)性，F(xiàn)T0-F1管擴(kuò)增曲線陽(yáng)性，F(xiàn)T0-F2管擴(kuò)增曲線陽(yáng)性，該 樣本結(jié)果判定為rs9939609A/T基因型；
[0028] 參照引物管擴(kuò)增曲線陽(yáng)性，F(xiàn)T0-F1管擴(kuò)增曲線陰性或者其與參照引物管的擴(kuò)增曲 線Λ CT > 10, FT0-F2管擴(kuò)增曲線陽(yáng)性，該樣本結(jié)果判定為rs9939609TT基因型；
[0029] 參照引物管擴(kuò)增曲線陰性，提示該樣本提取失敗，需要重新進(jìn)行提取。
[0030] 所述步驟（2)中，模板DNA選自人體血液基因組DNA或者口腔黏膜脫落細(xì)胞或頭 發(fā)。
[0031] 所述步驟（3)中，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)的條件為，95°C預(yù)變性2min，95°C變性15s， 60°C延伸lmin，46個(gè)循環(huán)。
[0032] 上述技術(shù)方案中所提及的qPCR的英文全名是Real-time Quantitative PCR Detecting System。即實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測(cè)系統(tǒng)，也叫實(shí)時(shí)定量基因擴(kuò)增熒光檢測(cè) 系統(tǒng)，簡(jiǎn)稱qPCR。
[0033] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：
[0034] 本發(fā)明提供了一種FTO rs9939609基因分型的ARMS-qPCR檢測(cè)試劑盒，以解決現(xiàn) 有基因分型檢測(cè)技術(shù)中費(fèi)時(shí)、程序繁瑣以及易污染等問題。本試劑盒可以快速、準(zhǔn)確、便宜、 高通量給FTO rs9939609基因進(jìn)行分型，其靈敏度高，特異性強(qiáng)，適用于常見樣本比如血液、 口腔黏膜以及頭發(fā)等。
[0035] 本發(fā)明能夠快速、低廉、準(zhǔn)確，高通量地檢測(cè)人體血液或者其他組織細(xì)胞中FT0基 因不同的類型，對(duì)于分型技術(shù)而言，是目前性價(jià)比最好的方法。便于臨床或者健康檢測(cè)大 規(guī)模的推行。
[0036] 本發(fā)明所用的 ARMS (amplification refractory mutation system)即擴(kuò)增阻礙突 變系統(tǒng)，用于對(duì)已知突變基因進(jìn)行檢測(cè)。該法通過設(shè)計(jì)兩個(gè)5'端引物，一個(gè)與正常DNA互 補(bǔ)，一個(gè)與突變DNA互補(bǔ)，對(duì)于純合性突變，分別加入這兩種引物及3'端引物進(jìn)行兩個(gè)平行 PCR，只有與突變DNA完全互補(bǔ)的引物才可延伸并得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。如果錯(cuò)配位于引物的 3'端則導(dǎo)致PCR不能延伸，則稱為ARMS。
[0037] ARMS檢測(cè)的靈敏度依賴于ARMS引物的特異性以及反應(yīng)條件如反應(yīng)液中MgC12的 濃度，加不加 DMS0等的優(yōu)化。為了增加引物的特異性，減少引物與靶向DNA有錯(cuò)配時(shí)的錯(cuò) 配延伸，可通過在引物3'端的第2、3個(gè)堿基引入另外一個(gè)或者兩個(gè)錯(cuò)配堿基，使之與模板 之間形成多重錯(cuò)配以阻止錯(cuò)誤延伸。
[0038] 本發(fā)明所用的探針為5'端FAM標(biāo)記的TaqMan探針，探針兩端分別標(biāo)記熒光報(bào)告 基團(tuán)（R)和熒光淬滅基團(tuán)（Q)。在探針完整時(shí)，即在隨機(jī)狀態(tài)和無 PCR產(chǎn)物雜交狀態(tài)時(shí)，報(bào) 告基團(tuán)發(fā)出的熒光被淬滅基團(tuán)吸收，檢測(cè)不到熒光的存在。在ARMS-qPCR擴(kuò)增過程中，當(dāng)特 異的PCR產(chǎn)物與TaqMan探針發(fā)生雜交反應(yīng)時(shí)，Goldstar Best Tag酶的5'端外切酶活性 也把TaqMan探針的堿基逐個(gè)剪切，報(bào)告基團(tuán)所釋放出的熒光就可以被內(nèi)置到PCR儀中的熒 光計(jì)檢測(cè)到。PCR經(jīng)過一個(gè)循環(huán)，熒光信號(hào)也和目的片段一樣，有一個(gè)同步指數(shù)擴(kuò)增的過程， 熒光信號(hào)的強(qiáng)弱就代表模板DNA拷貝數(shù)的多少。因此本發(fā)明是個(gè)很好的基因分型的工具。
[0039] 綜合了 ARMS引物以及實(shí)時(shí)熒光定量PCR的優(yōu)點(diǎn)，與直接測(cè)序等基因分型的技術(shù)相 比較，本發(fā)明用于FT0基因分型基因檢測(cè)具有如下優(yōu)勢(shì)：
[0040] 1、特異性強(qiáng)：設(shè)計(jì)的ARMS引物分別針對(duì)FTO AA rs9939609, TT rs9939609的特 異變異序列，能特異地?cái)U(kuò)增相應(yīng)的基因型DNA ;在ARMS引物3 '端的倒數(shù)第2、3個(gè)堿基引入 另外一個(gè)或者兩個(gè)錯(cuò)配堿基，增加 ARMS引物的特異性；
[0041] 2、本發(fā)明技術(shù)的靈敏度可達(dá)1%，遠(yuǎn)高于DNA直接測(cè)序15%的靈敏度；
[0042] 3、檢測(cè)過程為閉管反應(yīng)，大大降低了污染及結(jié)果偏差的可能性；
[0043] 4、操作快速簡(jiǎn)單，從樣本送檢到得到結(jié)果可在3個(gè)小時(shí)內(nèi)完成。而直接測(cè)序法檢 測(cè)步驟繁瑣：送檢標(biāo)本一提取DNA - PCR擴(kuò)增一驗(yàn)證PCR產(chǎn)物（電泳）一純化PCR產(chǎn)物一 直接測(cè)序一結(jié)果分析，其經(jīng)過兩個(gè)PCR產(chǎn)物的電泳過程，污染幾率很大，不適合在醫(yī)院大規(guī) 模開展；
[0044] 5、判讀結(jié)果明確客觀，若需要時(shí)可對(duì)結(jié)果進(jìn)行定量分析；
[0045] 6、高通量，一次可以檢測(cè)96個(gè)樣本；
[0046] 7、安全，整個(gè)體系中不包含有毒有害物質(zhì)，無需PCR產(chǎn)物的后處理，對(duì)操作人員和 環(huán)境都無害。
[0047] 總之，與直接測(cè)序等基因分型的技術(shù)相比，本發(fā)明用于FT0基因分型有特異性強(qiáng)、 靈敏度高，操作簡(jiǎn)單快速、高通量、判讀結(jié)果可靠，簡(jiǎn)便等優(yōu)勢(shì)。
【附圖說明】
[0048] 圖1為用FTO ARMS-qPCR基因分型試劑盒檢測(cè)一抑郁癥患者FTO rs9939609位置 基因型的擴(kuò)增曲線，經(jīng)檢測(cè)，此樣品在rs9939609位置的基因型為FTO AA rs9939609 ;
[0049] 圖2為用FTO ARMS-qPCR基因分型試劑盒檢測(cè)正常人FTO rs9939609位置基因型 的擴(kuò)增曲線，經(jīng)檢測(cè)，此樣品在rs9939609位置的基因型為FTO TT rs9939609;
[0050] 圖3為用FTO ARMS-qPCR基因分型試劑盒檢測(cè)正常人FTO rs9939609位置基因型 的擴(kuò)增曲線，經(jīng)檢測(cè)，此樣品在rs9939609位置的基因型為FTO A/Trs9939609。
【具體實(shí)施方式】
[0051] 以下結(jié)合附圖實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0052] 收集100例抑郁癥患者和50例正常人的血樣，用ARMS-qPCR的方法對(duì)其FT0基因 rs9939609位置進(jìn)行分型。
[0053] 設(shè)計(jì)并篩選能特異檢測(cè)上述3種基因型的ARMS引物各一條及參照引物一條，設(shè)計(jì) 通用下游引物一條，設(shè)計(jì)并篩選TaqMan通用探針一條，各引物、探針的序列如下：
[0054] FT0-R :5' -ATCTTATGTCCAAACAGTAG-3'
[0055] FTO-TaqMan :5, -FAM-TAGGTAACAGTCAGAAATGG-3，
[0056] FT0-C :5' -AGTTATGCATTTAGAATGTC-3'
[0057] FT0-F1 :5' -TTGCGACTGCTGTGAATGCT-3'
[0058] FT0-F2 :5, -TTGCGACTGCTGTGAATGCA-3'
[0059] 反應(yīng)體系的優(yōu)化：
[0060] (1)引物濃度的優(yōu)化，在反應(yīng)體系中其他條件相同的情況下，將引物濃度從 0. 1 μ M/L~1. 5 μ M/L作倍比連續(xù)稀釋，通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析確定最佳濃度為0. 5 μ M/L。
[0061] (2)探針濃度的優(yōu)化，在反應(yīng)體系中其他條件相同的情況下，將引物濃度從 0. 05 μ M/L~0. 5 μ M/L作倍比連續(xù)稀釋，通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析確定最佳濃度為0. 1 μ M/L。
[0062] (3)退火溫度的優(yōu)化，在反應(yīng)體系中其他條件相同的情況下，進(jìn)行梯度 PCR(55°C~65°C )，通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析確定最佳溫度為60°C。
[0063] (4)擴(kuò)增反應(yīng)Tag酶的優(yōu)化，通過比較市場(chǎng)上的各種PCR擴(kuò)增Tag酶，選取 Goldstar Best Tag 酶。
[0064] (5)優(yōu)化后最終的反應(yīng)體系為25ul，包括qPCR混合反應(yīng)液23 μ 1，參照引物和 ARMS 引物各 0· 5 μ 1 (終濃度 0· 5 μ M/L)，模板 DNA 1 μ 1 (終濃度 l-10ng/ μ 1)，qPCR mix (即 qPCR混合反應(yīng)液）組分及其終濃度為：
[0065]
[0066] ARMS-qPCR在ABI 7900檢測(cè)儀上檢測(cè)每個(gè)樣本進(jìn)行3管反應(yīng)，每管加入相同的 qPCR mix，通用下游引物，TaqMan探針，各管所不同的是參照引物或者ARMS引物。PCR反應(yīng) 條件為：95°C預(yù)變性10min，95°C 15s，60°C lmin，擴(kuò)增反應(yīng)為46循環(huán)。
[0067] 結(jié)果為：100例男性肥胖癥患者中有69人為FT0基因 AA rs9939609基因型，21人 為AT rs9939609，10人為TT rs9939609基因型；50人正常人中有38人為TT rs9939609 型，9人為A/Trs9939609基因型，3人為AA rs9939609基因型，經(jīng)DNA直接測(cè)序驗(yàn)證，完全 與ARMS-qPCR結(jié)果一致。
[0068] 上述結(jié)果表明，本發(fā)明的FT0基因 ARMS-qPCR分型方法方法可靠，靈敏度高，操作 簡(jiǎn)單，判讀結(jié)果客觀，利于大規(guī)模臨床開展。
[0069] 以上內(nèi)容僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，依據(jù)本發(fā)明的 思想，在【具體實(shí)施方式】及應(yīng)用范圍上均會(huì)有改變之處，本說明書內(nèi)容不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明 的限制。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于FTO基因分型的ARMS-qPCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于：包括qPCR反應(yīng)體系， 所述qPCR反應(yīng)體系包括qPCR混合反應(yīng)液、參照引物、ARMS引物和陽(yáng)極對(duì)照樣品；所述qPCR 混合反應(yīng)液包括PCR緩沖液、dNTP、MgCl2、Tag酶、PCR下游引物和TaqMan探針； 所述qPCR反應(yīng)體系中，各組分的終濃度分別為：PCR緩沖液為IX ; dNTP為0. 1~ 1.5禮；1%(：12為0.5~51111汀&8酶為0.05~0.11]/^1屮0?下游引物為0.1~14]\1汀39]\&111 探針為0. 1~1 μ M ;參照引物為0. 5 μ M ;ARMS引物為0. 5 μ M ;陽(yáng)性對(duì)照樣品為1~IOng/ μ 1〇 所述PCR下游引物的序列如FTO-R所示； 所述TaqMan探針的序列如FTO-TaqMan所示； 所述參照引物的序列如FTO-C所示，能夠擴(kuò)增所有不同F(xiàn)TO基因型； 所述ARMS引物為兩種上游引物中的任意一種，分別對(duì)應(yīng)FTOAArS9939609、 TTrs9939609型基因型，這兩種上游引物的序列如FT0-F1、FT0-F2所示；這兩種ARMS引物 分別在3'末端與不同的基因型堿基匹配，同時(shí)在其3'末端倒數(shù)第2、3位增加一個(gè)或者兩 個(gè)堿基錯(cuò)配，用于特異性擴(kuò)增的FTO rs9939609位基因型為AA/TT/AT ; 所述陽(yáng)極對(duì)照樣品分別為FTO不同基因型堿基置換的質(zhì)?；蚪MDNA。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于FTO基因分型的ARMS-qPCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于： 所述 Tag 酶為 Takara Tag 酶或 Goldstar Best Tag 酶。3. 基于權(quán)利要求1或2所述試劑盒的FTO基因分型ARMS-qPCR檢測(cè)方法，其特征在于， 包括如下步驟： (1) 設(shè)計(jì)并篩選含有FTO基因 rs9939609位不同基因型通用的參照引物、TaqMan探針 及兩種ARMS引物； (2) 從細(xì)胞體系或血液中提取到基因組DNA作為模板DNA ; (3) 進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，每個(gè)樣本的檢測(cè)分3管進(jìn)行，每個(gè)管加入相同的qPCR 混合反應(yīng)液，TaqMan探針和模板DNA，每管分別加入?yún)⒄找锖蛢煞NARMS引物中的一種，進(jìn) 行FTO基因 rs9939609位基因分型的qPCR檢測(cè)； (4) 結(jié)果判讀： 參照引物管擴(kuò)增曲線陽(yáng)性，F(xiàn)TO-Fl管擴(kuò)增曲線陽(yáng)性，F(xiàn)T0-F2管擴(kuò)增曲線陰性或者其與 參照引物管的擴(kuò)增曲線ACT > 10,該樣本結(jié)果判定為rs9939609AA基因型； 參照引物管擴(kuò)增曲線陽(yáng)性，F(xiàn)TO-Fl管擴(kuò)增曲線陽(yáng)性，F(xiàn)T0-F2管擴(kuò)增曲線陽(yáng)性，該樣本 結(jié)果判定為rs9939609A/T基因型； 參照引物管擴(kuò)增曲線陽(yáng)性，F(xiàn)TO-Fl管擴(kuò)增曲線陰性或者其與參照引物管的擴(kuò)增曲線 Λ CT > 10, FT0-F2管擴(kuò)增曲線陽(yáng)性，該樣本結(jié)果判定為rs9939609TT基因型； 參照引物管擴(kuò)增曲線陰性，提示該樣本提取失敗，需要重新進(jìn)行提取。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測(cè)方法，其特征在于：所述步驟（2)中，模板DNA選自人體 血液基因組DNA或者口腔黏膜脫落細(xì)胞或頭發(fā)。5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測(cè)方法，其特征在于：所述步驟（3)中，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng) 的條件為，95°C預(yù)變性2min，95°C變性15s，60°C延伸lmin，46個(gè)循環(huán)。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK105886600SQ201410587533
【公開日】2016年8月24日
【申請(qǐng)日】2014年10月20日
【發(fā)明人】張道允, 張恒, 鞏子英, 羅堅(jiān)誠(chéng), 賈寧
【申請(qǐng)人】江蘇所羅門兄弟醫(yī)學(xué)科技有限公司