用于檢測甘草β-AS基因單核苷酸多態(tài)性的引物組合物、試劑盒及方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于檢測甘草β-AS基因單核苷酸多態(tài)性的引物組合物、試劑盒及方法。該方法以包含β-AS基因的待測甘草全基因組DNA為模板，以特異引物對(共18對)為引物，PCR擴增甘草β-AS基因的15個外顯子區(qū)和4個內(nèi)含子區(qū)；再對擴增產(chǎn)物片段進行SSCP多態(tài)性檢測并對產(chǎn)物進行測序分析。該發(fā)明是一種在DNA水平上篩查和檢測與甘草酸合成密切相關的分子標記，檢測方法簡單、快速、成本低，檢測結果可靠、直接，適用于β-AS基因SNPs的大規(guī)模篩查，對于發(fā)掘優(yōu)良、篩除劣質的甘草種質資源，提高栽培甘草藥材的質量有重要意義。
【專利說明】
用于檢測甘草β-AS基因單核苷酸多態(tài)性的引物組合物、 試劑盒及方法
技術領域
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術領域，涉及甘草的功能基因的單核苷酸多態(tài)性（SNP)的檢 測，特別涉及一種檢測甘草β -AS基因的單核苷酸多態(tài)性的引物組合物、試劑盒及方法。
【背景技術】
[0002] 甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch是我國常用的大宗藥材。多年以來，商品甘 草一直依靠野生資源提供，然而由于多年掠奪性采挖，甘草野生資源日趨枯竭，栽培生產(chǎn)甘 草目前已經(jīng)成為甘草藥材商品的主要來源。甘草酸是甘草藥材的重要藥效成分，然而研究 表明，大部分栽培甘草中的甘草酸含量低于野生甘草，達不到2010版《中國藥典》中2. 0% 的合格標準，嚴重影響了中醫(yī)臨床療效和制藥工業(yè)的原料質量。在相同栽培條件下生產(chǎn)的 甘草藥材，不同單株間甘草酸含量存在顯著的差異。結合目前栽培甘草種子來源于野生甘 草的現(xiàn)狀，栽培甘草群體中單株之間甘草酸差異如此顯著必定是由遺傳變異導致。β -香樹 脂醇合成酶（β-AS)基因作為甘草酸合成途徑下游最為關鍵的功能基因，其編碼的β-AS 能夠催化2, 3-氧化鯊烯環(huán)化生成β -香樹酯醇進而形成甘草酸，因此其結構和表達很可能 會直接影響到甘草酸的合成。
[0003] SNPs (single nucleotide polymorphisms)主要是指在基因組水平上由單個核苷 酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。其為動植物可遺傳的變異中最常見的一種。占所有已 知多態(tài)性的90%以上。SNP所表現(xiàn)的多態(tài)性只涉及到單個堿基的變異，這種變異可由單個 堿基的轉換或顛換所引起，也可由堿基的插入或缺失所致。但通常所說的SNP并不包括后 兩種情況。根據(jù)分子生物學中心法則，SNPs會導致基因堿基序列的改變，理論上有可能影響 mRNA的表達及其結構，進而影響酶蛋白的結構，導致酶活性的改變，最終導致代謝途徑終產(chǎn) 物含量的改變。
[0004] 目前SNP的檢測技術有很多，有DNA序列測定法、SNaPshot法、Microarray芯片 法、引物延伸法、PCR-SSCP法、PCR-SSCP與DNA測序結合法、高分辨率溶解曲線法等。本發(fā)明 米用的是DNA測序與-SSCP結合法。PCR-SSCP(Polymerase Chain Reaction-Single-Strand Conformation Polymorphism)的基本原理是將PCR擴增的DNA片段在變性劑或低離子濃度 下進行高溫處理并使之保持在單鏈狀態(tài)下，然后進行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳時， 單鏈DNA的迀移率除與DNA鏈的長度有關外，更主要的是取決于DNA單鏈所形成的構象。在 非變性條件下，DNA單鏈可折疊成一定的空間構象，這種構象由DNA單鏈堿基決定，其穩(wěn)定 性靠分子內(nèi)局部順序的相互作用維持。相同長度DNA單鏈因其堿基序列不同，甚至單個堿 基不同導致形成的構象不同，而且單鏈DNA構象的變化很可能引起迀移率的改變。在凝膠 中，每條單鏈處于一定位置，靶DNA中若出現(xiàn)突變，就會出現(xiàn)泳動變位，通過顯色或顯影后， 在凝膠上就會顯示出帶型的差別，從而將變異DNA與正常DNA區(qū)分開。PCR-SSCP法檢測靈 敏度高，能夠檢測出lbp的小缺失和突變，且操作步驟少、周期短，適用于對大量樣本的突 變篩選。利用PCR-SSCP方法找到SNPs位點所存在的基因片段，再對該基因片段進行測序， 二者綜合分析能夠明確找到甘草β -AS基因的特化基因型，且使得實驗結果更具可靠性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明解決的問題在于利用PCR-SSCP與DNA測序結合法檢測甘草β -AS基因的 單核苷酸多態(tài)性，該方法是一種在DNA水平上篩查和檢測與甘草酸合成密切相關的分子標 記，能夠準確、快速的檢測出甘草β-AS基因的多態(tài)性位點，進而為發(fā)掘優(yōu)良、篩除劣質的 甘草種質資源提供依據(jù)。
[0006] 本發(fā)明是通過以下技術方案來實現(xiàn)：
[0007] 甘草β -AS基因的單核苷酸多態(tài)性，其基因單核苷酸多態(tài)性包括：
[0008] 甘草β -AS基因第94bp為A、G、A/G的堿基多態(tài)性；在506bp為C或C/G的堿基 多態(tài)性；在512bp為C或C/G的堿基多態(tài)性。
[0009] 上述檢測甘草β -AS基因的單核苷酸多態(tài)性的方法為：
[0010] 以甘草β-AS基因組DNA為模板，利用特異性引物PCR擴增甘草β-AS基因15個 外顯子和4個內(nèi)含子片段，然后用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測產(chǎn)物單鏈構象并進行測 序分析，即可準確鑒定甘草β -AS基因的單核苷酸多態(tài)性。
[0011] 所述的引物對見表1 :
[0012] 表 1
[0013]
[0014] 所述的PCR擴增的條件是：
[0015] PCR 反應體系：PCR 反應體系共 20yL :基因組 DNA1 yL，10XPCR buffer3. 2yL， dNTP(2. 5mmol/L)1. 6 μ L, Forward Primer(5 μ mol/L)1. 0 μ L, Reverse Primer(5 μ mol/ L) 1. 0 μ L，rTaqO. 2 μ L，ddH20 12. 0 μ L。
[0016] 所述的PCR擴增反應程序為：94°C預變性5min ;94°C變性30s，56°C退火lmin， 72°C延伸 lmin30s，34 個循環(huán)；72°C延伸 lOmin。
[0017] 所述的瓊脂糖凝膠電泳為1%瓊脂糖凝膠電泳。
[0018] 所述的聚丙烯酰胺電泳為16%聚丙烯酰胺凝膠電泳。
[0019] 所述根據(jù)非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳帶型及多態(tài)產(chǎn)物測序結果，可將甘草β -AS 基因可分為
[0020] 94A/G-506C-512C、94G-506C-512C、94A/G-506C/G-512C、94A-506C-512C、94A/ G-506C/G-512C/G、94G-506C-512C/G 和 94A/G-506C-512C/G7 種基因型。
[0021] 針對上述甘草β-AS基因核苷酸多態(tài)性，本發(fā)明還公開了其篩查和檢測方法，通 過PCR-SSCP與DNA測序結合法能夠快速、精確、低成本的檢測其SNPs位點。由于β -AS基 因是甘草酸合成途徑中的關鍵酶基因，本發(fā)明提供的檢測方法為β -AS基因的SNPs與甘草 酸合成關系的建立提供了依據(jù)，以便于推廣應用于甘草優(yōu)良種質資源的評價與篩選。
[0022] 本發(fā)明還涉及一種用于實施本發(fā)明所述方法的專用試劑盒，所述試劑盒內(nèi)容包 括：
[0023] 一、試劑盒引物成分：
[0024] 1. 1特異引物，所述的特異引物包括內(nèi)容見表1 ;
[0025] 1. 2生化試劑，所述生化試劑包括：
[0026] rTaq 聚合酶；ddH20 ;
[0027] 內(nèi)含 Mg2+的 lOXBuffer ;dNTP ;
[0028] 2000bp 的 DNAMarker。
[0029] 二、試劑盒操作說明：
[0030] 2.1PCR操作說明
[0031] (l)PCR擴增反應體系
[0032] 基因組 DNA1 μ L，10XPCR buffer3. 2 μ L，dNTP(2. 5mmol/L) 1. 6 μ L，F(xiàn)orward Primer (5 μ mol/L)(序列見表 1) 1. 0 μ L，Reverse Primer (5 μ mol/L)(序列見表 1) 1. 0 μ L， rTaqO. 2 μ L, ddH2012. 0 μ L〇
[0033] (2) PCR擴增反應程序
[0034] 94°(：預變性5111丨11;94°(：變性3〇8,56°(：退火1111丨11，72°(：延伸1111丨113〇8,34個循環(huán) ； 72°C 延伸 10min。
[0035] 2· 2電泳檢測與基因型判斷
[0036] (1) PCR產(chǎn)物的瓊脂糖電泳檢測
[0037] 擴增得到長度在100_350bp的PCR產(chǎn)物，經(jīng)用1 %的瓊脂糖電泳檢測，條帶清晰、明 殼、單一，見圖1、2所不。
[0038] (2) PCR 產(chǎn)物的 SSCP 分析
[0039] 對每個個體擴增片段變性處理之后，進行16 %聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，其個體 會出現(xiàn)不同帶型，見圖3、5所示。
[0040] (3)根據(jù)非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳帶型及多態(tài)產(chǎn)物測序結果，可將甘草β -AS 基因可成不同基因型，如圖4、6所示。
【附圖說明】
[0041] 圖1 94bp位置SNP位點片段基因瓊脂糖凝膠電泳圖1 · DNA marker (DL2000); 2. 94bp位置SNP位點片段PCR產(chǎn)物；圖2第二、三、四內(nèi)含子基因瓊脂糖凝膠電泳圖a: l.DNA marker(DL2000)，2.第二內(nèi)含子PCR產(chǎn)物；b :LDNA marker(DL2000)，2.第三內(nèi)含子 PCR產(chǎn)物；c :1. DNA marker (DL2000)，2.第四內(nèi)含子PCR產(chǎn)物；圖3 11份甘草樣品94bp位 置PCR產(chǎn)物SSCP結果；圖494bp位置SNPs位點測序峰圖及基因分型；圖5. 12份甘草樣品 第二內(nèi)含子PCR產(chǎn)物SSCP結果；圖6第二內(nèi)含子SNPs位點測序峰圖及基因分型。
[0042] 具體步驟
[0043] 1、甘草DNA提取
[0044] 提取甘草的全基因組DNA，保存于_20°C備用。
[0045] 2、引物設計
[0046] 根據(jù)已經(jīng)獲得的甘草β-AS基因全長序列，以提取的DNA作為模板，以表1中所列 引物分別PCR擴增β-AS基因15個外顯子和4個內(nèi)含子的基因片段。
[0047] 3、PCR反應體系
[0048] PCR 反應體系共 20 μ L :基因組 DNA1 μ L，10XPCR buffer3. 2 μ L，dNTP(2. 5mmol/ L) 1. 6 μ L，F(xiàn)orward Primer (5 μ mol/L)(序列見表 1) 1. 0 μ L，Reverse Primer (5 μ mol/L) (序列見表 1) 1. 〇 μ L，rTaqO. 2 μ L，ddH2012. 0 μ L。
[0049] 4、PCR反應條件：由于SSCP對于PCR產(chǎn)物純度要求較高，PCR產(chǎn)物純度越高，SSCP 分析中出現(xiàn)的雜帶數(shù)量越少，越利于目標條帶的判斷；為取得良好的分辨效果，在不影響 PCR效率的前提下盡可能提高反應的退火溫度，以降低非特異性擴增及引物二聚體對SSCP 帶來的影響，設計的反應條件有以下3種：
[0050] (1)94°C預變性 5min ;94°C變性 30s，55°C退火 lmin，72°C延伸 lmin30s，34 個循 環(huán)；72°C延伸 lOmin ;
[0051] (2)94°C預變性 5min ;94°C變性 30s，56°C退火 lmin，72°C延伸 lmin30s，34 個循 環(huán)；72°C延伸 lOmin ;
[0052] (3)94°C預變性 5min ;94°C變性 30s，57°C退火 lmin，72°C延伸 lmin30s，34 個循 環(huán)；72°C延伸 lOmin ;
[0053] PCR反應完成后使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物條帶長度和特異性。
[0054] 5、SSCP 體系
[0055] (1)膠濃度：由于不同片段長度的PCR產(chǎn)物所適用的膠的濃度不同，為確定最適合 100-300bp長度范圍PCR產(chǎn)物的膠濃度，共設置6種濃度梯度，見表2 :
[0056] 表2 6種濃度梯度的聚丙烯酰胺凝膠
[0057]
[0058] 在相同電泳條件及電泳時間下，使用如上表中所列6種不同濃度的聚丙烯酰胺凝 膠，對同一份長度范圍在100_300bp的PCR產(chǎn)物進行PCR-SSCP分析，通過條帶的位置及條 帶的分離度以確定本實驗中所適用的最佳膠濃度。
[0059] (2)上樣量：根據(jù)所設計的甘草β-AS基因外顯子片段引物，在合適的退火溫度下 進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物用1 %的瓊脂糖凝膠進行水平電泳檢測，上樣量為5 μ L ;使用紫外 檢測器檢測PCR產(chǎn)物濃度。
[0060] (3)電泳條件：由于電泳電壓以及電泳時間與SSCP譜帶的位置及分離度密切相 關，故設計不同的電泳電壓與電泳時間組合：A. 120V電壓下電泳9小時；B. 140V電壓電泳9 小時。
[0061] 結果分析：本發(fā)明設計的引物可完整擴增β -AS基因外顯子和1-4內(nèi)含子的全長， 運用的PCR-SSCP法可準確、快速的找到該段基因上所有的SNP位點，并可聯(lián)合所有SNP位 點劃分基因型。
[0062] 最終確定的PCR反應條件為：94°C預變性5min ;94°C變性30s，56°C退火lmin， 72°C延伸 lmin30s，34 個循環(huán)；72°C延伸 lOmin。
[0063] SSCP膠濃度：8-12%濃度的膠中各條帶的分離度差，無法滿足本實驗要求，故不 允考慮（結果未列出）。
[0064] 14%膠濃度下SSCP分辨率低，無法分辨出目標條帶的差異，18%膠濃度下，能夠 分辨出目標條帶的差異，但由于分辨率較高，極容易出現(xiàn)雜帶，不利于對主帶的判斷和分 析，故該實驗中選用16 %膠濃度。
[0065] SSCP上樣量：分別使用1-3 μ L PCR產(chǎn)物，然后在PCR管底部加入變性緩沖液至 10 μ L，PCR產(chǎn)物上樣量為3 μ L時，譜帶清晰明顯，達到SSCP分析要求，故將變性體系定為 3 μ L PCR擴增產(chǎn)物與7 μ L變性緩沖液相混合。
[0066] SSCP電泳條件：120V電壓下電泳9小時，條帶分離度較差；140V電壓電泳9小時， 條帶分離度良好。
[0067] 故本實驗選用140V電壓下電泳10小時。
[0068] 根據(jù)SSCP結果，發(fā)現(xiàn)15個外顯子中僅有第一外顯子94bp位置PCR產(chǎn)物的SSCP 條帶具有明顯差異，其他外顯子PCR產(chǎn)物的SSCP條帶未見明顯差異；4個內(nèi)含子中僅有第 二內(nèi)含子PCR產(chǎn)物的SSCP條帶具有明顯差異，其他外顯子PCR產(chǎn)物的SSCP條帶未見明顯 差異。
[0069] 將所獲得的PCR產(chǎn)物交由上海生工生物工程有限公司進行測序，測序結果顯示甘 草β -AS基因第一外顯子上94bp位置存在SNPs，可分為94G型，94A型，94A/G雜交型3 種類型；第二內(nèi)含子506bp位置和512bp位置存在兩處SNPs，可分為506C-512C型，506C/ G-512C/G 型，506C-512C/G 型和 506C/G-512C 型 4 種類型。
[0070] 根據(jù)β AS外顯子SNPs和1-4內(nèi)含子上的SNPs，可分為94A/G-506C-512C、 94G-506C-512C、94A/G-506C/G-512C、94A-506C-512C、94A/G-506C/G-512C/G、 94G-506C-512C/G 和 94A/G-506C-512C/G 共 7 種基因型。
【主權項】
1. 一種檢測甘草β -AS基因單核苷酸多態(tài)性的專用引物組，其特征在于，引物序列為2. -種檢測甘草β -AS基因單核苷酸多態(tài)性的試劑盒，其特征在于：包括如權利要求1 所述的引物。3. 如權利要求2所述的試劑盒，其還包括：rTaq聚合酶；CldH2O ; 10XPCR Buffer ;dNTP。4. 如權利要求1所述的引物在檢測或篩選β -AS基因單核苷酸多態(tài)性中的應用。5. 如權利要求2所述的試劑盒在檢測或篩選β -AS基因單核苷酸多態(tài)性中的應用。6. -種檢測甘草β -AS基因單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于， (1) 以甘草β -AS基因組DNA為模板，利用如權利要求1所述引物，PCR擴增甘草β -AS 基因15個外顯子和3個內(nèi)含子片段； (2) 瓊脂糖凝膠電泳驗證PCR產(chǎn)物質量； (3)非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測產(chǎn)物單鏈構象并進行測序分析。7. 如權利要求6所述的檢測甘草β -AS基因單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于，步驟 (1)所述的PCR擴增的條件是基因組DNAl yL，10XPCR buffer3. 2yL，濃度為2. 5mmol/L 的 dNTP I. 6 μ L，濃度為 5 μ mol/L 的 Forward Primer 1.0 μ L，濃度為 5 μ mol/L 的 Reverse Primer I. 0 μ L，rTaq 0· 2 μ L，ddH2012. 0 μ L，共 20 μ I 〇8. 如權利要求6所述的方法，其特征在于，步驟（I)所述的PCR擴增的條件是：94°C預 變性 5min ;94°C變性 30s，56°C退火 lmin，72°C延伸 lmin30s，34 個循環(huán)；72°C延伸 lOmin。9. 如權利要求6所述的方法，其特征在于，步驟（2)所述的瓊脂糖凝膠電泳為1%的瓊 脂糖凝膠電泳。10. 如權利要求6所述的方法，其特征在于，步驟（3)所述的非變性聚丙烯酰胺電泳為 16非變性％聚丙烯酰胺凝膠電泳。
【文檔編號】C12N15/11GK105886603SQ201510001163
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2015年1月5日
【發(fā)明人】劉春生, 臧藝玫, 喬晶, 李妍芃
【申請人】劉春生