一種定量檢測液體樣品中汞離子的方法及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種定量檢測液體樣品中汞離子的方法及一種汞離子定量檢測試劑盒，利用本發(fā)明提供的基于生物傳感器和微滴PCR技術的定量檢測方法和檢測試劑盒可以實現(xiàn)對汞離子的絕對定量檢測，定量檢測限可達到40fmol，靈敏度可達到10fmol，能夠滿足汞離子實際檢測的需要。此外，本方法操作簡單，靈活性強，是一種實現(xiàn)汞離子絕對定量檢測的有效方法。
【專利說明】
一種定量檢測液體樣品中汞離子的方法及試劑盒
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學檢測技術領域，具體的，涉及一種定量檢測液體樣品中汞 離子的方法及試劑盒。
【背景技術】
[0002] 在所有的水中的重金屬離子中，汞離子是所有對人體有嚴重危害的金屬離子之 一?，F(xiàn)階段已經(jīng)開發(fā)了大量的針對痕量汞離子的檢測方法。近期，基于生物傳感器的檢測方 法以其相對簡單的操作和較低的成本已經(jīng)取得了快速的進展。大部分的傳感器都基于將物 理或者化學信號轉(zhuǎn)化為核酸信號，因此，生物傳感器提供了一種通過檢測核酸信號來檢測 重金屬含量的方法。
[0003] 基于核酸信號的產(chǎn)生形式，生物傳感器可以分為"開型（turn-on)"傳感器和"關型 (turn-off)"傳感器。對于"關型"傳感器來說，由于其核酸信號是隨著檢測目的物質(zhì)的增加 而降低的，所以這類檢測方法較容易受到檢測樣品中的熒光干擾因子的影響，從而導致假 陽性或者假陰性的結果。因此，"開型"傳感器更適合實際檢測的需要。最近，一種基于T-Hg-T結構的生物傳感器開發(fā)出來并得到了廣泛的應用。這種結構可以特異性的結合規(guī)定數(shù)量 的汞離子，并通過特定結構的核酸信號的轉(zhuǎn)化達到汞離子檢測的目的。目前這種類型的生 物傳感器已經(jīng)與熒光檢測、等溫檢測、G-四重結構、微流控芯片、電化學等方法相結合并開 發(fā)出了各種類型的檢測方法。對于實際檢測工作來說，我們需要對痕量的汞離子進行定量， 從而可以對樣品或者污水中汞離子是否超標做出標識。但是以上的所有方法都是需要通過 對不同梯度的樣品進行梯度稀釋才可以取得定量結果的，這個過程中會受到人為操作等一 系列因素的影響。因此開發(fā)一種不依賴于標準曲線的重金屬離子檢測方法是很必要的。
[0004] 對于汞離子絕對定量檢測來說，檢測方法必須符合以下幾點要求：（1)汞離子信號 轉(zhuǎn)化為核酸信號的過程必須是線性的，而且這一步的影響信號富集也必須是可控的；（2)后 續(xù)的檢測方法必須是一種不依賴于標準曲線的檢測方法。微滴PCR是一種新型的PCR擴增技 術。這種方法通過將原始反應體系進行分割，使原始體系中的模板分子也分配到了不同的 小反應體系中，PCR程序結束后，通過流式檢測設備測定每個反應體系的熒光信號值，統(tǒng)一 分析之后確定陰性微滴和陽性微滴的個數(shù)，借助泊松分布從而確定整個反應體系中目的片 段的拷貝數(shù)。微滴PCR由于其簡便的操作，穩(wěn)定的擴增以及可以進行絕對定量的優(yōu)勢，現(xiàn)階 段已經(jīng)得到了快速的發(fā)展，其在單分子檢測，基因文庫擴增等方面已經(jīng)取得了很大的研究 進展。由于其后續(xù)可以借助流式的熒光檢測方法并可以借助數(shù)學統(tǒng)計實現(xiàn)絕對定量，所以 微滴PCR也被認為是一種重要的定量PCR的代替方法。
[0005] 因此有必要提供一種針對汞離子的基于生物傳感器和微滴PCR的定量檢測方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種不需要進行樣品前處理步驟的，而且不依賴于標準曲線 繪制的汞離子檢測方法，實現(xiàn)對待測樣品中汞離子的絕對定量。
[0007] 為了達到以上目的，本發(fā)明提供了一種定量檢測液體樣品中汞離子的方法，所述 方法包括以下步驟：
[0008] (1)以待測液體樣品為模板溶液，利用汞離子生物傳感器進行等溫PCR擴增獲得含 有等溫PCR擴增產(chǎn)物的擴增后體系；
[0009] (2)利用超純水對所述擴增后體系進行108倍稀釋，獲得最終的稀釋后物料，以所 述稀釋后物料作為模板溶液，利用微滴PCR擴增引物和探針進行微滴PCR擴增，采集微滴PCR 擴增產(chǎn)生的熒光信號，依照陰性孔的熒光確定熒光閾值以得到陽性擴增孔數(shù)；
[0010] (3)利用公式I計算每個擴增后體系中等溫PCR擴增產(chǎn)物的拷貝數(shù)，公式I中，A為擴 增后體系中等溫PCR擴增產(chǎn)物的拷貝數(shù)，No為總擴增孔數(shù)，X為陽性擴增孔數(shù)；
[0011] 公式 Ι:Α = -1η[(Ν0-Χ)/Ν()]ΧΝο
[0012] (4)利用公式Π 計算樣品中汞離子的濃度，公式Π 中，η為生物傳感器中可形成Τ-Hg-T結構的數(shù)量，Α為擴增后體系中等溫PCR擴增產(chǎn)物的拷貝數(shù)，ER為液體樣品中汞離子濃 度：
[0013] 公式Π :ER = nA/4816。
[0014] 優(yōu)選的，步驟(1)中等溫PCR擴增的體系為：
[0016] 在本發(fā)明所提供的方法中，所述待測液體樣品可以為直接采集的原始液體樣品， 待測樣品種類可以是血清樣品以及自然水樣品。
[0017] 其中，對所述擴增后體系進行稀釋的目的是使目的核酸片段的量滿足數(shù)字PCR的 檢測范圍，優(yōu)選的，將所述擴增后體系稀釋1〇 8倍時，具有最佳的檢測效果。
[0018] 其中，等溫PCR擴增的步驟包括:先將待測液體樣品、汞離子生物傳感器和ddH20接 觸混勻后在95 °C下溫浴4.5-5.5min獲得溫浴后體系，將所述溫浴后體系降溫至25 °C后加入 Klenow大片段等溫擴增酶、等溫PCR緩沖液和dNTPs，混勻后在37 °C溫浴1.8-2.2h獲得含有 等溫PCR擴增產(chǎn)物的擴增后體系。
[0019] 可選的，微滴PCR擴增的體系為：
[0021] 可選的，微滴PCR反應的條件包括將所述微滴PCR擴增體系在50 °C熱激活300s，95 °C預變性300s，95 °C變性15s，60 °C退火及延伸60s，共50個循環(huán)，最后在60 °C下采集熒光信 號。
[0022] 在本發(fā)明所提供的方法中，所述微滴PCR在微滴PCR生成芯片上進行，具體的可以 包括以下步驟，首先將20yL所述微滴PCR擴增體系加入到微滴PCR生成芯片上，再加入70yL 的微滴生成用油，進行微滴生成步驟，完成微滴生成步驟后，將微滴化的反應體系轉(zhuǎn)移至96 孔板中，封膜，將封膜后的96孔板放入PCR擴增儀中進行微滴PCR擴增。完成微滴PCR擴增后， 將微滴吸入流式熒光檢測器中進行熒光檢測。其中，所述微滴PCR生成芯片和所述微滴生成 用油可以為本領域所公知的適合于進行微滴PCR反應的商品化產(chǎn)品。
[0023] 閾值的判定方法為按照陰性樣品的熒光值確定反應的熒光閾值以區(qū)分反應中的 陰性亮點與陽性亮點。
[0024] 其中，在步驟(3)中，每個樣品中的拷貝數(shù)是通過陽性擴增孔數(shù)和總擴增孔數(shù)的比 例來確定的。通過如公式I所示的泊松分布公式計算擴增后體系中等溫PCR擴增產(chǎn)物的拷貝 數(shù)后通過ER值的計算獲得重金屬離子的絕對含量，最后計算得到的ER數(shù)值與樣品中汞離子 濃度相等，公式中汞離子的濃度以pmol為單位。
[0025]本檢測體系反應原理如圖1所示。檢測體系主要包括三個部分:生物傳感器等溫延 伸步驟、微滴PCR步驟、微滴熒光讀取步驟。在第一個步驟中，通過生物傳感器將汞離子信號 轉(zhuǎn)化為核酸信號，實現(xiàn)汞離子的線性信號轉(zhuǎn)換。另外一個方面，T-Hg-T的結構在較低溫度下 可以保持穩(wěn)定。所以本發(fā)明在等溫PCR擴增步驟中選取的內(nèi)切酶為Klenow大片段擴增酶。等 溫延伸后，發(fā)卡結構被補平成平端，從而產(chǎn)生引物結合位點。在等溫過程結束后，將第一步 的產(chǎn)物進行稀釋后作為第二步微滴PCR擴增的模板。只有第一步經(jīng)過延伸的發(fā)卡結構在這 個步驟中可以產(chǎn)生陽性的擴增信號。微滴PCR步驟結束后，通過讀取陽性擴增孔數(shù)，可以達 到對目的片段進行絕對定量的目的。
[0026]在本發(fā)明所提供的方法中，生物傳感器序列內(nèi)部包含的T-Hg-T結構的數(shù)量會對最 終的檢測結果的定量能力和擴增表現(xiàn)產(chǎn)生影響，優(yōu)選的，所述汞離子生物傳感器為T-Hg-T 數(shù)量為5的生物傳感器。
[0027]本發(fā)明中，當待測液體樣品中萊離子濃度在40fmol到40pmol時，ER隨著萊離子的 濃度有著很好的線性Y = 〇.963X+0.153,線性相關系數(shù)R2 = 0.992。這說明，當汞離子濃度位 于40fmol到40pmol時，ER隨著汞離子濃度的增加而呈現(xiàn)線性增長，并且在數(shù)據(jù)上ER值與汞 離子濃度相同(pmol為單位）。本發(fā)明具有非常低的定量檢測線可以滿足絕大部分實際檢測 樣品的需要。
[0028]優(yōu)選的，所述汞離子生物傳感器的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0029] 所述，微滴PCR擴增引物和探針序列為：
[0030] 上游引物 Hg-F-5: CCCAACCCGCCCTACC;
[0031] 下游引物Hg-R-5: TACCCGCTGAGGTTAAACAAC;
[0032] 探針 Hg-P-5 :FAM-GCTGAGGTTTTTCTTCCCCAGACCCTCTG-BQ1。
[0033] 本發(fā)明還提供了一種汞離子定量檢測試劑盒，所述試劑盒含有汞離子生物傳感器 以及微滴PCR擴增引物和探針：
[0034]其中，所述汞離子生物傳感器的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0035] 微滴PCR擴增引物和探針序列為：
[0036] 上游引物 Hg-F-5: CCCAACCCGCCCTACC，
[0037] 下游引物Hg-R-5: TACCCGCTGAGGTTAAACAAC，
[0038] 探針 Hg-P-5 :FAM-GCTGAGGTTTTTCTTCCCCAGACCCTCTG-BQ1。
[0039] 優(yōu)選的，所述試劑盒中還包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Klenow大片段等溫擴增酶、 Mg2+、PCR反應緩沖液。
[0040] 本發(fā)明所提供的方法可以直接對待檢測樣品中的汞離子進行定量檢測，從而省去 了常規(guī)儀器檢測中的樣品前處理步驟以及傳感器檢測中的需要標準曲線的步驟，使得檢測 過程簡便易行，避免了繁瑣的操作對檢測結果準確性的不良影響。另外，在本發(fā)明方法中， 通過定義了 ER參數(shù)，可以直接通過ER的計算對汞離子進行絕對定量，極大的簡化了反應步 驟。
[0041] 利用本發(fā)明提供的基于生物傳感器和微滴PCR技術的定量檢測方法和檢測試劑盒 可以實現(xiàn)對萊離子的絕對定量檢測，定量檢測限可達到40fmol，靈敏度可達到lOfmol，能夠 滿足汞離子實際檢測的需要。此外，本方法操作簡單，靈活性強，是一種實現(xiàn)汞離子絕對定 量檢測的有效方法。
【附圖說明】
[0042]圖1為基于生物傳感器和微滴PCR反應體系的原理圖。
[0043]圖2為生物傳感器序列與汞離子結合后的二級結構的差異圖。
[0044]圖中2+，2-為T-Hg-T結構為兩個時，含有汞離子和不含汞離子的圓二色譜曲線；5 +，5-為T-Hg-T結構為四個;7+，7-為T-Hg-T結構為七個。
[0045] 圖3為不同的生物傳感器的擴增效果的差異；
[0046] 其中a為含有2個T-Hg-T結構的生物傳感器汞離子梯度稀釋擴增曲線（圓圈線），b 為含有5個T-Hg-T結構的生物傳感器，c為含有7個T-Hg-T結構的生物傳感器。
[0047] 圖4為對于影響定量效果因素的優(yōu)化圖；
[0048] 其中a為對等溫擴增時間的優(yōu)化，b為對生物傳感器序列終濃度的優(yōu)化;帶有圓圈 的線為最終選取的條件組。
[0049] 圖5為微滴PCR的擴增熱點圖;a-h圖中汞離子濃度由低到高；
[0050] 圖中，縱坐標為Chi幅度(Chi Amplitude)，橫坐標為事件數(shù)(Event Number)。
[005? ]圖6為定量范圍以及ER與萊尚子添加量之間的散點關系圖；
[0052]其中，圖6a為萊尚子量與ER值之間的線性關系圖；圖6b為萊尚子量與ER值之間的 散點圖；橫坐標為原始體系中存在的汞離子的量，縱坐標為由本檢測體系計算得出的ER值。 [0053]圖7為檢測系統(tǒng)的特異性驗證圖。
[0054] 圖8為檢測系統(tǒng)的干擾離子影響的驗證圖，圖中Positive為陽性對照。
【具體實施方式】
[0055] 下面結合【具體實施方式】對本發(fā)明進行詳細說明。以下實施例用于說明本發(fā)明，但 不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用技術手段為本領域技術人員所熟 知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。如Sambrook等分子克隆實驗手冊（Sambrook J& Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual ,2001)，或按照制造廠商說明書建 議的條件。
[0056]實施例1用于汞離子基于生物傳感器和微滴PCR定量檢測的生物傳感器序列以及 引物和探針組合的設計
[0057]根據(jù)反應原理設置生物傳感器內(nèi)部的發(fā)卡結構，并進行不同T-Hg-T結構的優(yōu)化， 設計不同的汞離子生物傳感器序列：SEQ. 1 -3;設計擴增引物探針組:SEQ. 4-12。
[0058]實施例2針對汞離子檢測的基于生物傳感器和微滴PCR定量檢測方法的建立 [0059] 1.1實驗材料
[0060]本實施例中使用的汞離子標準樣品和溶液均購自sigma公司。微滴PCR相關的 SuperMix、微滴生成芯片均購自Bio-Rad公司，等溫擴增用酶以及其buffer購自NEB公司。 [0061 ] 1.2生物傳感器等溫延伸
[0062] 等溫擴增體系為待測血清2yL，ΙΟμΜ汞離子生物傳感器2yL，10 X等溫PCR buffer 2yL，dNTP混合液2yL、Klenow大片段等溫擴增酶0.2yL，ddH20補足至20yL。操作時先將待測 溶液，生物傳感器、水三種成分混勻后在95°C下溫浴5min后，室溫下緩慢降溫，降至室溫后， 加入等溫擴增酶、緩沖液、dNTPs三種組分，混勻后置于37°C溫浴2h。取出產(chǎn)物后，進行10 8倍 的稀釋用于后續(xù)的微滴PCR的反應。
[0063] 1 · 3微滴PCR擴增反應
[0064] (1)配置微滴PCR反應體系。微滴PCR擴增反應的反應體系以20yL計為10yL 2X SuperMix，10μΜ上下游引物各0.8yL，10μΜ探針0.4yL，經(jīng)過稀釋的步驟1.2的產(chǎn)物2yL，ddH20 補足至20yL。
[0065] (2)在微滴PCR的生成芯片上，加入20yL的上一個步驟的反應體系，再加入70yL的 微滴生成用油，進行微滴生成步驟，完成微滴生成步驟后，將微滴化的反應體系轉(zhuǎn)移至96孔 板中，封膜。
[0066] (3)將封膜后的96孔板放入PCR擴增儀中，PCR擴增程序為50 °C熱激活300s; 95 °C預 變性300s; 95 °C變性15s，60 °C退火及延伸60s，共50個循環(huán)；
[0067] (4)完成PCR擴增后，將微滴吸入流式熒光檢測器中，在60°C下進行熒光檢測。
[0068] 1.4數(shù)據(jù)分析
[0069] 數(shù)字PCR擴增完成后，采集所有樣品擴增產(chǎn)生的熒光信號。經(jīng)過系統(tǒng)自動分析，按 照陰性反應孔的熒光值設定熒光閾值以區(qū)分陰性點和陽性點。
[0070] 每個樣品中的拷貝數(shù)是通過陽性擴增孔數(shù)和總擴增孔數(shù)的比例來確定的。通過泊 松分布公式計算實際拷貝數(shù):Α = -1η[(Ν0-Χ)/ΝΟ]ΧΝ〇。上述公式中，A為每個樣品中的拷貝 數(shù)，No為總擴增孔數(shù)，X為陽性擴增孔數(shù)。通過ER值的計算獲得重金屬離子的絕對含量，ER計 算公式如下:ER = nA/4816。其中η為生物傳感器中可形成T-Hg-T結構的數(shù)量，A為每個樣品 中的拷貝數(shù)。最后計算得到的ER數(shù)值與樣品中汞離子的濃度相等（以pmol為單位）。
[0071 ] 1.5傳感器序列對反應結果和二級結構的影響
[0072]在本檢測體系中，生物傳感器序列內(nèi)部包含的T-Hg-T結構的數(shù)量會對最終的檢測 結果的定量能力和擴增表現(xiàn)產(chǎn)生影響，所以本檢測體系在驗證前通過圓二色譜和定量PCR 的方法對這方面進行了優(yōu)化。
[0073] 1.5.1圓二色譜法對傳感器序列二級結構的測定
[0074] 由于不同T-Hg-T結構的數(shù)量會導致不同的汞離子的結合量，所以我們通過圓二色 譜測定的方法對不同T-Hg-T個數(shù)的生物傳感器序列進行了二級結構的分析。
[0075] 圓二色譜的分析結果如圖2所示，可以看出，空白組的色譜曲線相較于加入汞離子 的色譜曲線有很大的區(qū)別，這說明，加入汞離子后確實會對生物傳感器的二級結構產(chǎn)生影 響。另外，當生物傳感器序列中有不同數(shù)量的T-Hg-T結構時，生物傳感器的二級結構會產(chǎn)生 明顯的不同，從色譜圖上分析，隨著T-Hg-T結構數(shù)量的增加，色譜曲線會向右側移動。
[0076] 1.5.2定量PCR對不同傳感器擴增表現(xiàn)的分析
[0077] T-Hg-T結構的數(shù)量會對發(fā)卡結構的穩(wěn)定產(chǎn)生以及汞離子的結合數(shù)量產(chǎn)生影響，從 而會進一步的影響擴增表現(xiàn)和體系的線性范圍。
[0078]本實驗使用定量PCR對檢測體系的優(yōu)化評價如圖3所示，由圖3可以看出，對T-Hg-T 數(shù)量為2、5、7的傳感器序列進行了優(yōu)化，當T-Hg-T數(shù)量為2時，定量PCR基本上沒有陽性結 果，這說明當T-Hg-T結構數(shù)量為2時，生物傳感器不能形成穩(wěn)定的二級結構，這點從我們之 前的圓二色譜的數(shù)據(jù)也可以得出。當T-Hg-T數(shù)量為7時，從定量PCR對線性范圍的實驗可以 得出，較大的T-Hg-T結構數(shù)量會對線性范圍產(chǎn)生負面的影響。T-Hg-T數(shù)量為5的生物傳感器 序列能夠取得最佳的檢測結果。
[0079] 1.6反應體系的優(yōu)化
[0080] 為了提高反應的靈敏度，優(yōu)先進行了反應體系的優(yōu)化，優(yōu)化因素為等溫反應的時 間以及生物傳感器的添加量(T-Hg-T數(shù)量為5的生物傳感器序列）。
[0081] 優(yōu)化結果如圖4所示，等溫擴增時間為2h，傳感器終濃度為0.6μΜ時，反應結果達到 最佳。
[0082] 1 · 7檢測體系定量能力的驗證
[0083] 由于汞離子的傳感器可以在一定的濃度范圍內(nèi)實現(xiàn)核酸信號的線性轉(zhuǎn)化。因此， 我們在這部分實驗對我們檢測體系的線性范圍以及線性檢測限進行了驗證。
[0084] 微滴PCR的擴增熱點圖如圖5所示，ER值與汞離子濃度的標準曲線圖和散點圖如圖 6所示。當萊離子濃度在40fmol到40pmol時，ER隨著萊離子的濃度有著很好的線性Υ = 0.963Χ+0.153，線性相關系數(shù)R2 = 0.992。這說明，當汞離子濃度位于40fmol到40pmol時，ER 隨著汞離子濃度的增加而呈現(xiàn)線性增長，并且在數(shù)據(jù)上ER值與汞離子濃度相同（pmol為單 位)。
[0085] 1.8特異性的驗證
[0086] 對于實際檢測方法來說，特異性具有相當重要的地位。本檢測體系中通過幾種常 見的重金屬離子進行驗證本檢測體系的特異性，方法同1.1-1.4。
[0087] Ag+，Ni2+，Co2+，Cd2+，F(xiàn)e 2+，Cu2+，Zn2+，Pb2+，F(xiàn)e3+和 Cr6+用于本檢測體系的特異性驗 證。驗證結果如圖7所示，從圖7的結果可以看出，本研究體系在以上幾種重金屬離子的特異 性很好，其余的重金屬離子中幾乎沒有陽性檢測信號的產(chǎn)生。
[0088] 1.9干擾離子對定量檢測的影響
[0089] 由于之前的實驗證明了本研究體系在不同重金屬離子中具有很強的特異性，所以 為了降低實驗成本，在本部分用銅離子進行了干擾離子的研究。
[0090] 干擾離子驗證實驗如圖8所示。由檢測結果可以看出，就算是干擾離子濃度相當?shù)?高（100倍），也不會對定量檢測結果產(chǎn)生顯著的影響。
[0091] 1.10靈敏度的驗證
[0092] 采用與1.1-1.4相同的方法，通過梯度稀釋驗證檢測體系的靈敏度，檢測結果如下 表1所示，從表1可以看出，當汞離子量在lOfmol時，檢測組可以與陰性組產(chǎn)生明顯的區(qū)別。
[0093] 表 1
[0094]
[0095] 1.11實際樣品的驗證
[0096]本實驗對實際樣品做了驗證以確定本檢測體系的實用性，方法同1.1-1.4。通過對 血清樣品和污水樣品的實際檢測，結果如下表2所示，本檢測體系對于不同基質(zhì)的汞離子都 具有很好的定量效果。
[0097] 表 2
[0098]
[0099] 雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在 本發(fā)明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。
【主權項】
1. 一種定量檢測液體樣品中汞離子的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟： (1) 以待測液體樣品為模板溶液，利用汞離子生物傳感器進行等溫PCR擴增獲得含有等 溫PCR擴增產(chǎn)物的擴增后體系； (2) 利用超純水對所述擴增后體系進行IO8倍稀釋，獲得最終的稀釋后物料，以所述稀釋 后物料作為模板溶液，利用微滴PCR擴增引物和探針進行微滴PCR擴增，采集微滴PCR擴增產(chǎn) 生的熒光信號，依照陰性孔的熒光確定熒光閾值以得到陽性擴增孔數(shù)； (3) 利用公式I計算每個擴增后體系中等溫PCR擴增產(chǎn)物的拷貝數(shù)，公式I中，A為擴增后 體系中等溫PCR擴增產(chǎn)物的拷貝數(shù)，No為總擴增孔數(shù)，X為陽性擴增孔數(shù)； 公式 Ι:Α = -1η[(Ν〇-Χ)/Ν()]ΧΝ〇 (4) 利用公式Π 計算樣品中汞離子的濃度，公式Π 中，η為生物傳感器中可形成T-Hg-T 結構的數(shù)量，A為擴增后體系中等溫PCR擴增產(chǎn)物的拷貝數(shù)，ER為液體樣品中汞離子濃度： 公式Π :ER=nA/4816。2. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)中等溫PCR擴增的體系為： 待測液體樣品 2pL 10 μΜ汞離子生物傳感器 2 μL IOx等溫PCR緩沖液 2μ[ dNTPs. 2μΙ Klenow大片段等溫擴增酶0.2 μL CMH2O補足至20.3. 根據(jù)權利要求2所述的方法，其特征在于，等溫PCR擴增的步驟包括:先將待測液體樣 品、汞離子生物傳感器和CldH2O接觸混勻后在95 °C下溫浴4.5-5.5min獲得溫浴后體系，將所 述溫浴后體系降溫至25°C后加入Klenow大片段等溫擴增酶、等溫PCR緩沖液和dNTPs，混勻 后在37°C溫浴1.8-2.2h獲得含有等溫PCR擴增產(chǎn)物的擴增后體系。4. 根據(jù)權利要求1-3中任意一項所述的方法，其特征在于，微滴PCR擴增的體系為： 2X SuperMix 10 LiL 10 μΜ上下游引物 各0.8 μL 10 μΜ 探針 0.4μL 稀釋后物料 2μL ddH20 補足至 20 gL。5. 根據(jù)權利要求4所述的方法，其特征在于，微滴PCR擴增反應的條件包括將所述微滴 PCR擴增體系在50°C熱激活300s，95°C預變性300s，95°C變性15s，60°C退火及延伸60s，共50 個循環(huán)，最后在60 °C下采集熒光信號。6. 根據(jù)權利要求1-3和5中任意一項所述的方法，其特征在于，所述汞離子生物傳感器 為T-Hg-T數(shù)量為5的生物傳感器。7. 根據(jù)權利要求6所述的方法，其特征在于，所述汞離子生物傳感器的核苷酸序列如 SEQ ID NO. 1所示。8. 根據(jù)權利要求7所述的方法，其特征在于，微滴PCR擴增引物和探針序列為： 上游引物 Hg-F-5: CCCAACCCGCCCTACC; 下游引物Hg-R-5: TACCCGCTGAGGTTAAACAAC; 探針 Hg-P-5: FAM-GCTGAGGTTTTTCTTCCCCAGACCCTCTG-BQ1。9. 一種汞離子定量檢測試劑盒，其特征在于，含有汞離子生物傳感器以及微滴PCR擴增 引物和探針： 其中，所述汞離子生物傳感器的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示； 微滴PCR擴增引物和探針序列為： 上游引物 Hg-F-5: CCCAACCCGCCCTACC; 下游引物Hg-R-5: TACCCGCTGAGGTTAAACAAC; 探針 Hg-P-5: FAM-GCTGAGGTTTTTCTTCCCCAGACCCTCTG-BQ1。10. 根據(jù)權利要求9所述的汞離子定量檢測試劑盒還包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、 Klenow大片段等溫擴增酶、Mg2+、PCR反應緩沖液。
【文檔編號】C12Q1/68GK105886618SQ201610251998
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年4月21日
【發(fā)明人】羅云波, 許文濤, 黃昆侖, 朱鵬宇, 程楠, 田文營, 徐瑗聰
【申請人】中國農(nóng)業(yè)大學