一種溫和氣單胞菌特異性引物及其在大菱鲆養(yǎng)殖過程中的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種溫和氣單胞菌特異性引物及其在大菱鲆養(yǎng)殖過程中的應(yīng)用。本發(fā)明所提供的溫和氣單胞菌特異性引物由上游引物F：GCTGATTTTGGTGATGCGTTCA和下游引物R：TACGTACAGATCCCCAGCCC構(gòu)成。本發(fā)明設(shè)計(jì)的溫和氣單胞菌特異性引物，能有效從各常見致病菌株中區(qū)分出溫和氣單胞菌，表現(xiàn)出很強(qiáng)的特異性和靈敏性。本發(fā)明所提供的在大菱鲆養(yǎng)殖過程中溫和氣單胞菌的PCR檢測方法，使得養(yǎng)殖過程中溫和氣單胞菌的檢測更為簡便，為今后大菱鲆養(yǎng)殖過程中高發(fā)致病菌的檢測和分析提供了必要的理論依據(jù)和完善的方法體系為促進(jìn)我國養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的規(guī)模化健康發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。
【專利說明】
一種溫和氣單胞菌特異性引物及其在大菱鲆養(yǎng)殖過程中的 應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于病原微生物檢測領(lǐng)域，具體涉及一種大菱鲆養(yǎng)殖過程中常見的致病 菌:溫和氣單胞菌(Aeromonas sobria)的PCR檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 有"多寶魚"之稱的大菱鲆已被引進(jìn)我國長達(dá)10年之久，憑借其優(yōu)良的苗種，先進(jìn) 的創(chuàng)新模式和工業(yè)化養(yǎng)殖的潮流，逐漸成為全國引人注目的重要養(yǎng)魚工業(yè)。這一全新產(chǎn)業(yè) 的發(fā)展，對(duì)我國的水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)拉動(dòng)均有很大作用，并為我國北方沿海城市工業(yè)化養(yǎng)魚的縱向 發(fā)展奠定了雄厚的理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。然而隨著養(yǎng)殖規(guī)模的快速增長，養(yǎng)殖密度的增加，以及 水體環(huán)境的惡化，一系列的疾病也隨之而來。近年來在大菱鲆養(yǎng)殖過程中細(xì)菌性疾病的急 劇爆發(fā)嚴(yán)重影響并制約了我國大菱鲆養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，給養(yǎng)殖戶帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損 失。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的是提供一種對(duì)溫和氣單胞菌具有特異性強(qiáng)且靈敏性高的特異性引 物。
[0004] 本發(fā)明的另一目的是提供一種在大菱鲆養(yǎng)殖過程中，可快速鑒定致病源，為養(yǎng)殖 戶挽回經(jīng)濟(jì)損失的大菱鲆養(yǎng)殖過程中溫和氣單胞菌的PCR檢測方法。
[0005] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種溫和氣單胞菌特異性引物，所述的溫和氣單胞菌 特異性引物由上游引物F和下游引物R構(gòu)成；
[0006] 所述的上游引物F的序列為:GCTGATTTTGGTGATGCGTTCA;
[0007] 所述的下游引物R的序列為:TACGTACAGATCCCCAGCCC
[0008] 優(yōu)選的，上述的一種溫和氣單胞菌特異性引物，所述的溫和氣單胞菌為Aeromonas sobria〇
[0009] -種大菱鲆養(yǎng)殖過程中溫和氣單胞菌的PCR檢測方法，方法如下：
[0010] 1)提取大菱鲆病灶部位細(xì)菌的總DNA;
[0011] 2)以所提取的DNA為模板，采用上述的溫和氣單胞菌特異性引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
[0012] 3)根據(jù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠呈像結(jié)果判斷大菱鲆是否被溫和氣單胞菌感 染;如果瓊脂糖凝膠呈現(xiàn)結(jié)果有486bp條帶產(chǎn)生，則大菱鲆被溫和氣單胞菌感染，否則沒有 被感染風(fēng)險(xiǎn)。
[0013] 上述的一種大菱鲆養(yǎng)殖過程中溫和氣單胞菌的PCR檢測方法：
[0015] PCR反應(yīng)條件:第一階段:94°Clmin;
[0016] 第二階段：94°C 30s，60 °C lmin，72 °C 30s; 30 循環(huán)；
[0017] 第三階段:72°C2min;
[0018] 第四階段:4°C保存。
[0019] 本發(fā)明的有益效果是：
[0020] 1.本發(fā)明，設(shè)計(jì)的溫和氣單胞菌特異性引物，能有效從各常見致病菌株中區(qū)分出 溫和氣單胞菌，表現(xiàn)出很強(qiáng)的特異性。
[0021] 2.本發(fā)明，設(shè)計(jì)的溫和氣單胞菌特異性引物，靈敏性高，可有效檢出養(yǎng)殖過程中的 溫和氣單胞菌，其最低檢測濃度可達(dá)到l〇_4ng/ul。
[0022] 3.本發(fā)明，所提供的在大菱鲆養(yǎng)殖過程中溫和氣單胞菌的PCR檢測方法，使得養(yǎng)殖 過程中溫和氣單胞菌的檢測更為簡便。在大菱鲆養(yǎng)殖過程中，一旦有被溫和氣單胞菌感染 的風(fēng)險(xiǎn)，即能夠做到快速鑒定致病源，為養(yǎng)殖戶挽回大量損失。本發(fā)明的檢測方法可有效檢 出大菱鲆養(yǎng)殖過程中的高危致病菌溫和氣單胞菌，經(jīng)驗(yàn)證此檢測方法特異性強(qiáng)，靈敏度高。 該檢測方法的確立為今后大菱鲆養(yǎng)殖過程中高發(fā)致病菌的檢測和分析提供了必要的理論 依據(jù)和完善的方法體系，不僅為今后大菱鲆養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展做出了貢獻(xiàn)，同時(shí)為促進(jìn) 我國養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的規(guī)?；】蛋l(fā)展奠定了基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0023] 圖1是溫和氣單胞菌特異性引物S的PCR反應(yīng)條件優(yōu)化；
[0024] 其中，M:Marker DL2000，l-6:退火溫度分別為55,56,57,58,59,6(TC。
[0025] 圖2是溫和氣單胞菌特異性引物S的特異性驗(yàn)證；
[0026] 其中，1 · Aeromonas bi val vium；2.Aeromonas caviae；3-4.Aeromonas hydrophila；
[0027] 5.Aeromonas jandaei；6.Aeromonas salmonicida；7.Aeromonas schubertii；
[0028] 8.Aeromonas sobria；9.Aeromonas veronii；10.Pseudomonas aeruginosa；
[0029] 11.Pseudomonas fragi；12.Pseudomonas gessardii；
[0030] 13.Pseudomonas helmanticensis；14.Pseudomonas kilonensis；
[0031 ] 15. Pseudomonas marginalis；16.Vibrio alginolyticus；17.Vibrio cyclitrophicus；
[0032] 18.Vibrio gigantis；M:Marker DL2000〇
[0033] 圖3是溫和氣單胞菌特異性引物S的PCR反應(yīng)靈敏性驗(yàn)證。
[0034] 其中，M:Marker DL2000，l-5:模板濃度分別為 10°，10-SlO-2，10-3，10-4ng/ul。
【具體實(shí)施方式】
[0035] 下面的實(shí)施例將對(duì)本發(fā)明予以進(jìn)一步的說明，但并不因此而限制本發(fā)明。
[0036] 實(shí)施例1 一種溫和氣單胞菌特異性引物 [0037](一)溫和氣單胞菌特異性引物的設(shè)計(jì)
[0038] 本實(shí)施例針對(duì)菌種溫和氣單胞菌(Aeromonas sobria)的dnaj基因，利用MEGA6軟 件，設(shè)計(jì)出對(duì)溫和氣單胞菌(Aeromonas sobria)具有特異性強(qiáng)且靈敏性高的一對(duì)特異性引 物S，該溫和氣單胞菌特異性引物的具體信息如表1所示。
[0039] 表 1
[0040]
[0041 ](二)溫和氣單胞菌特異性引物最佳PCR反應(yīng)條件的探索 [0042] 1、待試菌株DNA的提取
[0043] 使用Ezup柱氏基因組DNA抽提試劑盒（細(xì)菌），提取溫和氣單胞菌（Aeromonas sobria)菌種的DNA，具體步驟如下：
[0044] 1.1)取lml過夜培養(yǎng)的含有菌種溫和氣單胞菌(Aeromonas sobria)的菌液，加入 1.5ml離心管中，室溫8000rmp離心lmin，棄上清，收集菌體，加入180ul Buffer Digestion， 再加入20ul Proteinase K溶液，震蕩混勻。56°C水浴lh至細(xì)胞完全裂解。水浴過程中，每10 分鐘顛倒混勻一次，促進(jìn)細(xì)胞裂解。
[0045] 1.2)加入200ul Buffer BD，充分顛倒混勻。加入Buffer BD后，如有沉淀產(chǎn)生，可 70 °C水浴10分鐘。
[0046] 1.3)加入200ul的無水乙醇，充分顛倒混勻。加入無水乙醇后可能產(chǎn)生半透明纖維 狀懸浮物，不影響DNA的提取和應(yīng)用。
[0047] 1.4)將吸附柱放入收集管中，用移液器將步驟1.3)獲得的溶液和半透明纖維狀懸 浮物全部加入吸附柱中，靜置2min，在12000rmp室溫離心lmin，倒掉收集管中的廢液。
[0048] 1.5)將吸附柱放回收集管，加入500ul PW Solution，10000rmp離心30s，倒掉濾 液。
[0049] 1.6)將吸附柱放回收集管，加入500ul Wash Solution，10000rmp離心30s，倒掉濾 液。
[0050] 1.7)將吸附柱重新放回收集管中，于12000rmp室溫離心2min，棄去殘留的Wash Solution。將吸附柱打開蓋子于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘留的Wash Solution，Wash Solution的殘留會(huì)影響基因組DNA的產(chǎn)量和后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。
[0051 ] 1.8)取出吸附柱，放入一個(gè)新的1.5ml離心管中，加入50-100ul CE Buffer靜置 3min，12000rmp室溫離心2min，收集DNA溶液，即為溫和氣單胞菌（Aeromonas sobria)的 DNA。提取的DNA可立即進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)或-20 °C保存。
[0052] 2、溫和氣單胞菌特異性引物最佳退火溫度的探索
[0053]以溫和氣單胞菌的DNA為模板做PCR擴(kuò)增，并將目的引物的退火溫度范圍分別設(shè)置 為55-60°C，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在2%瓊脂糖lXTAE緩沖系統(tǒng)中電泳，每孔加樣5ul，用凝膠成像系 統(tǒng)觀察并攝影記錄，根據(jù)PCR后的凝膠電泳結(jié)果確定各引物最佳退火溫度。具體PCR反應(yīng)條 件和體系如表2所示，結(jié)果如圖1。
[0054]表2目的引物最佳PCR反應(yīng)探索條件 [0055]
[0056]由圖1可見，在溫度為55-5%~時(shí)，雖然特異性引物S與目的菌株有特異性目的條帶 產(chǎn)生，但同時(shí)也有不明顯非特異性條帶產(chǎn)生，但將溫度提升至60°C時(shí)，非特異性條帶消失， 故確定最佳退火溫度為60 °C。
[0057](三)溫和氣單胞菌特異性引物的特異性探索 [0058] 1、待試菌株DNA的提取
[0059]使用Ezup柱氏基因組DNA抽提試劑盒（細(xì)菌），分別提取如表3所示的不同菌種的 DNA，具體步驟如上述(二）中步驟1。
[0060] 2、特異性探索
[0061 ]分別以表3中，不同菌種的DNA為模板做PCR擴(kuò)增，具體PCR反應(yīng)條件和體系如表4所 示，PCR后的凝膠電泳結(jié)果如圖2所示。
[0062] 表3待試菌株如下：
[0064] 表4目的引物最佳PCR反應(yīng)條件
[0065]
[0066] 由圖2可見，該特異性引物在氣單胞菌屬內(nèi)，以及假單胞菌和弧菌屬內(nèi)均表現(xiàn)出很 強(qiáng)的特異性，只能和目的菌株溫和氣單胞菌(Aeromonas sobria)產(chǎn)生特異性擴(kuò)增，而未和 非目的菌株產(chǎn)生特異性擴(kuò)增。故可見其表現(xiàn)出很強(qiáng)的特異性。
[0067] (四)溫和氣單胞菌特異性引物的靈敏性的探索 [0068] 1、待試菌株DNA的提取
[0069] 使用Ezup柱氏基因組DNA抽提試劑盒（細(xì)菌），提取溫和氣單胞菌（Aeromonas sobria)菌種的DNA，具體步驟如上述(二）中步驟1。
[0070] 2、靈敏性的探索
[0071] 將溫和氣單胞菌的DNA濃度調(diào)至10ng/ul，并且依次稀釋為10°、10-1、10-2、10- 3、10- 4ng/ul，分別取2ul DNA作為PCR反應(yīng)模板，具體PCR反應(yīng)條件和體系如表5所示，PCR后的凝 膠電泳結(jié)果如圖3所示。
[0072]表5目的引物最佳PCR反應(yīng)探索條件
[0073]
[0074]由圖3可見，該引物在溫和氣單胞菌DNA濃度為10Q、10-\10-2、10- 3、10-4ng/ul時(shí)均 可產(chǎn)生特異性擴(kuò)增，其最低檢測濃度可達(dá)到l(T4ng/Ul。
[0075] 實(shí)施例2-種大菱鲆養(yǎng)殖過程中溫和氣單胞菌的PCR檢測方法
[0076] 方法如下：
[0077] 1、提取大菱鲆病灶部位細(xì)菌的總DNA;
[0078]將其病灶處組織用lml無菌水反復(fù)沖洗，至少三次，然后收集液體，使用Ezup柱氏 基因組DNA抽提試劑盒(細(xì)菌），提取大菱鲆病灶部位細(xì)菌的總DNA，具體步驟如上述實(shí)例1中 (二)的步驟1。
[0079] 2、以DNA為模板，采用實(shí)施例1所述的溫和氣單胞菌特異性引物，利用PCR方法擴(kuò) 增，得到PCR產(chǎn)物；
[0080]上游引物F: GCTGATTTTGGTGATGCGTTCA [0081 ]下游引物R: TACGTACAGATCCCCAGCCC
[0083] PCR反應(yīng)條件:第一階段:94°Clmin;
[0084] 第二階段：94°C 30s，60 °C lmin，72 °C 30s; 30 循環(huán)；
[0085] 第三階段：72°C2min;
[0086] 第四階段:4°C保存。
[0087] 3、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在2%瓊脂糖1 X TAE緩沖系統(tǒng)中電泳，每孔加樣5ul，用凝膠成像系 統(tǒng)觀察并攝影記錄。
[0088] 4、判斷標(biāo)準(zhǔn):根據(jù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠呈像結(jié)果判斷大菱鲆是否被溫和氣 單胞菌感染;如果瓊脂糖凝膠呈現(xiàn)結(jié)果有486bp條帶產(chǎn)生，則大菱鲆被溫和氣單胞菌感染， 否則沒有被感染。
[0089]驗(yàn)證:制作感染溫和氣單胞菌的大菱鲆模型，然后對(duì)該特異性引物進(jìn)行多次測試， 測試結(jié)果表明使用該引物進(jìn)行溫和氣單胞菌結(jié)果準(zhǔn)確性高;其中感染溫和氣單胞菌的18尾 大菱鲆檢測率為100%，未感染溫和氣單胞就的12尾大菱鲆的未檢出率也為100%，綜上所 述，該特異性引物可準(zhǔn)確檢出溫和氣單胞菌，檢測結(jié)果準(zhǔn)確率達(dá)到100%。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種溫和氣單胞菌特異性引物，其特征在于:所述的溫和氣單胞菌特異性引物由上 游引物F和下游引物R構(gòu)成； 所述的上游引物F的序列為:GCTGATTTTGGTGATGCGTTCA; 所述的下游引物R的序列為:TACGTACAGATCCCCAGCCC。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種溫和氣單胞菌特異性引物，其特征在于:所述的溫和氣單 胞菌是Aeromonas sobria。3. 權(quán)利要求1或2所述的溫和氣單胞菌特異性引物在大菱鲆養(yǎng)殖過程中的應(yīng)用。4. 一種大菱鲆養(yǎng)殖過程中溫和氣單胞菌的PCR檢測方法，其特征在于方法如下： 1) 提取大菱鲆病灶部位細(xì)菌的總DNA; 2) 以所提取的DNA為模板，采用權(quán)利要求1或2所述的溫和氣單胞菌特異性引物，進(jìn)行 PCR擴(kuò)增； 3) 根據(jù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠呈像結(jié)果判斷大菱鲆是否被溫和氣單胞菌感染;如 果瓊脂糖凝膠呈現(xiàn)結(jié)果有486bp條帶產(chǎn)生，則大菱鲆被溫和氣單胞菌感染，否則沒有被感 染。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種大菱鲆養(yǎng)殖過程中溫和氣單胞菌的PCR檢測方法，其特征 在 于:PCR反應(yīng)體系為?： 25μL體系：Estaq 12.5ul 上游引物F Iul 下游引物R Iul 樣品DNA 2ul ddH：0 S 5ul； PCR反應(yīng)條件:第一階段:94 °C Imin; 第二階段:94 °C 30s，60 °C Imin，72 °C 30s; 30 循環(huán)； 第三階段:72°C2min; 第四階段:4°C保存。
【文檔編號(hào)】C12Q1/04GK105886637SQ201610311622
【公開日】2016年8月24日
【申請(qǐng)日】2016年5月11日
【發(fā)明人】劉宏生, 顧穎, 張新剛, 張力, 趙健
【申請(qǐng)人】遼寧大學(xué)