紫薇矮化株型snp分子標(biāo)記及應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及紫薇矮化株型SNP分子標(biāo)記及應(yīng)用。本發(fā)明利用SLAF?seq技術(shù)開發(fā)出3個(gè)紫薇株型SNP分子標(biāo)記M16337、M25207和M38412，它們的核苷酸序列分別如SEQ ID NO:1?3所示。將本發(fā)明的3個(gè)分子標(biāo)記用于輔助選擇育種，可以實(shí)現(xiàn)苗期提早選擇，減少工作量，從而加快紫薇育種進(jìn)程。
【專利說明】
紫薇矮化株型SNP分子標(biāo)記及應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)及植物分子育種領(lǐng)域，具體地說，涉及紫薇矮化株型SNP分 子標(biāo)記及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 紫薇(Lagerstroemia indica)是我國的傳統(tǒng)木本花丼，有1800多年的栽培歷史 (張啟翔，1991)，樹姿優(yōu)美、花色艷麗、花期極長，在園林中得到了廣泛的應(yīng)用。紫薇作為一 種優(yōu)良觀賞花木，在應(yīng)用形式上較為單一，多以喬木狀的大花紫薇和灌木狀的紫薇品種為 主，迷你型的紫薇盆栽還有待開發(fā)。紫薇矮生品種成年植株高度僅30-60cm，因具有株型緊 湊、分枝多、節(jié)間短、花期長等優(yōu)良特性，既可用作觀花地被、綠蘺植物，也可用于盆栽觀賞 而具有珍貴的科研價(jià)值和廣闊的市場前景。但目前缺乏可以用于株高性狀輔助選擇的分子 記 D
[0003] Ye等（2015)利用AFLP和SSR分子標(biāo)記技術(shù)對矮化性狀進(jìn)行定位，得到一個(gè)與矮化 基因遺傳距離為23.33cM的AFLP標(biāo)記，重組率超過10%，難以用于紫薇矮化分子標(biāo)記輔助選 擇育種。由于紫薇缺乏基因組信息，使用傳統(tǒng)技術(shù)開發(fā)分子標(biāo)記費(fèi)時(shí)費(fèi)力，定位的成功率 低。
[0004] SLAF_seq(Specific Length Amplified Fragment Sequencing)為分子標(biāo)記的開 發(fā)提供了一條新思路，當(dāng)與高通量測序技術(shù)相結(jié)合時(shí)，優(yōu)勢更為突出。鑒于其測序的準(zhǔn)確 性，該技術(shù)在基因挖掘及高密度遺傳圖譜的構(gòu)建中得到了廣泛應(yīng)用。本發(fā)明利用SLAF-seq 技術(shù)開發(fā)了一批特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性高的紫薇株型的SNP標(biāo)記，為克隆矮化基因及進(jìn)行分子標(biāo) 記輔助選擇育種提供重要基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供紫薇矮化株型SNP分子標(biāo)記及應(yīng)用。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明是以屋久島紫薇為母本，紫薇品種'Pocomoke'為父 本雜交獲得的142株分離群體為試材，構(gòu)建株型正常/矮化基因池，開展紫薇矮化株型性狀 分子標(biāo)記的開發(fā)及標(biāo)記輔助選擇育種體系的建立。
[0007] 本發(fā)明提供的紫薇矮化株型SNP分子標(biāo)記，包括3個(gè)SNP分子標(biāo)記M16337、M25207和 M38412，它們的核苷酸序列分別如SEQIDN0:l-3所示。
[0008] 本發(fā)明還提供用于擴(kuò)增所述分子標(biāo)記的特異性PCR引物。
[0009] 標(biāo)記M16337引物序列為：
[0010] 正向引物 W -CCGTGATAATAATGGTAG-3'
[0011] 反向引物：5' -ATGTGAGTCATTGTGGAT-3'
[0012] 標(biāo)記M25207引物序列為：
[0013] 正向引物：5' -GTAGACAGACGTATACAGC-3'
[0014] 反向引物：57 -CGTTGACATTGCCAC-3'
[0015] 標(biāo)記M38412引物序列為：
[0016] 正向引物：5' -GATGCCACCTGAAGTTATT-3'
[0017] 反向引物：5' -GATTTTCCGGCGACTC-3'
[0018] 本發(fā)明還提供所述分子標(biāo)記在鑒定紫薇矮化株型中的應(yīng)用，包括以下步驟：
[0019] 1)提取待測植株的基因組DNA;
[0020] 2)以待測植株的基因組DNA為模板，利用擴(kuò)增所述分子標(biāo)記的引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增 反應(yīng)；
[0021] 3)檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行Sanger測序，如果擴(kuò)增產(chǎn)物相應(yīng)SNP位點(diǎn)表現(xiàn) 雜合，則待測植株為紫薇正常株型，如果相應(yīng)SNP位點(diǎn)表現(xiàn)純合，則待測植株為矮化株型;其 中，對應(yīng)于標(biāo)記M16337的SNP位點(diǎn)，位于SEQ ID NO: 1所示序列的第414位堿基，該處堿基為A 或G，對應(yīng)于標(biāo)記M25207的SNP位點(diǎn)，位于SEQ ID NO: 2所示序列的第412位堿基，該處堿基為 T或C，對應(yīng)于標(biāo)記M38412的SNP位點(diǎn)，位于SEQ ID N0:3所示序列的第375位堿基，該處堿基 為C或T。
[0022] 步驟2)中PCR擴(kuò)增體系為：100ngyL-1模板DNA lyL，2XTaq PCR Master Mix 12·5μ L，1 Ομπιο 1 L-1正、反向引物各0 · 6yL，ddH20 10 · 3yL; PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 °C預(yù)變性5min; 94 °C 變性30s，45°C-60°C (依引物而定)退火lmin，72°C延伸3〇8,35個(gè)循環(huán);72°(：終延伸1〇11^11。
[0023] 本發(fā)明還提供用于AS-PCR擴(kuò)增所述分子標(biāo)記的ASP引物。
[0036]本發(fā)明還提供一種篩選或鑒定紫薇矮化株型的方法，所述方法包括以下步驟： [0037] 1)提取待測植株的基因組DNA;
[0038] 2)以待測植株的基因組DNA為模板，利用擴(kuò)增所述分子標(biāo)記的ASP引物，進(jìn)行AS- PCR擴(kuò)增反應(yīng)；
[0039] 3)檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。如果擴(kuò)增產(chǎn)物相應(yīng)SNP位點(diǎn)表現(xiàn)雜合，則待測植株為紫薇正常株 型，如果相應(yīng)SNP位點(diǎn)表現(xiàn)純合，則待測植株為矮化株型；其中，對應(yīng)于標(biāo)記M16337的SNP位 點(diǎn)，位于SEQ ID NO: 1所示序列的第414位堿基，該處堿基為A或G，對應(yīng)于標(biāo)記M25207的SNP 位點(diǎn)，位于SEQ ID N0: 2所示序列的第412位堿基，該處堿基為T或C，對應(yīng)于標(biāo)記M38412的 SNP位點(diǎn)，位于SEQ ID N0:3所示序列的第375位堿基，該處堿基為C或T。
[0040]步驟2)中AS-PCR擴(kuò)增體系為：lOOngyL-1模板DNA lyL，2XTaq PCR Master Mix 12.5yL，10ymol L-1 正向引物0.6yL，10ymol L-1 反向引物 1 或2 0.6yL，ddH20 10.3yL;PCR反 應(yīng)程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性5min;94°C變性30s，45°C_60°C (依引物而定）退火lmin，72°C延伸 30s，35個(gè)循環(huán)；72°C終延伸lOmin。
[0041] 本發(fā)明還提供含有所述特異性PCR和/或所述ASP引物的用于篩選或鑒定紫薇矮化 株型的檢測試劑盒。
[0042] 本發(fā)明進(jìn)一步提供所述分子標(biāo)記在紫薇分子標(biāo)記輔助育種中的應(yīng)用。
[0043]本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0044](一）本發(fā)明利用SLAF-seq技術(shù)開發(fā)紫薇株型分子標(biāo)記，其周期短、成本低、效率 高，可為在其他無參考基因組物種中開發(fā)特異性分子標(biāo)記提供重要參考，也為分子育種、遺 傳多樣性、分子標(biāo)記輔助選擇育種提供了重要的開發(fā)途徑。
[0045] (二)本發(fā)明獲得的SNP分子標(biāo)記在不同樣本和不同群體中表現(xiàn)重復(fù)性好、擴(kuò)增穩(wěn) 定，不受環(huán)境條件的影響。
[0046] (三)本發(fā)明提供的ASP引物用于AS-PCR擴(kuò)增反應(yīng)，操作簡單，能夠克服紫薇不同基 因型鑒定的困難。
[0047] (四）將本發(fā)明篩選出的3個(gè)分子標(biāo)記用于輔助選擇育種，可以實(shí)現(xiàn)苗期提早選擇， 減少工作量，從而加快紫薇育種進(jìn)程。
【附圖說明】
[0048]圖1為本發(fā)明實(shí)施例4中標(biāo)記則6337在？1群體中AS-PCR的擴(kuò)增結(jié)果；其中，M: MarkerDL2000; 1-8:矮生個(gè)體;9-16:正常個(gè)體。
[0049]圖2為本發(fā)明實(shí)施例4中標(biāo)記1125207在？1群體中AS-PCR的擴(kuò)增結(jié)果；其中，M: MarkerDL2000; 1-8:矮生個(gè)體;9-16:正常個(gè)體。
[0050]圖3為本發(fā)明實(shí)施例4中標(biāo)記138412在？!群體中AS-PCR的擴(kuò)增結(jié)果；其中，M: MarkerDL2000; 1-8:矮生個(gè)體;9-16:正常個(gè)體。
[0051 ] 圖4顯示本發(fā)明實(shí)施例4中標(biāo)記M16337在BC!群體中AS-PCR的擴(kuò)增穩(wěn)定性;其中，M: MarkerDL2000; 1 -6:矮生個(gè)體;7-12:正常個(gè)體。
[0052] 圖5顯示本發(fā)明實(shí)施例4中標(biāo)記M25207在BC!群體中AS-PCR的擴(kuò)增穩(wěn)定性;其中，M: MarkerDL2000; 1 -6:矮生個(gè)體;7-12:正常個(gè)體。
[0053] 圖6顯示本發(fā)明實(shí)施例4中標(biāo)記M38412在BC!群體中AS-PCR的擴(kuò)增穩(wěn)定性;其中，M: MarkerDL2000; 1 -6:矮生個(gè)體;7-12:正常個(gè)體。
[0054]圖7顯示本發(fā)明實(shí)施例4中標(biāo)記在?:群體中輔助選擇育種準(zhǔn)確性;其中，a:單標(biāo)記 的準(zhǔn)確性;b:雙標(biāo)記組合的準(zhǔn)確性。
[0055]圖8顯示本發(fā)明實(shí)施例4中標(biāo)記在隊(duì):群體中輔助選擇育種準(zhǔn)確性;其中，a:單標(biāo)記 的準(zhǔn)確性;b:雙標(biāo)記組合的準(zhǔn)確性。
【具體實(shí)施方式】
[0056]以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例 均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件，如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊（Sambrook J&Russell DW, Molecular Cloning:a Laboratory Manual ,2001)，或按照制造廠商說明書建議的條件。
[0057]實(shí)施例1基于SLAF-seq技術(shù)開發(fā)紫薇株型性狀分子標(biāo)記 [0058] 1、實(shí)驗(yàn)材料
[0059] 供試材料包括母本屋久島紫薇（L. fauriei )、父本紫薇'Pocomoke '（L. indica 'Pocomoke'）及以其為親本雜交獲得的142株?1株型分離群體。親本在表型性狀上差異顯 著，母本喬木狀，株型直立開展，葉片大，節(jié)間長，父本為低矮灌木，株型緊湊，葉片小，節(jié)間 短。此外，92株株型分離群體用于分子標(biāo)記的驗(yàn)證。根據(jù)目標(biāo)性狀，于生長季結(jié)束（11月 份)后測定各群體后代的株型性狀，以正常型實(shí)生苗的平均高度為對照，其1/2以下劃分為 矮生型。所有材料均定植于國家花卉工程移栽技術(shù)研究中心北京小湯山實(shí)驗(yàn)基地（北煒 ，東經(jīng)E115°50/ )。
[0060] 2、基因組DNA的提取
[00611隨機(jī)選取？:群體中正常和矮生株型的單株各50株，提取DNA后等量混合分別構(gòu)建 正常型和矮生型基因池。DNA提取按照新型植物基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限 公司）說明進(jìn)行，制備1.0%瓊脂糖凝膠，吸取3yL DNA混合約2yL加樣緩沖液，電壓90V，電泳 30min，檢測是否有降解、RNA和蛋白質(zhì)污染等問題。用NANO DR0P2000測定DNA濃度，并分析 其純度，確保DNA濃度在lOOIOOngyL-1。
[0062] 3、紫薇株型性狀分子標(biāo)記的開發(fā)
[0063]利用酶切預(yù)測軟件SLAF_PrediCt(北京百邁客生物科技有限公司）對紫薇基因組 進(jìn)行系統(tǒng)分析，主要根據(jù)基因組的GC含量、重復(fù)序列情況和基因特點(diǎn)等信息，設(shè)計(jì)標(biāo)記開發(fā) 方案，確定酶切組合、切膠范圍及測序量等，以保證其分子標(biāo)記開發(fā)的密度和均勻性，從而 確保達(dá)到預(yù)期的實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?br>[0064]分別取親本、正常型和矮生型基因池4個(gè)樣品的DNA 500ng，加入限制性內(nèi)切酶酶 切3h。反應(yīng)結(jié)束后用Quick Spin column(Qiagen)純化酶切產(chǎn)物，并用33yL EB回收。以回收 的酶切產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系為25yL，包括模板DNA 100ng，10 X PCR反應(yīng)緩沖 液2.5yL，2.5mmolL-MNTP 的Taq DNA合成酶（NEB)0.3yL，10ymol I^Msel 引物2μ L，ddH20加至25yL。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后，加入Mse I、T4DNA連接酶、ATP及So 1 exa接頭，37 °C反應(yīng) 5h。純化產(chǎn)物后2%瓊脂糖電泳，用Gel Extraction Kit(Qiagen)回收電泳中300_500bp的 條帶，并以其為模板，在含Phusion Master Mix(NEB)和Solexa引物混合物中進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后用Illumina GAIIx(11 lumina，San Diego，CA，USA)測序。完成4個(gè)樣品的 DNA測序，保證獲得不低于50000個(gè)SLAF標(biāo)簽，標(biāo)簽整體平均深度達(dá)到120 X。利用軟件SLAF-Poly.pl.(北京百邁客生物科技有限公司）對測序得到的reads數(shù)據(jù)進(jìn)行評估和低質(zhì)量過 濾，再利用比對軟件BLAT將各樣品有效數(shù)據(jù)進(jìn)行相似度聚類，并通過深度識別，基因型糾錯(cuò) 后，得到有效的SLAF片段。
[0065] 利用SLAF-seq技術(shù)完成對樣品的測序，共獲得樣品的有效reads為32.15M條，SLAF 標(biāo)簽79863個(gè)，整體平均深度197.9X，達(dá)到簡化基因組的預(yù)期目標(biāo)(表1)。
[0066]表1樣品數(shù)據(jù)量統(tǒng)計(jì)
[0067]
[0068] 對篩選得到的Marker采用SNP-index關(guān)聯(lián)方法進(jìn)行檢驗(yàn)分析，獲得顯著性差異標(biāo) 記。Maa表示aa群體來源于Μ的深度;Paa表示aa群體來源于P的深度;Mab表示ab群體來源于Μ 的深度;Pab表示ab群體來源于Ρ的深度；
[0069] SNP-index(aa) =Maa/(Paa+Maa)
[0070] SNP-index(ab) =Mab/(Pab+Mab)
[0071 ] Delta(SNP-index)=SNP-index(ab)-SNP_index(aa)
[0072] 根據(jù)遺傳連鎖可以推測，如果該Marker與目標(biāo)性狀相關(guān)，則兩個(gè)群體中的SNP-index都會(huì)顯著偏離0.5(隱池中的SNP-index會(huì)接近于1)，〇6]^&(3即-;[11(161)會(huì)顯著偏離0。 該Marker與目標(biāo)性狀相關(guān)性越高，Delta(SNP-index)偏離0的程度越大，即更接近1。選擇 Delta(SNP-index)>0· 3的Marker為差異標(biāo)記，即更可能與性狀相關(guān)。
[0073] 實(shí)施例2根據(jù)紫薇株型差異性標(biāo)記設(shè)計(jì)引物
[0074]利用SLAF-seq技術(shù)共獲得紫薇矮化株型性狀特異標(biāo)簽38個(gè)。根據(jù)測序結(jié)果，選擇3 個(gè)Marker(M16337、M25207、M38412)利用Primer Premier5.0設(shè)計(jì)引物，引物序列見表2〇 [0075]表2用于Sanger測序的3對引物信息
[0076]
[0077] 隨機(jī)挑選30株極端個(gè)體進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系25yL，含lOOngyL-1模板DNA 1μ L，2XTaq PCR Master Mix(艾德萊）12.5yL，10ymol L-1正向和反向引物（上海生工）各0·6μ L，ddH2〇 10·3μΙ^ΡΟ?程序?yàn)?94°C 預(yù)變性 5min;94°C 變性 30s，45°C-60°C (依引物而定)退火 lmin，72°C延伸3〇8,35個(gè)循環(huán)；72°(：終延伸1〇1^11。？0?產(chǎn)物純化后直接進(jìn)行3&1^64則序（北 京睿博興科生物技術(shù)有限公司），將子代與親本的結(jié)果進(jìn)行對照，確定該標(biāo)記含有真實(shí)的 SNP，且標(biāo)記與目的性狀的緊密關(guān)聯(lián)。
[0078] 實(shí)施例3基于SLAF標(biāo)記建立AS-PCR方法進(jìn)行基因分型
[0079] 利用Sanger測序獲得SLAF片段全長后（即標(biāo)記M16337、M25207和M38412,核苷酸序 列分別如SEQ ID N0:1-3所示），對相應(yīng)的SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)AS-PCR引物。引物設(shè)計(jì)時(shí)，在等位基 因特異性引物(ASP)的3'末端分別與SNP位點(diǎn)的兩個(gè)堿基完全匹配，同時(shí)在特異性引物3'末 端的倒數(shù)第2或第3位置引入1個(gè)錯(cuò)配堿基，以此提高PCR的特異性及穩(wěn)定性。AS-PCR操作過 程中需將兩條ASP引物與其公用引物分別組對，在兩個(gè)PCR管中對同一 DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò) 增。若樣品中的等位位點(diǎn)與ASP引物的3'末端相匹配，便能進(jìn)行有效擴(kuò)增，反之則不能進(jìn)行 有效擴(kuò)增。
[0080] AS-PCR反應(yīng)體系為25yL，含lOOngyL-1 模板DNA lyL，2XTaq PCR Master Mix(艾德 萊）12.5yL，1 Ομπιο 1 L-1正向和反向引物(上海生工)各0.6yL，ddH2〇 10.3yL。反應(yīng)程序?yàn)?94 °(：預(yù)變性5!1^11;94°(：變性3〇8,45°(：-60°(：(依引物而定）退火11^11，72°(：延伸3〇8,35個(gè)循環(huán) ； 72°C終延伸10min。擴(kuò)增結(jié)束后用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，統(tǒng)計(jì)各群體所有單株 的基因型。如果相應(yīng)SNP位點(diǎn)表現(xiàn)雜合，則標(biāo)志著樣本材料為正常株型，如果相應(yīng)SNP位點(diǎn)表 現(xiàn)純合，則標(biāo)志著樣本材料為矮化株型。其中，對應(yīng)于標(biāo)記M16337的SNP位點(diǎn)，位于SEQ ID NO: 1所示序列的第414位堿基，該處堿基為A或G，對應(yīng)于標(biāo)記M25207的SNP位點(diǎn)，位于SEQ ID NO: 2所示序列的第412位堿基，該處堿基為T或C，對應(yīng)于標(biāo)記M38412的SNP位點(diǎn)，位于SEQ ID NO: 3所示序列的第375位堿基，該處堿基為C或T。
[0081 ]用于AS-PCR擴(kuò)增的3對標(biāo)記引物信息見表3。
[0082]表3用于AS-PCR擴(kuò)增的3對引物信息
[0083]
[0084] 實(shí)施例4標(biāo)記的準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性、重復(fù)性檢測
[0085] 用得到的3個(gè)標(biāo)記組6337、]\125207、]\08412對？1群體142個(gè)單株進(jìn)行43-?0財(cái)廣增驗(yàn) 證，標(biāo)記的鑒定結(jié)果見圖7，發(fā)現(xiàn)準(zhǔn)確率最高的為M25207，高達(dá)80%，其中各標(biāo)記在矮化個(gè)體 中的成功率顯著高于正常個(gè)體，M25207在矮化個(gè)體中準(zhǔn)確率高達(dá)84%。同時(shí)利用標(biāo)記組合 M16337+M25207進(jìn)行表型鑒定時(shí)，成功率高達(dá)90%，且在矮生個(gè)體中達(dá)93%。由此可見，開發(fā) 的SNP標(biāo)記可以用于紫薇Fi群體矮化株型性狀的輔助選擇育種中。
[0086] 獲得的特異性分子標(biāo)記是否穩(wěn)定對其應(yīng)用也是非常重要的，通過相同引物對不同 的分離群體進(jìn)行擴(kuò)增，如果能獲得穩(wěn)定的條帶，說明開發(fā)的標(biāo)記是穩(wěn)定的，可用于紫薇不同 株型的鑒定。以92株群體為材料，驗(yàn)證所開發(fā)的SNP標(biāo)記的穩(wěn)定性及準(zhǔn)確率。以M38412為 例，其在正常株型個(gè)體擴(kuò)出兩條帶，為CT雜合，在矮化株型個(gè)體中擴(kuò)出一條帶，為CC純合，說 明3個(gè)標(biāo)記在群體中也能較好的鑒定不同的表型，具有很好的穩(wěn)定性。3個(gè)標(biāo)記在隊(duì):群體 中表型鑒定準(zhǔn)確率略微下降，單標(biāo)記M25207準(zhǔn)確率為77%，雙標(biāo)記組合準(zhǔn)確率為84% (圖 8)。其中，圖1-圖3分別為標(biāo)記組6337、]\125207和]\08412在?1群體中45-?0?的擴(kuò)增結(jié)果。圖4-圖6分別顯示標(biāo)記M16337、M25207和M38412在BCi群體中AS-PCR的擴(kuò)增穩(wěn)定性。
[0087] 本發(fā)明建立的分子標(biāo)記輔助選擇育種可以實(shí)現(xiàn)苗期提早選擇、減少工作量，大大 提高了紫薇株型的選擇效率，從而加快育種進(jìn)程。
[0088] 雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在 本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。 [0089] 參考文獻(xiàn)
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【主權(quán)項(xiàng)】
1. 紫薇矮化株型SNP分子標(biāo)記，其特征在于，包括3個(gè)SNP分子標(biāo)記M16337、M25207和 M38412,它們的核苷酸序列分別如SEQ ID NO: 1-3所示。2. 用于擴(kuò)增權(quán)利要求1所述分子標(biāo)記的特異性PCR引物，其特征在于， 標(biāo)記M16337引物序列為： 正向引物:5' -CCGTGATAATAATGGTAG-3' 反向引物：5' -ATGTGAGTCATTGTGGAT-3' 標(biāo)記M25207引物序列為： 正向引物：5' -GTAGACAGACGTATACAGC-3' 反向引物：5' -CGTTGACATTGCCAC-3' 標(biāo)記M38412引物序列為： 正向引物：5' -GATGCCACCTGAAGTTATT-3' 反向引物：5' -GAITTTCCGGCGACTC-3'。3. 權(quán)利要求1所述分子標(biāo)記在鑒定紫薇矮化株型中的應(yīng)用，其特征在于，包括以下步 驟： 1) 提取待測植株的基因組DNA; 2) 以待測植株的基因組DNA為模板，利用擴(kuò)增所述分子標(biāo)記的引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)； 其中，用于擴(kuò)增所述分子標(biāo)記的引物序列同權(quán)利要求2所述； 3) 檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，如果擴(kuò)增產(chǎn)物相應(yīng)SNP位點(diǎn)表現(xiàn)雜合，則待測植株為紫薇正常株 型，如果相應(yīng)SNP位點(diǎn)表現(xiàn)純合，則待測植株為矮化株型；其中，對應(yīng)于標(biāo)記M16337的SNP位 點(diǎn)，位于SEQ ID NO: 1所示序列的第414位堿基，該處堿基為A或G，對應(yīng)于標(biāo)記M25207的SNP 位點(diǎn)，位于SEQ ID NO: 2所示序列的第412位堿基，該處堿基為T或C，對應(yīng)于標(biāo)記M38412的 SNP位點(diǎn)，位于SEQ ID NO: 3所示序列的第375位堿基，該處堿基為C或T。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟2)中PCR擴(kuò)增體系為=IOOngyI/1模板 DNA lyL，2XTaq PCR Master Mix 12.5yL，10ymol L-1 正、反向引物各0.6yL，ddH20 10·3μ L;PCR 反應(yīng)程序?yàn)?94°C 預(yù)變性 5min;94°C 變性 30s，45°C-60°C 退火 lmin，72°C 延伸 30s，35 個(gè) 循環(huán);72 °C終延伸I Omin。5. 用于AS-PCR擴(kuò)增權(quán)利要求1所述分子標(biāo)記的ASP引物，其特征在于， 標(biāo)記M16337引物序列為： 正向引物：5' -TCCCGTGGCTCTAACCTCT-3' 反向引物1:5' -TCTTGAACCATTTTTTTCCCT-3' 反向引物2:5' -TCTTGAACCATTTTTTTCCCC-3' 標(biāo)記M25207引物序列為： 正向引物:5' -TAGAACAAGACTCGGAAAA-3, 反向引物1:5' -CGCACATCGTACGTAAAA-3' 反向引物2:5' -CGCACATCGTACGTAAAG-3' 標(biāo)記M38412引物序列為： 正向引物:5' -CCAACGAGCAGCATCCAAAG-3' 反向引物1:5' -GGCGACTCGAACTTCTCCG-3' 反向引物2:5' -GGCGACTCGAACTTCTCCA-3'。6. -種篩選或鑒定紫薇矮化株型的方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 提取待測植株的基因組DNA; 2) 以待測植株的基因組DNA為模板，利用擴(kuò)增權(quán)利要求1所述分子標(biāo)記的ASP引物，進(jìn)行 AS-PCR擴(kuò)增反應(yīng)； 其中，用于擴(kuò)增所述分子標(biāo)記的ASP引物序列同權(quán)利要求5所述； 3) 檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，如果擴(kuò)增產(chǎn)物相應(yīng)SNP位點(diǎn)表現(xiàn)雜合，則待測植株為紫薇正常株型， 如果相應(yīng)SNP位點(diǎn)表現(xiàn)純合，則待測植株為矮化株型；其中，對應(yīng)于標(biāo)記M16337的SNP位點(diǎn)， 位于SEQ ID NO: 1所示序列的第414位堿基，該處堿基為A或G，對應(yīng)于標(biāo)記M25207的SNP位 點(diǎn)，位于SEQ ID NO: 2所示序列的第412位堿基，該處堿基為T或C，對應(yīng)于標(biāo)記M38412的SNP 位點(diǎn)，位于SEQ ID NO: 3所示序列的第375位堿基，該處堿基為C或T。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟2)中AS-PCR擴(kuò)增體系為：IOOngyI/1模 板DNA lyL，2XTaq PCR Master Mixl2.5yL，10ymol L-1 正向引物0.6yL，10ymol L-1 反向引 物 1 或2 0.6yL，ddH20 10.3yL;PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性5min;94°C變性30s，45°C-60°C 退火lmin，72°C延伸3〇8,35個(gè)循環(huán);72°(：終延伸1〇11^11。8. 含有權(quán)利要求2和/或權(quán)利要求5所述引物的用于篩選或鑒定紫薇矮化株型的檢測試 劑盒。9. 權(quán)利要求1所述分子標(biāo)記在紫薇分子標(biāo)記輔助育種中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12Q1/68GK105886640SQ201610326992
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年5月17日
【發(fā)明人】潘會(huì)堂, 葉遠(yuǎn)俊, 張啟翔, 蔡明 , 程堂仁, 王佳, 鞠易倩, 焦垚, 馮露
【申請人】北京林業(yè)大學(xué)