一種煙曲霉菌的pcr檢測的引物及方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種煙曲霉菌的PCR檢測的引物，包括正向引物F2625，引物序列為CGATCGTGGTCTCTTCCGA和反向引物R3438，引物序列為CTGCCGGGTCAGAATCTGT，本發(fā)明還公開了一種煙曲霉菌的PCR檢測方法，包括CTAB法提取樣品真菌菌株的基因組DNA；利用上述引物，以所述基因組DNA作為模板，進行PCR擴增，以便獲得真菌菌株的基因組DNA的擴增產(chǎn)物；以及瓊脂糖凝膠電泳檢測所述基因組DNA的擴增產(chǎn)物，EB染色觀察。本發(fā)明提供的檢測方法能快速、準確、高效檢測出待測物中的煙曲霉菌。
【專利說明】
一種煙曲霉菌的PCR檢測的引物及方法
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術領域。具體地，本發(fā)明涉及一種真菌的PCR檢測及方法，更具 體地，涉及一種煙曲霉菌的PCR檢測的引物及方法。
【背景技術】
[0002] 煙曲霉(Aspergillus fumigatus)是自然界中廣泛存在的腐生真菌，也是重要的 機會致病菌。隨著免疫受損人群的增多，系統(tǒng)性曲霉病的90 %是由煙曲霉引起的。同時，煙 曲霉產(chǎn)生的毒素嚴重污染糧食與飼料制品，危害人和動物的健康，造成重大的經(jīng)濟損失，煙 曲霉已成為臨床醫(yī)學和醫(yī)學微生物家們關注的熱點。
[0003] 煙曲霉的檢測技術經(jīng)歷了傳統(tǒng)培養(yǎng)鑒別、層析法及色譜法等化學方法檢測、免疫 學檢測、分子生物學檢測等。隨著PCR和DNA測序技術的發(fā)展，多基因座序列分析得到廣泛承 認。目前應用于曲霉的遺傳標記主要有rDNA ITSl-5.8S-ITRS2，calmodulin gene(CaM)和 beta-tubulin gene(benA)。
[0004] 然而，目前對于煙曲霉的檢測技術的研究仍有待改進。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明旨在解決現(xiàn)有技術中存在的技術問題之一，為此，本發(fā)明的一個目的在于 提供了一種能夠有效檢測出煙曲霉菌的PCR檢測的引物和方法，具有快速、準確、高效等特 點。
[0006] 需要說明的是，本發(fā)明是基于發(fā)明人的下列發(fā)現(xiàn)而完成的：
[0007] 根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提出了一種煙曲霉菌的PCR檢測的引物，所述引物 為：正向引物F2625,引物序列為CGATCGTGGTCTCTTCCGA;反向引物R3438,引物序列為 CTGCCGGGTCAGAATCTGT 〇
[0008] 在本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提出了一種煙曲霉菌的PCR檢測方法，包括以下步 驟：
[0009] CTAB法提取樣品真菌菌株的基因組DNA;以及
[0010] 利用權利要求1所述的引物，以所述基因組DNA作為模板，進行PCR擴增，以便獲得 真菌菌株的基因組DNA的擴增產(chǎn)物；以及
[0011]瓊脂糖凝膠電泳檢測所述基因組DNA的擴增產(chǎn)物，EB染色觀察。
[0012] 進一步地，所述PCR擴增的退火溫度為50攝氏度至55攝氏度。
[0013] 進一步地，所述基因組DNA的擴增產(chǎn)物的長度為814bp。
[0014] 本發(fā)明與現(xiàn)有的技術相比具有如下有益效果：
[0015] 本發(fā)明提供的引物和檢測方法包括煙曲霉在內(nèi)的20個分類單元34個菌株，結果表 明，只有煙曲霉擴增出814bp的單一擴增產(chǎn)物，表現(xiàn)為陽性，其他18個供試的曲霉種未能得 到擴增產(chǎn)物，均表現(xiàn)為陰性。說明本發(fā)明的引物和方法具有良好的特異性。
[0016] 本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中 變得明顯，或通過本發(fā)明的實踐了解到。
【附圖說明】
[0017] 圖1為根據(jù)本發(fā)明的一個實施例的真菌通用引物ITS1/ITS4擴增7種曲霉的PCR擴 增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結果。
[0018] 圖2為根據(jù)本發(fā)明的一個實施例的引物F2625/R3438擴增7種曲霉的PCR擴增產(chǎn)物 的瓊脂糖凝膠電泳結果。
[0019]圖3為根據(jù)本發(fā)明的一個實施例的引物F2625/R3438擴增34個曲霉的PCR擴增產(chǎn)物 的瓊脂糖凝膠電泳結果。
【具體實施方式】
[0020] 下面詳細描述本發(fā)明的實施例。下面通過參考附圖描述的實施例是示例性的，僅 用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。
[0021] 1、設計特異性擴增煙曲霉的引物對
[0022] 通過比較曲霉屬真菌RPB2基因序列，設計特異性引物10個見表1，由生工生物工程 (上海)股份有限公司合成。
[0023] 表1基于RPB2基因設計的引物編號、序列及參數(shù)
[0026] 2、待測曲霉菌株的收集或分離及培養(yǎng)
[0027] 待測曲霉菌樣品來源于中國科學院微生物研究所真菌學國家實驗室、北京大學真 菌和真菌病研究中心及分離物(見表2)，接種至PDA培養(yǎng)基上，置培養(yǎng)箱28 °C培養(yǎng)。
[0028] 表2.供試34個曲霉菌株或分離物的編號及其來源
[0029]
[0031] 3、DNA模板制備
[0032] 挑取直徑5mm的待測曲霉菌株菌絲塊接種至100ml PD液體培養(yǎng)基中，室溫下?lián)u床 培養(yǎng)(250rpm)2 - 4周，收集菌體并用無菌生理鹽水沖洗數(shù)次，滅菌濾紙吸干。取O.lg菌體在 液氮中迅速研磨成粉末，用2 % (w/v) CTAB緩沖液抽提菌絲DNA，0.8 %瓊脂糖凝膠檢測DNA樣 品濃度，置-20 °C備用。
[0033] 4、特異性PCR檢測方法的建立
[0034] PCR檢測20μ1 反應體系包括：超純水 10yl，2XEcoTaq PCR Super Mix(+dye)8yl (TaqDNA聚合酶0.05UAil，4mM MgC12,0.4mM dNTP，Beijing TransGen Biotech·，北京），引 物F2625和R3438(ΙΟμΜ)各0.5μ1，模板DNA ΙμL。
[0035] PCR 反應條件為：94°C 預變性 3min;94°C 變性 3〇8,50°(：(或55°(：)退火3〇8,72°(：延伸 45 8,30個循環(huán)；72°(：延伸7111丨11。？01?反應在？1'(：-1501'116^11。。7(3 161(]\^1^8631。11， Masachusetts，USA)進行。
[0036] 5、結果判定
[0037] 發(fā)明人選取供試34個曲霉菌株中提取的7種曲霉的DNA樣品，進行了 PCR產(chǎn)物瓊脂 糖凝膠電泳檢測，目的是檢驗7種曲霉的DNA樣品質量。如圖1所示，圖1為真菌通用引物 ITS1/ITS4擴增7種曲霉的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測結果。圖中1至9點樣孔依次是DNA Marker、煙曲霉、棒曲霉、米曲霉、黃曲霉、構巢曲霉、黑曲霉、費希新薩托菌、以雙蒸水為空 白模板對照。
[0038]圖2為特異引物F2625/R3438擴增7種曲霉的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測結果。圖 中1至9點樣孔依次是DNA Marker、煙曲霉、棒曲霉、米曲霉、黃曲霉、構巢曲霉、黑曲霉、費希 新薩托菌、以雙蒸水為空白模板對照。驗證了本發(fā)明的引物具有良好的鑒別作用，僅煙曲霉 能擴增出預計的產(chǎn)物。
[0039]供試的34個曲霉菌株隸屬20種，經(jīng)引物F2625和R3438擴增、2 %瓊脂糖凝膠電泳檢 測，僅A.fumigatus和六.116〇6111口1:;[(3118的11個菌株分別擴增出約80(^口大小的單一產(chǎn)物外， 其它18種23個供試菌株未能得到擴增產(chǎn)物。結果同時暗示，不支持A . fumigatus和 A.neoellipticus在種水平上的差異。
[0040]圖 3 中 1 至25點樣孔依次是 1 · DNA Marker，2 · 14346Aspergi 1 lus awamori， 3·13907A·clavatus，4·14339A.creber，5·3·14527A·flavus，6-14·A.fumigatus 2810、 9793、13945、14019、14023、14029、14327、NRRL163T、NRRL6113，15.CYHlA.lentulus，16-17.A.neollipticusNRRL5109T、9732，18-19.A.nigerl3527、14348,20-21.A.paraciticus 3.13640,14039,22.13912A.sydowii,23.14347A.tubingensis, 24.13899A.ustus,25.13902Emericella nidulans [0041 ] 6、序列測定驗證
[0042] 純化F2625和R3438擴增產(chǎn)物片段送生工生物工程（上海）股份有限公司，ABI 3730XL測序儀雙向測序，序列結果與NCBI公布的煙曲霉RPB2基因序列完全一致。
[0043] 引物F2625/R3438擴增煙曲霉得到的序列為814bp:
[0044]

[0045]在本說明書的描述中，參考術語"一個實施例"、"一些實施例"、"示例"、"具體示 例"、或"一些示例"等的描述意指結合該實施例或示例描述的具體特征、結構、材料或者特 點包含于本發(fā)明的至少一個實施例或示例中。在本說明書中，對上述術語的示意性表述不 一定指的是相同的實施例或示例。而且，描述的具體特征、結構、材料或者特點可以在任何 的一個或多個實施例或示例中以合適的方式結合。
[0046]盡管已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實施例，本領域的普通技術人員可以理解:在不 脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下可以對這些實施例進行多種變化、修改、替換和變型，本 發(fā)明的范圍由權利要求及其等同物限定。
【主權項】
1. 一種煙曲霉菌的PCR檢測的引物，其特征在于，所述引物為： 正向引物F2625,引物序列為CGATCGTGGTCTCTTCCGA; 反向引物R3438,引物序列為CTGCCGGGTCAGAATCTGT。2. -種煙曲霉菌的PCR檢測方法，其特征在于，包括以下步驟： CTAB法提取樣品真菌菌株的基因組DNA;以及 利用權利要求1所述的引物，以所述基因組DNA作為模板，進行PCR擴增，以便獲得真菌 菌株的基因組DNA的擴增產(chǎn)物；以及 瓊脂糖凝膠電泳檢測所述基因組DNA的擴增產(chǎn)物，EB染色觀察。3. 根據(jù)權利要求2所述的PCR檢測方法，其特征在于，所述PCR擴增的退火溫度為50攝氏 度至55攝氏度。4. 根據(jù)權利要求2所述的PCR檢測方法，其特征在于，所述基因組DNA的擴增產(chǎn)物的長度 為814bp。
【文檔編號】C12N15/11GK105886643SQ201610355146
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年5月26日
【發(fā)明人】余知和, 周建芬, 曾昭清, 余蕓, 程云方
【申請人】長江大學