密執(zhí)安棒狀桿菌多重檢測試劑、試劑盒及其應(yīng)用
【專利摘要】本申請公開了一種密執(zhí)安棒狀桿菌多重檢測試劑、試劑盒及其應(yīng)用。本申請的密執(zhí)安棒狀桿菌多重檢測試劑中含有五條鎖式探針，分別為Seq ID No.1所示序列的CMN鎖式探針、Seq ID No.2所示序列的CMM鎖式探針、Seq ID No.3所示序列的CMI鎖式探針、Seq ID No.4所示序列的CMS鎖式探針、Seq ID No.5所示序列的CMT鎖式探針。本申請的多重檢測試劑，含有五個亞種的特異性鎖式探針，能夠同時對五個亞種進行特異性檢測；提高了檢測效率和檢測質(zhì)量。本申請的試劑及試劑盒，為密執(zhí)安棒狀桿菌高通量檢測提供了一種簡單有效的途徑，適于檢驗檢疫部門使用，為保障生物安全，避免病菌傳播提供了有力的科學(xué)依據(jù)。
【專利說明】
密執(zhí)安棒狀桿菌多重檢測試劑、試劑盒及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本申請涉及植物病原菌檢測領(lǐng)域，特別是涉及一種密執(zhí)安棒狀桿菌多重檢測試 劑、試劑盒及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 密執(zhí)安棒狀桿菌(Clavibacter michiganensis)為放線菌目、微球菌科、密執(zhí)安棒 狀桿菌屬，是重要的植物病原細菌。其中，密執(zhí)安棒狀桿菌的五個亞種：Clavibacter michiganensis subsp.nebraskensis(縮寫CMN)、Clavibacter michiganensis subsp .michiganensis(縮寫CMM)、Clavibacter michiganensis subsp· insidiosus(縮寫 CMI)、Clavibacter michiganensis subsp · sepedonicus (縮寫CMS)、Clavibacter michiganensis subsp. tessellarius(縮寫CMT)，是目前密執(zhí)安棒狀桿菌屬檢驗檢疫研究 的重點。這五個亞種是危害性大、分布廣的密執(zhí)安棒狀桿菌屬亞種，并且，五個亞種的形態(tài) 學(xué)特征近似，分子生物學(xué)特征也相近，因此很難鑒別。
[0003] Clavibacter michiganensis subsp.nebraskensis又稱玉米內(nèi)州萎蔫病菌，主要 分布于北美洲，自然寄主包括玉米(Zea mays)、墨西哥假蜀黍(Zea mexicana)，接種寄主包 括墨西哥假蜀泰（Euchlaena mexicana)、甘庶（Saccharum off icinarum)、高粱（Sorghum bicolor)、蘇丹草（Sorghum sudanense)、鴨茅狀磨擦禾(Tripsacum dactyloides) D病菌在 種子中至少存活1年，可進行遠距離傳播，對感染的玉米品種具有毀滅性的危害，是我國進 境植物檢疫性有害生物。
[0004] Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis又稱番前細菌性潰瘍病菌， 在亞洲、歐洲、北美洲、中美洲及加勒比海地區(qū)、南美洲、非洲和大洋洲等都有分布，是世界 范圍的重要病害，也是我國進境植物檢疫性有害生物。Clavibacter michiganensis subsp .michiganensis的自然寄主包括：番前（So lanum ly coper si cum)、辣椒（Cap si cum annuum)、前屬（Solanum)、龍葵（Solanum nigrum)、裂葉前（Solanum trif lorum)和其他的 前科雜草。接種寄主包括：燕麥（Avena sativa)、西瓜（Citrullus 1&1^切8)、西瓜 (Citrullus vulgaris)、黃瓜（Cucumis sativus)、樹番前（Cyphomandra betacea)、向日葵 (Helianthus annuus)、大麥（ordeum vulgare)、秘魯番前（Lycopersicon peruvianum)、酉昔 栗番前（Lycopersicon pimpinellifolium)、心葉煙（Nicotiana glutinosa)、黑麥（Secale cereale)、Solanum humboldtii、Solanum muricatum、Solanum nigrum var guineense、 Solanum pruniforme>Solanum racemif lorum、馬鈴薯（Solanum tuberosum)、普通小麥 (Triticum aestivum)。病菌在在土壤里的病殘組織中可存活2~3年。
[0005] Clavibacter michiganensis subsp.insidiosus又稱苜蓿細菌性萎蔫病菌，在亞 洲、歐洲、北美洲、南美洲、非洲和大洋洲等都有分布，也是世界范圍的重要病害，也是我國 進境植物檢疫性有害生物。其自然寄主包括:百脈根Lotus corniculatus、苜蓿屬Medicago (野苜蓿Medicago falcata、紫苜蓿Medicago sativa)、白香草木樨Melilotus albus、驢喜 豆〇11〇13^(31118￥；!_(^36：[>0113、木犀371'；!_邱3：[ >從8從118、車軸草屬1'1^：[>01；!_11111。接種寄主包括： Medicago dzawknetica、Medicago glutinosa、Medicago hemicycla、小首蕃Medicago minima、Medicago prostratanMedicago sativa var·gaetula、Medicago sativa var·parviflora、Medicago sativa var·pi 1ifera、Medicago sogdiananMedicago suffruticosa、Medicago tianschanica、Medicago transoxana、玉米Zea mays。 Clavibacter michiganensis subsp. insidiosus一般在受害寄主根管和病殘寄主組織上 越冬，也可在種子和干草上越冬，春季通過傷口侵入根系，引起萎蔫病。
[0006] Clavibacter michiganensis subsp.sepedonicus又稱馬鈴薯環(huán)腐病菌在亞洲、 歐洲、北美洲、中美洲及加勒比海地區(qū)、南美洲、非洲等都有分布，是世界范圍的重要病害， 也是我國進境植物檢疫性有害生物。其自然寄主為馬鈴薯Solanum tuberosum，接種寄主包 括:厶1：116仙63、甜菜136七3￥11]^31^8、番前1^(3(^618；[(30116 8(31116111：111]1等前屬植物。帶菌種薯 是主要的初侵染源，采用切塊播種時，切刀傳病是擴大再侵染的主要途徑。切一刀病薯的切 刀能傳染24~40個健薯。灌溉水或雨水也可將病薯腐爛釋放出來的細菌傳到健薯或健株根 莖上。帶菌種薯細菌隨養(yǎng)分和水分流動沿維管束依次向上進入新芽、莖、葉柄和葉內(nèi)，形成 系統(tǒng)侵染。當(dāng)葡匐莖長出時，病菌又沿葡匐莖的維管束進入新生薯塊，但種子不帶菌。
[0007] Clavibacter michiganensis subsp.tessellarius又稱密執(zhí)安棒狀桿菌棋盤亞 種，是Clavibacter michiganensis subsp.nebraskensisNClavibacter michiganensis subsp.michiganensis、Clavibacter michiganensis subsp·insidiosus、Clavibacter michiganensis subsp .sepedonicus的近似種，在檢驗檢疫過程中，極易引起混淆。
[0008] 由于以上五種密執(zhí)安棒狀桿菌的形態(tài)學(xué)特征和分子學(xué)特征都極其相似，容易引起 混淆，因此，亟需一種能夠?qū)γ軋?zhí)安棒狀桿菌進行有效檢測鑒定的方法或試劑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本申請的目的是提供一種密執(zhí)安棒狀桿菌多重檢測試劑、試劑盒及其應(yīng)用。
[0010] 本申請采用了以下技術(shù)方案：
[0011] 本申請的一方面公開了一種密執(zhí)安棒狀桿菌多重檢測試劑，該多重檢測試劑中含 有五條鎖式探針，五條鎖式探針分別為Seq ID No. 1所示序列的Clavibacter michiganensis subsp.nebraskensis 特異性鎖式探針、Seq ID Νο·2 所不序列的 Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis特異性鎖式探針、Seq ID Νο·3所不序 列的Clavibacter michiganensis subsp. insidiosus特異性鎖式探針、Seq ID Νο·4所不 序列的Clavibacter michiganensis subsp.sepedonicus特異性鎖式探針、Seq ID Νο·5所 不序列的Clavibacter michiganensis subsp.tessellarius特異性鎖式探針。
[0012] 本申請的另一面還公開了的密執(zhí)安棒狀桿菌多重檢測試劑在密執(zhí)安棒狀桿菌滾 環(huán)擴增檢測、滾環(huán)擴增液相芯片檢測中的應(yīng)用。
[0013] 需要說明的是，本申請的試劑實際上就是五種密執(zhí)安棒狀桿菌亞種的特異性鎖式 探針，因此，可以將其用于密執(zhí)安棒狀桿菌滾環(huán)擴增檢測。而本申請的一種優(yōu)選實現(xiàn)方式 中，將滾環(huán)擴增與液相芯片結(jié)合，利用液相芯片對滾環(huán)擴增產(chǎn)物進行檢測和分析，與常規(guī)的 凝膠電泳相比，具有更高的靈敏度和準(zhǔn)確性。
[0014] 還需要說明的是，本申請的試劑，即五條特異性鎖式探針，經(jīng)過嚴密的設(shè)計和驗 證，五條鎖式探針可以組合在一起進行多重檢測，并且，五條鎖式探針都具有很好的特異 性，不會相互干擾，具有很好的一致性。
[0015] 本申請的另一面公開了一種密執(zhí)安棒狀桿菌的滾環(huán)擴增檢測方法，包括采用本申 請的多重檢測試劑，對待測樣品進行滾環(huán)擴增，通過五條鎖式探針的擴增情況判斷待測樣 品中是否含有Clavibacter michiganensis subsp · nebraskensis、Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis、Clavibacter michiganensis subsp.insidiosus、 Clavibacter michiganensis subsp·sepedonicus和/或Clavibacter michiganensis subsp.tesseliarius〇
[0016] 需要說明的是，本申請的密執(zhí)安棒狀桿菌多重檢測試劑，實際上就是五種密執(zhí)安 棒狀桿菌亞種的鎖式探針，其設(shè)計之處就考慮到將其用于滾環(huán)擴增，以進行多重檢測；因 此，本申請?zhí)岢隽硕嘀貦z測密執(zhí)安棒狀桿菌的滾環(huán)擴增檢測方法。其中，通過五條鎖式探針 的擴增情況判斷待測樣品，目前主要的方法包括凝膠電泳或芯片雜交;而本申請的優(yōu)選方 案中將其與液相芯片結(jié)合，通過液相芯片判斷鎖式探針的擴增情況。
[0017] 本申請的再一面公開了一種密執(zhí)安棒狀桿菌的滾環(huán)擴增液相芯片檢測方法，包括 以下步驟，
[0018] (1)提取待測樣品的DNA樣本；
[0019] (2)采用權(quán)利要求1所述的多重檢測試劑，對提取的DNA樣本進行滾環(huán)擴增；
[0020] (3)將五種偶聯(lián)微球?qū)L環(huán)擴增產(chǎn)物進行雜交和液相芯片分析，獲得檢測結(jié)果；
[0021 ] 其中，五種偶聯(lián)微球分別為偶聯(lián)有Clavibacter michiganensis subsp . nebraskens is特異性鎖式探針Zip序列的液相芯片微球、偶聯(lián)有Clavibacter michiganensis subsp .michiganensis特異性鎖式探針Zip序列的液相芯片微球、偶聯(lián)有 Clavibacter michiganensis subsp · insidiosus特異性鎖式探針Zip序列的液相芯片微 球、偶聯(lián)有Clavibacter michiganensis subsp · sepedonicus特異性鎖式探針Zip序列的液 相芯片微球、偶聯(lián)有Clavibacter michiganensis subsp · tessellarius特異性鎖式探針 Zip序列的液相芯片微球。
[0022] 優(yōu)選的，Clavibacter michiganensis subsp.nebraskensis特異性鎖式探針Zip 序列為 Seq ID No. 6 所不序列，Clavibacter michiganensis subsp .michiganensis 特異性 鎖式探針 Zip序列為 Seq ID Νο·7 所不序列，Clavibacter michiganensis subsp.insidiosus特異性鎖式探針Zip序列為Seq ID Νο·8所不序列，Clavibacter michiganensis subsp .sepedonicus 特異性鎖式探針 Zip序列為 Seq ID No. 9 所不序列， Clavibacter michiganensis subsp.tessellarius特異性鎖式探針Zip序列為Seq ID No. 10所示序列。
[0023] 需要說明的是，鎖式探針的基本結(jié)構(gòu)是，從5'到3'端依序為:T1檢測臂區(qū)、通用引 物結(jié)合區(qū)、Zip區(qū)和Τ2檢測臂區(qū)；其中Τ1檢測臂區(qū)和Τ2檢測臂區(qū)是用于跟靶標(biāo)序列特異性結(jié) 合的區(qū)域，每條鎖式探針的檢測臂區(qū)是不同的，特別是最末幾個堿基是不同的，以此保障檢 測的特異性;每條鎖式探針的通用引物結(jié)合區(qū)序列是一樣的，以方便所有鎖式探針在連接 成環(huán)后，采用一對引物完成所有環(huán)狀鎖式探針的擴增;而Zip區(qū)是每條鎖式探針的特異識別 區(qū)，類似于條形碼的作用，Zip區(qū)通常是一段約20bp的隨機序列，每條鎖式探針的Zip區(qū)都不 同。在鎖式探針中Zip區(qū)的作用就是識別鎖式探針，因此，可以用于進行基因芯片雜交，以判 別鎖式探針是否有擴增等。而本申請中，則是將滾環(huán)擴增與液相芯片結(jié)合，所以，在液相芯 片的微球上偶聯(lián)Zip區(qū)序列；如果鎖式探針有連接成環(huán)，并且有進行擴增，則其擴增產(chǎn)物就 可以與偶聯(lián)微球結(jié)合，從而被液相芯片系統(tǒng)檢測出來。
[0024] 本申請的再一面公開了一種密執(zhí)安棒狀桿菌多重檢測試劑盒，該試劑盒中含有本 申請的密執(zhí)安棒狀桿菌多重檢測試劑。
[0025] 需要說明的是，本申請的試劑，即五條鎖式探針，可以單獨制成產(chǎn)品，以方便密執(zhí) 安棒狀桿菌多重檢測使用。
[0026] 優(yōu)選的，試劑盒中還含有五條鎖式探針的通用引物，通用引物包括第一引物，第一 引物為Seq ID No. 11所示序列。
[0027] 更優(yōu)選的，通用引物還包括第二引物，第二引物為Seq ID No. 12所示序列。
[0028] 需要說明的是，本申請的試劑，實際上就是密執(zhí)安棒狀桿菌五個亞種的五條特異 性的鎖式探針，因此，在將其制成試劑盒的時候，為了方便滾環(huán)擴增使用，還可以在其中配 置通用引物。可以理解，對于滾環(huán)擴增而言，通用引物可以是一條引物，也可以采用兩條引 物，都可以進行滾環(huán)擴增；當(dāng)然，優(yōu)選的，采用兩條引物進行滾環(huán)擴增能夠獲得更好的擴增 效果。
[0029] 優(yōu)選的，試劑盒中還含有五條鎖式探針的五條捕獲探針，五條捕獲探針分別為Seq ID No.6所示序列或其反向互補序列、Seq ID No.7所示序列或其反向互補序列、Seq ID No.8所示序列或其反向互補序列、Seq ID No.9所示序列或其反向互補序列、Seq ID No. 10 所示序列或其反向互補序列。
[0030]需要說明的是，在考慮到采用基因芯片或者斑點雜交判斷滾環(huán)擴增產(chǎn)物的情況， 本申請的試劑盒還可以選擇性的配備五條捕獲探針，這五條捕獲探針，實際上就是針對鎖 式探針的Zip區(qū)而設(shè)計的；可以直接是Zip區(qū)序列，也可以是其反向互補序列；當(dāng)然，最好采 用Zip區(qū)序列，這樣可以避免鎖式探針本底顯色。如果使用Zip區(qū)的反向互補序列，則即便鎖 式探針沒有連接成環(huán)、沒有被擴增，同樣可以與捕獲探針雜交，也就是說直接的鎖式探針也 可以與捕獲探針雜交，從而顯色，即本底顯色?？梢岳斫?，如果配備捕獲探針，或者采用基因 芯片或斑點雜交對滾環(huán)擴增產(chǎn)物進行判斷，則需要對第一引物進行生物素標(biāo)記。
[0031] 優(yōu)選的，試劑盒中還含有用于液相芯片檢測的，五條鎖式探針的五種偶聯(lián)微球，五 種偶聯(lián)微球分別為偶聯(lián)有Clavibacter michiganensis subsp.nebraskensis特異性鎖式 探針Zip序列的液相芯片微球、偶聯(lián)有Clavibactermichiganensissubsp.michiganensis 特異性鎖式探針Zip序列的液相芯片微球、偶聯(lián)有Clavibacter michiganensis subsp. insidiosus特異性鎖式探針Zip序列的液相芯片微球、偶聯(lián)有Clavibacter michiganensis subsp · sepedonicus特異性鎖式探針Zip序列的液相芯片微球、偶聯(lián)有 Clavibacter michiganensis subsp·tesseliarius特異性鎖式探針Zip序列的液相芯片微 球。
[0032] 需要說明的是，考慮到滾環(huán)擴增與液相芯片結(jié)合，為了方便使用，本申請的試劑盒 中直接提供了偶聯(lián)有鎖式探針Zip序列的液相芯片微球，滾環(huán)擴增完成后，直接采用本申請 試劑盒提供的偶聯(lián)微球進行雜交，然后采用液相芯片系統(tǒng)進行分析，即可獲得結(jié)果，使用簡 單方便。
[0033]本申請的有益效果在于：
[0034]本申請的密執(zhí)安棒狀桿菌多重檢測試劑，含有五個亞種的特異性鎖式探針，能夠 同時對五個近似種進行特異性檢測；提高了檢測效率和檢測質(zhì)量。本申請的試劑以及基于 該試劑的試劑盒，為密執(zhí)安棒狀桿菌的高通量檢測提供了一種簡單有效的途徑，特別適合 于檢驗檢疫等部門使用，為保障生物安全，避免密執(zhí)安棒狀桿菌傳播提供了有力的科學(xué)依 據(jù)。
【附圖說明】
[0035]圖1是本申請實施例中CMN的捕獲探針與微球偶聯(lián)的測試結(jié)果圖；
[0036]圖2是本申請實施例中CMM的捕獲探針與微球偶聯(lián)的測試結(jié)果圖；
[0037]圖3是本申請實施例中CMI的捕獲探針與微球偶聯(lián)的測試結(jié)果圖；
[0038]圖4是本申請實施例中CMS的捕獲探針與微球偶聯(lián)的測試結(jié)果圖；
[0039]圖5是本申請實施例中CMT的捕獲探針與微球偶聯(lián)的測試結(jié)果圖；
[0040] 圖6是本申請實施例中五重滾環(huán)擴增液相芯片檢測體系雜交溫度優(yōu)化結(jié)果；
[0041] 圖7是本申請實施例中五重滾環(huán)擴增液相芯片檢測體系雜交時間優(yōu)化結(jié)果；
[0042] 圖8是本申請實施例中五重滾環(huán)擴增液相芯片檢測體系中，雜交時，滾環(huán)擴增產(chǎn)物 用量優(yōu)化結(jié)果；
[0043] 圖9是本申請實施例中五重滾環(huán)擴增液相芯片檢測體系特異性檢測結(jié)果。
【具體實施方式】
[0044] 下面通過具體實施例對本申請作進一步詳細說明。以下實施例僅對本申請進行進 一步說明，不應(yīng)理解為對本申請的限制。
[0045] 實施例
[0046]本例的密執(zhí)安棒狀桿菌多重檢測試劑由密執(zhí)安棒狀桿菌的五個亞種： Clavibacter michiganensis subsp·nebraskensis、Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis、Clavibacter michiganensis subsp. insidiosus >Clavibacter michiganensis subsp·sepedonicus、Clavibacter michiganensis subsp·tessellarius 的五條鎖式探針組成。本例采用滾環(huán)擴增結(jié)合液相芯片對五條鎖式探針進行特異性試驗， 五條鎖式探針的設(shè)計以及相關(guān)試驗詳細如下：
[0047] 一、供試材料及主要溶液
[0048] 1.供試菌株
[0049] 本例采用了兩株CMI菌株、三株CMM菌株、三株CMN菌株、兩株CMS菌株和兩株CMT菌 株進行試驗，同時，采用了七個其它近似種屬的菌株作為陰性對照進行試驗。菌株詳細情況 如表1所示。
[0050] 表1供試菌株及其來源
[0051]
[0052] 表1中，菌株編號是本例對菌株的編號，該編號由六個數(shù)字組成，是沿用深圳出入 境檢驗檢疫局植物檢驗檢疫實驗室植物病原細菌保存庫菌株編號;原始編號是指菌株來源 的原始編號。來源中，1 為ATCC,American Type Culture Collection Center;2為ICMP, International Collection of Microorganisms from Plants;3為NCPPB,National Collection of Plant Pathogenic Bacteria;4為ICPB, International Collection of Phytopathogenic Bacteria;5為LMG,Belgian C〇-〇rdianted Collections of Micro-organisms; 6為中國農(nóng)業(yè)大學(xué)種子健康檢測中心;7為中國檢驗檢疫科學(xué)研究院。
[0053] 2.菌株培養(yǎng)
[0054]首先用無菌接種環(huán)挑取所用供試菌株在營養(yǎng)培養(yǎng)基(NA)28°C活化48h后備用；然 后用無菌水配制成濃度約1 X 108CFU/mL的細胞菌懸液。菌懸液濃度測定方法為，用紫外光 柵分光光度計在波長為600nm測量配制的細菌懸浮液樣品光密度值約為0.1，然后以10倍梯 度稀釋，再分別取l〇〇yL稀釋為10 5、106和107倍的細菌懸浮液涂于NA培養(yǎng)基，各梯度4次重 復(fù)，置28 °C培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)48-72h后進行平板單菌落計數(shù)，并計算原配細菌懸浮液濃度。 [0055] 3.DNA提取和濃度測量
[0056]供試菌株DNA的提取參照Axygen的DNA試劑盒說明書進行。即用1.5mL離心管收集 lmL過夜培養(yǎng)的細胞懸浮液，lOOOOg離心2min后棄上清液;加入350yL去離子水懸浮細胞，振 蕩混勻；加入〇.8yL RNaseA，漩渦震蕩15s，室溫靜置lmin;加入150yL Buffer C-L和8yL proteinase K立即漩禍震蕩lmin，短暫離心后，置56°C水浴30min以上；加入350yL Buffer P-D，漩渦震蕩30s混勻。12000g離心10min;將DNA制備管至于2mL離心管中，將離心后的上清 液移至制備管，12000g離心lmin;棄濾液加500yL Buffer Wl，12000g離心lmin;棄濾液加 700yL Buffer W2，12000g離心lmin，重復(fù)1次;棄濾液后再離心lmin;將離心后的制備管另 置于潔凈的1.5mL離心管中，加入120yL Eluent或無菌水，靜置lmin后離心lmin,最后_20°C 保存。最后取lyL按照Nanodrop 2000c核酸蛋白分析儀操作測定DNA濃度。
[0057] 4.主要溶液
[0058] 1)0.1M MES偶聯(lián)緩沖液pH4.5:稱取4.88g MES，用200mL去離子水充分溶解，然后 定容至250mL，pH調(diào)整至4.5,0.22μπι過濾除菌，4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0059] 2)0.02%Tween 20,即清洗緩沖液I:量取50yL購買的Tween 20,加入200mL去離子 水，混勻，然后定容至250mL，0.22μπι過濾除菌，室溫保存?zhèn)溆谩?br>[0060] 3)0.1%SDS，即清洗緩沖液Π :量取2.5mL 10%SDS，加入200mL去離子水，混勻，然 后定容至250mL，0.22μπι過濾除菌，室溫保存?zhèn)溆谩?br>[0061 ] 4)1.5\了]\^(：雜交緩沖液，即微球稀釋液：量取45〇11^51的了]\^(：、3.7611^20%的 Sarkosyl、37 · 5mL 1Μ的Tris-HCl (ρΗ8 · 0)、6mL 0 · 5Μ的EDTA(pH8 · 0)、2 · 74mL去離子水；混 勻，獲得500mL雜交緩沖液，室溫保存?zhèn)溆谩?br>[0062] 5)1 ΧΤΕ ρΗ8·0,即樣品稀釋液：量取2.5mL的100XTE ρΗ8·0,加入去離子水 200mL，混勻，最終定容至250mL，0.22μπι過濾除菌，室溫保存?zhèn)溆谩?br>[0063] 6)20%Sarkosyl:稱取50g Sarkosyl，用200mL去離子水充分溶解，然后定容至 250mL，0.22μηι過濾除菌，室溫保存?zhèn)溆谩?br>[0064] 7) 1 X TMAC雜交緩沖液，即雜交液:量取167mL 1.5 X TMAC雜交緩沖液，加入去離子 水83mL，混勻，即獲得1 X TMAC雜交緩沖液，室溫保存?zhèn)溆谩?br>[0065]二、鎖式探針及通用引物的設(shè)計合成
[0066]通過下載并整理NCBI數(shù)據(jù)庫公布的靶標(biāo)細菌及其近似種核酸序列，采用BioEdit 對其ITS區(qū)、16S rRNA gene等保守區(qū)域進行比對分析，尋找堿基差異大的保守序列，并找出 不同于近似種的靶標(biāo)特異位點，或采用常規(guī)PCR和實時熒光PCR檢測方法中使用的特異性檢 測位點，按照鎖式探針設(shè)計原則，采用Primer Premier 5.0分析鎖式探針T1檢測臂區(qū)和T2 檢測臂區(qū)的!'111值，并采用1^^81：1'11〇1：1'116 5.4分析鎖式探針的二級結(jié)構(gòu)，設(shè)計本例的鎖式探 針。
[0067]鎖式探針中間的連接序列是一段與檢測靶序列無關(guān)的序列，主要包括通用引物結(jié) 合區(qū)，約40bp左右，以及用于滾環(huán)擴增產(chǎn)物與液相芯片雜交檢測的Zip區(qū)，約20bp。本例建立 了一套Zipcode核酸序列數(shù)據(jù)庫以供外來危險性植物細菌的鎖式探針設(shè)計選用。本研究設(shè) 計的鎖式探針長度在96&口-103&口之間，鎖式探針的發(fā)夾結(jié)構(gòu)采用1^^31：1'11〇1：1'116 5.4進行 預(yù)測，確保發(fā)夾結(jié)構(gòu)能值最小。在合成鎖式探針時，其5 '端需要進行磷酸化修飾，所有鎖式 探針和引物均由大連寶生物工程有限公司(TAKARA)合成，本例設(shè)計的鎖式探針及通用引物 如表2所示。
[0068] 表2鎖式探針和通用引物
[0070] 表2中，CMN-PLP為Clavibacter michiganensis subsp.nebraskensis特異性鎖式 探針、0\1]\1-?1^為〇1&￥；^&(^61'111；[(311丨8&116118丨8 81^8口.111；[(311丨8&116118丨8特異性鎖式探針、 CMI-PLP為Clavibacter michiganensis subsp· insidiosus特異性鎖式探針、CMS-PLP為 Clavibacter michiganensis subsp.sepedonicus特異性鎖式探針、CMT-PLP為 Clavibacter michiganensis subsp· tesseliarius特異性鎖式探針。5' 端的 "P04"為磷酸 化修飾。鎖式探針虛線部分為T1檢測臂區(qū)和T2檢測臂區(qū)，實線部分為通用引物結(jié)合區(qū)，黑體 部分即實線和虛線之間的部分為Zip區(qū)。
[0071] 在鎖式探針測試階段，即采用凝膠電泳驗證滾環(huán)擴增結(jié)果的階段，所采用的第一 引物的5'端沒有生物素標(biāo)記;在采用液相芯片對滾環(huán)擴增產(chǎn)物進行分析時，所使用的第一 引物的5'端具有"Biotin"生物素標(biāo)記。
[0072]三、液相芯片檢測探針的設(shè)計合成
[0073]基于滾環(huán)擴增的液相芯片檢測，需要合成兩種探針：1)捕獲探針（Capture Probe)，即一段帶有5'氨基修飾的-C12-手臂的寡核苷酸，這段序列與鎖式探針Zip區(qū)的堿 基序列相同，與羧基微球偶聯(lián)，并用于檢測滾環(huán)擴增產(chǎn)物；2)驗證探針（Validation Oligo)，即一段帶有5'生物素(Biotin)標(biāo)記片段，該序列與捕獲探針反向互補，用于捕獲探 針與微球偶聯(lián)的效率驗證。所有探針均由大連寶生物工程有限公司（TAKARA)合成，捕獲探 針和驗證探針如表3所示。本例的捕獲探針與微球偶聯(lián)后即獲得偶聯(lián)微球。
[0074] 表3捕獲探針和驗證探針

[0076] 表3中，CMN-CP為Clavibacter michiganensis subsp.nebraskensis的捕獲探針、 CMM-CP為Clavibacter michiganensis subsp .111；!_。1118&11611818的捕獲探針、0\11-〇?為 Clavibacter michiganensis subsp · insidiosus的捕獲探針、CMS-CP為Clavibacter michiganensis subsp · sepedonicus的捕獲探針、CMT-CP為Clavibacter michiganensis subsp · tessellarius 的捕獲探針。CMN-V0 為 Clavibacter michiganensis subsp.nebraskensis 的驗證探針、CM M-VO為 Clavibact er michiganensis subsp.michiganensis 的驗證探針、CMI-VO 為 Clavibacter michiganensis subsp. insidiosus 的驗證探針、CMS-VO 為 Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus 的驗證探針、CMT-VO 為 Clavibacter michiganensis subsp.tessellarius的驗證探針。其中，"Amin〇-Ci2"表示捕獲探針的5'端連接有氨基修飾 的12個碳的手臂，"Biotin"表示驗證探針的5'端有生物素標(biāo)記。
[0077] 四、液相芯片偶聯(lián)微球的制備和質(zhì)控
[0078] 1.捕獲探針與微球偶聯(lián)
[0079] 為后續(xù)多重液相懸浮芯片檢測，需將本研究中靶標(biāo)菌對應(yīng)的捕獲探針與不同編號 的微球偶聯(lián)備用。本例捕獲探針與偶聯(lián)微球的編號分別為:CMN-CP偶聯(lián)52利^球、CMM-CP偶 聯(lián)45#微球、CMI-CP偶聯(lián)33#微球、CMS-CP偶聯(lián)51#微球、CMT-CP偶聯(lián)35#微球。
[0080] 整個偶聯(lián)過程需要完全避光，具體步驟包括：
[0081 ] 1)取2份新鮮的EDC粉末，使之恢復(fù)至室溫；
[0082] 2)蝸旋儀上以最高轉(zhuǎn)速懸浮微球30s混勾，然后在超聲清洗儀上超聲微球30s防止 微球貼壁；
[0083] 3)取100yL微球到EP離心管中，最高轉(zhuǎn)速離心2min;
[0084] 4)棄上清，取50yL，pH4.5，0.1M的MES重懸微球，徹底蝸旋30s，超聲20s，使微球分 散；
[0085] 5)加入2yL稀釋好的0. lnmol/yL的捕獲探針于重懸微球中，渦旋震蕩20s;
[0086] 6)制備新鮮的10mg/mL的EDC溶液，加入2.5yL EDC至微球中，徹底混勻，室溫黑暗 條件下600rpm震蕩孵育30min;
[0087] 7)再次制備新鮮的10mg/mL的EDC溶液，加入2.5yL EDC至微球中，徹底混勻，室溫 黑暗條件下600rpm震蕩孵育30min;
[0088] 8)加入lmL 0.02%Tween 20,稍微蝸旋混勻，以最高轉(zhuǎn)速離心2min，棄上清液；
[0089] 9)用lmL 0.1%SDS重懸沉淀40s，最高轉(zhuǎn)速離心2min，棄上清液；
[0090] 10)用100yL，pH 8.0, IX TE buffer重懸沉淀，蝸旋儀上最高轉(zhuǎn)速蝸旋30s，超聲 20s，4°C黑暗條件下儲存。
[0091] 2.微球計數(shù)
[0092]通過血球計數(shù)器來計算偶聯(lián)后微球的數(shù)量，從而估算微球濃度。
[0093] 具體步驟如下：
[0094] 1)微球準(zhǔn)備:將偶聯(lián)好的微球在渦旋儀上重懸40s，用雙蒸水按照1:100的比例稀 釋微球并徹底混勻；
[0095] 2)血球計數(shù)器準(zhǔn)備：使用70%乙醇將蓋玻片和血球計數(shù)器清潔干凈，然后將蓋玻 片潤濕并覆蓋至血球計數(shù)器上；
[0096] 3)加樣：取10yL稀釋后的微球轉(zhuǎn)移到血球計數(shù)器中并放置幾分鐘使微球完全擴 散，同時用吸水紙吸掉多余的液體；
[0097] 4)計數(shù):在100倍顯微鏡下，移動計數(shù)器將視野對準(zhǔn)計數(shù)器的中央大方塊，記錄計 數(shù)池四個角以及中央方塊內(nèi)的微球數(shù)(每個方塊細胞數(shù)應(yīng)不大于20-50)。
[0098] 5)計算:血球計數(shù)器每個大方塊可以容納的體積為1mm2 X 0. lmm=0.1mm3 = 1 (T4cm3 =l(T4mL，因此，每毫升溶液中微球的個數(shù)=每個方塊內(nèi)微球平均數(shù)X細胞稀釋比例X 104;
[0099] 6)微球濃度(個) = (5個方格里微球數(shù)量之和)/5 X 10 X 100。
[0100] 本例中CMN-CP偶聯(lián)52#微球濃度是12500個AxL，CMM-CP偶聯(lián)45#微球11500個AxL， CMI-CP偶聯(lián)33#微球濃度是18750個/VL，CMS-CP偶聯(lián)51#微球濃度是12250個AxL，CMT-CP偶 聯(lián)35#微球濃度是16500個ΛΛ。
[0101] 3.捕獲探針偶聯(lián)效率驗證
[0102] 制備偶聯(lián)微球工作混合物：
[0103] 制備新鮮偶聯(lián)好的微球工作液，以便進行偶聯(lián)效率驗證或后續(xù)雜交檢測，具體步 驟如下：
[0104] 1)微球準(zhǔn)備:將偶聯(lián)微球超聲15-20s，充分渦旋振蕩混勻待用；
[0105] 2)體系準(zhǔn)備:每管反應(yīng)中工作混合物體系為33yL，每種微球至少5000個，其中包含 22yL的1.5 X TMAC雜交緩沖液，CMN-CP偶聯(lián)52#微球體積為0.4yL，CMM-CP偶聯(lián)45#微球體積 為0.4yL，CMI-CP偶聯(lián)33#微球體積為0.3yL，CMS-CP偶聯(lián)51#微球體積為0.4yL，CMT-CP偶聯(lián) 35#微球體積為0.3yL;最后加入無菌水9.2yL，置于冰上備用；
[0106] 制備驗證探針工作液：
[0107] 制備新鮮稀釋的驗證探針工作液，確保每個探針濃度為lOfmol/yL。
[0108] 1)本例的起始驗證探針工作原液濃度為O.Olnmol/yL，即lOpmol/yL;
[0109] 2)五個驗證探針的工作原液各取4yL，加入80yL pH8.0的TE，獲得100yL的驗證探 針混合原液，其中，各個驗證探針的濃度為〇.4pmolAiL，即400fmolAiL;
[0110] 3)取10yL驗證探針混合原液，加入到390yL pH8.0的TE中，徹底渦旋混勻，則獲得 400yL驗證探針工作液，其中每個探針的終濃度為1 Ofmo Ι/yL，放置冰上備用。
[0111] 偶聯(lián)效率驗證
[0112]為確保捕獲探針和微球偶聯(lián)的效果，需進行偶聯(lián)效率驗證，具體步驟如下：
[0113] 1)向每個PCR管中加入新鮮配置的偶聯(lián)微球工作混合物33yL;
[0114] 2)向各個PCR管中加入不同濃度的驗證探針，形成不同濃度梯度的驗證探針體系， 每個濃度重復(fù)3次，各濃度設(shè)置如下：
[0115] A.直接分別向三個PCR管中加入17yL TE，每個PCR管的總反應(yīng)體積為50yL，驗證探 針的濃度為〇;
[0116] B.分別向三個PCR管中加入0.5yL驗證探針工作液和16.5yL TE，每個PCR管的總反 應(yīng)體積為50yL，每個反應(yīng)中，五個驗證探針的量分別為5fmol;
[0117] C.分別向三個PCR管中加入lyL驗證探針工作液和16yL TE，每個PCR管的總反應(yīng)體 積為50yL，每個反應(yīng)中，五個驗證探針的量分別為lOfmol;
[0118] D.分別向三個PCR管中加入2yL驗證探針工作液和15yL TE，每個PCR管的總反應(yīng)體 積為50yL，每個反應(yīng)中，五個驗證探針的量分別為20fmol
[0119] E.分別向三個PCR管中加入5yL驗證探針工作液和12yL TE，每個PCR管的總反應(yīng)體 積為50yL，每個反應(yīng)中，五個驗證探針的量分別為50fmol
[0120] F.分別向三個PCR管中加入10yL驗證探針工作液和7yL TE，每個PCR管的總反應(yīng)體 積為50yL，每個反應(yīng)中，五個驗證探針的量分別為1 OOfmo 1
[0121] G.分別向三個PCR管中加入20yL驗證探針工作液，每個PCR管的總反應(yīng)體積為53μ L，每個反應(yīng)中，五個驗證探針的量分別為200fmol
[0122] 3)每個PCR管充分混勻后，置于PCR儀進行雜交反應(yīng)，反應(yīng)條件為95°C，5min; 50°C， 15min，然后 52°C 雜交 30min;
[0123] 4)制備新鮮的4yg/mL的SA-PE，用1 X TMAC緩沖液稀釋；
[0124] 5)雜交反應(yīng)完成后，向每個PCR管中加入100yL SA-PE報告液，充分混勻，室溫黑暗 條件下600rpm震蕩孕育lOmin;
[0125] 6)取125yL PCR管的反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至96孔板中，根據(jù)Bioplex使用說明書分析熒光 值，判定探針與微球的偶聯(lián)效率。
[0126] 按照終量為 Ofmol、5fmol、lOfmol、20fmol、50fmol、lOOfmol、200fmol進行系列梯 度稀釋后與偶聯(lián)微球的捕獲探針雜交檢測。結(jié)果如圖1-圖5所示，結(jié)果表明，5個偶聯(lián)的捕獲 探針與驗證探針雜交后均具有較高的雜交信號，其熒光中位值MFI隨著對應(yīng)驗證探針用量 增加而逐漸上升，說明微球與捕獲探針偶聯(lián)成功。
[0127] 五、密執(zhí)安棒狀桿菌五重滾環(huán)擴增液相芯片檢測體系
[0128] 1.五重滾環(huán)擴增體系
[0129] 將01^、01^、011、01^、011'五個亞種的鎖式探針配置成，各自終濃度均為200?111〇1/1 的混合鎖式探針。
[0130] 五重滾環(huán)擴增體系中，連接反應(yīng)體系的總體積為20yL，包括：10XTaq DNA ligase 緩沖液2yL，40U/yL Taq DNAligase 0.5yL，各鎖式探針濃度200pm〇VL的混合鎖式探針1μ L，每種模板2yL，無菌ddH2〇 6.5yL。
[0131] 連接反應(yīng)采用熱循環(huán)連接法，反應(yīng)條件為：94°C4min ;然后進入20個循環(huán)：94°C 30s，65°C5min;循環(huán)結(jié)束后95°C15min滅活Taq DNA ligase，然后置于冰上。
[0132] 取10yL連接產(chǎn)物加入10yL消化反應(yīng)混合液：（lOXExonuclease I緩沖液2yL，20U/ yL的Exonuclease I 0 · f5yL; 10 XExonucleaseHI緩沖液2yL; 100U/yL的ExonucleaseHIO · 〇5 yL;無菌dd H20補足10yL)，37°C反應(yīng)2.5h，徹底消化未環(huán)化的線性探針和未反應(yīng)的DNA模 板，最后95°C反應(yīng)20min，滅活剩余的核酸外切酶，冰上操作。
[0133] 將連接消化后的產(chǎn)物作為模板，用PF/PR擴增引物進行滾環(huán)擴增，反應(yīng)體系為25μ L: 10 XBst DNA polymerase緩沖液2.5yL，8U/yL Bst DNA polymerase?！?yL，10ymol/L PF 0.5yL，10ymol/L PR 0.5yL，10mmol/L dNTPs lyL，消化產(chǎn)物2yL，無菌dd H20補足25yL，冰 上操作。反應(yīng)條件:62.5°C反應(yīng)lh。其中滾環(huán)擴增下游引物采用帶生物素修飾的PR2。
[0134] 2.五重滾環(huán)擴增液相芯片檢測體系
[0135] 將五種偶聯(lián)微球:CMN-CP偶聯(lián)52#微球、CMM-CP偶聯(lián)45#微球、CMI-CP偶聯(lián)33#微球、 CMS-CP偶聯(lián)5W微球、CMT-CP偶聯(lián)35利^球，混勻，制成偶聯(lián)微球工作液。
[0136] 將帶生物素標(biāo)記的01^、0麗、011、013、011'的五重滾環(huán)擴增產(chǎn)物與混合的偶聯(lián)微球 工作液雜交。雜交體系為:滾環(huán)擴增產(chǎn)物2_10yL、偶聯(lián)微球工作液33yL、TE Buffer補足50μ L。其中滾環(huán)擴增產(chǎn)物的具體用量按照本例的優(yōu)化方案添加。
[0137] 雜交反應(yīng)條件為:95°C，5min; 50°C，15min，雜交溫度和時間按照本例的優(yōu)化方案 進行。
[0138] 雜交的過程中，制備新鮮的4yg/mL的SA-PE，用1XTMAC緩沖液稀釋。雜交完成后， 向每個PCR管中加入10 OyL SA-TO報告液，充分混勻，室溫黑暗條件下6 0 Or pm震蕩孕育 l〇min;震蕩孕育完成后，從PCR反應(yīng)液中取125yL樣品在Bio-plex液相芯片上機進行檢測分 析，根據(jù)中位熒光強度值(MFI)來進行結(jié)果判定。
[0139] 本例為了獲得五重滾環(huán)擴增液相芯片檢測體系，首先對雜交溫度進行了優(yōu)化，然 后對雜交時間、滾環(huán)擴增產(chǎn)物用量進行了優(yōu)化。
[0140] 具體的，雜交溫度優(yōu)化設(shè)定了46°C、48 °C、50 °C、52 °C、54°C、56°C等6個雜交溫度梯 度進行優(yōu)化，以溫度為變量，其他條件完全相同情況下，每個梯度設(shè)置3個重復(fù)，確定最佳雜 交溫度;其他條件包括雜交時間設(shè)定為20min，滾環(huán)擴增產(chǎn)物的用量為8yL。雜交時間優(yōu)化設(shè) 定了 lOmin、15min、20min、25min、30min、40min等6個時間梯度，以時間為變量，其他條件完 全相同情況下，每個梯度設(shè)置3個重復(fù)考察不同時間下雜交效果，確定最佳雜交時間；其它 條件包括雜交溫度根據(jù)優(yōu)化的結(jié)果設(shè)定為52°C，滾環(huán)擴增產(chǎn)物的用量為8yL。滾環(huán)擴增產(chǎn)物 用量的優(yōu)化設(shè)定了 2yL、4yL、6yL、8yL、1 OyL、17yL等6個體積梯度為優(yōu)化對象，其他條件完全 相同，每個梯度設(shè)置3個重復(fù);其它條件包括雜交溫度和雜交時間，根據(jù)優(yōu)化結(jié)果，設(shè)定雜交 溫度為52°C，雜交時間為30min。
[0141] 3.捕獲探針特異性驗證
[0142] 將五條驗證探針分別與混合的偶聯(lián)微球工作液雜交反應(yīng)，驗證探針的用量為 100加〇1。驗證探針工作原液濃度為10?1]1〇1/^1^，將五條驗證探針分別稀釋200倍，獲得 50fmol/yL的驗證探針工作液。
[0143] 雜交反應(yīng)體系為:混合的偶聯(lián)微球工作液33yL、50fmolAiL的驗證探針工作液2yL、 TE Buffer 15yL。另外，設(shè)置一個空白對照，即以2yL去離子水空白對照替換2yL的50fmolAi L驗證探針工作液。
[0144] 雜交反應(yīng)條件根據(jù)優(yōu)化的五重滾環(huán)擴增液相芯片檢測體系的反應(yīng)條件進行，具體 的，95°(：，511^11;50°(：，1511^11，然后52°(：雜交3〇11^11。
[0145] 雜交完成后，向每個PCR管中加入100yL SA-PE報告液，充分混勻，室溫黑暗條件下 600rpm震蕩孕育10min;震蕩孕育完成后，從PCR反應(yīng)液中取125yL樣品在Bio-plex液相芯片 上機進行檢測分析，觀察五種捕獲探針是否有交叉反應(yīng)，以評估捕獲探針的特異性。
[0146] 4.單重滾環(huán)擴增產(chǎn)物的五重液相芯片檢測
[0147] 將五條鎖式探針分別與其陽性樣品進行滾環(huán)擴增，引物采用帶生物素標(biāo)記的引 物。設(shè)置一個去離子水空白對照，即以等體積的去離子水替換陽性樣品，其它組分相同，進 行滾環(huán)擴增。
[0148] 單重滾環(huán)擴增體系中，連接反應(yīng)體系的總體積為20yL，包括：10XTaq DNA ligase 緩沖液2yL，40U/yL Taq DNAligase 0.5yL，200pmol/L的鎖式探針lyL，模板2yL，無菌ddH20 14.5yL〇
[0149] 滾環(huán)擴增的消化反應(yīng)，以及后續(xù)的滾環(huán)擴增與"1.五重滾環(huán)擴增體系"相同，在此 不累述。
[0150] 滾環(huán)擴增完成后，將五個滾環(huán)擴增產(chǎn)物分別與混合的偶聯(lián)微球工作液雜交反應(yīng)。 本例采用的五個陽性樣品分別為菌株編號470324的CMN菌株的DNA、菌株編號470316的CMM 菌株的DNA、菌株編號470343的CMI菌株的DNA、菌株編號470330的CMS菌株的DNA、菌株編號 470326 的 CMT 菌株的 DNA。
[0151] 雜交反應(yīng)體系為:滾環(huán)擴增產(chǎn)物2yL、偶聯(lián)微球工作液33yL、TE Bufferl5yL。
[0152] 雜交反應(yīng)條件為:95°(：，511^11;50°(：，151^11，然后52°(：雜交3〇1^11。
[0153] 雜交完成后，向每個PCR管中加入100yL SA-PE報告液，充分混勻，室溫黑暗條件下 600rpm震蕩孕育lOmin;震蕩孕育完成后，從PCR反應(yīng)液中取125yL樣品在Bio-plex液相芯片 上機進行檢測分析，觀察實際擴增產(chǎn)物能否與捕獲探針雜交產(chǎn)生熒光中位值，各產(chǎn)物與偶 聯(lián)微球之間是否出現(xiàn)交叉反應(yīng)。
[0154] 5.密執(zhí)安棒狀桿菌五重滾環(huán)擴增液相芯片檢測體系特異性
[0155] 選取菌株 CMI(470343、470344)、CMT(470326、470327)、CMS(470330、470333)、CMM (470308、470313、470316)、01^(470321、470324、470325)的0嫩作為單一或協(xié)同陽性模板， 其他菌株的DNA作為陰性模板，無菌雙蒸水作為空白對照，采用五條鎖式探針制備的混合鎖 式探針，進行五重滾環(huán)擴增。滾環(huán)擴增采用的引物為生物素標(biāo)記的引物。最后將滾環(huán)擴增產(chǎn) 物與混合的偶聯(lián)微球工作液雜交，評估該檢測體系的特異性。
[0156] 五重滾環(huán)擴增體系中，連接反應(yīng)體系的總體積為20yL，包括：10XTaq DNA ligase 緩沖液2yL，40U/yL Taq DNAligase 0.5yL，各鎖式探針濃度200pm〇VL的混合鎖式探針1μ L，模板 2yL，無菌 ddH2〇 14.5yL。
[0157] 后續(xù)的消化和滾環(huán)擴增與"1.五重滾環(huán)擴增體系"相同，在此不累述。
[0158] 雜交反應(yīng)體系為:滾環(huán)擴增產(chǎn)物2yL、偶聯(lián)微球工作液33yL、TE Bufferl5yL。
[0159] 雜交反應(yīng)條件為:95°(：，511^11;50°(：，151^11，然后52°(：雜交3〇1^11。
[0160] 雜交完成后，向每個PCR管中加入100yL SA-PE報告液，充分混勻，室溫黑暗條件下 600rpm震蕩孕育10min;震蕩孕育完成后，從PCR反應(yīng)液中取125yL樣品在Bio-plex液相芯片 上機進行檢測分析，觀察陽性模板是否能夠有效的檢測出五個密執(zhí)安棒狀桿菌亞種，而其 它陰性模板和空白對照是否符合預(yù)期。
[0161 ] 6.密執(zhí)安棒狀桿菌五重滾環(huán)擴增液相芯片檢測體系靈敏度
[0162] 為評估CMI、CMT、CMS、CMM、CMN五重液相懸浮芯片檢測靈敏度，分別選取CMI (470343)、CMT(470326)、CMS(470330)、CMM(470316)、CMN(470324)作為標(biāo)準(zhǔn)陽性菌株，提取 DNA，利用核酸蛋白分析儀測定其濃度和純度，并制成五重混合模板，按10倍梯度進行稀釋 至10-6倍。
[0163] 同時，將該五種菌株分別制成純菌懸液，利用紫外分光光度計，在波長600nm下調(diào) 節(jié)其光密度值為0.1，并利用無菌水稀釋至ΚΓ 8倍，然后分別取100yL的10-6，1〇_7，1〇_8倍梯度 稀釋的菌懸液涂于ΝΑ培養(yǎng)基，每個處理3次重復(fù)，置于30°C黑暗培養(yǎng)5天后記錄菌落數(shù)確定 實際的菌懸液濃度，單位cfu/mL。同時將五種菌株的分別制成的純菌懸液原液混合，制成混 合模板，并按10倍梯度進行稀釋至1〇_ 8倍，分別取l〇yL各稀釋梯度的混合DNA和混合菌懸液 進行五重滾環(huán)擴增，然后對滾環(huán)擴增產(chǎn)物進行液相芯片檢測，最終確定五重液相芯片檢測 靈敏度。
[0164] 五重滾環(huán)擴增體系中，連接反應(yīng)體系的總體積為20yL，包括：10XTaq DNA ligase 緩沖液2yL，40U/yL Taq DNAligase 0.5yL，各鎖式探針濃度200pm〇VL的混合鎖式探針1μ L，模板 2yL，無菌 ddH2〇 14.5yL。
[0165] 后續(xù)的消化和滾環(huán)擴增與"1.五重滾環(huán)擴增體系"相同，在此不累述。
[0166] 雜交反應(yīng)體系為:滾環(huán)擴增產(chǎn)物2yL、偶聯(lián)微球工作液33yL、TE Bufferl5yL。
[0167] 雜交反應(yīng)條件為:95°(：，511^11;50°(：，151^11，然后52°(：雜交3〇1^11。
[0168] 雜交完成后，向每個PCR管中加入100yL SA-PE報告液，充分混勻，室溫黑暗條件下 600rpm震蕩孕育lOmin;震蕩孕育完成后，從PCR反應(yīng)液中取125yL樣品在Bio-plex液相芯片 上機進行檢測分析。
[0169] 觀察DNA模板和菌懸液模板兩者分別可以檢測的濃度下限，從而判斷五重滾環(huán)擴 增液相芯片檢測體系的靈敏度。
[0170] 7.密執(zhí)安棒狀桿菌五重滾環(huán)擴增液相芯片檢測體系重復(fù)性
[0171] 以CMN、CMM、CMI、CMS、CMT五個亞種的混合DNA作為模板，采用五條鎖式探針制備的 混合鎖式探針，進行五重滾環(huán)擴增。滾環(huán)擴增采用的引物為生物素標(biāo)記的引物。最后將滾環(huán) 擴增產(chǎn)物與混合的偶聯(lián)微球工作液雜交，評估該檢測體系的特異性。在相同條件下做3次重 復(fù)性試驗，計算其變異系數(shù)(CV% )，以此驗證密執(zhí)安棒狀桿菌五重滾環(huán)擴增液相芯片檢測 體系的重復(fù)性。
[0172] 變異系數(shù)(CV% )=標(biāo)準(zhǔn)差/算數(shù)平均值X 100%
[0173] 六、結(jié)果及分析
[0174] 1.五重滾環(huán)擴增液相芯片檢測體系
[0175] 雜交溫度優(yōu)化:本例設(shè)置了46°C、48°C、50°C、52°C、54°C、56°C等6個雜交溫度梯度 進行優(yōu)化，結(jié)果表明：五重滾環(huán)擴增產(chǎn)物與混合的偶聯(lián)微球工作液的雜交溫度在46 °C_52°C 之間時，五種靶標(biāo)菌被檢測到的熒光中位值都逐漸上升;在52 °C -56 °C之間，五種靶標(biāo)菌被 檢測到的熒光中位值都逐漸減少，如圖6所示。綜合考慮，最終確定該五重檢測中雜交最佳 溫度為52°C。
[0176] 雜交時間優(yōu)化:本例設(shè)置了 1〇111；[11、15111；[11、20111；[11、25111；[11、30111；[11、40111；[11等6個時間梯 度。結(jié)果顯示，以最佳雜交溫度52°C進行雜交時，五重滾環(huán)擴增產(chǎn)物與混合的偶聯(lián)微球工作 液的雜交時間從l0min到30min時，其熒光中位值緩慢升高；當(dāng)雜交時間從30min到40min時， 五個靶標(biāo)菌的熒光中位值都減少;如圖7所示。可見30min是比較明顯的拐點，因此，確定最 佳雜交時間為30min。
[0177] 滾環(huán)擴增產(chǎn)物用量優(yōu)化:本例設(shè)定了 2以1^、4以1^、6以1^、8以1^、1(^1^、17以1^等6個體積梯 度。結(jié)果顯示，以最佳雜交溫度52 °C、最佳雜交時間30min進行雜交時，隨著加入體系中滾環(huán) 擴增產(chǎn)物體積的增加，五種靶標(biāo)菌的檢測熒光強度值相應(yīng)降低，如圖8所示，因此確定最佳 添加體積為2yL。
[0178] 最終確定五重滾環(huán)擴增液相芯片檢測體系的最佳雜交溫度為52°C、最佳雜交時間 為30min，雜交反應(yīng)中滾環(huán)擴增產(chǎn)物的用量為2yL。
[0179] 2.捕獲探針特異性驗證
[0180] 采用五條驗證探針分別與混合的偶聯(lián)微球工作液雜交反應(yīng)，判斷五種捕獲探針是 否有交叉反應(yīng)，以評估捕獲探針的特異性。其中驗證探針相當(dāng)于最理想的擴增產(chǎn)物，與捕獲 探針完全反向互補，倘若有交叉反應(yīng)，現(xiàn)實的擴增產(chǎn)物理論上也會出現(xiàn)交叉反應(yīng)，所以出現(xiàn) 交叉反應(yīng)將無法進行后續(xù)檢測。
[0181]本例的五條捕獲探針的特異性驗證結(jié)果如表3所示，結(jié)果顯示，本例的五條驗證探 針僅與其對應(yīng)的偶聯(lián)微球有雜交，而與其它微球無雜交，可見，本例的五條捕獲探針具有良 好的特異性。
[0182] 表4驗證探針對捕獲探針特異性驗證結(jié)果
[0183]
[0184] 表4中，結(jié)果判定"CMI/CMT/CMS/CMM/CMN"欄，"+"表示檢出為陽性，表示檢出為 陰性;例如表示"CMI"陽性，其余為陰性；表示"CMT"陽性，其余為 陰性；以此類推。
[0185] 3.單重滾環(huán)擴增產(chǎn)物的五重液相芯片檢測
[0186]本例將五條鎖式探針分別與其陽性樣品進行滾環(huán)擴增，五個滾環(huán)擴增產(chǎn)物分別與 混合的偶聯(lián)微球工作液雜交反應(yīng)。結(jié)果如表5所示，陽性樣品與預(yù)設(shè)的對應(yīng)的偶聯(lián)微球有雜 交信號，而與其它偶聯(lián)微球沒有雜交信號，例如CMN的陽性樣品滾環(huán)擴增產(chǎn)物，僅與52#微球 有雜交信號，其它偶聯(lián)微球沒有雜交信號。該檢測結(jié)果與捕獲探針特異性驗證結(jié)果相同。
[0187]表5單重滾環(huán)擴增產(chǎn)物的五重液相芯片檢測
[0188]
[0189] 表5中，結(jié)果判定"CMI/CMT/CMS/CMM/CMN"欄，"+"表示檢出為陽性，表示檢出為 陰性;例如表示"CMI"陽性，其余為陰性；表示"CMT"陽性，其余為 陰性；以此類推。
[0190] 4.五重滾環(huán)擴增液相芯片檢測體系特異性
[0191] 本例以CMN、CMM、CMI、CMS、CMT五個亞種的混合DNA作為陽性模板，其他17個菌株的 DNA作為陰性模板，無菌雙蒸水作為空白對照，進行五重滾環(huán)擴增，擴增完成后與混合的偶 聯(lián)微球工作液雜交。
[0192] 結(jié)果如表6和圖9所示，當(dāng)樣品1中包含CMI、CMT、CMS、CMM、CMN五種混合DNA時，五重 檢測體系可以同時檢測到33、35、51、45、52號微球的熒光中位值分別為360、528.5、587、 321、403，根據(jù)結(jié)果判定全部為陽性。當(dāng)樣品2中只含011、011\?1、(：麗四種混合0嫩時五重 檢測體系可以同時檢測到33、35、45、52號微球的熒光中位值分別為374.5、619.8、461.5、 682，而無靶標(biāo)對應(yīng)的51號微球僅顯示背景值，根據(jù)結(jié)果判定CMI、CMT、CMM、CMN樣品檢測均 呈陽性。同樣，當(dāng)樣品同時含有3種、2種或1種陽性靶標(biāo)DNA時，五重檢測體系均可同時檢測 出對應(yīng)微球顯示陽性信號，而當(dāng)僅存在其他非靶標(biāo)菌DNA時，五種微球菌未出現(xiàn)強熒光值， 表明該五重檢測體系可在同一反應(yīng)同時檢測出CMI、CMT、CMS、CMM、CMN協(xié)同混合模板，也可 以檢測出單一靶標(biāo)菌DNA模板，而其他對照菌株結(jié)果均為陰性。因此，該CMI、CMT、CMS、CMM、 CMN五重檢測方法具有較好的特異性。
[0193] 表6五重滾環(huán)擴增液相芯片檢測體系特異性檢測結(jié)果
[0194]
[0195] 表6 中，1表示CMI (470343)、CMT(470326)、CMS(470330)、CMM(470316)、CMN (470324)混合 DNA;2 表示〇11(470343)、〇11'(470326)、〇麗(470316)、〇1^(470324)混合0嫩；3 表示CMI(470343)、CMT(470326)、CMN(470324)混合DNA;4表示CMS(470330)、CMM(470316)混 合DNA; 5表示CMM(470316); 6表示CMM(470308); 7表示CMN(470324);8表示CMN(470325); 9表 示CMT(470326); 10表示CMT(470327); 11 表示CMI(470343); 12表示CMI(470344); 13表示CMS (470330); 14表示CMS(470333) ; 15表示AC(470106); 16表示CFF(470366) ; 17表示XCC (470703) ;18表示PSST(470522) ;19表示PSPI(470580) ;20表示PST0(470537) ;21 表示EA (470404); 22表示空白對照。結(jié)果判定"CMI/CMT/CMS/CMM/CMN"欄，"+"表示檢出為陽性， 表示檢出為陰性;例如表示"CMI"陽性，其余為陰性；表示"CMT"陽 性，其余為陰性；以此類推。
[0196] 5.五重滾環(huán)擴增液相芯片檢測體系靈敏度
[0197] 將菌株 CMI(470343)DNA 原始濃度為 14.8即/^1^、011'(470326)0嫩原始濃度為171^/ yL、CMS(470330)DNA 原始濃度為 57.9叫/^1^、01?(470316)0財原始濃度161^/^1^〇1? (470324)DNA原始濃度56.6ngAiL等體積混勻后按10倍梯度稀釋，取各梯度混合DNA作為模 板進行五重檢測，其結(jié)果見表7,可見011、011\01^、《1、01^五重液相懸浮芯片檢測體系能 檢測到CMT、CMM和CMN祀標(biāo)菌稀釋倍數(shù)為10- 4的DNA，以及CMI和CMS靶標(biāo)菌稀釋倍數(shù)為10_5的 DNA，其對應(yīng)的微球熒光強度仍大于空白熒光值的3倍，判定為陽性，即CMI、CMT、CMS、CMM、 CMN 靶標(biāo)菌 DNA 最低濃度值分別為 148f g/yL、1 · 7pg/yL、579f g/yL、1 · 6pg/yL、5 · 66pg/yL。當(dāng) 混合DNA稀釋倍數(shù)為1(T6時，該五種微球熒光值均顯陰性。表明該五重檢測體系能夠檢測到 靶標(biāo)菌DNA的閥值為148f g/yL。
[0198] 表7五重滾環(huán)擴增液相芯片檢測體系DNA檢測靈敏度
[0199]
[0200] 表7中10°表示原始濃度，10-1表示10倍稀釋，以此類推，Blank為水空白對照。
[0201 ]將菌株CMI(470343)、CMT(470326)、CMS(470330)、CMM(470316)和CMN(470324)混 合配制成l(T2-l(T8CFU/mL的不同梯度菌懸液，然后分別進行連接消化、滾環(huán)擴增以及后續(xù) 的五重液相懸浮芯片檢測，結(jié)果如表8所示，結(jié)果可見，當(dāng)混合菌懸液的濃度為l(T 4Cfu/mL 時，33#、35#、51#、45#和52#五個偶聯(lián)微球的熒光中位值分別為93、151.5、141.5、124、142， 均大于3倍空白對照的熒光值，即檢測結(jié)果為陽性;當(dāng)混合菌懸液的濃度為l(T 3CFU/mL時，僅 35#、45#和52#微球的熒光中位值分別為129.5、140和94，并大于3倍的空白對照樣品的熒光 值，即檢測結(jié)果都為陽性，而33#和51#微球的熒光中位值都不能大于3倍的空白對照樣品的 熒光值，即檢測結(jié)果都為陰性；當(dāng)混合菌懸液的濃度為l(T 2CFU/mL時，五者的熒光中位值都 不能大于3倍的空白對照樣品的熒光值，即檢測結(jié)果都為陰性，表明該五重檢測體系能夠檢 測到CMT、CMM和CMN的菌懸液濃度閾值為10_ 4CFU/mL，以及CMI和CMS的菌懸液濃度閾值為10 -3CFU/mL〇
[0202] 表8五重滾環(huán)擴增液相芯片檢測體系菌懸液檢測靈敏度
[0203]
[0204] 6.密執(zhí)安棒狀桿菌五重滾環(huán)擴增液相芯片檢測體系重復(fù)性
[0205] 通過提取 CMI(470343)、CMT(470326)、CMS(470330)、CMM(470316#PCMN(470324) 的DNA進行連接消化以及滾環(huán)擴增，然后通過五重液相懸浮芯片體系進行三次重復(fù)性檢測， 并通過計算各批次間檢測的平均熒光值的變異系數(shù)，以判斷檢測方法的重復(fù)性，結(jié)果如表9 所示。
[0206]表9密執(zhí)安棒狀桿菌五重滾環(huán)擴增液相芯片檢測體系重復(fù)性
[0208] 表9的結(jié)果顯示，檢測CMI的33#號微球、檢測CMT的35#號微球、檢測CMS的51#號微 球、檢測CMM的45#號微球和CMN的52#號微球的熒光中位值都在300以上，三次重復(fù)試驗的平 均熒光值變異系數(shù)分別為6.7%、3.7%、8.3%、9.0%和7.3%，以及空白對照的背景熒光值 變異系數(shù)也為2.8%，均在10%以內(nèi)，表明該方法具有良好的可重復(fù)性。
[0209]以上內(nèi)容是結(jié)合具體的實施方式對本申請所作的進一步詳細說明，不能認定本申 請的具體實施只局限于這些說明。對于本申請所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫 離本申請構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本申請的保護 范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種密執(zhí)安棒狀桿菌多重檢測試劑，其特征在于:所述多重檢測試劑中含有五條鎖 式探針，五條鎖式探針分別為Seq ID No. 1所示序列的Clavibacter michiganensis subsp.nebraskensis 特異性鎖式探針、Seq ID Νο·2所不;序列的 Clavibacter michiganensis sub sp .mi chi ganen s is特異性鎖式探針、Seq ID Νο·3所;^ 序列的 Clavibacter michiganensis subsp.insidiosus特異性鎖式探針、Seq ID Νο·4所;^序列 的Clavibacter michiganensis subsp.sepedonicus特異性鎖式探針、Seq ID Νο·5所;^序 列的Clavibacter michiganensis subsp·tessellarius特異性鎖式探針。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的密執(zhí)安棒狀桿菌多重檢測試劑在密執(zhí)安棒狀桿菌滾環(huán)擴增檢 測、滾環(huán)擴增液相芯片檢測中的應(yīng)用。3. -種密執(zhí)安棒狀桿菌的滾環(huán)擴增檢測方法，其特征在于:包括采用權(quán)利要求1所述的 多重檢測試劑，對待測樣品進行滾環(huán)擴增，通過五條鎖式探針的擴增情況判斷待測樣品中 是否含有 Clavibacter michiganensis subsp.nebraskensis、Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis^Clavibacter michiganensis subsp·insidiosus、 Clavibacter michiganensis subsp·sepedonicus和/或Clavibacter michiganensis subsp.tessellarius〇4. 一種密執(zhí)安棒狀桿菌的滾環(huán)擴增液相芯片檢測方法，其特征在于:包括以下步驟， (1) 提取待測樣品的DNA樣本； (2) 采用權(quán)利要求1所述的多重檢測試劑，對提取的DNA樣本進行滾環(huán)擴增； (3) 將五種偶聯(lián)微球?qū)L環(huán)擴增產(chǎn)物進行雜交和液相芯片分析，獲得檢測結(jié)果； 所述五種偶聯(lián)微球分別為偶聯(lián)有Clavibacter michiganensis subsp.nebraskensis 特異性鎖式探針Zip序列的液相芯片微球、偶聯(lián)有Clavibacter michiganensis subsp .michiganensis特異性鎖式探針Zip序列的液相芯片微球、偶聯(lián)有Clavibacter michiganensis subsp . ins id io sus特異性鎖式探針Z ip序列的液相芯片微球、偶聯(lián)有 Clavibacter michiganensis subsp · sepedonicus特異性鎖式探針Zip序列的液相芯片微 球、偶聯(lián)有Clavibacter michiganensis subsp·tessellarius特異性鎖式探針Zip序列的 液相芯片微球。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的滾環(huán)擴增液相芯片檢測方法，其特征在于:所述Clavibacter michiganensis subsp.nebraskensis特異性鎖式探針Zip序列為Seq ID Νο·6所;^序列，所 述Clavibacter michiganensis subsp .michiganensis特異性鎖式探針Zip序列為Seq ID No. 7所;^序列，所述Clavibacter michiganensis subsp. insidiosus特異性鎖式探針Zip 序列為Seq ID No .8所;^序列，所述Clavibacter michiganensis subsp .sepedonicus特異 性鎖式探針Zip序列為Seq ID No. 9所示序列，所述Clavibacter michiganensis subsp.tessellarius特異性鎖式探針Zip序列為Seq ID No. 10所示序列D6. -種密執(zhí)安棒狀桿菌多重檢測試劑盒，其特征在于:所述試劑盒中含有權(quán)利要求1所 述的密執(zhí)安棒狀桿菌多重檢測試劑。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒中還含有所述五條鎖式探針 的通用引物，所述通用引物包括第一引物，所述第一引物為Seq ID No. 11所示序列。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于:所述通用引物還包括第二引物，所述第 二引物為Seq ID No. 12所示序列。9. 根據(jù)權(quán)利要求6-8任一項所述的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒中還含有所述五條 鎖式探針的五條捕獲探針，所述五條捕獲探針分別為Seq ID No.6所示序列或其反向互補 序列、Seq ID No.7所示序列或其反向互補序列、Seq ID No.8所示序列或其反向互補序列、 Seq ID No.9所示序列或其反向互補序列、Seq ID No. 10所示序列或其反向互補序列。10. 根據(jù)權(quán)利要求6-8任一項所述的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒中還含有用于液 相芯片檢測的，五條鎖式探針的五種偶聯(lián)微球，所述五種偶聯(lián)微球分別為偶聯(lián)有 Clavibacter michiganensis subsp.nebraskensis特異性鎖式探針Zip序列的液相芯片微 球、偶聯(lián)有Clavibacter michiganensis subsp .michiganensis特異性鎖式探針Zip序列的 液相芯片微球、偶聯(lián)有Clavibacter michiganensis subsp. insidiosus特異性鎖式探針 Zip序列的液相芯片微球、偶聯(lián)有Clavibacter michiganensis subsp · sepedonicus特異性 鎖式探針Zip序列的液相芯片微球、偶聯(lián)有Clavibacter michiganensis subsp. tessel Iarius特異性鎖式探針Zip序列的液相芯片微球。
【文檔編號】C12Q1/04GK105886644SQ201610355680
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年5月25日
【發(fā)明人】馮建軍, 王忠文, 吳紹精, 龍海, 陳枝楠
【申請人】深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術(shù)中心, 深圳市檢驗檢疫科學(xué)研究院