一種鑒定辣椒上馬鈴薯y病毒屬病毒的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明屬于病毒分離與鑒定技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種質(zhì)譜與DNA測(cè)序聯(lián)用鑒定辣椒上馬鈴薯Y病毒屬（Potyvirus）具體病毒種類(lèi)的方法。該方法使用時(shí)包括：提取病毒、電鏡觀察、電泳并染色、質(zhì)譜分析、DNA測(cè)序、結(jié)果判定等步驟。本申請(qǐng)可用于零背景材料鑒定，能夠較為迅速和準(zhǔn)確的鑒定出樣品中是否含有馬鈴薯Y病毒屬病毒；而且即使針對(duì)混合樣病毒樣品時(shí)，采用本發(fā)明，也可快速和準(zhǔn)確的鑒定出樣品中是否含有兩種或兩種以上的病毒，可以較好避免病毒株系強(qiáng)弱對(duì)于病毒鑒定的影響。同時(shí)就檢測(cè)成本而言，本申請(qǐng)所提供的質(zhì)譜?DNA聯(lián)用方法更加經(jīng)濟(jì)可行，因而具有一定的推廣應(yīng)用價(jià)值。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
一種鑒定辣椒上馬鈴薯丫病毒屬病毒的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于病毒分離與鑒定技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種質(zhì)譜與DNA測(cè)序聯(lián)用鑒定辣 椒上馬鈴薯Y病毒屬(/? 具體病毒種類(lèi)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 辣椒（CajOsictw? a/LOt/ω? L.)是前科（5Wa/3aceae)辣椒屬（CajOsictw? Linn ·)的一 種一年生或有限多年生植物。由于其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，維生素 C含量在蔬菜中居首位，同時(shí)作為 重要的調(diào)味品，辣椒已成為人民生活中不可或缺的一類(lèi)蔬菜。隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和辣椒 育種技術(shù)的提高，產(chǎn)量高、性狀優(yōu)良的辣椒品種不斷的被培育成功。目前，中國(guó)辣椒栽培面 積全球最大，根據(jù)FA0統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，2014年我國(guó)鮮辣椒產(chǎn)量達(dá)到1620萬(wàn)噸，占同期全球總 產(chǎn)量的51.9%。但是，隨著辣椒種植面積日益擴(kuò)大，病毒病的危害也越來(lái)越嚴(yán)重。病毒病已成 為辣椒生產(chǎn)最嚴(yán)重的病害和限制因素之一。據(jù)調(diào)查，辣椒病毒病發(fā)病率一般在30%以上，嚴(yán) 重時(shí)高達(dá)90%，甚至顆粒無(wú)收。更糟糕的是侵染辣椒的病毒種類(lèi)多，罹病辣椒癥狀多樣，畸 形，花葉、落葉等并存，目前尚無(wú)防治方法。
[0003] 自報(bào)道黃瓜花葉病毒?osaic riras，CMV)侵染辣椒以來(lái)，至今已報(bào)道 至少有45種的病毒能侵染辣椒。馬鈴薯Y病毒屬病毒(Potyvirus)則是侵染辣椒作物的主要 病毒，近年來(lái)已逐漸成為辣椒頭號(hào)病害之一，嚴(yán)重危害辣椒產(chǎn)業(yè)發(fā)展。該屬有近200個(gè)確定 種或暫定種，已知能侵染辣椒的病毒主要有辣椒脈斑駁病毒（rei/jai ?oiUe riras，ChiVMV)、辣椒環(huán)斑病毒（riras，ChiRSV)、馬鈴薯Y病毒(Poia ?ο Υ，PVY)、煙草蝕紋病毒（7b/?acco eicA ri_rt/s，TEV)、辣椒斑馬交病毒 riras，PepMoV)和干辣椒脈斑駁病毒(Peftoer rirt/s，PVMV)等6種。而現(xiàn)有 的植物病毒檢測(cè)方法主要有PCR/RT-PCR、ELISA、電鏡觀察、基因芯片等技術(shù)。但是，單一使 用這些檢測(cè)方法，要么很難診斷其確切的病毒病原，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，要么就是成本太高，因而有 必要加以繼續(xù)改進(jìn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明主要目的是提供一種質(zhì)譜與DNA測(cè)序聯(lián)用鑒定辣椒上馬鈴薯Y病毒屬 (/? i/rirus)病毒的方法，從而為相關(guān)病癥的預(yù)防和治療奠定應(yīng)用基礎(chǔ)。
[0005] 本發(fā)明所采取的詳細(xì)技術(shù)方案如下所述。
[0006] -種質(zhì)譜與DNA測(cè)序聯(lián)用鑒定辣椒上馬鈴薯Y病毒屬病毒的方法，所 述馬鈴薯Y病毒屬(Poi/rirus)病毒具體包括:辣椒脈斑駁病毒（CAiDi rei/jai riras，ChiVMV)、辣椒環(huán)斑病毒（_ri/3《Sj〇oi riras，ChiRSV)、馬鈴薯Y病毒(Poia ?ο riras Y，，PVY)、煙草蝕紋病毒（7b/?acco eicA rirt/s，TEV)、辣椒斑駁病毒（Pefloer ?oide rirt/s，PepMoV)和干辣椒脈斑駁病毒(Pefloer rirt/s，PVMV)，鑒定時(shí)具體包 括如下步驟： (1)處理樣品，獲得病毒分離物;提取步驟可參考《辣椒環(huán)斑病毒提純及抗血清制備》 (章紹延等，熱帶作物學(xué)報(bào)，2013，34(3) : 534~537)中操作，具體為： 收集疑似感染馬鈴薯Y病毒屬病毒的辣椒病樣葉片樣品200 g，然后加入1L Extraction Buffer(0.2 mol/L NaAc緩沖液，ρΗ5·0,加入β-疏基乙醇至終濃度0.4%)于攪 拌機(jī)中打碎，用四層紗布過(guò)濾，濾液分裝于離心瓶中，并冰浴30 min; 4°C、8000 r/min離心 10 min，取上清并加入PEG6000、NaCl、Triton X-100分別至終濃 度8%、0·2mo 1/L、0·5%，然后4°C攪拌45 min; 4°C、8500 r/min離心15 min，棄上清，用濾紙小心吸去殘留液體，用0.1倍于 Extraction Buffer體積的Tris -Citrate BuffeKO.l mol/L Tris ρΗ6· 5，0· 032 mol/L 檸檬酸鈉，加入Triton X-100至終濃度0.5%)重懸，4°C攪拌45 min; 4°C、10000 r/min離心10 min，取上清，將上清轉(zhuǎn)移到HITACHI 40 Pa Tube中，用配 有平針頭的注射器伸入液面以下將30%蔗糖墊層溶液從離心管底部緩慢注入； 4°C、27000 r/min條件離心2 h，棄上清，沉淀用300 yL Tris-citrate buffer 重懸， 即為病毒粗提液，然后進(jìn)行氯化銫密度梯度離心，以便對(duì)病毒進(jìn)行進(jìn)一步純化和提取，具體 過(guò)程為： 將8.7 g氯化銫加入到20 mL Tris-citrate buffer中，充分溶解，然后平均分裝到2 個(gè)離心管中，在離心管頂部小心加入1 mL上述所制備的病毒粗提液，繼續(xù)加 Tris-citrate buffer溶液至液面距離心管管口約2~3 mm; 配平離心管(精確到千分之一)并以36000 r/min(轉(zhuǎn)子型號(hào):HITACHI P40ST)在4°C下 離心16 h;離心結(jié)束后小心取出離心管，盡量不使溶液震蕩，并拍照記錄； 根據(jù)離心管內(nèi)病毒帶顏色(藍(lán)白色），識(shí)別出目的病毒帶，用帶長(zhǎng)針頭的注射器將目的 帶小心吸出； 用等體積的滅菌ddH2〇稀釋所吸出的目的病毒帶，4°C、10000 r/min離心10 min，取上 清加入1/2體積的24% PEG溶液，混合均勻后于冰上沉淀10 min;再4°C、10000 r/min離心 10 min，棄上清，再瞬時(shí)離心用微量移液槍吸除殘留液體，用1 mL Tris-citrate buffer 重懸后，-20 °C保存?zhèn)溆?，此即為待鑒定的、提純后的目的病毒帶樣品（病毒提純液）； (2) 病毒電鏡觀察:取步驟（1)中的提純后病毒提純液5 yL置于2%磷鎢酸溶液(pH6.8) 中負(fù)染約30 min后，透射電鏡進(jìn)行觀察拍照； (3) 電泳并染色:對(duì)步驟（1)中所獲得的病毒分離物（即，提純后病毒提純液)進(jìn)行SDS-PAGE電泳并染色分析，具體為： 取7 yL病毒提純液，加入等體積的2 X SDS-PAGE上樣緩沖液，混勻； 沸水浴5 min，然后置冰上2 min，再4°C、12000 rpm離心1 min; 取上清液1〇μL上樣到預(yù)先制備的SDS-PAGE不連續(xù)膠(濃縮膠濃度為5%、分離膠濃度為 12%)膠孔中，以25 mA穩(wěn)流進(jìn)行電泳； 電泳結(jié)束后，將膠塊置于考馬斯亮藍(lán)染液中浸泡，搖床上(80 rpm，室溫)染色30 min; 自來(lái)水將凝膠沖洗干凈后浸泡于脫色液中，室溫平緩搖動(dòng)4~8h，其間更換脫色液3~4 次； 脫色完成后進(jìn)行UVP凝膠成像系統(tǒng)掃描分析； (4) 質(zhì)譜分析鑒定，對(duì)步驟(3)中電泳后膠條初步分析，將含有馬鈴薯Y病毒屬病毒的膠 條進(jìn)行切割，進(jìn)行基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜分析(MALDI-T0F-T0F); 依據(jù)質(zhì)譜結(jié)果，選擇NCBInr全庫(kù)中的NCBInr_virus(683995 sequences)對(duì)質(zhì)譜結(jié)果進(jìn) 行檢索比對(duì)； (5) DNA測(cè)序以對(duì)病毒核酸進(jìn)行鑒定，具體為： 利用蛋白酶K對(duì)步驟（1)中所制備的病毒提純液中的病毒顆粒進(jìn)行消化，然后利用酚 仿抽提、乙醇沉淀的方法獲得純化的病毒RNA; 將提純的病毒RNA用反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA第一鏈； 根據(jù)步驟(4)中的蛋白質(zhì)搜索鑒定結(jié)果，選擇適當(dāng)?shù)囊?，以合成的cDNA為模板進(jìn)行 PCR擴(kuò)增;PCR擴(kuò)增時(shí)所用引物序列為，
將擴(kuò)增得到的產(chǎn)物回收后連于PMD18T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行菌液PCR 初步鑒定； 將初步鑒定為陽(yáng)性的克隆菌進(jìn)行測(cè)序分析； (6) 結(jié)果判定： 電鏡觀察中，如果觀察到680~900 nm長(zhǎng)、11~13 nm寬的彎曲線狀病毒顆粒，則可初步判 定辣椒病樣為馬鈴薯Y病毒屬病毒感染樣品； 依據(jù)電泳結(jié)果的初步質(zhì)譜分析，及后續(xù)的檢索比對(duì)結(jié)果，可進(jìn)一步縮小待鑒定的病毒 范圍，并初步確定感染辣椒病樣的病毒是哪一種或哪幾種； 進(jìn)一步根據(jù)質(zhì)譜分析的結(jié)果，設(shè)計(jì)特異引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增和測(cè)序，最終確定感染辣 椒病樣的病毒類(lèi)型。
[0007] 隨著分子生物學(xué)技術(shù)和深度測(cè)序(Deep sequencing)的不斷發(fā)展，以基因芯片技 術(shù)、小RNA測(cè)序(Small RNA sequencing)、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNAseq)等為核心的新技術(shù)在病毒鑒 定方面具有較好的優(yōu)越性。但是這些方法普遍需要較高的檢測(cè)費(fèi)用，并且后期的生物信息 學(xué)分析需要高性能的硬件支持，因而在推廣及應(yīng)用普及上存在一定的缺陷。而就利用PCR技 術(shù)鑒定病毒種類(lèi)而言，J. Chen等曾報(bào)道過(guò)一種用馬鈴薯Y病毒科通用引物對(duì)該科病毒進(jìn)行 檢測(cè)的方法（A universal PCR primer to detect members of the Potyviridae and its use to examine the taxonomic status of several members of the family,Arch Virol.，2001，146(4):757-766)。但使用該方法時(shí)，如果是單一病毒形成的單獨(dú)侵染時(shí)，可 以較為準(zhǔn)確地檢測(cè)出侵染的病毒;而如果是復(fù)雜的復(fù)合侵染過(guò)程，一些弱毒株系劣勢(shì)種可 能被優(yōu)勢(shì)種掩蓋，從而造成檢測(cè)結(jié)果的不夠完整和全面，因而也存在較大的應(yīng)用局限性。
[0008] 本申請(qǐng)所提供的針對(duì)辣椒上馬鈴薯Y病毒屬的病毒鑒定方法，可用于零背景材料 鑒定，能夠較為迅速和準(zhǔn)確的鑒定出樣品中是否含有辣椒脈斑駁病毒（CArei/ja2 ?oiUe riras，ChiVMV)、辣椒環(huán)斑病毒riras，ChiRSV)、馬鈴薯Y病毒 (Poiaio Y, PVY)、煙草蝕紋病毒（r〇/?acco eicA Ki_rt/s，TEV)、辣椒斑駁病毒 (Peftoei· riras，PepMoV)和干辣椒脈斑駁病毒（Peftoei· riras， PVMV)等馬鈴薯Y病毒屬病毒;而且即使針對(duì)混合樣病毒樣品時(shí)，采用本發(fā)明，也可快速和準(zhǔn) 確的鑒定出樣品中是否含有兩種或兩種以上的馬鈴薯Y病毒屬病毒，可以較好避免病毒株 系強(qiáng)弱對(duì)于病毒鑒定的影響；除此之外，利用本發(fā)明，還可以鑒定辣椒上其他的馬鈴薯Y病 毒屬新病毒(不包括已知6種病毒）。同時(shí)就檢測(cè)成本而言，本申請(qǐng)所提供的質(zhì)譜-DNA聯(lián)用方 法顯然更加經(jīng)濟(jì)可行，因而具有一定的推廣應(yīng)用價(jià)值。
【附圖說(shuō)明】
[0009] 圖1為所采集樣品的生理病癥表現(xiàn)及所提取樣品的電鏡圖，其中A為所采集樣品的 生理病癥，B為所提取的病毒樣品的電鏡掃描圖； 圖2為純化病毒后的SDS-PAGE電泳圖； 圖3為純化病毒RNA后的電泳圖及相關(guān)擴(kuò)增片段電泳圖，其中a為純化病毒RNA的電泳 圖，b為典型引物擴(kuò)增片段電泳圖； 圖4為病毒蛋白的一級(jí)PMF譜圖； 圖5為病毒蛋白的相應(yīng)肽段的二級(jí)譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0010] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的解釋說(shuō)明，在介紹具體實(shí)施例前，對(duì)本發(fā)明 中部分實(shí)驗(yàn)試劑、實(shí)驗(yàn)設(shè)備等情況簡(jiǎn)要介紹如下。
[0011] 樣品來(lái)源:下述實(shí)施例中疑似辣椒環(huán)斑病毒(ChiRSV)感染樣品采自海南文昌某地 的黃燈籠辣椒葉片，具有典型的花葉斑駁癥狀，因而可初步認(rèn)為受到辣椒環(huán)斑病毒 (ChiRSV)感染，但對(duì)于是否確定受到辣椒環(huán)斑病毒(ChiRSV)侵染則需對(duì)病毒進(jìn)一步進(jìn)行分 離鑒定。
[0012] 主要試劑： AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒，勱瑞生物科技(上海)有限公司； PMD18-T載體，寶生物工程(大連)有限公司； DH5a大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，北京全式金生物有限公司； EasyTaq PCR Mix，北京全式金生物有限公司； 質(zhì)粒提取試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司； 其他未說(shuō)明試劑均以本領(lǐng)域常用制備方法制備而成或從市場(chǎng)常規(guī)購(gòu)得，不再重復(fù)介 紹。
[0013] 主要設(shè)備： 超速離心機(jī)(HITACHI himac CP 80MX)，日立（中國(guó)）有限公司； 透射電鏡(JEM-1010型），日本(中國(guó)）電子公司； UVP凝膠成像系統(tǒng)，天美（中國(guó)）科學(xué)儀器有限公司。
[0014] 實(shí)施例1 本發(fā)明所提供的質(zhì)譜與DNA測(cè)序聯(lián)用鑒定辣椒上馬鈴薯Y病毒屬(Potyvirus)病毒的方 法，具體包括如下操作步驟。
[0015] (1)處理樣品，獲得病毒分離物 如圖1A所示，本實(shí)施例中所采集的樣品具有典型的花葉斑駁癥狀，因而可作為疑似受 辣椒環(huán)斑病毒(ChiRSV)感染樣品。
[0016] 收集疑似感染辣椒環(huán)斑病毒的辣椒病樣葉片200 g，進(jìn)行提取，獲得病毒，具體操 作步驟為：用1 L的Extraction Buffer(0.2 mol/L NaAc緩沖液，ρΗ5·0,加入β-疏基乙醇 至終濃度0.4%)于攪拌機(jī)中將樣品粉碎，四層紗布過(guò)濾，濾液分裝于離心瓶中，冰浴30 min; 4°C、8000 r/min離心 10 min，取上清并加入PEG6 000、NaCl、Triton X-100分別至終濃 度 8%、0 · 2mo 1 /L、0 · 5%，4 °C 攪拌 45min; 4°C、8500 r/min離心15 min，棄上清，用濾紙小心吸去殘留液體，用0.1倍于 Extraction Buffer體積的Tris -Citrate BuffeKO.l mol/L Tris ρΗ6· 5，0· 032 mol/L 檸檬酸鈉，加入Triton X-100至終濃度0.5%)重懸，4°C攪拌45 min; 4°C、10000 r/min離心10 min，取上清，將上清轉(zhuǎn)移到HITACHI 40 Pa Tube中，用配有 平針頭的注射器伸入液面以下將30%蔗糖墊層溶液從離心管底部緩慢注入； 4°C、27000 r/min離心2 h，棄上清，沉淀用300 yL Tris-citrate buffer 重懸，BP為 病毒粗提液;然后進(jìn)行氯化銫密度梯度離心，以便對(duì)病毒進(jìn)行進(jìn)一步純化和提取，具體過(guò)程 為： 將8.7 g氯化銫加入到20 mL Tris-citrate buffer中，充分溶解，平均分裝到2個(gè)離 心管中，在離心管頂部小心加入1 mL病毒粗提液，繼續(xù)加 Tris-citrate buffer溶液至液 面距離心管管口約2~3 mm; 配平離心管(精確到千分之一）以36000 r/min(轉(zhuǎn)子型號(hào):HITACHI P40ST)在4°C下離 心16 h;小心取出離心管，盡量不使溶液震蕩，拍照記錄； 根據(jù)離心管內(nèi)病毒帶顏色(藍(lán)白色），識(shí)別出目的病毒帶，用帶長(zhǎng)針頭的注射器將目的 帶小心吸出； 用等體積的滅菌ddH2〇稀釋?zhuān)?°C、10000 r/min離心10min;取上清加入1/2體積的24% PEG溶液，混合均勻后于冰上沉淀10 min; 4°C、10000 r/min離心10 min，棄上清，再瞬時(shí)離心用微量移液槍吸除殘留液體，用1 mL Tris-citrate buffer重懸，-20°C保存，此即為待鑒定的病毒提純液。
[0017] (2)病毒電鏡觀察:將步驟（1)中的病毒提純液5 yL置于2%磷鎢酸溶液(PH6.8)中 負(fù)染約30 min后，用JEM-1010型透射電鏡進(jìn)行觀察拍照。
[0018] 結(jié)果如圖1B所示，可看到大量頭發(fā)絲狀、大小約700 X12nm的病毒顆粒，具有典型 的Poi/rirt/s屬特征，依據(jù)此特征，可初步判定該辣椒樣品為馬鈴薯Y病毒屬病毒。
[0019] (3)電泳并染色 對(duì)步驟(1)中所獲得的病毒分離物(病毒提純液)進(jìn)行SDS-PAGE電泳并染色分析，具體 為： 取7yL病毒提純液，加入等體積的2 X SDS-PAGE上樣緩沖液，混勻； 沸水浴5 min，然后置冰上2 min，再4°C、12000 rpm離心1 min; 取上清液10 μL上樣到預(yù)先制備的SDS-PAGE不連續(xù)膠(濃縮膠濃度為5%、分離膠濃度為 12%)膠孔中，以25 mA穩(wěn)流進(jìn)行電泳； 電泳結(jié)束后，將膠塊置于考馬斯亮藍(lán)染液中浸泡，搖床上(80 rpm，室溫)染色30 min; 自來(lái)水將凝膠沖洗干凈后浸泡于脫色液中，室溫平緩搖動(dòng)4~8h，其間更換脫色液3~4 次； 脫色完成后進(jìn)行UVP凝膠成像系統(tǒng)掃描。
[0020] 電泳結(jié)果如圖2所示。從圖中可以看出，凝膠上有兩條大小相近的主要條帶，大小 與大多數(shù)屬病毒的外殼蛋白（Coat protein，CP)大小接近，在30~45 kDa之間。將 兩條目的膠條分別切下，并編號(hào)為29D、30D，以進(jìn)行下一步的質(zhì)譜分析。
[0021] (4)質(zhì)譜分析鑒定 將步驟(3)中所切下的編號(hào)為29D、30D的膠條，雙蒸水中保存，送往華大基因研究院進(jìn) 行基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜分析(MALDI-T0F-T0F)。
[0022]質(zhì)譜分析結(jié)果表明（圖4和圖5)，兩個(gè)膠條分別獲得1個(gè)一級(jí)質(zhì)譜以及5個(gè)由一級(jí)譜 中的若干最強(qiáng)峰產(chǎn)生的二級(jí)譜。
[0023] 利用蛋白質(zhì)搜索鑒定軟件Mascot(版本2.3.02)，選擇NCBInr全庫(kù)中的NCBInr_ virrus(683995 sequences)對(duì)質(zhì)譜結(jié)果進(jìn)行檢索比對(duì)。
[0024] 比對(duì)結(jié)果表明（如下表所示），與29D和30D匹配度排名前5的蛋白均來(lái)自ChiRSV(如 下表的病毒蛋白序列比對(duì)結(jié)果所示）；兩者匹配度得分最高的都是蛋白ID為YP_ 006423994.1的ChiRSV的衣殼蛋白，其得分分別為433和463均遠(yuǎn)高于閾值53分，且覆蓋率分 別達(dá)到48.71%和46.13%。因此，可初步確認(rèn)從海南黃燈籠辣椒上分離得到的/? 為 ChiRSV。
[0025]病毒蛋白序列比對(duì)結(jié)果：
[0026]但需要說(shuō)明的是，如果僅依據(jù)質(zhì)譜比對(duì)結(jié)果，顯然難以準(zhǔn)確判定是否僅為ChiRSV， 例如從上表比對(duì)結(jié)果可以看出，除匹配到ChiRSV外，還有其他匹配的病毒，如得分206排名 第6的Zeafr jeDor siripe riras(LYSV)。其主要原因是，在不排除復(fù)合侵染的情況下，同 屬不同種病毒的CP蛋白氨基酸序列有一定的同源性。因而必須進(jìn)一步進(jìn)行其他途徑的鑒 定，才能鑒定是否僅為ChiRSV或是含有ChiRSV的混合物。
[0027] (5)DNA測(cè)序以對(duì)病毒核酸進(jìn)行鑒定 利用蛋白酶K (TAKARA)對(duì)步驟（1)的病毒提純液中的病毒顆粒進(jìn)行消化，然后利用酚 仿抽提、乙醇沉淀的方法獲得純化的病毒RNA。對(duì)所提取的病毒RNA進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電 泳，結(jié)果如圖3a所示。從圖中可以看出，在2500bp左右有一條明亮的條帶，這與屬 的RNA經(jīng)普通電泳獲得的條帶大小基本一致。
[0028] 將病毒RNA用PrimeScript反轉(zhuǎn)錄酶（TAKARA)合成cDNA第一鏈。
[0029] 根據(jù)步驟(4)中的蛋白質(zhì)搜索鑒定結(jié)果，選擇適當(dāng)?shù)囊铮院铣傻腸DNA為模板進(jìn) 行擴(kuò)增;具體引物序列設(shè)計(jì)如下： ChiRSV-F:5'-GGT TTG ATG GTT TGG TGC ATT GTG-3'， ChiRSV-R:5'-CAC TTA CAA CAA TGG CAG ATC GTA G-3'。
[0030] 以合成的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖如圖3b所示，從圖中可以看 出，擴(kuò)增片段大小約600bp，與實(shí)際大小相符。
[0031] 需要說(shuō)明的是，基于步驟(4)中的比對(duì)結(jié)果，在無(wú)法排除LYSV的情況下，發(fā)明人還 采用了LYSV的特異引物進(jìn)行了擴(kuò)增，但未擴(kuò)增到目的片段。因此，可以排除樣品中存在 LYSV〇
[0032] 將擴(kuò)增得到的產(chǎn)物回收后連于pMD18T (TAKARA)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取陽(yáng)性克 隆進(jìn)行菌液PCR初步鑒定； 將初步鑒定為陽(yáng)性的克隆菌進(jìn)行測(cè)序分析。
[0033] (6)結(jié)果判定： 依據(jù)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行Blast比對(duì)，以確定具體的病毒類(lèi)型。就該實(shí)施例而言，比對(duì)結(jié)果顯 示，測(cè)序結(jié)果所得序列與質(zhì)譜鑒定得到的蛋白序列對(duì)應(yīng)的核苷酸序列同源性為99.2%，氨基 酸同源性為99.0%，與質(zhì)譜鑒定結(jié)果吻合。因此，可以斷定侵染海南黃燈籠辣椒的 為辣椒環(huán)斑病毒(ChiRSV)。
[0034]需要說(shuō)明的是，該實(shí)施例僅是針對(duì)辣椒上較為典型的辣椒環(huán)斑病毒(ChiRSV)感染 樣品進(jìn)行的檢測(cè)判定，屬于較好實(shí)施例，對(duì)于其他單一病毒或混合病毒的鑒定過(guò)程與此類(lèi) 似，故此不再重復(fù)描述。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種質(zhì)譜與DNA測(cè)序聯(lián)用鑒定辣椒上馬鈴薯Y病毒屬病毒的方法，其特征在于，所述 馬鈴薯Y病毒屬病毒具體包括:辣椒脈斑駁病毒、辣椒環(huán)斑病毒、馬鈴薯Y病毒、煙草蝕紋病 毒、辣椒斑駁病毒和干辣椒脈斑駁病毒，鑒定時(shí)具體包括如下步驟： (1) 處理樣品，獲得病毒分離物;提取步驟按照《辣椒環(huán)斑病毒提純及抗血清制備》中操 作，獲得病毒提純液； (2) 病毒電鏡觀察:取步驟（1)中的提純后病毒提純液置于2%磷鎢酸溶液中負(fù)染，透射 電鏡進(jìn)行觀察拍照； (3) 電泳并染色：對(duì)步驟（1)中所獲得的病毒提純液進(jìn)行SDS-PAGE不連續(xù)膠電泳，并進(jìn) 行染色，脫色后進(jìn)行UVP凝膠成像系統(tǒng)掃描分析； (4) 質(zhì)譜分析鑒定，對(duì)步驟(3)中電泳后膠條初步分析，將含有馬鈴薯Y病毒屬病毒的膠 條進(jìn)行切割，進(jìn)行基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜分析； 依據(jù)質(zhì)譜結(jié)果，選擇NCBInr全庫(kù)中的NCBInr_virus對(duì)質(zhì)譜結(jié)果進(jìn)行檢索比對(duì)； (5) DNA測(cè)序以對(duì)病毒核酸進(jìn)行鑒定，具體為： 利用蛋白酶K對(duì)步驟(1)中所制備的病毒提純液中的病毒顆粒進(jìn)行消化，然后利用酚仿 抽提、乙醇沉淀的方法獲得純化的病毒RNA; 將提純的病毒RNA用反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA第一鏈； 根據(jù)步驟(4)中的蛋白質(zhì)搜索鑒定結(jié)果，選擇適當(dāng)?shù)囊铮院铣傻腸DNA為模板進(jìn)行 PCR擴(kuò)增； 將擴(kuò)增得到的產(chǎn)物回收后連于PMD18T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行菌液PCR 初步鑒定； 將初步鑒定為陽(yáng)性的克隆菌進(jìn)行測(cè)序分析； (6) 結(jié)果判定： 電鏡觀察中，如果觀察到680~900 nm長(zhǎng)、11~13 nm寬的彎曲線狀病毒顆粒，則可初步判 定辣椒病樣為馬鈴薯Y病毒屬病毒感染樣品； 依據(jù)電泳結(jié)果的初步質(zhì)譜分析，及后續(xù)的檢索比對(duì)結(jié)果，進(jìn)一步縮小待鑒定的病毒范 圍，并初步確定感染辣椒病樣的病毒是哪一種或哪幾種； 進(jìn)一步根據(jù)質(zhì)譜分析的結(jié)果，設(shè)計(jì)特異引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增和測(cè)序，最終確定感染辣 椒病樣的病毒類(lèi)型。2. 如權(quán)利要求1所述質(zhì)譜與DNA測(cè)序聯(lián)用鑒定辣椒上馬鈴薯Y病毒屬病毒的方法，其特 征在于，步驟(5)中，判定具體馬鈴薯Y病毒屬病毒時(shí)，PCR擴(kuò)增時(shí)所用引物序列為， 針對(duì)辣椒環(huán)斑病毒，引物序列設(shè)計(jì)為： ChiRSV-F:5 '-GGTTTGATGGTTTGGTGCATTGTG-3 '， ChiRSV-R:5 '-CACTTACAACAATGGCAGATCGTAG-3 '； 針對(duì)辣椒脈斑駁病毒，引物序列設(shè)計(jì)為： ChiVMV-F:5 '-CAGGAGAGAGTGTTGATGCTGG-3 '， ChiVMV-R:5，-GCGCTAATGACATATCGGTAAGG-3，； 針對(duì)馬鈴薯γ病毒，引物序列設(shè)計(jì)為： PVY-F:5，-CAACTGTGATGAATGGGCTTATGG-3，， PVY-R:5 '-AGCCCTCACTGGTGTTCGTG-3 '； 針對(duì)煙草蝕紋病毒，引物序列設(shè)計(jì)為： TEV-F:5'_ GCTGGAACTTCAGGAACATTCTCAG-3'， TEV-R:5 '- CTTGCTCCTCACCATCCATCATG-3 '； 針對(duì)辣椒斑駁病毒，引物序列設(shè)計(jì)為： PepMoV-F:5'-CAG ACACATTGGATGCTGGAGAGG-3'， PepMoV-R:5 '-ATCGTGGCATGTATGGTTCTTGC-3 '； 針對(duì)干辣椒脈斑駁病毒，引物序列設(shè)計(jì)為： PVMV-F:5'_ ATGTGGGTGATGGTTGATGGTG-3'， PVMV-R:5 '- CCTCCTCCTGTGTGCCTACC-3 '。
【文檔編號(hào)】C12R1/94GK105886668SQ201610359725
【公開(kāi)日】2016年8月24日
【申請(qǐng)日】2016年5月27日
【發(fā)明人】余乃通, 劉志昕, 章紹延, 王健華, 周琴, 張雨良, 張秀春
【申請(qǐng)人】中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所