來自于乳酸克魯維酵母的乳糖酶的改良酶變體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及具有乳糖酶活性的變體多肽。本發(fā)明還涉及編碼此類變體多肽的核酸序列，包含所述核酸序列的核酸構(gòu)建體，包含所述核酸構(gòu)建體的重組表達載體和包含所述表達載體的重組宿主細胞。進一步地，本發(fā)明涉及經(jīng)由使用此類宿主細胞生產(chǎn)乳糖酶變體的方法。而且，本發(fā)明涉及生產(chǎn)乳糖酶多肽變體的方法。本發(fā)明進一步涉及包含乳糖酶變體的組合物，在乳制品的制備中此類乳糖酶變體的用途或含乳糖酶變體的組合物的用途，生產(chǎn)乳制品的方法及所得乳制品。
【專利說明】來自于乳酸克魯維酵母的乳糖酶的改良酶變體 發(fā)明領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及具有乳糖酶活性的變體多肽。本發(fā)明還涉及編碼此類變體多肽的核酸 序列，包含所述核酸序列的核酸構(gòu)建體，包含所述核酸構(gòu)建體的重組表達載體和包含所述 表達載體的重組宿主細胞。進一步地，本發(fā)明涉及經(jīng)由使用此類宿主細胞生產(chǎn)乳糖酶變體 的方法。而且，本發(fā)明涉及生產(chǎn)乳糖酶多肽變體的方法。本發(fā)明進一步涉及包含乳糖酶變體 的組合物，在乳制品的制備中此類乳糖酶變體的用途或含乳糖酶變體的組合物的用途，生 產(chǎn)乳制品的方法及所得乳制品。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 本發(fā)明涉及乳糖酶。乳糖酶或β-半乳糖苷酶(E.C:3.2.1.23)是一種催化乳糖(一 種二糖)水解成其組分單糖葡萄糖和半乳糖的酶。乳糖存在于乳制品中并且更具體地存在 于乳、脫脂乳、乳酪、冰淇淋、發(fā)酵乳制品例如酸奶、許多未成熟干酪和其它乳制品中。在幼 年哺乳動物(其中包括人)的腸壁內(nèi)通過自然存在的乳糖酶發(fā)生乳糖的分解。僅一小部分成 年群體尚未喪失這種性能并且仍然可以消化乳糖。在大多數(shù)成體中由乳糖引起的營養(yǎng)和功 能問題是由乳糖酶的缺乏而引起并且眾所周知且有描述。此類群體的成員不能使乳糖水 解，在這種情況下乳糖進入大腸，在這里其導(dǎo)致脫水、鈣吸收差、腸胃氣脹、噯氣和痙攣，并 且，在嚴重的情況下，甚至水性爆發(fā)性腹瀉。
[0004] 乳糖酶重要的工業(yè)應(yīng)用是在用于乳糖不耐受個體的乳糖水解乳制品的生產(chǎn)中。此 類水解乳制品包括巴氏滅菌乳、UHT乳及用或不用中間加工步驟(例如蛋白水解）由其全部 或部分原始組成部分復(fù)原的乳。用乳糖酶處理可在熱處理乳之前或之后進行?？赏ㄟ^將酶 添加到乳中或其含乳糖的組成部分之一中進行乳糖酶處理。
[0005] 乳糖的溶解特性使得可能導(dǎo)致其在以高濃度存在時結(jié)晶，在乳制品例如煉乳、淡 奶、乳粉、凍乳、冰淇淋和在具有高乳含量的甜食產(chǎn)品中產(chǎn)生沙粒狀或顆粒狀質(zhì)地。乳糖被 乳糖酶全部或部分水解消除了這個問題，從而提供具有均勻質(zhì)地的產(chǎn)品并且因此消費者接 受程度更高。
[0006] 乳糖酶的另一種工業(yè)應(yīng)用是增加含乳糖的產(chǎn)品如乳或酸奶中的甜味。此類產(chǎn)品中 乳糖的水解由于生成葡萄糖而導(dǎo)致甜味增加，而產(chǎn)品的熱量值不增加。相反，乳糖酶的使用 還可減少變甜的乳制品中的糖添加，而不會損害甜味。
[0007] 乳糖酶的另一種工業(yè)應(yīng)用是含有乳組分的乳糖產(chǎn)品例如面包的水解。在此類產(chǎn)品 中添加乳糖以增強風(fēng)味、保持水分、提供褐變和改善烘烤特性。水解的乳糖糖漿有望例如增 強面包皮顯色、改善風(fēng)味和香氣、改變質(zhì)地、延長保存期限和加強面包結(jié)構(gòu)。
[0008] 發(fā)酵乳制品例如酸奶中乳糖被乳糖酶水解將增加甜味。同樣，在發(fā)酵過程開始之 前添加乳糖酶時，可提高酸發(fā)展的速率并且因此減少加工時間。乳或乳源性產(chǎn)品例如乳清 的乳糖酶處理使得此類產(chǎn)品適合應(yīng)用于動物飼料和寵物食品中用于乳糖不耐受動物，例如 貓。乳糖水解允許生產(chǎn)更高濃度的乳清并且同時預(yù)防與早先關(guān)于乳糖缺陷患者描述的問題 類似的腸道問題。濃縮乳糖水解乳清以生產(chǎn)含有70-75%固體的糖漿并且用作冰淇淋、面包 和甜食產(chǎn)品中的食品成分。
[0009] 乳糖酶已有描述并且從多種生物，包括微生物中分離。乳糖酶常常是微生物如克 魯維酵母菌屬(Kluyveromyces)和桿菌屬(Bacillus)的細胞內(nèi)組分?？唆斁S酵母菌屬并且 尤其是脆壁克魯維酵母(K.fragilis)和乳酸克魯維酵母(K.lactis)，和其它酵母例如念珠 菌屬(Candida)、圓酵母屬(Torula)和球擬酵母屬(Torulopsis)的酵母是酵母乳糖酶的常 見來源，而凝結(jié)芽孢桿菌(B. coagulans)、環(huán)狀芽孢桿菌(B. circulans)或乳酸菌是眾所周 知的細菌乳糖酶來源。源自這些生物的幾種商用乳糖酶制劑可用，例如Maxilact?(來自于 乳酸克魯維酵母，由荷蘭代爾夫特DSM生產(chǎn)）。這些乳糖酶是所謂的中性乳糖酶，因為其具有 介于pH=6和pH=8之間的最適pH。
[0010] 雖然酵母中性乳糖酶常常在工業(yè)上用于生產(chǎn)無乳糖或乳糖減少的乳制品，但酶處 理的使用成本往往很高。酶的使用成本相對較高的主要原因是：
[0011] ?為了維持生產(chǎn)工廠內(nèi)的衛(wèi)生狀況，在低溫下進行培育。在這個溫度下工業(yè)上使 用的乳糖酶不是很活躍并且應(yīng)按相對高的劑量添加。
[0012] ?目前使用的乳糖酶在用乳糖酶培育后期，受其產(chǎn)物，尤其是半乳糖抑制。當(dāng)需要 具有低殘留乳糖濃度的產(chǎn)品時，必須添加額外的酶以補償由于半乳糖積累而引起的活性降 低。
[0013] ?目前使用的乳糖酶在乳中具有相對較低的比活性，在應(yīng)用中需要使用高酶劑 量。
[0014] 因此，生產(chǎn)乳糖減少和無乳糖的產(chǎn)品的酶劑量和成本相對較高。
[0015] 顯然需要一種或多種能夠克服以上提到的至少一種缺點的乳糖酶變體。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0016] 本發(fā)明涉及具有乳糖酶活性的變體多肽，即涉及乳糖酶變體。本發(fā)明的乳糖酶變 體與參考多肽相比可具有一種或多種改良的特性，所述參考多肽通常具有乳糖酶活性。參 考多肽可為野生型乳糖酶，例如來自于乳酸克魯維酵母的乳糖酶。本發(fā)明的變體多肽可稱 為"乳糖酶變體"、"改良乳糖酶"等等。已生成克魯維酵母中性乳糖酶的變體，其具有導(dǎo)致在 乳糖減少或無乳糖的乳制品生產(chǎn)中此類乳糖酶的使用成本降低的特性。具有關(guān)于乳制品生 產(chǎn)的改良特性的乳糖酶變體可展示：
[0017] ?針對0NPG更高的比活性；
[0018] ?針對乳糖更高的比活性；
[0019] ?在低溫乳中的針對乳糖更高的活性；
[0020] ?半乳糖抑制降低;和/或
[0021] ?在乳中更高的G0S產(chǎn)量。
[0022] 與參考多肽相比，可測定這些改良中的每一種。而且，與參考多肽相比，本發(fā)明的 變體多肽可具有至少2種或3種或4種改良特性。表1提供了改良特性組合的實例。
[0023] 因此本發(fā)明提供了具有乳糖酶活性的變體多肽，其中所述變體具有下述氨基酸序 列，在與包含SEQ ID N0:2中列出的序列的乳糖酶比對時，所述氨基酸序列包含對應(yīng)于第
[0024] 233、257、258、263、274、284、297、415、440、483、619、621、622、633、862或1004位氨 基酸中的任一個的氨基酸殘基的至少一個取代，
[0025]所述位置參照SEQ ID N0:2定義并且其中所述變體與具有乳糖酶活性的參考多肽 相比具有一種或多種改變的特性并且其中所述變體與SEQ ID NO:2具有至少60%序列同一 性。
[0026] 本發(fā)明還提供了：
[0027] -編碼本發(fā)明的變體的核酸序列；
[0028] -包含此類核酸序列的核酸構(gòu)建體，所述核酸序列與能夠指導(dǎo)乳糖酶在合適表達 宿主中的表達的一個或多個控制序列可操作性連接；
[0029] -包含此類核酸構(gòu)建體的重組表達載體;和
[0030] -包含此類表達載體的重組宿主細胞。
[0031] 本發(fā)明還涉及生產(chǎn)乳糖酶的方法，其包括在有助于乳糖酶生成的條件下培養(yǎng)本發(fā) 明的宿主細胞并且回收乳糖酶。
[0032] 此外，本發(fā)明涉及生產(chǎn)乳糖酶多肽變體的方法，所述方法包括：
[0033] a)選擇具有乳糖酶活性的多肽；
[0034] b)取代對應(yīng)于
[0035] 233、257、258、263、274、284、297、415、440、483、619、621、622、633、862或1004位氨 基酸中的任一個的至少一個氨基酸殘基，
[0036] 所述位置參照SEQ ID N0:2定義；
[0037] c)任選地取代如b)中所限定的一個或多個另外的氨基酸；
[0038] d)制備由步驟a)_c)產(chǎn)生的變體；
[0039] e)測定變體的特性;及
[0040] f)選擇與包含SEQ ID N0:2中列出的序列的乳糖酶相比具有改變特性的變體并選 擇與SEQ ID N0:2具有至少60%序列同一性的變體，從而產(chǎn)生乳糖酶多肽變體。
[0041]進一步地，本發(fā)明涉及：
[0042] -組合物，其包含本發(fā)明的變體或通過本發(fā)明的方法能夠獲得的變體；
[0043] -在乳制品的制備中根據(jù)本發(fā)明的變體乳糖酶或本發(fā)明的組合物的用途；
[0044] -生產(chǎn)乳制品的方法，所述方法包括向乳中添加有效量的根據(jù)本發(fā)明的變體乳糖 酶或本發(fā)明的組合物并且進行適當(dāng)?shù)倪M一步乳制品生產(chǎn)步驟;及
[0045] -能夠通過此類方法或用途獲得的乳制品。
[0046] 序列表簡述
[0047] SEQ ID N0:1列出了來自于乳酸克魯維酵母的野生型乳糖酶基因序列的核酸序列 [0048] SEQ ID N0:2列出了來自于乳酸克魯維酵母的乳糖酶序列的氨基酸序列
[0049] 發(fā)明詳述
[0050] 貫穿本說明書和所附權(quán)利要求，詞語"包含"、"包括"和"具有"應(yīng)包容性地解釋。 即，在上下文允許時，這些詞語旨在傳達可能包括未具體敘述的其它要素或整體。
[0051] 在本文中不使用數(shù)量詞修飾時用于指一個或一個以上（即一個或至少一個）的對 象。舉例而言，"要素"可意為一種要素或一種以上的要素。
[0052]在本文中，"乳糖酶"或β-半乳糖苷酶(E. C. 3.2.1.23)是一種催化乳糖(一種二糖） 水解成其組分單糖葡萄糖和半乳糖的酶。由于乳糖酶的轉(zhuǎn)移酶活性在這個反應(yīng)期間可形成 半乳-寡聚糖(G0S)。
[0053]在幼年哺乳動物的腸道中，以及在植物、真菌、酵母和細菌中，發(fā)現(xiàn)乳糖酶。
[0054] 乳糖酶可為中性或酸性乳糖酶。在一個優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的變體多肽具 有中性乳糖酶活性，即其具有介于pH=6和pH=8之間的最適pH。
[0055] 乳糖酶可為細胞內(nèi)或細胞外產(chǎn)生的乳糖酶。在一個優(yōu)選的實施方式中，乳糖酶是 細胞內(nèi)產(chǎn)生的乳糖酶。
[0056] 編碼乳糖酶(例如本發(fā)明的變體)的基因或cDNA可經(jīng)克隆并在宿主生物中過表達。 可用于乳糖酶過表達的公知宿主生物包括曲霉菌（Aspergillus)、克魯維酵母菌 (Kluyveromyce)、木霉(Trichoderma)、大腸桿菌(Escherichia coli )、畢赤酵母(Pichia)、 糖酵母（Saccharomyces)、耶氏酵母（Yarrowia)、鏈抱霉（Neurospora)、乳球菌 (Lactococcus)或桿菌（Bacillus) 〇
[0057] 在本文中，可取代以獲得本發(fā)明的變體的位置參照為乳酸克魯維酵母乳糖酶的 SEQIDN0:2定義。
[0058] 本發(fā)明涉及與具有乳糖酶活性的參考多肽相比，具有乳糖酶活性的變體多肽。參 考多肽通常可為具有乳糖酶活性的野生型多肽，例如SEQ ID N0:2或相關(guān)序列的乳糖酶。參 考多肽也可稱為親本多肽或?qū)Ρ榷嚯摹?br>[0059] 更具體地，本發(fā)明涉及具有乳糖酶活性的變體多肽，其中所述變體具有下述氨基 酸序列，在與包含SEQ ID N0:2中列出的序列的乳糖酶比對時，所述氨基酸序列包含對應(yīng)于 第
[0060] 233、257、258、263、274、284、297、415、440、483、619、621、622、633、862或1004位氨 基酸中的任一個的氨基酸殘基的至少一個取代，所述位置參照SEQ ID N0:2定義并且其中 所述變體與具有乳糖酶活性的參考多肽相比具有一種或多種改變的特性并且其中所述變 體與SEQ ID N0:2具有至少60%序列同一性。
[0061] 野生型參考多肽可從任何適合生物獲得。通常，野生型參考多肽可從微生物，優(yōu)選 其中自然產(chǎn)生乳糖酶的微生物獲得。
[0062] 此類微生物包括酵母例如克魯維酵母菌。參考多肽可為乳酸克魯維酵母野生型序 列。
[0063]優(yōu)選地，參考多肽為SEQ ID N0:2中列出的乳糖酶。
[0064] 如本文所描述的變體多肽通常為非自然存在的多肽。
[0065] 因此本發(fā)明提供了具有乳糖酶活性的變體多肽，其中所述變體具有下述氨基酸序 列，在與包含SEQ ID N0:2中列出的序列的乳糖酶比對時，所述氨基酸序列包含對應(yīng)于第
[0066] 233、257、258、263、274、284、297、415、440、483、619、621、622、633、862或1004位氨 基酸中的任一個的氨基酸殘基的至少一個取代，所述位置參照SEQ ID N0:2定義并且其中 所述變體與具有乳糖酶活性的參考多肽(例如SEQ ID N0:2的多肽)相比具有一種或多種改 變的特性并且其中所述變體與SEQ ID N0:2具有至少60%序列同一性。
[0067] 變體多肽與參考多肽相比通常將具有至少一種改良特性，尤其是就關(guān)于變體多肽 在制備乳制品的方法中的用途的特性而論。
[0068] 具體而言，改良特性可涉及活性或比活性或涉及半乳糖抑制的降低或在乳中更高 的G0S產(chǎn)量。
[0069] 表1列出了影響本發(fā)明的變體乳糖酶的具體特性的位置。
[0070] 表1:相對于SEQID N0:2定義的優(yōu)選取代。指出了不同特性如針對作為底物的0NPG 或乳糖的比活性、在低溫乳中的活性、半乳糖對乳糖酶活性抑制的降低及在乳中更高的半 乳-寡聚糖產(chǎn)量。
[0072] 本發(fā)明的變體多肽針對0NPG可展示出更高的比活性。
[0073] 本發(fā)明因此提供了一種具有乳糖酶活性的變體多肽，其中所述變體具有下述氨基 酸序列，在與包含SEQ ID N0:2中列出的序列的乳糖酶比對時，所述氨基酸序列包含對應(yīng)于 第
[0074] 233、257、258、263、274、284、297、415、440、483、619、621、622、633、862或1004位氨 基酸中的任一個的氨基酸殘基的至少一個取代，所述位置參照SEQ ID N0:2定義并且其中 所述變體與具有乳糖酶活性的參考多肽(例如SEQ ID N0:2的多肽)相比針對0NPG具有更高 的比活性并且其中所述變體與SEQ ID N0:2具有至少60%序列同一性。
[0075] 優(yōu)選地，本發(fā)明提供了一種具有乳糖酶活性的變體多肽，其中所述變體具有下述 氨基酸序列，在與包含SEQ ID N0:2中列出的序列的乳糖酶比對時，所述氨基酸序列包含對 應(yīng)于第415、483、619、621、622或633位氨基酸中的任一個的氨基酸殘基的至少一個取代， [0076]所述位置參照SEQ ID N0:2定義并且其中所述變體與具有乳糖酶活性的參考多肽 (例如SEQ ID N0: 2的多肽）相比針對0NPG具有更高的比活性并且其中所述變體與SEQ ID N0:2具有至少60%序列同一性。優(yōu)選對應(yīng)于第415和/或619位氨基酸中的任一個的氨基酸 殘基的至少一個取代，所述位置參照SEQ ID N0:2定義。
[0077] 更優(yōu)選地，本發(fā)明提供了一種具有乳糖酶活性的變體多肽，其中所述變體具有下 述氨基酸序列，在與包含SEQ ID N0:2中列出的序列的乳糖酶比對時，所述氨基酸序列包含 選自
[0078] 了415(：、了4154、44835、￥6191、1621￥、]\16221^或了6336的至少一個取代，
[0079]所述位置參照SEQ ID N0:2定義并且其中所述變體與具有乳糖酶活性的參考多肽 (例如SEQ ID N0: 2的多肽）相比針對0NPG具有更高的比活性并且其中所述變體與SEQ ID NO: 2具有至少60%序列同一性。優(yōu)選取代T415C和/或V619I，所述位置參照SEQ ID NO: 2定 義。
[0080] 本發(fā)明的另一種變體多肽針對乳糖可展示出更高的比活性。因為乳糖是乳制品中 乳糖酶的天然底物，所以變體多肽的更高比活性可導(dǎo)致酶的所需劑量減少并且因此可導(dǎo)致 處理成本更低。通過減少應(yīng)用中的酶劑量，也減少了增加的副活性的量，并且因此預(yù)期更高 品質(zhì)的最終乳制品。
[0081] 本發(fā)明因此提供了一種具有乳糖酶活性的變體多肽，其中所述變體具有下述氨基 酸序列，在與包含SEQ ID N0:2中列出的序列的乳糖酶比對時，所述氨基酸序列包含對應(yīng)于 第
[0082] 233、257、258、263、274、284、297、415、440、483、619、621、622、633、862或1004位氨 基酸中的任一個的氨基酸殘基的至少一個取代，所述位置參照SEQ ID N0:2定義并且其中 所述變體與具有乳糖酶活性的參考多肽(例如SEQ ID N0:2的多肽)相比針對乳糖具有更高 的比活性并且其中所述變體與SEQ ID N0:2具有至少60%序列同一性。
[0083] 優(yōu)選地，本發(fā)明提供了一種具有乳糖酶活性的變體多肽，其中所述變體具有下述 氨基酸序列，在與包含SEQ ID N0:2中列出的序列的乳糖酶比對時，所述氨基酸序列包含對 應(yīng)于第
[0084] 415、440或483位氨基酸中的任一個的氨基酸殘基的至少一個取代，所述位置參照 SEQ ID N0:2定義并且其中所述變體與具有乳糖酶活性的參考多肽(例如SEQ ID N0:2的多 肽)相比針對乳糖具有更高的比活性并且其中所述變體與SEQ ID N0:2具有至少60%序列 同一性。優(yōu)選對應(yīng)于第415和/或483位氨基酸中的任一個的氨基酸殘基的至少一個取代(這 種優(yōu)選是基于對包含取代組合的乳糖酶變體的分析），所述位置參照SEQ ID N0:2定義。
[0085] 更優(yōu)選地，本發(fā)明提供了一種具有乳糖酶活性的變體多肽，其中所述變體具有下 述氨基酸序列，在與包含SEQ ID N0:2中列出的序列的乳糖酶比對時，所述氨基酸序列包含 選自
[0086] T415C、T415A、Y440F 或 A483S 的至少一個取代，
[0087]所述位置參照SEQ ID N0:2定義并且其中所述變體與具有乳糖酶活性的參考多肽 (例如SEQ ID N0: 2的多肽）相比針對乳糖具有更高的比活性并且其中所述變體與SEQ ID 勵:2具有至少60%序列同一性。優(yōu)選取代了4154、了415(：和/或44833(這種優(yōu)選是基于對包含 取代組合的乳糖酶變體的分析），所述位置參照SEQ ID N0:2定義。
[0088] 甚至更優(yōu)選地，本發(fā)明提供了一種具有乳糖酶活性的變體多肽，其中所述變體具 有下述氨基酸序列，在與包含SEQ ID N0:2中列出的序列的乳糖酶比對時，所述氨基酸序列 包含對應(yīng)于第
[0089] 233、257、258、263、274、284、297、415、440、483、619、621、622、633、862或1004位氨 基酸中的任一個的氨基酸殘基的至少兩個、三個、四個或五個取代
[0090] 所述位置參照SEQ ID N0:2定義并且其中所述變體與具有乳糖酶活性的參考多肽 (例如SEQ ID N0: 2的多肽）相比針對乳糖具有更高的比活性并且其中所述變體與SEQ ID NO: 2具有至少60 %序列同一性。
[0091] 此類突變體的實例為表5中描述的突變體16、17、18、20、21、22、23、24、25、26、27、 28、29、30、31、32、33、34、35或36。
[0092]優(yōu)選在低溫下（優(yōu)選地所述低溫在4_12°C的范圍內(nèi)），本發(fā)明的再一種變體多肽可 針對乳中的乳糖展示出更高的活性。因為乳糖酶常常用于低溫乳中，所以在這種特定應(yīng)用 中變體多肽的活性增強可導(dǎo)致酶劑量降低，并且因此而降低成本。另外，變體多肽更高的活 性可導(dǎo)致乳加工時間減少并且因此而降低可能的微生物腐敗的風(fēng)險。
[0093] 本發(fā)明因此提供了一種具有乳糖酶活性的變體多肽，其中所述變體具有下述氨基 酸序列，在與包含SEQ ID N0:2中列出的序列的乳糖酶比對時，所述氨基酸序列包含對應(yīng)于 第
[0094] 233、257、258、263、274、284、297、415、440、483、619、621、622、633、862或1004位氨 基酸中的任一個的氨基酸殘基的至少一個取代，所述位置參照SEQ ID N0:2定義并且其中 所述變體與具有乳糖酶活性的參考多肽(例如SEQ ID N0:2的多肽)相比針對低溫乳中的乳 糖展示出增強的活性并且其中所述變體與SEQ ID N0:2具有至少60%序列同一性。
[0095] 優(yōu)選地，本發(fā)明提供了一種具有乳糖酶活性的變體多肽，其中所述變體具有下述 氨基酸序列，在與包含SEQ ID N0:2中列出的序列的乳糖酶比對時，所述氨基酸序列包含對 應(yīng)于第
[0096] 233、257、258、263、274、284、297、440、619、633、862或1004位氨基酸中的任一個的 氨基酸殘基的至少一個取代，
[0097]所述位置參照SEQ ID N0:2定義并且其中所述變體與具有乳糖酶活性的參考多肽 (例如SEQ ID N0:2的多肽)相比針對低溫乳中的乳糖展示出增強的活性并且其中所述變體 與SEQ ID N0:2具有至少60%序列同一性。優(yōu)選(至少)對應(yīng)于第440位氨基酸的氨基酸殘基 的取代，所述位置參照SEQ ID N0:2定義(這種優(yōu)選是基于對包含取代組合的乳糖酶變體的 分析）。優(yōu)選的取代組合是位置440和619處的取代。
[0098] 更優(yōu)選地，本發(fā)明提供了一種具有乳糖酶活性的變體多肽，其中所述變體具有下 述氨基酸序列，在與包含SEQ ID N0:2中列出的序列的乳糖酶比對時，所述氨基酸序列包含 選自
[0099] D233V、D257G、A258T、N263S、K274E、N284S、E297G、Y440F、V619I、T633G、L862VS A1004P的至少一個取代，
[0100]所述位置參照SEQ ID N0:2定義并且其中所述變體與具有乳糖酶活性的參考多肽 (例如SEQ ID N0:2的多肽)相比針對低溫乳中的乳糖展示出增強的活性并且其中所述變體 與SEQIDN0:2具有至少60%序列同一性。優(yōu)選取代為（至少)Y440F，所述位置參照SEQID N0: 2定義（這種優(yōu)選是基于對包含取代組合的乳糖酶變體的分析）。優(yōu)選的取代組合是 Y440F+V619L·
[0101] 雖然，對應(yīng)于第
[0102] 233、257、258、263、274、284、297、440、619、633、862或1004位氨基酸中的任一個的 氨基酸殘基的至少一個取代的存在(所述位置參照SEQ ID N0:2定義)足以獲得具有乳糖酶 活性并且針對低溫乳中的乳糖進一步顯示出增強的活性的變體多肽，但是本文顯示雙重突 變或三重突變多肽變體針對低溫乳中的乳糖也展示出增強的活性。
[0103] 因此，本發(fā)明還提供了一種具有乳糖酶活性的變體多肽，其中所述變體具有下述 氨基酸序列，在與包含SEQ ID N0:2中列出的序列的乳糖酶比對時，所述變體包含的氨基酸 序列在與SEQ ID腸：2中列出的序列比對時，包含選自263、274或284(更優(yōu)選地似633、 K274E或N284S)的至少兩個取代，所述位置參照SEQ ID N0:2定義并且其中所述變體與具有 乳糖酶活性的參考多肽(例如SEQ ID N0:2的多肽)相比針對低溫乳中的乳糖展示出增強的 活性并且其中所述變體與SEQ ID N0:2具有至少60%序列同一性。
[0104] 本發(fā)明還提供了一種具有乳糖酶活性的變體多肽，其中所述變體具有下述氨基酸 序列，在與包含SEQ ID N0: 2中列出的序列的乳糖酶比對時，所述變體包含的氨基酸序列在 與SEQ ID N0:2中列出的序列比對時，包含在位置263、274和284處的取代(更優(yōu)選地所述取 代為 N263S、K274E 和 N284S)
[0105] 所述位置參照SEQ ID N0:2定義并且其中所述變體與具有乳糖酶活性的參考多肽 (例如SEQ ID N0:2的多肽)相比針對低溫乳中的乳糖展示出增強的活性并且其中所述變體 與SEQ ID N0:2具有至少60%序列同一性。
[0106] 本發(fā)明還提供了一種具有乳糖酶活性的變體多肽，其中所述變體具有下述氨基酸 序列，在與包含SEQ ID N0: 2中列出的序列的乳糖酶比對時，所述變體包含的氨基酸序列在 與SEQ ID N0:2中列出的序列比對時，包含在位置257和297處的取代(優(yōu)選地所述取代為 D257G和E297G)，
[0107]所述位置參照SEQ ID N0:2定義并且其中所述變體與具有乳糖酶活性的參考多肽 (例如SEQ ID N0:2的多肽)相比針對低溫乳中的乳糖展示出增強的活性并且其中所述變體 與SEQ ID N0:2具有至少60%序列同一性。
[0108] 本發(fā)明還提供了一種具有乳糖酶活性的變體多肽，其中所述變體具有下述氨基酸 序列，在與包含SEQ ID N0:2中列出的序列的乳糖酶比對時，所述氨基酸序列包含對應(yīng)于第
[0109] 233、257、258、263、274、284、297、415、440、483、619、621、622、633、862或1004位氨 基酸中的任一個的氨基酸殘基的至少三個、四個或五個取代
[0110]所述位置參照SEQ ID N0:2定義并且其中所述變體與具有乳糖酶活性的參考多肽 (例如SEQ ID N0:2的多肽)相比針對低溫乳中的乳糖展示出增強的活性并且其中所述變體 與SEQ ID N0:2具有至少60%序列同一性。
[0111] 此類突變體的實例為表5中描述的突變體15、17、18、19、20、21或22。
[0112] 本發(fā)明的另一種突變多肽可展示出半乳糖抑制降低。在乳糖濃度低且半乳糖濃度 高時，半乳糖抑制導(dǎo)致在之后的時間點乳糖水解緩慢。因此將期望有半乳糖抑制降低的乳 糖酶，特別是在想要生產(chǎn)乳糖濃度低于〇. 5g/L的乳制品時。
[0113] 本發(fā)明因此提供了一種具有乳糖酶活性的變體多肽，其中所述變體具有下述氨基 酸序列，在與包含SEQ ID N0:2中列出的序列的乳糖酶比對時，所述氨基酸序列包含對應(yīng)于 第
[0114] 233、257、258、263、274、284、297、415、440、483、619、621、622、633、862或1004位氨 基酸中的任一個的氨基酸殘基的至少一個取代，所述位置參照SEQ ID N0:2定義并且其中 所述變體與具有乳糖酶活性的參考多肽(例如SEQ ID N0:2的多肽)相比展示出降低的半乳 糖抑制并且其中所述變體與SEQ ID NO:2具有至少60%序列同一性。
[0115] 優(yōu)選地，本發(fā)明提供了一種具有乳糖酶活性的變體多肽，其中所述變體具有下述 氨基酸序列，在與包含SEQ ID N0:2中列出的序列的乳糖酶比對時，所述氨基酸序列包含對 應(yīng)于第
[0116] 619、621或622位氨基酸中的任一個的氨基酸殘基的至少一個取代，所述位置參照 SEQ ID N0:2定義并且其中所述變體與具有乳糖酶活性的參考多肽(例如SEQ ID N0:2的多 肽)相比展示出降低的半乳糖抑制并且其中所述變體與SEQ ID N0:2具有至少60%序列同 一性。
[0117] 更優(yōu)選地，本發(fā)明提供了一種具有乳糖酶活性的變體多肽，其中所述變體具有下 述氨基酸序列，在與包含SEQ ID N0:2中列出的序列的乳糖酶比對時，所述氨基酸序列包含 選自
[0118] V619I、I621V 或 M622L 的至少一個取代，
[0119] 所述位置參照SEQ ID N0:2定義并且其中所述變體與具有乳糖酶活性的參考多肽 (例如SEQ ID N0:2的多肽)相比展示出降低的半乳糖抑制并且其中所述變體與SEQ ID N0: 2具有至少60 %序列同一性。
[0120] 本發(fā)明的另一種突變多肽可在乳中展示出增加的G0S產(chǎn)量。G0S(半乳-寡聚糖)是 被定義為不可消化的食品成分的益生元，其通過刺激結(jié)腸中有益菌的生長和/或活性而有 益地影響宿主。并非所有乳糖酶都同樣非常適于制備G0S。具有能夠在乳中存在的低乳糖濃 度(<50g/L)下積累G0S的另一種乳糖酶是所期望的。
[0121] 本發(fā)明因此提供了一種具有乳糖酶活性的變體多肽，其中所述變體具有下述氨基 酸序列，在與包含SEQ ID N0:2中列出的序列的乳糖酶比對時，所述氨基酸序列包含對應(yīng)于 第
[0122] 233、257、258、263、274、284、297、415、440、483、619、621、622、633、862或1004位氨 基酸中的任一個的氨基酸殘基的至少一個取代，所述位置參照SEQ ID N0:2定義并且其中 所述變體與具有乳糖酶活性的參考多肽(例如SEQ ID N0:2的多肽)相比在乳中展示出增加 的G0S產(chǎn)量并且其中所述變體與SEQ ID N0:2具有至少60%序列同一性。
[0123] 優(yōu)選地，本發(fā)明提供了一種具有乳糖酶活性的變體多肽，其中所述變體具有下述 氨基酸序列，在與包含SEQ ID N0:2中列出的序列的乳糖酶比對時，所述氨基酸序列包含對 應(yīng)于第
[0124] 619或622位氨基酸中的任一個的氨基酸殘基的至少一個取代，
[0125] 所述位置參照SEQ ID N0:2定義并且其中所述變體與具有乳糖酶活性的參考多肽 (例如SEQ ID N0: 2的多肽）相比在乳中展示出增加的G0S產(chǎn)量并且其中所述變體與SEQ ID NO: 2具有至少60 %序列同一性。
[0126] 更優(yōu)選地，本發(fā)明提供了一種具有乳糖酶活性的變體多肽，其中所述變體具有下 述氨基酸序列，在與包含SEQ ID N0:2中列出的序列的乳糖酶比對時，所述氨基酸序列包含 選自
[0127] V619I或M622L的至少一個取代，
[0128] 所述位置參照SEQ ID N0:2定義并且其中所述變體與具有乳糖酶活性的參考多肽 (例如SEQ ID NO: 2的多肽）相比在乳中展示出增加的GOS產(chǎn)量并且其中所述變體與SEQ ID NO :2具有至少60 %序列同一性。
[0129] 本發(fā)明的變體乳糖酶與親本相比在除以上指定位置外的位置處也可包含附加修 飾，例如，一個或多個附加取代、添加或缺失。本發(fā)明的變體可包含不同類型的這類修飾的 組合。變體可包含一個、兩個、三個、四個、至少5個、至少10個、至少15個、至少20個、至少25 個、至少30個或更多個此類修飾(其可全部為同一類型或可為不同類型的修飾）。通常，附加 修飾可為取代。因此本發(fā)明還提供了一種具有乳糖酶活性的變體多肽，其中所述變體具有 下述氨基酸序列，在與包含SEQ ID N0:2中列出的序列的乳糖酶比對時，所述氨基酸序列包 含對應(yīng)于第
[0130] 233、257、258、263、274、284、297、415、440、483、619、621、622、633、862或1004位氨 基酸中的任一個的氨基酸殘基的至少一個取代，所述位置參照SEQ ID N0:2定義，并且其中 所述變體與具有乳糖酶活性的參考多肽相比具有一種或多種改變的特性，并且其中所述變 體多肽包含除限定的那些取代以外的附加取代并且其中所述變體與SEQ ID N0:2具有至少 60 %序列同一性。
[0131] 根據(jù)本發(fā)明的變體(例如具有如表1或表2中列出的一個或多個取代的變體)與參 考乳糖酶多肽（例如SEQ ID勵:2的乳糖酶）可具有至少約60%、65%、70%、75%或80%同 源性/同一性，例如與親本多肽具有至少約85%同源性，例如與親本多肽具有至少約90%同 源性，與親本多肽具有至少95%同源性，與親本多肽具有至少約98%同源性或與親本多肽 具有至少約99%同源性。此類變體通常將具有如表1或表2中列出的一個或多個取代或多組 取代。
[0132] 因此本發(fā)明還提供了一種具有乳糖酶活性的變體多肽，其中所述變體具有下述氨 基酸序列，在與包含SEQ ID N0:2中列出的序列的乳糖酶比對時，所述氨基酸序列包含對應(yīng) 于第
[0133] 233、257、258、263、274、284、297、415、440、483、619、621、622、633、862或1004位氨 基酸中的任一個的氨基酸殘基的至少一個取代，所述位置參照SEQ ID N0:2定義并且其中 所述變體與具有乳糖酶活性的參考多肽相比具有一種或多種改變的特性并且其中所述變 體與SEQ ID N0:2具有至少80%序列同一性。
[0134] 本發(fā)明的變體通常將保留乳糖酶活性。即，本發(fā)明的變體通常將能夠?qū)⑷樘寝D(zhuǎn)化 為葡萄糖和半乳糖或本發(fā)明的變體通常將能夠?qū)⑷樘寝D(zhuǎn)化為葡萄糖和半乳糖并且能夠形 成G0S。本發(fā)明的變體是通常能夠進行乳糖的酶轉(zhuǎn)化并且可用于乳制品，例如乳或酸奶的制 備的變體。
[0135] 優(yōu)選地，本發(fā)明的變體與其所來源的參考乳糖酶多肽相比通常將表現(xiàn)出改良特 性。如果變體按照下文所述來使用的話，例如，在制備乳制品的方法中使用的話，此類改良 特性通常將是相關(guān)的性質(zhì)。
[0136] 表現(xiàn)出相對于參考乳糖酶改良的特性的多肽變體是在相關(guān)特性上展示出可測量 的降低或增加的多肽變體，通常使得變體更適合如下使用，例如用于生產(chǎn)乳制品的方法中。
[0137] 所述特性因此可降低至少10 %、至少20 %、至少30 %、至少40 %、至少50 %、至少 60 %、至少70 %、至少80 %、至少90 %、至少95 %或至少99 %?；蛘?，所述特性可增加至少 10%、至少25%、至少50%、至少100%、至少200%、至少500%或至少1000%。在這種情況下 降低或增加百分比表示與參考乳糖酶多肽比較的降低或增加百分比。技術(shù)人員熟知如何測 量此類百分比變化一其是對參考乳糖酶活性和變體乳糖酶活性的比較。
[0138] 本文描述的變體全體包含在術(shù)語"根據(jù)本發(fā)明的多肽"或"根據(jù)本發(fā)明的變體"中。
[0139] 術(shù)語"肽"和"寡肽"被認為是同義的（正如普遍公認的那樣)并且當(dāng)上下文需要指 出通過肽鍵偶聯(lián)的至少兩個氨基酸的鏈時，每個術(shù)語可交換使用。在本文中對于含有多于 約七個氨基酸殘基的鏈，使用詞"多肽"。本文中所有寡肽和多肽的式或序列均從左到右并 且從氨基末端至羧基末端的方向書寫。本文所用氨基酸的單字母代碼在本領(lǐng)域普遍已知并 且可以在Sambrook等（Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY, 1989)中找到。
[0140] 本發(fā)明的多肽可以為經(jīng)分離的形式，例如基本上經(jīng)分離的形式。"經(jīng)分離的"多肽 或蛋白質(zhì)意指從其天然環(huán)境中取出的多肽或蛋白質(zhì)。例如，出于本發(fā)明的目的，在宿主細胞 中表達的重組產(chǎn)生的多肽和蛋白被認為是經(jīng)過分離的，已用任何合適的技術(shù)進行了基本純 化的重組多肽也被認為是經(jīng)過分離的。可通過本領(lǐng)域已知的方法從重組細胞培養(yǎng)物中回收 和純化根據(jù)本發(fā)明的多肽變體。
[0141] 本發(fā)明的多肽包括化學(xué)合成過程的產(chǎn)物，及通過重組技術(shù)由原核宿主或真核宿主 (包括，例如，細菌、酵母、真菌、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞)產(chǎn)生的產(chǎn)物。取決于重組生 產(chǎn)過程中采用的宿主，本發(fā)明的多肽可為糖基化的或可為非糖基化的。另外，本發(fā)明的多肽 還可包括初始修飾的甲硫氨酸殘基，在一些情況下這由宿主介導(dǎo)的過程導(dǎo)致。
[0142] 本發(fā)明特征還在于根據(jù)本發(fā)明的多肽變體的生物活性片段。將此類片段視為涵蓋 在術(shù)語"本發(fā)明的變體"中。
[0143] 本發(fā)明的多肽變體的生物活性片段包括包含下述氨基酸序列的多肽，所述氨基酸 序列與本發(fā)明的變體蛋白的氨基酸序列足夠相同或源于本發(fā)明的變體蛋白的氨基酸序列， 所述片段包括的氨基酸較之全長蛋白要少，但顯示出相應(yīng)全長蛋白的至少一種生物活性。 通常，生物活性片段包含具有本發(fā)明的變體蛋白的至少一種活性的結(jié)構(gòu)域或基序。本發(fā)明 的蛋白質(zhì)的生物活性片段可以是長度為例如1〇、25、50、100個或更多個氨基酸的多肽。而 且，可以通過重組技術(shù)制備其中蛋白質(zhì)的其它區(qū)域缺失的其它生物活性部分并且針對本發(fā) 明的多肽的天然形式的一種或多種生物活性對其進行評價。
[0144] 通常，本發(fā)明的蛋白質(zhì)片段將包含本文限定的一個或多個取代。
[0145] 本發(fā)明特征還在于編碼以上生物活性片段的核酸片段(所述生物活性片段本身為 本發(fā)明的變體)。
[0146] 本發(fā)明還提供了一種編碼本發(fā)明的變體多肽的核酸序列。因此本發(fā)明還提供了編 碼具有乳糖酶活性的變體多肽的核酸序列，其中所述變體具有下述氨基酸序列，在與包含 SEQ ID N0:2中列出的序列的乳糖酶比對時，所述氨基酸序列包含對應(yīng)于第
[0147] 233、257、258、263、274、284、297、415、440、483、619、621、622、633、862或1004位氨 基酸中的任一個的氨基酸殘基的至少一個取代，所述位置參照SEQ ID N0:2定義并且其中 所述變體與具有乳糖酶活性的參考多肽(例如SEQ ID N0:2的多肽)相比具有一種或多種改 變的特性并且其中所述變體與SEQ ID N0:2具有至少60%序列同一性。
[0148] 本發(fā)明還涉及經(jīng)分離的多核苷酸，其編碼本發(fā)明的多肽變體的至少一種功能結(jié)構(gòu) 域。通常，此類結(jié)構(gòu)域?qū)疚拿枋龅囊粋€或多個取代。
[0149] 在本發(fā)明的一個實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的核酸序列編碼包含下述氨基酸序列的 多肽，其中，所述氨基酸序列較之親本乳糖酶而言具有一處或多處截短，和/或至少一處氨 基酸取代、缺失和/或插入。
[0150] 在本文中使用時，術(shù)語"基因"和"重組基因"是指包括編碼本文所述的變體的開放 閱讀框的核酸分子?；蚩砂ň幋a序列、非編碼序列、內(nèi)含子和調(diào)控序列。即，在本文中使 用時，"基因"可指本文所定義的經(jīng)分離的核酸分子。因此，在本申請的上下文中，術(shù)語"基 因"，不僅僅指天然存在的序列。
[0151] 可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的標準分子生物學(xué)技術(shù)連同本文提供的序列信息 來產(chǎn)生本發(fā)明的核酸分子。
[0152] 例如，使用標準的合成技術(shù)，可從頭合成所需的核酸分子。此類合成工藝通常將是 自動化工藝。
[0153] 或者，可通過使用現(xiàn)有核酸分子，例如野生型核酸分子的定點誘變來產(chǎn)生本發(fā)明 的核酸分子。可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的許多技術(shù)進行定點誘變。
[0154] 在一種此類方法中，這里僅以舉例的方式提到，使用編碼期望取代的寡核苷酸"弓丨 物"在質(zhì)粒模板上進行PCR。因為引物是新合成的鏈的末端，所以在第一個循環(huán)期間在結(jié)合 模板DNA鏈中應(yīng)存在錯配，在該第一輪之后，基于引物的鏈(含突變)將與原始模板的濃度相 等。連續(xù)循環(huán)之后，將呈指數(shù)增長，并且在800萬：1的區(qū)域內(nèi)在25個循環(huán)后將在數(shù)量上超過 原始未突變的鏈，從而產(chǎn)生經(jīng)突變的擴增片段的幾乎均勻的溶液。然后通過酶消化(例如使 用僅切割甲基化DNA的限制酶，例如Dpnl)而消除模板DNA。源自堿裂解質(zhì)粒制備并因此而甲 基化的模板在這個步驟中被破壞，但突變質(zhì)粒得到保存，因為它是在體外生成并且因此未 甲基化。
[0155] 在此類方法中，在單次PCR反應(yīng)中，例如通過使用各自包含一個或多個錯配的一個 或多個寡核苷酸可以向核酸分子中引入一個以上突變(編碼如本文所述的取代）。或者，可 通過進行一次以上的PCR反應(yīng)向核酸分子中引入一個以上突變，每次反應(yīng)引入一個或多個 突變，從而以連續(xù)、重復(fù)的方式向核酸中引入改變的核酸。
[0156] 可使用cDNA、mRNA或者基因組DNA作為模板和恰當(dāng)?shù)腻e配寡核苷酸引物根據(jù)上述 定點誘變技術(shù)生成本發(fā)明的核酸。以這種方式得到的核酸分子可克隆到恰當(dāng)載體中并通過 DNA序列分析表征。
[0157] 本發(fā)明的核酸序列與親本乳糖酶相比，可包含一個或多個缺失，即空位。此類缺 失/空位也可使用定點誘變，使用恰當(dāng)?shù)墓押塑账嵘?。生成此類缺失的技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù) 人員公知。
[0158] 此外，對應(yīng)于本發(fā)明的核苷酸序列或可與本發(fā)明的核苷酸序列雜交的寡核苷酸可 通過標準的合成技術(shù)，例如使用自動化DNA合成儀制備。
[0159]此外，互補核酸分子包括在本發(fā)明中。與另一核苷酸序列互補的核酸分子是與另 一核苷酸序列充分互補，使其可以與另一核苷酸序列雜交，從而形成穩(wěn)定雙鏈體的核酸分 子。
[0160]本發(fā)明的一個方面涉及編碼本發(fā)明的變體或其生物活性片段或結(jié)構(gòu)域的經(jīng)分離 的核酸分子，以及足以用作雜交探針以鑒定編碼本發(fā)明的多肽的核酸分子的核酸分子及適 于用作PCR引物用于核酸分子的擴增或突變(例如用于本發(fā)明的核酸分子的制備）的此類核 酸分子的片段。
[0161] "經(jīng)分離的多核苷酸"或"經(jīng)分離的核酸"是并非緊鄰在其所來源的生物自然存在 的基因組中與之緊鄰的兩個編碼序列（一個在5'末端另一個在3'末端）的DNA或RNA。因此， 在一個實施方式中，經(jīng)分離的核酸包括緊鄰編碼序列的一些或所有5'非編碼(例如，啟動 子)序列。因此該術(shù)語包括，例如，并入到載體、自主復(fù)制質(zhì)?；虿《净蛟松锘蛘婧松?的基因組DNA中的重組DNA或獨立于其它序列、作為單獨分子(例如，通過PCR或限制性內(nèi)切 核酸酶處理產(chǎn)生的基因組DNA片段)存在的重組DNA。還包括是編碼基本上不含細胞物質(zhì)、病 毒物質(zhì)或培養(yǎng)基(通過重組DNA技術(shù)產(chǎn)生時)或化學(xué)前體或其它化學(xué)品（經(jīng)化學(xué)合成時）的附 加多肽的雜合基因的一部分的重組DNA。而且，"經(jīng)分離的核酸片段"是并非作為片段自然存 在并且不會在自然狀態(tài)下找到的核酸片段。
[0162] 在本文中使用時，術(shù)語"多核苷酸"或"核酸分子"旨在包括DNA分子(例如，cDNA或 基因組DNA)和RNA分子(例如，mRNA)及使用核苷酸類似物生成的DNA或RNA的類似物。核酸分 子可為單鏈或雙鏈，但是優(yōu)選為雙鏈DNA?？墒褂霉押塑账犷愃莆锘蜓苌?例如，肌苷或硫 代磷酸酯核苷酸)合成核酸。此類寡核苷酸可用于，例如，制備具有改變的堿基配對能力或 增強的核酸酶抗性的核酸。
[0163] 本發(fā)明的另一個實施方式提供了與本發(fā)明的核酸分子反義的經(jīng)分離核酸分子。
[0164] 術(shù)語"同源性"或"同一性百分比"在本文中可交換使用。為了本發(fā)明的目的，在本 文中為了測定兩個氨基酸序列或兩個核酸序列的同一性百分比，出于最佳比較的目的而比 對序列（例如，可以在第一氨基酸或核酸的序列中引入空位以與第二氨基酸或核酸序列最 佳比對）。然后比較在相應(yīng)氨基酸或核苷酸位置的氨基酸或核苷酸殘基。當(dāng)?shù)谝恍蛄兄械奈?置被與第二序列中的相應(yīng)位置相同的氨基酸或核苷酸殘基占據(jù)時，則分子在該位置相同。 兩個序列之間的同一性百分比是序列共有相同位置數(shù)量的函數(shù)（即，同一性％=相同位置 的數(shù)量/位置(即重疊位置)的總數(shù)xlOO)。優(yōu)選地，兩個序列為相同長度。
[0165] 可在比較的兩個序列的整個長度上或在兩個序列的片段上進行序列比較。通常， 將在比較的兩個序列的全長上進行比較。然而，可在例如，二十、五十、一百個或更多個連續(xù) 氨基酸殘基的區(qū)域上進行序列同一性。
[0166] 技術(shù)人員將意識到幾種不同的計算機程序可用于測定兩個序列之間的同源性的 事實。例如，序列的比較和兩個序列之間同一性百分比的測定可以使用數(shù)學(xué)算法完成。在一 個優(yōu)選的實施方式中，使用已經(jīng)并入Accelrys GCG軟件包(在http ://www.accelrys. com/ products/gcg/上可用）中的GAP程序中的Needleman和Wunsch( J.Mol · Biol · (48): 444-453 (1970))算法，使用Blosum 62矩陣或PAM250矩陣及16、14、12、10、8、6或4的空位權(quán)重和1、2、 3、4、5或6的長度權(quán)重測定兩個氨基酸或核酸序列之間的同一性百分比。技術(shù)人員將認識到 所有這些不同的參數(shù)將產(chǎn)生略有不同的結(jié)果，但是使用不同算法時兩個序列的總體同一性 百分比無顯著改變。
[0167] 本發(fā)明的蛋白質(zhì)序列或核酸序列可進一步用作"查詢序列"以進行對公用數(shù)據(jù)庫 的搜索以（例如）鑒定其它家族成員或相關(guān)序列。此類搜索可使用Altschul等人（1990) 夂]?〇13丨〇1.215:403-10的^^5了財口81^5了?程序(2.0版本)進行?？捎?1^5了?程序、得分= 50、字長=3進行BLAST蛋白質(zhì)搜索以獲得與本發(fā)明的蛋白質(zhì)分子同源的氨基酸序列。出于 比較的目的，為獲得空位比對，如Altschul等人（1997)Nucleic Acids ResJSdThSSSg-SdO 2 中所述 ，可利 用空位BLAST 。 當(dāng)利用BLAST 和空位 BLAST 程序時 ，可以 使用各個程序 (例如 BLASTP和BLASTN)的默認參數(shù)。參見http://www.ncbi · nlm.nih.gov/上國家生物技術(shù)信息 中心（National Center for Biotechnology Information)的主頁。
[0168] 本發(fā)明還提供了一種核酸構(gòu)建體，其包含編碼具有乳糖酶活性的變體多肽的核酸 序列，其中所述變體具有下述氨基酸序列，在與包含SEQ ID N0:2中列出的序列的乳糖酶比 對時，所述氨基酸序列包含對應(yīng)于第
[0169] 233、257、258、263、274、284、297、415、440、483、619、621、622、633、862或1004位氨 基酸中的任一個的氨基酸殘基的至少一個取代，所述位置參照SEQ ID N0:2定義并且其中 所述變體與具有乳糖酶活性的參考多肽(例如SEQ ID N0:2的多肽)相比具有一種或多種改 變的特性并且其中所述變體與SEQ ID N0:2具有至少60%序列同一性，其中所述核酸序列 與能夠指導(dǎo)乳糖酶在合適表達宿主細胞中的表達的一個或多個控制序列可操作性連接。
[0170] 本發(fā)明的另一個方面涉及含有編碼本發(fā)明的變體乳糖酶多肽的核酸的載體，優(yōu)選 表達載體。
[0171]在本文中使用時，術(shù)語"載體"是指能夠?qū)⒘硪缓怂徂D(zhuǎn)運到與之相連的核酸上的核 酸分子。一種類型的載體為"質(zhì)粒"，是指附加 DNA區(qū)段可連入其中的環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)。另一種 類型的載體為病毒載體，其中附加 DNA區(qū)段可連入病毒基因組中。某些載體能夠在其被引入 的宿主細胞中自主復(fù)制（例如，具有細菌復(fù)制起點的細菌載體和附加型哺乳動物載體）。其 它載體(例如，非附加型哺乳動物載體)在引入宿主細胞之后整合到宿主細胞的基因組中， 并從而連同宿主基因組一起復(fù)制。而且，某些載體能夠指導(dǎo)與之可操作性連接的基因的表 達。本文將此類載體稱為"表達載體"。一般而言，用于重組DNA技術(shù)的表達載體常常呈質(zhì)粒 形式。術(shù)語"質(zhì)粒"和"載體"在本文中可交換使用，因為質(zhì)粒是最常用的載體形式。然而，本 發(fā)明旨在包括此類其它形式的表達載體，例如起到等效功能的病毒載體(例如，復(fù)制缺陷型 逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒）。
[0172] 本發(fā)明的重組表達載體包含呈適于核酸在宿主細胞中表達的形式的本發(fā)明的核 酸，這意味著重組表達載體包括基于要用于表達的宿主細胞而選擇的、與要表達的核酸序 列可操作性連接的一個或多個調(diào)控序列。在重組表達載體中，"可操作性連接"旨在表示目 標核苷酸序列以允許核苷酸序列表達(例如，在體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)中或當(dāng)載體引入宿主細 胞時在宿主細胞中）的方式與調(diào)控序列連接。術(shù)語"調(diào)控序列"旨在包括啟動子、增強子和其 它表達控制元件（例如，多聚腺苷酸化信號）。例如，在Goeddel ; Gene Express ion Technology:Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego，CA( 1990)中描述 了此類調(diào)控序列。調(diào)控序列包括指導(dǎo)核苷酸序列在許多類型的宿主細胞中的組成型表達的 調(diào)控序列及指導(dǎo)核苷酸序列僅在某一種宿主細胞中的表達的調(diào)控序列（例如，組織特異性 調(diào)控序列）。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將認識到，表達載體的設(shè)計可取決于諸如要轉(zhuǎn)化的宿主細胞 的選擇、期望蛋白質(zhì)的表達水平等因素。本發(fā)明的表達載體可引入宿主細胞中，從而產(chǎn)生如 本文所述的核酸所編碼的蛋白質(zhì)或肽(例如，SEQ ID N0: 2的乳糖酶變體，例如功能等同物 或片段、或包含一個或多個此類變體的融合蛋白）。
[0173] 本發(fā)明的重組表達載體可設(shè)計為本發(fā)明的變體蛋白在原核細胞或真核細胞中表 達。例如，本發(fā)明的變體蛋白可以在細菌細胞例如大腸桿菌、昆蟲細胞(使用桿狀病毒表達 載體）、酵母細胞或哺乳動物細胞中表達。在Goeddel，Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego,CA(1990)中進一步討論了適合 的宿主細胞。或者，重組表達載體可以在體外轉(zhuǎn)錄和翻譯，例如使用T7啟動子調(diào)控序列和T7 聚合酶。
[0174]用于本發(fā)明的表達載體包括染色體來源的載體、附加體來源的載體和病毒來源的 載體，例如源自細菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母附加體、酵母染色體元件、病毒例如桿狀病毒、乳多 空病毒、牛痘病毒、腺病毒、禽痘病毒、假狂犬病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒的載體，及源自其組合的載 體，例如源自質(zhì)粒和噬菌體遺傳元件(例如粘粒和噬菌粒)的載體。
[0175] DNA插入物應(yīng)與適當(dāng)?shù)膯幼?，例如菌體ApL啟動子，大腸桿菌lac、trp和tac啟 動子，SV40早期和晚期啟動子和逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR啟動子等可操作性連接。其它適合的啟動子 將為技術(shù)人員所知。在一個特定實施方式中，優(yōu)選能夠指導(dǎo)乳糖酶在絲狀真菌中的高表達 水平的啟動子。此類啟動子在本領(lǐng)域已知。表達構(gòu)建體可含有用于轉(zhuǎn)錄起始、終止的位點， 并且在轉(zhuǎn)錄區(qū)域中，含有用于翻譯的核糖體結(jié)合位點。構(gòu)建體表達的成熟轉(zhuǎn)錄物的編碼部 分將包括在起點處的翻譯起始AUG和適當(dāng)?shù)匚挥谝g的多肽末端的終止密碼子。
[0176] 載體DNA可經(jīng)由傳統(tǒng)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染技術(shù)引入原核細胞或真核細胞中。在本文中使用 時，術(shù)語"轉(zhuǎn)化"和"轉(zhuǎn)染"意在指各種本領(lǐng)域公認的將外源核酸(例如，DNA)引入宿主細胞的 技術(shù)，包括磷酸鈣或氯化鈣共沉淀、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)、感染、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染、陽離子 脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染或電穿孔。在Sambrook等人(Molecular Cloning:ALaboratory Manual， 2nd,ed.Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)，Davis等人Basic Methods in Molecular Biology(1986)和其 它實驗室手冊中可以找到轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細胞的適合方法。
[0177] 對于哺乳動物細胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，已知取決于所用的表達載體和轉(zhuǎn)染技術(shù)，僅一小 部分細胞可將外源DNA整合到其基因組中。為了鑒定和選擇這些組成部分，通常將編碼選擇 性標記(例如，抗生素抗性）的基因連同目的基因一起引入宿主細胞。優(yōu)選的選擇性標記包 括賦予對藥物，例如G418、潮霉素(hygromycin)和甲氨蝶呤(methatrexate)的抗性的選擇 性標記?？蓪⒕幋a選擇性標記的核酸引入宿主細胞內(nèi)與編碼本發(fā)明的變體蛋白的核酸相同 的載體上或可引入單獨載體上?？赏ㄟ^藥物選擇鑒定經(jīng)引入的核酸穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞(例如 已經(jīng)并入選擇性標記基因的細胞將存活，而其它細胞死亡）。
[0178]蛋白質(zhì)在原核生物中的表達常常在具有含有指導(dǎo)融合蛋白或非融合蛋白表達的 組成型啟動子或誘導(dǎo)型啟動子的載體的大腸桿菌中進行。融合載體向其中編碼的蛋白質(zhì)， 例如向重組蛋白的氨基末端添加了許多氨基酸。此類融合載體通常起到三種用途：1)增加 重組蛋白的表達;2)增加重組蛋白的溶解性;和3)通過在親和純化中起到配體的作用而有 助于重組蛋白的純化。常常，在融合表達載體中，在融合部分和重組蛋白的接合處引入蛋白 水解切割位點以使得在融合蛋白純化之后重組蛋白能夠與融合部分分離。
[0179]如本文所示，表達載體將優(yōu)選含有選擇性標記。此類標記包括:用于真核細胞培養(yǎng) 的二氫葉酸還原酶或新霉素抗性，以及用于在大腸桿菌和其它細菌中培養(yǎng)的四環(huán)素或氨芐 青霉素抗性。恰當(dāng)宿主的代表性實例包括細菌細胞，例如大腸桿菌、鏈霉菌 (Streptomyces)、鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium)和某些芽抱桿菌(Bacillus) 種，例如枯草芽孢桿菌(13.811131：；[118)、解淀粉芽孢桿菌(13.311171011卩1161^(^6118)、地衣芽孢 桿菌（B. licheniformis)和克勞氏芽孢桿菌（B.clausii);真菌細胞例如曲霉菌 (八8卩6找；111118)種，例如黑曲霉(厶.111861')、米曲霉(厶.(^5^&6)和構(gòu)巢曲霉(厶.111(1111&118)， 和/或鐮孢菌(Fusarium)種例如鑲片鐮孢菌(F · venenatum)，和/或木霉菌(Trichoderma)種 例如里氏木霉(T.reesei);酵母細胞例如克魯維酵母菌，例如乳酸克魯維酵母和馬克斯克 魯維酵母(K.marxianus)和/或畢赤酵母，例如畢赤氏巴斯德酵母(P.pastoris)和/或糖酵 母，例如釀酒酵母（S . cerevisiae)，和/或漢遜酵母（Hansenula)，例如多形漢遜酵母 (H.polymorpha);昆蟲細胞例如果繩S2(Drosophila S2)和草地貪夜蛾Sf9(Spodoptera Sf9);動物細胞例如CH0、C0S和Bowes黑色素瘤;及植物細胞。適于上述宿主細胞的培養(yǎng)基和 條件在本領(lǐng)域已知。
[0180] 優(yōu)選用于細菌的載體是例如W0-Al-2004/074468(通過引用并入本文）中所公開的 那些。其它適合的載體對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。
[0181] 適用于本發(fā)明的已知的細菌啟動子包括W0-Al-2004/074468(通過引用并入本文） 中公開的啟動子。
[0182] 可通過將增強子序列插入載體中而增加高等真核生物對編碼本發(fā)明的變體的DNA 的轉(zhuǎn)錄。增強子為DNA的順式作用元件，通常約10至300bp，其在指定宿主細胞類型中起到增 加啟動子轉(zhuǎn)錄活性的作用。增強子的實例包括位于復(fù)制起點后側(cè)100至270bp處的SV40增強 子、巨細胞病毒早期啟動子增強子、復(fù)制起點后側(cè)的多瘤病毒增強子和腺病毒增強子。
[0183] 為了使翻譯的蛋白質(zhì)分泌到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔、細胞周質(zhì)間隙或細胞外環(huán)境中，可將恰當(dāng) 的分泌信號并入表達的多肽中。信號對多肽而言可以是內(nèi)源的或其可為異源信號。
[0184] 本發(fā)明的變體可呈使其可包括附加異源功能區(qū)（例如分泌信號）的形式表達。本發(fā) 明的變體也可包含，例如，添加到多肽N-端的附加氨基酸(尤其是帶電氨基酸)的區(qū)域，例如 用以提高在純化期間或在后續(xù)處理和儲存期間在宿主細胞內(nèi)的穩(wěn)定性和持久性。此外，可 向本發(fā)明的變體添加肽部分以促進純化，例如通過添加組氨酸殘基或T7標簽。
[0185] 本發(fā)明的變體，例如本發(fā)明的蛋白質(zhì)或其功能等同物，例如其生物活性部分和片 段，可以與非變體多肽(例如，異源氨基酸序列)可操作性連接以形成融合蛋白。關(guān)于這一點 "非變體多肽"是指具有對應(yīng)于和本發(fā)明的變體乳糖酶并非基本上同源的蛋白質(zhì)的氨基酸 序列的多妝。
[0186] 在融合蛋白中，本發(fā)明的變體可與本發(fā)明的多肽的全長序列或生物活性片段相對 應(yīng)。在一個優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明的融合蛋白包含至少兩個生物活性部分。在融合蛋白 中，術(shù)語"可操作性連接"旨在表明變體多肽和非變體多肽以符合讀碼框的方式相互融合。 非變體多肽可與變體多肽的N-端或C-端融合。
[0187] 可通過使變體呈融合蛋白的形式表達而增強變體乳糖酶的表達和分泌。關(guān)于這一 點，核酸序列可編碼包含乳糖酶的融合蛋白。更具體地，融合伴侶可為葡糖淀粉酶或其片 段。在一個實施方式中，乳糖酶或其融合蛋白經(jīng)過宿主細胞膜分泌。
[0188] 例如，在一個實施方式中，融合蛋白是其中變體序列與GST序列的C-端融合的融合 蛋白。此類融合蛋白可促進根據(jù)本發(fā)明的重組變體的純化。在另一個實施方式中，融合蛋白 是在其N-端含有異源信號序列的本發(fā)明的變體。在某些宿主細胞(例如，哺乳動物和酵母宿 主細胞)中，可通過使用異源信號序列而增加本發(fā)明的變體的表達和/或分泌。
[0189]在另一實例中，桿狀病毒包膜蛋白的gp67分泌序列可用作異源信號序列（Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel等人編，John Wiley&Sons，1992)。真核異源信 號序列的其它實例包括蜂毒肽和人胎盤堿性磷酸酶的分泌序列（Stratagene;La Jolla， California)。再一實例中，有用的原核異源信號序列包括phoA分泌信號(Sambrook等人，同 上）和蛋白質(zhì)A分泌信號（Pharmacia Biotech;Piscataway，New Jersey)。
[0190] 信號序列可用于促進本發(fā)明的變體的分泌和分離。信號序列通常特征在于疏水性 氨基酸的核，其通常在分泌期間在一個或多個切割事件中從成熟蛋白上被切割掉。此類信 號肽含有在其通過分泌途徑時允許信號序列從成熟蛋白上被切割掉的加工位點。信號序列 可指導(dǎo)變體分泌，例如從轉(zhuǎn)化進表達載體的真核宿主分泌，信號序列可隨后或同時被切割 掉。然后可通過已知方法容易地從胞外介質(zhì)純化本發(fā)明的變體。或者，可使用促進純化的序 列，例如用GST結(jié)構(gòu)域?qū)⑿盘栃蛄羞B接到目標變體上。因此，例如，編碼本發(fā)明的變體的序列 可與標記序列，例如編碼促進本發(fā)明融合變體的純化的肽的序列融合。在本發(fā)明這個方面 的某些優(yōu)選實施方式中，標記序列為六-組氨酸肽，例如PQE載體(Qiagen，Inc.)中提供的標 簽，其中，許多在市場上可買到。如Gentz等人，Proc. Natl .Acad. Sci .USA 86:821-824 (1989)中所述，例如，六-組氨酸提供了對融合蛋白的方便純化。HA標簽是用于純化的另一 種肽，其與已經(jīng)由例如Wi 1 son等人，Ce 11 37:767 (1984)描述的源自流感病毒血凝素蛋白的 表位相對應(yīng)。
[0191] 本發(fā)明的融合蛋白可通過標準的重組DNA技術(shù)生成。例如，根據(jù)常規(guī)技術(shù)將編碼不 同多肽序列的DNA片段以符合讀碼框的方式連接在一起，例如通過采用平末端或交錯切口 末端進行連接，采用限制性酶消化以提供適當(dāng)末端，視情況而定填充粘性末端，采用堿性磷 酸酶處理以避免不期望的連接，及采用酶促連接。在另一實施方式中，可通過常規(guī)技術(shù)包括 自動化DNA合成儀合成融合基因?；蛘撸梢允褂缅^定引物來對基因片段進行PCR擴增，所述 引物能在兩個連續(xù)的基因片段之間產(chǎn)生互補突出端，隨后可以進行退火和再次擴增以產(chǎn)生 嵌合基因序列（參見，例如，Current Protocols in Molecular Biology，編輯Ausubel等人 John Wiley&Sons: 1992)。而且，已經(jīng)編碼融合部分(例如，GST多肽)的許多表達載體在市場 上可買到。可將編碼變體的核酸克隆到此類表達載體中，使得融合部分以符合讀碼框的方 式與所述變體連接。
[0192] 術(shù)語"功能等同物"和"功能變體"在本文中可交換使用。根據(jù)本發(fā)明的功能等同物 是編碼表現(xiàn)出如本文所定義的變體的特定功能的多肽的經(jīng)分離的DNA片段。因此功能等同 物也涵蓋生物活性片段并且本身涵蓋在本發(fā)明的術(shù)語"變體"中。
[0193] 優(yōu)選地，本發(fā)明的功能等同物包含本文所述的一個或多個取代。然而，除上述取代 外，功能等同物可包含一個或多個修飾。
[0194] 功能核酸等同物通?？珊谐聊蛔兓虿桓淖兙幋a的多肽的生物學(xué)功能的突變。 因此，本發(fā)明提供了編碼含有對特定生物活性并非必需的氨基酸殘基的變化的變體乳糖酶 蛋白的核酸分子。此類變體蛋白在氨基酸序列上不同于它們所來源的親本乳糖酶序列，而 保持其至少一種生物活性，優(yōu)選地它們至少保持乳糖酶活性。在一個實施方式中，經(jīng)分離的 核酸分子包含編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列，其中所述蛋白質(zhì)包含與參考氨基酸序列（例如SEQ ID 吣:2中所示的序列）至少約60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、 98%、99%或更高同源的基本上同源的氨基酸序列。
[0195] 如本文所定義，術(shù)語"基本上同源"是指第一氨基酸或核苷酸序列含有足夠或最小 數(shù)量的與第二氨基酸或核苷酸序列相同或等同（例如，具有類似側(cè)鏈）的氨基酸或核苷酸， 使得第一和第二氨基酸或核苷酸序列具有共同結(jié)構(gòu)域。例如，含有具有約60%，優(yōu)選65%， 更優(yōu)選70%，甚至更優(yōu)選75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性或更 高的共同結(jié)構(gòu)域的氨基酸或核苷酸序列本文定義為足夠相同。
[0196] 技術(shù)人員將認識到，可通過突變向根據(jù)本發(fā)明的核苷酸序列引入變化，從而在所 得蛋白質(zhì)的氨基酸序列中產(chǎn)生變化，而基本上不改變此類蛋白質(zhì)的功能。
[0197] 因此，本發(fā)明的乳糖酶變體優(yōu)選為包含與參考氨基酸序列（例如SEQ ID N0:2中所 示的序列）至少約 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或 更高同源的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，并且通常還保持了參考多肽的至少一種功能活性。也可 (例如)通過篩選本發(fā)明蛋白質(zhì)的突變體，例如截短突變體的組合文庫的乳糖酶活性而鑒定 本發(fā)明的變體，例如根據(jù)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的功能等同物。在一個實施方式中，通過在核酸水 平上的組合誘變產(chǎn)生變體的多樣化文庫。通過(例如)將合成寡核苷酸混合物酶促連接到基 因序列中，使得一組簡并的潛在蛋白質(zhì)序列可作為單獨多肽或者作為一組更大的融合蛋白 (例如對于噬菌體展示而言)表達，從而產(chǎn)生變體的多樣化文庫。存在可以用于由簡并寡核 苷酸序列產(chǎn)生本發(fā)明多肽的潛在變體文庫的各種方法。合成簡并寡核苷酸的方法在本領(lǐng)域 已知（參見，例如，Narang( 1983 )Tetrahedron 39 : 3 ; Itakura 等人（1984) Annu .Rev.Biochem.53:323; Itakura等人（1984)Science 198:1056;Ike 等人（1983) Nucleic Acid Res.ll:477)〇
[0198] 另外，編碼本發(fā)明多肽的序列的片段文庫可用于產(chǎn)生多樣化的多肽群用于篩選隨 后的變體選擇。例如，可以如下產(chǎn)生編碼序列片段的文庫:通過在其中每個分子大約僅發(fā)生 一次切刻的條件下用核酸酶處理目標編碼序列的雙鏈PCR片段，使雙鏈DNA變性，使DNA復(fù)性 以形成可包括來自于不同切刻產(chǎn)物的有義/反義對的雙鏈DNA，通過用S1核酸酶處理從重新 形成的雙鏈體去除單鏈部分，并且將所得片段文庫連接到表達載體中。通過這種方法，可得 到編碼目標蛋白質(zhì)不同大小的N-端和內(nèi)部片段的表達文庫。
[0199] 在本領(lǐng)域中已知有幾種技術(shù)用于篩選通過截短的點突變而產(chǎn)生的組合文庫的基 因產(chǎn)物，和用于篩選cDNA文庫中具有選定特性的基因產(chǎn)物。用于篩選大基因文庫的、適用于 高通量分析的、最廣泛使用的技術(shù)通常包括:將基因文庫克隆到可復(fù)制的表達載體中，用所 得載體文庫轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)募毎?，和在下述條件下表達組合基因，所述條件下期望活性的檢測 促進編碼其產(chǎn)物被檢測到的基因的載體的分離。遞歸整體誘變（Recursive ensemble mutagenesis，REM)，一種增強文庫中功能突變體頻率的技術(shù)，可以與篩選試驗組合使用以 鑒定本發(fā)明蛋白質(zhì)的變體(Arkin和Yourvan( 1992)Proc ·Natl · Acad· Sci ·USA 89 : 7811-7815 ;Delgrave等人（1993)Protein Engineering6(3): 327-331) 〇
[0200] 根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸的片段還可包含不編碼功能性多肽的多核苷酸。此類多核 苷酸可起到用于PCR反應(yīng)的探針或引物的作用。
[0201] 根據(jù)本發(fā)明的核酸，不管它們是否編碼功能多肽或非功能性多肽，均可用作雜交 探針或聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)引物。不編碼具有乳糖酶活性的多肽的本發(fā)明核酸分子的用 途尤其包括(1)與中期染色體涂片原位雜交(例如FISH)以提供乳糖酶編碼基因的精確染色 體定位，如Verma等人，Human Chromosomes : a Manual of Basic Techniques，Pergamon ?^88，如*￥〇4(1988)所述；（2州〇1'1:1161'11印跡分析，用于檢測乳糖酶1111?祖在特定組織和/ 或細胞中的表達;和(3)可作為診斷工具使用的引物和探針，以分析能在給定的生物(例如， 組織)樣品中與此類探針或引物雜交的核酸是否存在。
[0202]可通過以下標準程序獲得給定參考乳糖酶的變體：
[0203]-變體的合成或誘變（易錯、摻雜寡核苷酸(doped oligo)、示蹤寡核苷酸（spiked oligo))
[0204] -在例如大腸桿菌或乳酸克魯維酵母中轉(zhuǎn)化
[0205] -轉(zhuǎn)化株的培養(yǎng)、轉(zhuǎn)化株的選擇
[0206] -表達
[0207] -任選的純化和濃縮
[0208] -初步篩選
[0209] -改良變體(例如，關(guān)于比活性)的鑒定。
[0210] 在一個實施方式中，本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明的乳糖酶多肽變體的方法， 所述方法包括：
[0211] a)選擇參考乳糖酶多肽；
[0212] b)取代對應(yīng)于 233、257、258、263、274、284、297、415、440、483、619、621、622、633、 862或1004中的任一個的至少一個氨基酸殘基，
[0213] 所述位置參照SEQ ID N0:2定義；
[0214] c)任選地取代如b)中所限定的一個或多個另外的氨基酸；
[0215] d)制備由步驟a)_c)產(chǎn)生的變體；
[0216] e)確定所述變體的特性，例如如實施例中所示；
[0217] f)選擇與參考乳糖酶多肽相比具有改變的特性的變體，并且其中所述變體與SEQ ID N0:2具有至少60%序列同一性。
[0218] 在生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明的乳糖酶多肽變體的方法中的優(yōu)選實施方式中，參考乳糖酶多 肽具有SEQ ID N0:2中列出的序列。
[0219] 更優(yōu)選地在根據(jù)本發(fā)明的方法的步驟b)中，取代對應(yīng)于
[0220] 233、257、258、263、274、284、297、415、440、483、619、621、622、633、862或1004中的 任一個的至少一個氨基酸殘基，
[0221] 所述位置參照SEQ ID N0:2定義。參考多肽可與SEQ ID N0: 2具有至少約80%同源 性。
[0222] 在另一個實施方式中，本發(fā)明特征在于含有本發(fā)明所涵蓋的核酸的細胞，例如經(jīng) 轉(zhuǎn)化的宿主細胞或重組宿主細胞。"經(jīng)轉(zhuǎn)化的細胞"或"重組細胞"是已經(jīng)借助于重組DNA技 術(shù)向其中（或向其祖代中）引入了根據(jù)本發(fā)明的核酸的細胞。包括原核細胞和真核細胞兩 者，例如，細菌、真菌、酵母等，特別優(yōu)選來自于酵母，例如乳酸克魯維酵母的細胞。宿主細胞 還包括但不限于哺乳動物細胞系如CH0、VER0、BHK、HeLa、C0S、MDCK、293、3T3、WI38和脈絡(luò)叢 細胞系。
[0223] 適合的細菌宿主生物的實例為革蘭氏陽性細菌種例如芽孢桿菌科 (Bacillaceae)，包括枯草芽抱桿菌（Bacillus subtilis)、地衣芽抱桿菌（Bacillus licheniformis)、遲緩芽抱桿菌(Bacillus lentus)、短芽抱桿菌(Bacillus brevis)、嗜熱 脂肪芽抱桿菌（Bacillus stearothermophilus)、嗜喊芽抱桿菌（Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽抱桿菌（Bacillus amylol i quefaci ens)、凝結(jié)芽抱桿菌 (Bacillus coaguIans)、環(huán)狀芽抱桿菌(Bacillus circuIans)、燦爛芽抱桿菌(Bacillus lautus)、巨大芽抱桿菌（Bacillus megaterium)和蘇云金芽抱桿菌（Bacillus thuringiensis);鏈霉菌種例如鼠灰鏈霉菌（Streptomyces murinus);乳酸細菌種包括乳 球菌(Lactococcus spp·)例如乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)，乳桿菌(Lactobacillus spp.)包括羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)、明串珠菌(Leuconostoc spp.)和鏈球 菌（S t r e p t o c o c c u s s p p . ) 或者，可選擇革蘭氏陰性細菌種例如屬于腸桿菌科 (Enterobacteriaceae)，包括大腸桿菌或?qū)儆诩賳伟?Pseudomonadaceae)的種的菌株 作為宿主生物。
[0224] 適合的酵母宿主生物可有利地選自糖酵母種，包括釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)或?qū)儆诹阎辰湍?Schizosaccharomyces)的種。其它有用的酵母宿主生物包括 畢赤酵母，例如其甲醇營養(yǎng)型種，包括畢赤氏巴斯德酵母(Pichia pastoris)，和克魯維酵 母菌，包括乳酸克魯維酵母。
[0225] 絲狀真菌中的適合宿主生物包括支頂孢菌屬（Acremonium)、曲霉菌屬 (Aspergillus)、鐮孢菌屬(Fusarium)、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、毛霉菌屬(Mucor)、毀絲霉菌 屬（17〇01；[(^1^0^)、脈孢菌屬（^111'08。0^)、青霉菌屬（？611；!_(3；!_11；!_11111)、梭孢殼屬 (Thielavia)、彎頸霉屬（Tolypocladium)或木霉屬（Trichoderma)的種，例如棘孢曲霉 (Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉（Aspergillus awamori )、臭曲霉（Aspergillus foetidus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、構(gòu)巢曲霉 (Aspergillus nidu Ians)或黑曲霉（Aspergillus niger)，包括黑曲霉泡盛變種 (Aspergillus nigervar.awamori)、桿抱狀鏡抱菌（Fusarium bactridioides)、谷物鏡抱 菌（Fusarium cereals)、克魯克威爾鏡抱菌（Fusarium crookwellense)、黃色鏡抱菌 (Fusarium culmorum)、禾谷鏡抱菌（Fusarium graminearum)、禾鏡抱菌（Fusarium graminum)、異抱鏡抱菌（Fusarium heterosporum)、合歡木鏡抱菌（Fusarium negundi)、尖 抱鏡抱菌（Fusarium oxysporum)、多枝鏡抱菌（Fusarium reticula turn)、粉紅鏡抱菌 (Fusarium roseum)、接骨木鏡抱菌（Fusarium sambucinum)、膚色鏡抱菌（Fusarium sarcochroum)、擬枝抱鏡抱菌（Fusarium sporotrichiodes)、硫色鏡抱菌（Fusarium sulphureum)、圓鏡抱菌（Fusarium torulosum)、擬絲抱鏡抱菌（Fusarium trichothecioides)、鑲片鏡抱菌（Fusarium venena turn)、特異腐質(zhì)霉（Humi co la insolens)、疏棉狀腐質(zhì)霉(Humicola langinosa)、米黑毛霉(Mucor miehei)、嗜熱毀絲霉 (Myceliophtora thermophi la)、粗糖脈抱菌（Neurospora crassa)、產(chǎn)黃青霉菌 (Penicillium chrysogenum)、沙門桕干酪青霉菌（Penicillium camenbertii)、產(chǎn)紫青霉 菌（Penicillium purpurogenum)、米黑根毛霉菌（Rhizomucor miehei)、太瑞斯梭抱殼霉 (Thielavia terestris)、哈茨木霉（Tricho-derma harzianum)、康氏木霉（Trichoderma koningii)、長枝木霉（Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉（Trichoderma reesii) 或綠色木霉(Trochoderma viride)。
[0226] 可以對宿主細胞加以選擇，選出能調(diào)節(jié)插入序列表達的宿主細胞或能以特異性 的、期望的方式對并入的核酸序列的產(chǎn)物進行修飾或加工的宿主細胞。蛋白質(zhì)產(chǎn)物的此類 修飾(例如，糖基化)和加工(例如，切割)可促進編碼的蛋白質(zhì)的最佳功能。
[0227] 多種宿主細胞都具有特征性的及特異性的機制，用于對蛋白及基因產(chǎn)物的翻譯后 加工和修飾。可以選擇分子生物學(xué)和/或微生物學(xué)領(lǐng)域中技術(shù)人員所熟悉的恰當(dāng)細胞系或 宿主系統(tǒng)以確保對表達的外源蛋白質(zhì)的修飾和加工是令人期望的及正確的。為了這個目 的，可以使用具有胞內(nèi)加工機制的真核宿主細胞，所述機制用于對初級轉(zhuǎn)錄本的正確加工、 對基因產(chǎn)物的糖基化和磷酸化。此類宿主細胞在本領(lǐng)域公知。
[0228] 如果期望的話，經(jīng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞系可產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的變體。許多適于穩(wěn)定轉(zhuǎn) 染哺乳動物細胞的載體公開可用，構(gòu)建此類細胞系的方法也公知，例如在Ausubel等人中 (同上）。
[0229] 本發(fā)明還公開了包含根據(jù)本發(fā)明的乳糖酶變體的組合物。因此本發(fā)明提供了組合 物，其包含如本文所述的變體多肽和選自鹽（如氯化鈉或氯化鉀）、防腐劑、多元醇（如甘 油）、金屬離子(如鎂或錳離子)的至少一種組分。
[0230] 所述組合物可任選地包含其它成分，例如其它酶。此類組合物可包含本發(fā)明的變 體多肽或通過本發(fā)明的鑒定變體乳糖酶的方法能夠獲得的變體多肽。
[0231] 除變體乳糖酶和一種或多種另外的酶(若存在）以外，根據(jù)本發(fā)明的組合物可包含 常規(guī)上用于乳糖酶制備的添加劑，例如KC1或甘油。
[0232] 本發(fā)明還涉及在乳制品的制備中本發(fā)明的變體多肽或本發(fā)明的組合物的用途。
[0233] 本發(fā)明還涉及生產(chǎn)乳制品的方法，所述方法包括向乳中添加有效量的本發(fā)明的變 體多肽或組合物并且使所述變體多肽發(fā)揮其酶活性。
[0234] 本發(fā)明涉及能夠通過此類方法獲得的乳制品。
[0235] 在本文中使用時，乳制品涵蓋由乳生產(chǎn)的任何組合物，例如酪蛋白和/或乳清蛋 白。實例為乳、乳源性產(chǎn)品、發(fā)酵乳制品（例如酸奶）、煉乳、UHT乳、淡乳、乳粉、凍乳、冰淇淋、 乳酪、黃油、酪乳、乳清和/或干酪。產(chǎn)品也可為水解產(chǎn)物或通過分餾乳或乳清獲得的產(chǎn)品， 如酪蛋白酸鹽、乳蛋白濃縮物、乳清蛋白濃縮物(WPC)、乳清蛋白分離物(WPI)或(濃縮的）乳 清滲透液及由其制得的產(chǎn)品。
[0236] 乳例如獲自奶牛、水牛、山羊、綿羊、駱駝、驢、馬、馴鹿、盤鹿或牦牛。
[0237] 本文對作為現(xiàn)有技術(shù)給出的專利文件或其它材料的引用不得視為承認截至任何 權(quán)利要求的優(yōu)先權(quán)日，該文件或材料已知或其所含信息是公知常識的一部分。
[0238] 現(xiàn)將參考以下實施例闡明本發(fā)明，然而本發(fā)明不限于以下實施例。 實施例
[0239] 一般材料和方法
[0240] 分子和遺傳學(xué)技術(shù)
[0241 ] 標準遺傳學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)在本領(lǐng)域已知（例如Maniat is等人" Molecular cloning:a laboratory manual"（1982)Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.；Miller'Experiments in molecular genetics"（1972)Cold Spring Harbor Laboratory ,Cold Spring Harbor，Ν·Υ· ; Sambrook和Russell''Molecular cloning: a laboratory manual"（第3版）''（2001 )Cold Spring Harbor Laboratory ,Cold Spring Harbor Laboratory Press;Ausubel"Current protocols in molecular biology"（1987) Green Publishing and Wiley Interscience，New York)〇
[0242] 質(zhì)粒和菌株
[0243] 從Invitrogen?(LifeTechnologies Corporation，Carlsbad，CA，USA)獲得pBAD/ HisAJ-半乳糖苷酶缺陷型菌株大腸桿菌BW25113( Δ (araD-araB)567、Δ lacZ4787(:: ι·;τηΒ-3)、λ-、rph_l、Δ (rhaD-rhaB)568、hsdR514)(Datsenko KA、Wanner BL(2000)Proc Natl Acad Sci USA97:6640-6645)用于表達乳酸克魯維酵母菌β-半乳糖苷酶變體。
[0244] 培養(yǎng)基
[0245] 2χΡΥ培養(yǎng)基（16g/l BD BBL?Phytone?蛋白胨、10g/l酵母提取物、5g/l NaCl)用 于大腸桿菌生長。補充抗生素 （l〇〇μg/ml氨芐青霉素）以維持質(zhì)粒。為了誘導(dǎo)基因表達使用 0.02 %最終濃度的L-阿拉伯糖。
[0246] 實施例1 :DNA構(gòu)建體和轉(zhuǎn)化
[0247] 將合成DNA構(gòu)建體設(shè)計成以產(chǎn)生Ncol相容性突出端的Bbsl限制位點開始并且以在 終止密碼子之后產(chǎn)生Hindlll相容性突出端的Bbsl限制位點結(jié)束。在合成DNA構(gòu)建體的設(shè)計 中去除了內(nèi)部Bbsl限制位點。作為一個示例，編碼野生型乳酸克魯維酵母β-半乳糖苷酶序 列的DNA片段作為SEQ ID Ν0:1列出。所有變體以類似方式設(shè)計并且在表達載體pBAD/HisA 的Ncol/Hindlll位點中作為Bbsl片段克隆。
[0248] 表2中描繪了在14種變體中引入的氨基酸變化。與野生型乳酸克魯維酵母β-半乳 糖苷酶氨基酸序列（SEQ ID Ν0:2)比較，指出了變化的位置。一些變體有引入到β-半乳糖苷 酶蛋白的氨基酸序列中的多個變化，如變體#8和#7。編碼無變化的β-半乳糖苷酶蛋白的野 生型基因也用于基因克隆和轉(zhuǎn)化并且之后用于和用變體基因產(chǎn)生的酶比較。
[0249] 表2:引入乳酸克魯維酵母β-半乳糖苷酶的蛋白質(zhì)序列中的氨基酸變化。根據(jù)單字 母表示法示出氨基酸。
[0251 ] 大腸桿菌BW25113的轉(zhuǎn)化使用Zymo Research Z-Competent?大腸桿菌轉(zhuǎn)化試劑盒 和緩沖液套組(T3001)進行。將經(jīng)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌株涂布在含有100μg/ml氨芐青霉素、 0.02 %L-阿拉伯糖和40μg/ml 5-溴-4-氯-3-吲噪基-β-D-吡喃半乳糖苷(X-Gal)的2xPY瓊 脂板上，并且在30°C下培育過夜。
[0252] X-gal為乳糖類似物，并且被β-半乳糖苷酶水解。X-gal在被β-半乳糖苷酶切割時 產(chǎn)生半乳糖和5-溴-4-氯-3-羥基吲哚。然后后者自發(fā)地二聚并且氧化成5，5 二溴-4，4 ' -二氯-靛藍，5，5 二溴-4，4 二氯-靛藍是一種不溶性深藍色產(chǎn)物。將所述板儲存在4°C下 至少24小時以允許在X-Gal水解后藍色形成。因為野生型大腸桿菌菌株BW25113由于lac操 縱子缺失而缺乏β-半乳糖苷酶活性，所以藍色的形成證實了所選β-半乳糖苷酶變體的活性 表達。每種構(gòu)建體中，使用小規(guī)模24孔培養(yǎng)(實施例2)檢測到三種形成藍色的轉(zhuǎn)化株的β-半 乳糖苷酶生成，并且選擇最佳的生產(chǎn)轉(zhuǎn)化株以進行進一步的酶表征。
[0253] 實施例2: β-半乳糖苷酶樣品的培養(yǎng)和制備
[0254] 將表達變體β-半乳糖苷酶基因的大腸桿菌BW25113轉(zhuǎn)化株從瓊脂板復(fù)制到具有 200μ1 2*ΡΥ和 100μg/ml氨芐青霉素的96寬孔板中（NUNC 267334，NUNC A/S，Roskilde, Denmark)，接著在30°C、550rpm和80%濕度下在INFORS HT Microtron振蕩器（Infors AG, Bottmingen,Switzerland)中過夜培育。用來自于這些預(yù)培養(yǎng)物的15μ1接種包含3ml 2*PY 與100取/1111氨芐青霉素的24孔板(4乂￥6?01101^24(^105,417861/'(：〇?1丨即，附 148311]5八）。 用呼吸密封材料(6786051，greiner bi〇-〇ne，F(xiàn)rickenhausen，Germany)覆蓋24孔板并且在 30°(：、550印111和80%濕度下在1嚦01?冊]^(^〇讓〇11振蕩器中培育，直至達到0.4-0.6的 60011111光密度。然后，添加1^-阿拉伯糖至0.02%的最終濃度并且在20°(：、750印111和80%濕度 下在INF0RS HT Microtron振蕩器中進一步培育24孔板20-24小時。在2750rpm和4°C下離心 24孔板10分鐘并且通過傾析所述板而去除上清液。將獲得的細胞團塊儲存在-20°C下至少 24小時。通過利用渦旋使冷凍細胞團塊重新懸浮在lml提取緩沖液（50mM Tris-HCl pH 7.5、0.2mM MgS04、2mg/ml溶菌酶、0.1mg/ml DNAse I、lx完全蛋白酶抑制劑混合物（無 EDTA，Roche))中，在室溫下培育30分鐘，接著在2750rpm和4°C下離心10分鐘。通過添加1體 積的甘油配制包含過表達的β-半乳糖苷酶(無細胞抽提物，CFE)的上清液并用于不同活性 測定中。
[0255] 實施例3:乳糖酶蛋白量的測定
[0256] 使用HP-SEC(Thermo Scientific Dionex UltiMate 3000Rapid Separation)測 定大腸桿菌產(chǎn)生的乳糖酶蛋白的量。為此將2μ1實施例1的無細胞提取物(CFE)裝到BEH200， 8〇(：1.7以1114.6乂15〇1]11]1柱(￥3七6^)上。流動相由10〇11^[磷酸鉀緩沖液(。!17.32)組成并且保 持在0. lmL/min的流量下。柱溫保持在25°C，而流量設(shè)為0. lmL/min。在蛋白質(zhì)洗脫后，測量 在280nm下的吸光度。因為乳糖酶蛋白比CFE中大多數(shù)其它蛋白更大，所以它是在這些條件 下從柱上洗脫的第一個蛋白峰。計算這個峰下的面積并且通過與牛血清白蛋白（BSA)標準 品比較而量化。如實施例4-7中所述，該量化結(jié)果用于計算蛋白質(zhì)的（比)活性。
[0257] 表3A:在實施例4-7中描述的各種測定中對變體(比)活性的分析結(jié)果。標記了顯著 (p〈0.05)高于或低于(抑制％)野生型乳糖酶(6個樣品)平均值的值。
[0259] 表3B:在實施例4-7中描述的各種測定中對變體(比)活性的分析結(jié)果。表3A的值表 示為與相同測定中野生型酶的值比較的相對值。
[0260]
[0261] 實施例4:針對作為底物的0NPG的活性測定
[0262] 使用鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷(0NPG)作為底物的活性測定基本上按照食品化 學(xué)藥典（Food Chemical Codex)(FCC 第8版，第1319-1320 頁：Lactase(neutral)0_ galactosidase activity)中描述的過程。
[0263] 使用緩沖液A(含有0.05mM EDTA、0.1mM MgS04和0.2%(W/V)Triton Π 00的 100mM 磷酸鉀(pH6.5))稀釋實施例2中產(chǎn)生的樣品200倍，直至約0.1個中性乳糖酶單位(NLU)/mL。 使用相同但無 Triton X100的緩沖液制備底物(20mL中50mg的鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷 (Sigma-Aldrich))。預(yù)熱底物后，將以下材料混在一起：125yL底物和25yL樣品。允許反應(yīng)在 37 °C下進行10分鐘，之后通過添加25yL碳酸鈉（30g/L)和20yL超純水終止反應(yīng)。所得405nm 下的吸光度可以使用并且與由鄰硝基苯酚(0ΝΡ)制得的校準曲線比較。在Konelab臨床分析 儀(Thermo Scientific Arena 30)上進行測量。如食品化學(xué)藥典中所述進行活性的計算并 且校正測定溫度的差異。校正系數(shù)為1.25并且根據(jù)經(jīng)驗確定。通過將這些值除以測定中的 蛋白質(zhì)劑量(如實施例3中所述)測定不同乳糖酶變體的比活性并且在表3中描繪了結(jié)果。 [0264] 實施例5:針對作為底物的乳糖的活性測定
[0265] 于緩沖液B(含有0.05mM EDTA和ImM MgS04的100mM磷酸鈉 (pH6.5))中將樣品稀釋 至約0.4NLU/mL。底物由4.8 %溶于緩沖液B中的乳糖一水合物組成。酶混合物由在總計10mL 緩沖液B中的780個單位的辣根過氧物酶(Sigma Aldrich)、0.25個單位的葡萄糖氧化酶 (DSM)和12.51^(+/-111^)2,2/-連氮基-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽以8了3,3丨 8111& Aldrich)組成。測定是相對于中性乳糖酶的連續(xù)稀釋液(0.1-0.8NLU/mL)測量。為了使反應(yīng) 發(fā)生，將以下材料轉(zhuǎn)移到標準微量滴定板的一個孔:25yL緩沖液B、25yL樣品或標準品、25yL 酶混合物。預(yù)培育10分鐘后，添加175yL底物并且在MTP讀數(shù)器(Tecan Infinity M1000)上 在420nm和30°C下測量反應(yīng)30分鐘。每30秒測量吸光度并且計算每5個數(shù)據(jù)點（2.5分鐘）的 斜率。使用整個測定中的最大斜率計算活性。這個最大斜率表示為在此處描述的條件下每 分鐘乳糖酶產(chǎn)生的葡萄糖μπιο?數(shù)(LACU)。通過將這些值除以測定中的蛋白質(zhì)濃度(mg/ml) (如實施例3中所述)計算不同乳糖酶變體的比活性。表3中描繪了這些乳糖酶變體的比活性 (LACU/mg)。針對乳糖的高比活性可導(dǎo)致酶在可能應(yīng)用中的劑量更低。
[0266] 實施例6:在半乳糖存在下的活性測定
[0267] 于緩沖液B中將樣品稀釋至約0.4NLU/mL。底物由4.8 %溶于緩沖液B中的乳糖一水 合物組成。酶混合物由在總計10 m L緩沖液B中的7 8 0個單位的辣根過氧物酶（S i g m a Aldrich)、0.25個單位的葡萄糖氧化酶(DSM)和12.511^(+/-111^)2,2^連氮基-雙(3-乙基苯 并噻唑啉-6 -磺酸）二銨鹽(A B T S，S i g m a A1 d r i c h)組成。抑制緩沖液C由在緩沖液B中的 1500mM半乳糖(純度>99.9% )組成。測定是相對于中性乳糖酶的連續(xù)稀釋液(0.1-0.8NLU/ mL)測量。為了使反應(yīng)發(fā)生，將以下材料轉(zhuǎn)移到標準微量滴定板的一個孔:25yL緩沖液C(除 標準品以外）、25yL樣品或標準品、25yL酶混合物。預(yù)培育10分鐘后，添加175yL底物并且在 MTP讀數(shù)器上在420nm和30 °C下測量反應(yīng)30分鐘。每30秒測量吸光度并且計算每5個數(shù)據(jù)點 的斜率。使用整個測定中的最大斜率計算活性。這個最大斜率表示為在此處描述的條件下 每分鐘乳糖酶產(chǎn)生的葡萄糖μπιο?數(shù)(LACGU)。通過將這些值除以測定中的蛋白質(zhì)濃度(mg/ ml)(如實施例3中所述)計算不同乳糖酶變體的比活性(LACGU/mg)并且結(jié)果示于表3中。
[0268] 使用下式計算半乳糖抑制百分比
[0269] 抑制 ％ = 100*(x_y)/x
[0270] 其中X代表如實施例5中所述的以LACU/mg乳糖酶計的比活性，并且y代表如實施例 6中所述的以LACGU/mg乳糖酶計的比活性。表3中示出了抑制％的計算結(jié)果。當(dāng)需要低殘留 乳糖濃度時，在乳糖酶濃度低且半乳糖濃度高的應(yīng)用中的條件下低抑制％可導(dǎo)致更高活 性。
[0271] 實施例7:在低溫乳中的活性測定
[0272] 在深孔微量滴定板中將lmL商業(yè)半脫脂UHT乳(Campina)與0.2mL在實施例2中產(chǎn)生 的酶（約20NLU/mL)混合。在靜態(tài)條件下在6°C下培育樣品4、24或48小時。在這樣培育之后， 通過在90°C下熱處理6分鐘而終止反應(yīng)，之后將樣品直接置于-20°C的冰箱中直至進行分 析。用于匪R的樣品制備如下進行：添加48yL 4.0M HC1，然后密封所述板并通過傾斜而混 合。然后，在600rpm下振蕩所述板20分鐘并且隨后在4750rpm下離心10分鐘。從清澈上清液 轉(zhuǎn)移0.3mL到新板中并與0.2mL于D 20中含有20g/L馬來酸（內(nèi)標)和40g/L EDTA的溶液合并。 密封為所述板，通過傾斜而混合并短暫離心。凍干后，將殘渣溶于〇.〇5mL D20中并重復(fù)凍 干。將干燥的殘渣溶于〇.7mL D20中，再凍干過夜并且再溶于0.7mL D20中。小心混合后，在 4750rpm下離心樣品10分鐘并將0.6mL轉(zhuǎn)移到NMR管中。在配備有冷凍探針的在700MHz的質(zhì) 子頻率下在290K的探針溫度下工作的Bruker Avance III分光計上測量樣品。使用8次掃描 和30秒延遲單次測量樣品。由匪R譜，量化了下列化合物：乳糖（δ = 4.67(d))、葡萄糖δ = 4.64(d)、半乳糖δ = 4.58(d)和半乳-寡聚糖(G0S，從δ = 4.52至大約δ = 4.38的面積的積 分）。在表3中，指出了每mg添加的酶在培育4小時后檢測到的葡萄糖的量。也描繪了48小時 后，當(dāng)大部分乳糖水解且剩下少許殘留乳糖(<〇.5g/l)時，檢測到的GOS的量。
[0273] 酶在低溫(4-12Γ)乳中高乳糖水解活性可引起在與乳品工業(yè)相關(guān)的此類應(yīng)用中 酶的劑量減少，并且因此成本減少。G0S產(chǎn)量增加可引起生產(chǎn)的乳的益生元效果。
[0274] 實施例8:乳糖酶變體的組合
[0275] 如實施例1中所述產(chǎn)生乳糖酶基因中突變的不同組合，例外是:多個氨基酸變化組 合在基因構(gòu)建體的表達產(chǎn)物中。表4中描繪了含有這些組合氨基酸變化的不同變體。與野生 型乳酸克魯維酵母半乳糖苷酶氨基酸序列（SEQ ID N0:2)比較，指出了變化的位置。 [0276] 表4:引入乳酸克魯維酵母β-半乳糖苷酶蛋白質(zhì)序列中的氨基酸變化。根據(jù)單字母 表示法示出氨基酸。
[0278] 同樣，經(jīng)修飾的乳糖酶基因在大腸桿菌中表達并且如實施例2中所述分離乳糖酶 蛋白。如實施例3中所述測定表達的乳糖酶蛋白的量。如實施例5中所述測定這些酶樣品對 乳糖水解的活性并且與以完全相同的方式表達和分離的野生型酶的活性比較。還如實施例 7中所述測定4小時后在低溫乳中酶樣品對乳糖水解的活性。
[0279] 通過將測量值除以測定中的乳糖酶蛋白濃度(mg/ml)而計算不同乳糖酶變體的比 活性。將兩項測定中這些乳糖酶變體的比活性表示為與在相同測定中獲得的野生型酶的活 性相比較的相對活性。為此在兩項測定中將野生型乳糖酶的比活性設(shè)為100,并且計算的變 體的比活性相對于此。表5中描繪了這項分析的結(jié)果。
[0280] 表5:在各項測定中變體(比）活性的分析結(jié)果。將值描繪為相對于用野生型乳糖酶 發(fā)現(xiàn)的值。標記了顯著(P〈〇.05)高于野生型乳糖酶平均值的值。
[0281]
[0282]由這項分析可以得出：幾種組合變體在兩項測定中均顯示出有利的乳糖水解。
【主權(quán)項】
1. 一種具有乳糖酶活性的變體多肽，其中所述變體具有下述氨基酸序列，在與包含SEQ ID NO: 2中列出的序列的乳糖酶比對時，所述氨基酸序列包含對應(yīng)于第 233、257、258、263、274、284、297、415、440、483、619、621、622、633、862或1004位氨基酸 中的任一個的氨基酸殘基的至少一個取代， 所述位置參照SEQ ID N0:2定義并且其中所述變體與具有乳糖酶活性的參考多肽相比 具有一種或多種改變的特性并且其中所述變體與SEQ ID NO:2具有至少80%序列同一性。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的變體多肽，其中所述參考多肽為SEQ ID NO:2的乳糖酶。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的變體多肽，其中所述變體多肽為非自然存在的多肽。4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項所述的變體多肽，其中所述變體與具有乳糖酶活性的參 考多肽相比針對ONPG展示出增加的比活性。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的變體多肽，其包含下述氨基酸序列，在與SEQ ID N0:2中列出 的序列比對時，所述氨基酸序列包含對應(yīng)于第415、483、619、621、622或633位氨基酸中的任 一個的氨基酸殘基的至少一個取代。6. 根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的變體多肽，其包含下述氨基酸序列，在與SEQ ID N0:2中列 出的序列比對時，所述氨基酸序列包含選自T415C、T415A、A483S、V619I、I621V、M622U^ T633G的至少一個取代。7. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項所述的變體多肽，其中所述變體與具有乳糖酶活性的參 考多肽相比針對乳糖展示出增加的比活性。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的變體多肽，其包含下述氨基酸序列，在與SEQ ID N0:2中列出 的序列比對時，所述氨基酸序列包含對應(yīng)于第415、440或483位氨基酸中的任一個的氨基酸 殘基的至少一個取代。9. 根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的變體多肽，其包含下述氨基酸序列，在與SEQ ID NO: 2中列 出的序列比對時，所述氨基酸序列包含選自T415C、T415A、Y440F或A483S的至少一個取代。10. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項所述的變體多肽，其中所述變體與具有乳糖酶活性的參 考多肽相比針對乳中的乳糖展示出增加的比活性。11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的變體多肽，其包含下述氨基酸序列，在與SEQ ID NO: 2中列 出的序列比對時，所述氨基酸序列包含對應(yīng)于第233、257、258、263、274、284、297、440、619、 633、862或1004位氨基酸中的任一個的氨基酸殘基的至少一個取代。12. 根據(jù)權(quán)利要求10或11所述的變體多肽，其包含下述氨基酸序列，在與SEQ ID N0:2 中列出的序列比對時，所述氨基酸序列包含選自D233V、D257G、A258T、N263S、K274E、N284S、 E297G、Y440F、V619I、T633G、L862V或A1004P的至少一個取代。13. 根據(jù)權(quán)利要求10或11或12所述的變體多肽，其包含下述氨基酸序列，在與SEQ ID NO: 2中列出的序列比對時，所述氨基酸序列包含選自N263S、K274E或N284S的至少兩個取 代。14. 根據(jù)權(quán)利要求10或11或12所述的變體多肽，其包含下述氨基酸序列，在與SEQ ID NO: 2中列出的序列比對時，所述氨基酸序列至少包含取代D257G和E297G。15. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項所述的變體多肽，其中所述變體與具有乳糖酶活性的參 考多肽相比展示出降低的半乳糖抑制。16. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的變體多肽，其包含下述氨基酸序列，在與SEQ ID N0:2中列 出的序列比對時，所述氨基酸序列包含對應(yīng)于第619、621或622位氨基酸中的任一個的氨基 酸殘基的至少一個取代。17. 根據(jù)權(quán)利要求15或16所述的變體多肽，其包含下述氨基酸序列，在與SEQ ID N0:2 中列出的序列比對時，所述氨基酸序列包含選自V619I、I621V或M622L的至少一個取代。18. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項所述的變體多肽，其中所述變體與具有乳糖酶活性的參 考多肽相比在乳中展示出增加的GOS產(chǎn)量。19. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的變體多肽，其包含下述氨基酸序列，在與SEQ ID N0:2中列 出的序列比對時，所述氨基酸序列包含對應(yīng)于第619或622位氨基酸中的任一個的氨基酸殘 基的至少一個取代。20. 根據(jù)權(quán)利要求18或19所述的變體多肽，其包含下述氨基酸序列，在與SEQ ID N0:2 中列出的序列比對時，所述氨基酸序列包含選自V619I或M622L的至少一個取代。21. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的變體多肽，其包含除權(quán)利要求1中限定的取代以 外的附加取代。22. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的變體多肽，其與SEQ ID NO: 2具有至少80%序列 同一,性。23. -種核酸序列，其編碼根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項所述的變體多肽。24. -種核酸構(gòu)建體，其包含與能夠指導(dǎo)乳糖酶在合適表達宿主中的表達的一個或多 個控制序列可操作性連接的權(quán)利要求23所述核酸序列。25. -種重組表達載體，其包含權(quán)利要求24所述核酸構(gòu)建體。26. -種重組宿主細胞，其包含權(quán)利要求25所述表達載體。27. -種生產(chǎn)乳糖酶的方法，其包括在有助于所述乳糖酶生成的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求 26所述宿主細胞并且回收所述乳糖酶。28. -種生產(chǎn)乳糖酶多肽變體的方法，所述方法包括： (a) 選擇具有乳糖酶活性的多肽； (b) 取代對應(yīng)于 233、257、258、263、274、284、297、415、440、483、619、621、622、633、862 或1004位氨基酸中的任一個的至少一個氨基酸殘基，所述位置參照SEQ ID N0:2定義； (c) 任選地取代如(b)中所限定的一個或多個另外的氨基酸； (d) 制備由步驟(a)-(c)產(chǎn)生的變體； (e) 確定所述變體的特性； (f) 選擇與(a)所述多肽相比具有改變的性質(zhì)的變體，從而生產(chǎn)乳糖酶多肽變體。29. -種組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1-22中任一項所述的變體多肽或通過根據(jù)權(quán)利 要求28所述的方法能夠獲得的變體多肽及選自鹽、防腐劑、多元醇或金屬離子的至少一種 組分。30. 根據(jù)權(quán)利要求1-22中任一項所述的變體多肽或根據(jù)權(quán)利要求29所述的組合物在低 乳糖或無乳糖乳制品的制備中的用途。31. -種生產(chǎn)乳制品的方法，所述方法包括向乳制品中添加有效量的根據(jù)權(quán)利要求1-22中任一項所述的變體多肽或根據(jù)權(quán)利要求29所述的組合物并且使所述多肽發(fā)揮其酶活 性。32. -種乳制品，其能夠通過權(quán)利要求31所述的方法或通過根據(jù)權(quán)利要求30所述的用 途獲得。
【文檔編號】C12N9/38GK105899659SQ201580004344
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2015年1月13日
【發(fā)明人】芮妮.馬賽爾.鐘.德, 烏爾麗克.瑪利亞.穆勒, 彼得呂斯·雅各布斯·西奧多瑞斯·蒂克爾
【申請人】帝斯曼知識產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司