用于產(chǎn)生遺傳修飾的動物的組合物和方法
【專利摘要】公開了用于改進遺傳修飾的種系傳遞的方法、組合物和非人類動物及其部分。更特別地，本發(fā)明公開了用于產(chǎn)生具有破壞的或可破壞的育性基因的非人類胚胎的方法和組合物，所述非人類胚胎可被用作用于使供體多能細胞包括遺傳修飾的供體多能細胞發(fā)育成生殖細胞和配子的宿主。還公開了用于從此類胚胎產(chǎn)生具有破壞的育性基因的嵌合非人類動物和用于使用包含缺乏破壞的育性基因的同類非人類動物繁殖所述嵌合非人類動物以產(chǎn)生具有源自所述供體多能細胞的基本上所有的配子和/或生殖細胞的非人類動物的方法和組合物。本發(fā)明還公開了用于在主題方法中使用的非人類配子、生殖細胞、胚胎和動物。
【專利說明】用于產(chǎn)生遺傳修飾的動物的組合物和方法
[0001] 相關(guān)申請
[0002] 本申請要求2013年11月7日提交的標題為"Compositions and Methods for Producing Genetically Modified Animals" 的澳大利亞臨時申請?zhí)?013904307和2014年 6月6 日提交的標題為 "Compositions and Methods for Producing Genetically Modified Animals"的澳大利亞臨時申請?zhí)?014902162的優(yōu)先權(quán)，其每個的內(nèi)容通過引用 以其全文并入本文。 發(fā)明領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明一般性地涉及用于產(chǎn)生具有破壞的或可破壞的育性基因的非人類胚胎的 方法和組合物，所述非人類胚胎可被用作用于使供體多能細胞發(fā)育為生殖細胞和配子的宿 主，所述供體多能細胞包括遺傳修飾的供體多能細胞。本發(fā)明還涉及用于從此類胚胎產(chǎn)生 具有破壞的育性基因的嵌合非人類動物和用于使用同類(cognate)非人類動物繁殖所述嵌 合非人類動物以產(chǎn)生具有源自供體多能細胞的基本上所有的配子和/或生殖細胞的非人類 動物的方法和組合物，所述同類非人類動物包含缺乏破壞的育性基因。
[0004] 發(fā)明背景
[0005] 小鼠胚胎干(ES)細胞是多能的，并且能夠在囊胚注射后促成小鼠的所有組織。其 還能夠相對簡便地被遺傳操作，并且已經(jīng)被用于在將靶突變引入基因組中之后產(chǎn)生遺傳修 飾的小鼠（參見例如Doetschman T等，1987.Nature 330:576-578)。
[0006] 當被引入到囊胚胚胎環(huán)境中之后，具有遺傳修飾的小鼠'供體'ES細胞整合到宿主 囊胚的內(nèi)細胞團中并分化成體細胞譜系和生殖細胞(germ cell)譜系，最終產(chǎn)生被稱為嵌 合體的嵌合小鼠。嵌合性的差異是由于供體ES細胞對囊胚的貢獻的不同量。供體ES細胞在 囊胚中發(fā)揮作用越好，越多的細胞源自供體ES細胞，這繼而增強遺傳修飾傳遞到種系(germ line)中（種系傳遞（germ line transmission))。
[0007] 但是，由于知之甚少的若干復雜因素，在嵌合體中由供體ES細胞促成的種系是不 可預知的并且從〇%至100%變化，所述若干復雜因素包括：（i)需要供體ES細胞在正確的時 間在正確的位置用于整合到內(nèi)細胞團（inner cell mass，ICM)發(fā)育過程中，（ii)供體ES細 胞變成原生殖細胞(primordial germ cell)并隨后發(fā)育成功能性配子的固有(遺傳和表觀 遺傳)能力，和（iii)在常規(guī)嵌合體中，在胚胎發(fā)育期間宿主和供體干細胞之間競爭發(fā)育微 環(huán)境以最終變成配子。
[0008] 因此，需要改進遺傳修飾的多能細胞諸如ES細胞的種系傳遞和加快從嵌合體產(chǎn)生 多能細胞衍生的動物。
[0009] 發(fā)明概述
[0010] 本發(fā)明部分起源于以下結(jié)論(determination):通過破壞其中被引入供體多能細 胞的植入前(pre-implantation)非人類胚胎中的育性基因，能夠顯著增強包含內(nèi)源性育性 基因的供體多能細胞（例如，包含遺傳修飾的供體多能細胞）的種系傳遞。在合適的替代 (surrogate)或代孕(foster)非人類動物中，胚胎的植入和孕育產(chǎn)生后代，包括:包含內(nèi)源 性生殖細胞或配子的嵌合非人類動物，所述內(nèi)源性生殖細胞或配子包含破壞的育性基因； 以及包含源自供體多能細胞的生殖細胞或配子的嵌合非人類動物，所述源自供體多能細胞 的生殖細胞或配子不包含育性基因中的破壞。當與包含未破壞的育性基因的同類非人類動 物交配時，包含含有破壞的育性基因的內(nèi)源性生殖細胞或配子的嵌合非人類動物將具有受 損的或抑制的能育性，并且包含源自供體多能細胞的生殖細胞或配子的那些嵌合非人類動 物將具有正常的或者未受損的能育性，從而增強了包含源自供體多能細胞的生殖細胞或配 子的第一窩后代的產(chǎn)生。
[0011]因此，在一個方面，本發(fā)明提供了一種植入前非人類宿主胚胎，所述植入前非人類 宿主胚胎包含在其種系中的破壞的育性基因或基本上由其組成。被破壞的育性基因可以在 任何染色體上，并且在一些實施方案中，育性基因位于性染色體(例如，X或Y染色體)上。在 特定的實施方案中，育性基因位于X染色體上。育性基因的破壞可以是雜合的或者純合的， 并且在特定的實施方案中，育性基因的兩個等位基因均被破壞。合適地，育性基因的破壞抑 制雄性能育性，并且在這種類型的示例性實例中，破壞抑制精子功能或精子發(fā)生。在特定的 實施方案中，育性基因是GILZ。
[0012] 在相關(guān)方面，本發(fā)明提供了一種如上文廣泛描述的植入前非人類宿主胚胎，所述 植入前非人類宿主胚胎還包含供體多能細胞，所述供體多能細胞包含缺乏對其的破壞的育 性基因。在一些實施方案中，供體多能細胞是干細胞(例如，選自胚胎干(ES)細胞、上胚層干 細胞、胚胎生殖細胞、誘導性多能干細胞、遺傳修飾的ES細胞、遺傳修飾的上胚層干細胞、遺 傳修飾的胚胎生殖(EG)細胞、遺傳修飾的誘導性多能干(iPS)細胞或者這些中的任何兩個 或更多個的組合）。合適地，多能細胞包含遺傳修飾。在特定的實施方案中，供體多能細胞是 雄性多能細胞。
[0013] 本發(fā)明的另一個方面提供了一種包含如上文和本文其他位置廣泛限定的破壞的 育性基因和供體多能細胞的非人類宿主胚胎，所述供體多能細胞包含缺乏對其的破壞的育 性基因。在一些實施方案中，供體多能細胞是適當?shù)匕z傳修飾的干細胞（例如，ES細 胞）。適當?shù)兀w多能細胞是雄性多能細胞。
[0014] 在本發(fā)明的又另一方面，提供了用于產(chǎn)生非人類動物的方法。這些方法一般地包 括以下或者基本上由以下組成:將如上文和本文其他位置廣泛限定的植入前非人類宿主胚 胎引入到假孕非人類動物中，并在適于胚胎的發(fā)育的條件下孕育植入前非人類宿主胚胎， 從而產(chǎn)生非人類動物。
[0015] 在相關(guān)方面，本發(fā)明提供了一種由這些方法得到的非人類動物。
[0016] 本發(fā)明的仍然另一個方面提供了一種替代或代孕非人類動物，所述替代或代孕非 人類動物包含如上文和本文其他位置廣泛限定的非人類宿主胚胎或者基本上由其組成。
[0017] 在本發(fā)明的另一個方面，提供了用于產(chǎn)生嵌合非人類動物的方法。這些方法一般 地包括以下或基本上由以下組成:將如上文和本文其他位置廣泛限定的植入前非人類宿主 胚胎引入到假孕非人類動物中，所述植入前非人類宿主胚胎包含供體多能細胞，所述供體 多能細胞包含缺乏對其的破壞的育性基因；并且在適合于胚胎的發(fā)育的條件下孕育植入前 非人類宿主胚胎，從而產(chǎn)生嵌合非人類動物。
[0018] 在相關(guān)方面，本發(fā)明提供了 一種由這些方法獲得的嵌合非人類動物。
[0019] 本發(fā)明的又另一個方面提供了用于產(chǎn)生具有破壞的育性基因的非人類宿主胚胎 的方法。這些方法一般地包括以下或者基本上由以下組成：使1)攜帶可破壞的育性基因的 第一動物品系;與2)攜帶不育性激活轉(zhuǎn)基因（包括破壞所述可破壞的育性基因的基因）的第 二動物品系雜交，從而產(chǎn)生包含具有破壞的育性基因的生殖細胞的轉(zhuǎn)基因非人類宿主胚 胎。在一些實施方案中，使所述第一動物品系的雌性成員與所述第二動物品系的雄性成員 雜交。如本文使用的，所述第一動物品系和所述第二動物品系的各自的成員是非人類動物 的繁殖對(breeding pair)的繁殖配偶(breeding partner)。
[0020] 在仍然另一個方面，本發(fā)明提供了一種非人類動物的繁殖對，所述繁殖對包括： (1)第一繁殖配偶，所述第一繁殖配偶包含可破壞的育性轉(zhuǎn)基因，所述可破壞的育性轉(zhuǎn)基因 包括如上文和本文其他位置廣泛描述的可破壞的育性基因，所述可破壞的育性基因通過育 性基因破壞物(disrupted)分子可破壞，其中所述可破壞的育性基因與啟動子可操作連接， 和(2)第二繁殖配偶，所述第二繁殖配偶包含破壞物轉(zhuǎn)基因，所述破壞物轉(zhuǎn)基因包含編碼育 性基因破壞物分子的核苷酸序列（"破壞物核苷酸序列"），其中所述破壞物核苷酸序列與啟 動子可操作連接。在一些實施方案中，育性基因破壞物分子是重組酶并且可破壞的育性基 因與重組酶識別位點可操作連接，所述重組酶識別位點在所述重組酶的存在下介導可破壞 的育性基因的破壞。在其它實施方案中，育性基因破壞物分子是抑制性RNA分子，所述抑制 性RNA分子適當?shù)赝ㄟ^反義抑制或RNA干擾抑制可破壞的育性基因的表達。在仍然其它實施 方案中，育性基因破壞物分子是抗體，所述抗體與可破壞的育性基因的多肽產(chǎn)物免疫相互 作用。
[0021] 在一些實施方案中，破壞物核苷酸序列是條件性地可表達的，并且在這種類型的 示例性實例中，破壞物轉(zhuǎn)基因包含與破壞物核苷酸序列可操作連接的表達調(diào)節(jié)元件 (expression-modulating element)，其中所述元件條件性地抑制破壞物核苷酸序列的表 達。例如，在第一條件下表達調(diào)節(jié)元件可以抑制破壞物核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄，并且在第二條件 下表達調(diào)節(jié)元件的破壞可以允許或者增強破壞物核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄。在一些實施方案中， 表達調(diào)節(jié)元件包含抑制子核苷酸序列（例如，轉(zhuǎn)錄終止子），所述抑制子核苷酸序列抑制破 壞物核苷酸序列的表達并且與重組酶識別位點可操作連接，其中所述重組酶識別位點在重 組酶的存在下介導抑制子核苷酸序列的破壞。在這種類型的示例性實例中，第一繁殖配偶 包含刺激或增強破壞物核苷酸序列的表達的激活子轉(zhuǎn)基因，所述激活子轉(zhuǎn)基因包含與啟動 子可操作連接的所述重組酶的編碼序列。
[0022] 在一些實施方案中，第一繁殖配偶是雌性，并且第二繁殖配偶是雄性。
[0023] 適當?shù)?，第一繁殖配偶的激活子轉(zhuǎn)基因是純合的和/或第二繁殖配偶的破壞物轉(zhuǎn) 基因是純合的。
[0024] 在相關(guān)方面，本發(fā)明提供了一種非人類動物的繁殖對，所述繁殖對包括：（1)第一 繁殖配偶，所述第一繁殖配偶包含可破壞的轉(zhuǎn)基因，所述可破壞的轉(zhuǎn)基因包括可破壞的育 性基因，所述可破壞的育性基因與啟動子且與在重組酶識別位點可操作連接，所述重組酶 識別位點在重組酶的存在下介導所述育性基因的破壞;和(2)第二繁殖配偶，所述第二繁殖 配偶包含破壞物轉(zhuǎn)基因，所述破壞物轉(zhuǎn)基因包含編碼育性基因破壞物分子的破壞物核苷酸 序列，所述破壞物核苷酸序列與啟動子可操作連接，其中所述育性基因破壞物分子包括重 組酶。在一些實施方案中，第一繁殖配偶是雌性并且第二繁殖配偶是雄性。
[0025] 在一些實施方案中，第一繁殖配偶的可破壞的轉(zhuǎn)基因是純合的和/或第二繁殖配 偶的破壞物轉(zhuǎn)基因是純合的。
[0026] 在一些實施方案中，非人類動物的繁殖對包括：（1)第一繁殖配偶，所述第一繁殖 配偶包含第一可破壞的轉(zhuǎn)基因和第一破壞物轉(zhuǎn)基因，所述第一可破壞的轉(zhuǎn)基因包括與啟動 子且與第一重組酶識別位點可操作連接的可破壞的育性基因，所述第一重組酶識別位點在 第一重組酶的存在下介導所述可破壞的育性基因的破壞，所述第一破壞物轉(zhuǎn)基因包含與啟 動子可操作連接的第二重組酶的編碼序列，其中所述第二重組酶特異性地識別第二重組酶 識別位點，和(2)第二繁殖配偶，所述第二繁殖配偶包含第二可破壞的轉(zhuǎn)基因和第二破壞物 轉(zhuǎn)基因，所述第二可破壞的轉(zhuǎn)基因包括與啟動子且與第二重組酶識別位點可操作連接的可 破壞的育性基因，所述第二重組酶識別位點在所述第二重組酶的存在下介導所述可破壞的 育性基因的破壞，所述第二破壞物轉(zhuǎn)基因包含與啟動子可操作連接的所述第一重組酶的編 碼序列，其中所述第一重組酶特異性地識別所述第一重組酶識別位點。適當?shù)?，所述第一?殖配偶的所述第一可破壞的轉(zhuǎn)基因和所述第一破壞物轉(zhuǎn)基因是純合的和/或所述第二繁殖 配偶的所述第二可破壞的轉(zhuǎn)基因和所述第二破壞物轉(zhuǎn)基因是純合的。
[0027] 在另一個相關(guān)的方面，本發(fā)明提供了一種非人類動物的繁殖對，所述繁殖對包括： (1)第一繁殖配偶，所述第一繁殖配偶包含可破壞的育性基因；和(2)第二繁殖配偶，所述第 二繁殖配偶包含破壞物轉(zhuǎn)基因，所述破壞物轉(zhuǎn)基因包含破壞物核苷酸序列，所述破壞物核 苷酸序列與啟動子可操作連接，并且所述破壞物核苷酸序列編碼抑制所述可破壞的育性基 因的表達的抑制性RNA分子(例如，反義RNA、siRNA、shRNA等）。在一些實施方案中，所述破壞 物核苷酸序列是條件性地可表達的并且在這種類型的示例性實例中，破壞物轉(zhuǎn)基因包含與 所述破壞物核苷酸序列可操作連接的表達調(diào)節(jié)元件，其中所述元件條件性地抑制所述破壞 物核苷酸序列的表達。例如，在第一條件下所述表達調(diào)節(jié)元件可以抑制所述破壞物核苷酸 序列的轉(zhuǎn)錄，并且在第二條件下所述表達調(diào)節(jié)元件的破壞可以允許或增強所述破壞物核苷 酸序列的轉(zhuǎn)錄。在一些實施方案中，所述表達調(diào)節(jié)元件包含抑制子核苷酸序列（例如，轉(zhuǎn)錄 終止子），所述抑制子核苷酸序列抑制所述破壞物核苷酸序列的表達并且所述抑制子核苷 酸序列與重組酶識別位點可操作連接，其中所述重組酶識別位點在重組酶的存在下介導所 述抑制子核苷酸序列的破壞。在這種類型的示例性實例中，所述第二繁殖配偶包含激活子 轉(zhuǎn)基因，所述激活子轉(zhuǎn)基因包含與啟動子可操作連接的重組酶的編碼序列。所述第二繁殖 配偶的可破壞的育性基因適當?shù)厥且吧突?。在一些實施方案中，所述第一繁殖配偶?雌性，并且所述第二繁殖配偶是雄性。
[0028] 因此，在一些實施方案中，所述非人類動物的繁殖對包括：（1)第一繁殖配偶，所述 第一繁殖配偶包含與啟動子可操作連接的可破壞的育性基因和激活子轉(zhuǎn)基因，所述激活子 轉(zhuǎn)基因包含與啟動子可操作連接的重組酶的編碼序列;和(2)第二繁殖配偶，所述第二繁殖 配偶包含破壞物轉(zhuǎn)基因，所述破壞物轉(zhuǎn)基因包含破壞物核苷酸序列，所述破壞物核苷酸序 列編碼抑制所述可破壞的育性基因的表達的抑制性RNA分子(例如，反義RNA、s i RNA、shRNA 等），其中所述破壞物核苷酸序列與啟動子并且與表達調(diào)節(jié)元件可操作連接，所述表達調(diào)節(jié) 元件包含抑制子核苷酸序列（例如，轉(zhuǎn)錄終止子），所述抑制子核苷酸序列在所述重組酶的 不存在下抑制所述破壞物核苷酸序列的表達并且所述抑制子核苷酸序列與重組酶識別位 點可操作連接，所述重組酶識別位點在所述重組酶的存在下介導所述抑制子核苷酸序列的 破壞。適當?shù)?，所述第一繁殖配偶的所述激活子轉(zhuǎn)基因是純合的和/或所述第二繁殖配偶的 所述破壞物轉(zhuǎn)基因是純合的。在一些實施方案中，所述第一繁殖配偶是雌性并且所述第二 繁殖配偶是雄性。
[0029] 在又另一個相關(guān)的方面，本發(fā)明提供了一種非人類動物的繁殖對，所述繁殖對包 括：（1)第一繁殖配偶，所述第一繁殖配偶包含可破壞的育性基因；和(2)第二繁殖配偶，所 述第二繁殖配偶包含破壞物轉(zhuǎn)基因，所述破壞物轉(zhuǎn)基因包含破壞物核苷酸序列，所述破壞 物核苷酸序列編碼與所述可破壞的育性基因的多肽產(chǎn)物免疫相互作用的抗體，并且所述破 壞物核苷酸序列與啟動子可操作連接。在一些實施方案中，所述破壞物核苷酸序列是條件 性地可表達的并且在這種類型的示例性實例中，所述破壞物轉(zhuǎn)基因包含與所述破壞物核苷 酸序列可操作連接的表達調(diào)節(jié)元件，其中所述元件條件性地抑制所述破壞物核苷酸序列的 表達。例如，在第一條件下所述表達調(diào)節(jié)元件可以抑制所述破壞物核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄，并且 在第二條件下所述表達調(diào)節(jié)元件的破壞可以允許或增強所述破壞物核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄。在 一些實施方案中，所述表達調(diào)節(jié)元件包含抑制子核苷酸序列（例如轉(zhuǎn)錄終止子），所述抑制 子核苷酸序列抑制所述破壞物核苷酸序列的表達，并且所述抑制子核苷酸序列與重組酶識 別位點可操作連接，其中所述重組酶識別位點在重組酶的存在下介導所述抑制子核苷酸序 列的破壞。在這種類型的示例性實例中，所述第一繁殖配偶包含激活子轉(zhuǎn)基因，所述激活子 轉(zhuǎn)基因包含與啟動子可操作連接的所述重組酶的編碼序列。所述第二繁殖配偶的可破壞的 育性基因適當?shù)厥且吧突?。在一些實施方案中，所述第一繁殖配偶是雌性，并且所述?二繁殖配偶是雄性。
[0030] 因此，在一些實施方案中，所述非人類動物的繁殖對包括：（1)第一繁殖配偶，所述 第一繁殖配偶包含與啟動子可操作連接的可破壞的育性基因和激活子轉(zhuǎn)基因，所述激活子 轉(zhuǎn)基因包含與啟動子可操作連接的重組酶的編碼序列;和(2)第二繁殖配偶，所述第二繁殖 配偶包含破壞物轉(zhuǎn)基因，所述破壞物轉(zhuǎn)基因包含破壞物核苷酸序列，所述破壞物核苷酸序 列編碼與所述育性基因的多肽產(chǎn)物免疫相互作用的抗體，其中所述破壞物核苷酸序列與啟 動子并且與表達調(diào)節(jié)元件可操作連接，所述表達調(diào)節(jié)元件包含抑制子核苷酸序列(例如，轉(zhuǎn) 錄終止子），所述抑制子核苷酸序列在重組酶的不存在下抑制所述破壞物核苷酸序列的表 達，并且所述抑制子核苷酸序列與重組酶識別位點可操作連接，所述重組酶識別位點在所 述重組酶的存在下介導所述抑制子核苷酸序列的破壞。適當?shù)?，所述第一繁殖配偶的所?激活子轉(zhuǎn)基因是純合的和/或所述第二繁殖配偶的所述破壞物轉(zhuǎn)基因是純合的。在一些實 施方案中，所述第一繁殖配偶是雌性，并且所述第二繁殖配偶是雄性。
[0031] 在另一個方面，本發(fā)明提供了用于產(chǎn)生包含破壞的育性基因的非人類宿主胚胎的 方法。這些方法一般地包括以下或者基本上由以下組成：（a)使如上文和本文其他位置廣泛 描述的非人類動物的繁殖對的第一繁殖配偶與所述繁殖對的第二繁殖配偶交配;和(b)從 所述繁殖對的雌性成員產(chǎn)生植入前非人類胚胎，所述胚胎包含在其種系中的所述育性基因 的破壞。在一些實施方案中，所述方法還包括在允許所述植入前非人類宿主胚胎的形成的 條件下培養(yǎng)非人類宿主胚胎。在一些實施方案中，所述第一繁殖配偶是雌性，并且所述第二 繁殖配偶是雄性。在一些實施方案中，所述方法還包括將如例如上文和本文其他位置所描 述的供體多能細胞引入到所述植入前非人類胚胎中。適當?shù)?，所述多能細胞包含遺傳修飾。 在特定的實施方案中，所述多能細胞是雄性多能細胞。
[0032] 在相關(guān)方面，本發(fā)明提供了一種從以上方法得到的非人類宿主胚胎。
[0033] 在又另一個方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生嵌合非人類動物的方法。這些方法一般地包 括以下或基本上由以下組成：（1)移植植入前非人類胚胎，所述植入前非人類胚胎包含在其 種系中的如例如上文和本文其他位置所描述的育性基因的破壞，并且所述植入前非人類胚 胎還包含如例如上文和本文其他位置所描述的異源多能細胞;和(2)在適于所述胚胎發(fā)育 的條件下孕育（1)的非人類宿主胚胎，從而產(chǎn)生具有在其種系中的破壞的育性基因和遺傳 修飾的嵌合非人類動物。適當?shù)?，所述嵌合非人類動物是雄性嵌合非人類動物?br>[0034] 在相關(guān)方面，本發(fā)明提供了一種嵌合非人類動物，所述嵌合非人類動物從這些方 法得到。
[0035] 本發(fā)明的仍然另一個方面提供了產(chǎn)生在其基因組中包含遺傳修飾的非人類動物 的方法。這些方法一般地包括以下或者基本上由以下組成：（1)移植植入前非人類胚胎，所 述植入前非人類胚胎包含在其種系中的如例如上文和本文其他位置所描述的育性基因的 破壞，并且所述植入前非人類胚胎還包含如例如上文和本文其他位置所描述的異源多能細 胞;和（2)在適于所述胚胎發(fā)育的條件下孕育（1)的非人類宿主胚胎，從而產(chǎn)生包括嵌合非 人類動物的一窩幼崽，所述嵌合非人類動物具有在其種系中的破壞的育性基因和遺傳修 飾；（3)用在其基因組中包含缺乏對其的破壞的育性基因的同類雌性非人類動物繁殖來自 該窩幼崽的雄性嵌合非人類動物，以當所述雄性嵌合非人類動物包含源自所述異源多能細 胞的生殖細胞或配子時產(chǎn)生包含所述遺傳修飾的非人類動物。
[0036] 在相關(guān)方面，本發(fā)明提供了一種包含遺傳修飾的非人類動物，所述非人類動物從 以上的方法得到。
[0037] 在另一個方面，本發(fā)明提供了一種非人類動物(例如，替代或代孕非人類動物），所 述非人類動物具有移植在其中的如上文和本文其他位置廣泛描述的植入前非人類宿主胚 胎。
[0038] 本發(fā)明的另一個方面提供了一種嵌合非人類動物，所述嵌合非人類動物源自如上 文和本文其他位置廣泛描述的植入前非人類宿主胚胎。
[0039] 附圖簡述
[0040]圖1是Tsc22d3條件性敲除靶向載體的示意圖。藍框:外顯子;neo:用于在ES細胞中 選擇的新霉素盒;FRT:用于flp重組酶介導的neo去除的識別序列；ΙοχΡ:用于ere重組酶介 導的外顯子缺失的識別序列;amp:氨芐青霉素抗性基因；ori :復制起點。
[0041]圖2是示出革E1R0SA26等位基因變體A的示意圖。Ubic:人泛素啟動子;neo:用于在ES 細胞中選擇的新霉素盒；cre:Cre重組酶;終止（STOP):轉(zhuǎn)錄/翻譯'終止'元件；ΙοχΡ:用于 Cre重組酶介導的終止缺失的識別序列;pA:聚腺苷酸化信號;破壞物元件:破壞育性基因的 表達或者其蛋白質(zhì)產(chǎn)物的功能的任何元件(例如，shRNA、抗體）。
[0042]圖3是示出靶R0SA26等位基因變體B的示意圖。Ubic:人泛素啟動子;neo:用于在ES 細胞中選擇的新霉素盒;ere: Cre重組酶;終止:轉(zhuǎn)錄/翻譯'終止'元件；ΙοχΡ:用于Cre重組 酶介導的終止缺失的識別序列;pA:聚腺苷酸化信號;破壞物元件:破壞育性基因的表達或 者其蛋白質(zhì)產(chǎn)物的功能的任何元件(例如，shRNA、抗體）。
[0043]圖4是示出后代中的革E1R0SA26等位基因變體A的示意圖。Ubic:人泛素啟動子;neo: 用于在ES細胞中選擇的新霉素盒;cre:Cre重組酶;終止:轉(zhuǎn)錄/翻譯'終止'元件；ΙοχΡ:用于 Cre重組酶介導的終止缺失的識別序列;pA:聚腺苷酸化信號;破壞物元件:破壞育性基因的 表達或者其蛋白質(zhì)產(chǎn)物的功能的任何元件(例如，shRNA、抗體）。
[0044]圖5是顯示通過本發(fā)明的方法的一個實施方案產(chǎn)生的第一窩后代的非限制性實例 的照片展示。該圖中顯示的幼畜是兩種嵌合體的所有幼崽。嵌合體是基于Tsc22d3C〇nK0/ conKO囊胚產(chǎn)生的。所有幼畜顯示出白色毛色，這是源自靶ES細胞的動物所預期的。
[0045]圖6是顯示用于基因分型的DNA印跡分析的代表性實例的照片表示。將活組織檢查 樣品裂解并用BamHI消化。wt等位基因的預期大小是17.5kb，并且靶等位基因的預期大小是 9.71^<^045^046^049^055^077^078^065^066^056^057^058^059^064&厶074被 確定為 wt/靶;A047、A048、A050、A076、A080、A067、A068、A069、A060、A070&A075被確定為 wt/ wt并且A054、A079M070不能被確定。
[0046] 發(fā)明詳述
[0047] 1.定義
[0048] 除非另有限定，本文使用的所有技術(shù)和科學術(shù)語具有如本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技 術(shù)人員通常所理解的相同的含義。盡管任何類似或等同于本文記載的那些方法和材料的方 法和材料能夠被用于本發(fā)明的實踐或測試中，描述了優(yōu)選的方法和材料。為了本發(fā)明的目 的，以下術(shù)語在下文中被定義。
[0049] 冠詞"一 (a)"和"一 (an)"在本文中被用來指一個或多于一個(即至少一個)冠詞的 語法客體。舉例來說，"育性基因"意指單個育性基因或多于一個育性基因。
[0050] 如本文使用的，"和/或"是指并包括列出的相關(guān)項的一個或更多個的任何和所有 可能的組合，以及當以選擇性(或)解讀時，沒有組合。
[0051] 術(shù)語"抗體"被用來指任何具有抗原結(jié)合區(qū)域并包含抗體片段的抗體樣分子，所述 抗體片段諸如Fab'、Fab、F(ab'）2、單結(jié)構(gòu)域抗體(DAB)、Fv、scFv(單鏈Fv)等。
[0052] 術(shù)語"反義"是指相對于DNA雙鏈體的有義鏈中的脫氧核苷酸殘基的序列，其核苷 酸殘基的序列為相反的5 '至3 '方向的核苷酸序列。DNA雙鏈體的"有義鏈"是指在DNA雙鏈體 中被在其天然狀態(tài)下的細胞轉(zhuǎn)錄成"有義mRNA"的鏈。因此，"反義"序列是具有與DNA雙鏈體 中的非編碼鏈相同的序列的序列。術(shù)語"反義RNA"是指與靶初級轉(zhuǎn)錄物或mRNA的全部或部 分互補并且通過干擾靶基因的初級轉(zhuǎn)錄物或mRNA的加工、轉(zhuǎn)運和/或翻譯阻斷靶基因的表 達的RNA轉(zhuǎn)錄物。反義RNA的互補性可以是與特定基因轉(zhuǎn)錄物的任何部分，換言之，在5'非編 碼序列、3 '非編碼序列、內(nèi)含子或編碼序列。另外，如本文使用的，反義RNA可含有增加反義 RNA阻斷基因表達的效力的核酶序列的區(qū)域。"核酶"是指有催化作用的RNA并且包括序列特 異性的內(nèi)切核糖核酸酶。"反義抑制"是指反義RNA轉(zhuǎn)錄物的產(chǎn)生能夠阻止靶蛋白的表達。
[0053] 如本文使用的術(shù)語"繁殖"意指雄性配子和雌性配子的結(jié)合以使得受精發(fā)生。此類 結(jié)合可以通過交配(mating)(交配(copulation))或者通過體外或體內(nèi)人工方法引起。此類 人工方法包括，但不限于，人工授精、外科手術(shù)輔助的人工授精、體外受精、細胞質(zhì)內(nèi)精子注 射、透明帶鉆孔（zona drilling)、受精的卵母細胞的體外培養(yǎng)、卵巢轉(zhuǎn)移和卵巢分裂 (splitting)〇
[0054] "細胞"、"宿主細胞"、"轉(zhuǎn)化的宿主細胞"等是不僅指特定的受試細胞還指此類細 胞的后代或潛在后代的術(shù)語。因為某些修飾由于突變或環(huán)境影響可在隨后的世代中發(fā)生， 所以此類后代實際上可以與親本細胞不相同，但是仍然包括在如本文使用的術(shù)語的范圍 內(nèi)。
[0055] 如本文使用的，術(shù)語"順式作用序列"或"順式調(diào)控區(qū)域"或類似術(shù)語應被用來意指 源自可表達的基因序列的任何核苷酸序列，其中基因序列的表達至少部分地被核苷酸序列 調(diào)控。本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識到，順式調(diào)控區(qū)域可以能夠激活、沉默、增強、抑制或在其它方 面改變?nèi)魏谓Y(jié)構(gòu)基因序列的表達水平和/或細胞類型特異性和/或發(fā)育特異性。
[0056] "編碼序列"，編碼區(qū)等意指促成基因的多肽產(chǎn)物的編碼的任何核酸序列。相對地， 術(shù)語"非編碼序列"和"非編碼區(qū)"是指不促成基因的多肽產(chǎn)物的編碼的任何核酸序列。
[0057] 術(shù)語"構(gòu)建體"在本文中被用來指包含至少兩個核酸序列或區(qū)段的基因或核酸序 列或區(qū)段，所述至少兩個核酸序列或區(qū)段來自在天然條件下不同時具有那些序列或區(qū)段的 物種，或者所述序列或區(qū)段以在未轉(zhuǎn)化的宿主的天然基因組或核小體中通常不存在的方式 被定位或連接。
[0058]如本文使用的，"互補的"多核苷酸是能夠經(jīng)由根據(jù)標準沃森-克里克互補規(guī)則堿 基配對而雜交的那些多核苷酸。具體地，嘌呤將與嘧啶堿基配對以形成鳥嘌呤與胞嘧啶配 對的結(jié)合(G:C)和在DNA的情況中腺嘌呤與胸腺嘧啶配對的結(jié)合(A:T)或者在RNA的情況中 腺嘌呤與尿嘧啶配對的結(jié)合(A:U)。例如，序列"A-G-T"與互補序列"T-C-A"結(jié)合。應理解兩 個多核苷酸可以彼此雜交，即使它們不完全或全部彼此互補，條件是每個多核苷酸具有與 另一個基本上互補的至少一個區(qū)域。如本文使用的術(shù)語"互補的"或"互補性"是指多核苷酸 在允許的鹽和溫度條件下通過堿基配對的天然結(jié)合。兩個單鏈分子之間的互補性可以是 "部分的"，其中只有一些核苷酸結(jié)合，或者當在單鏈分子之間沿著分子的整個長度或者沿 著單鏈分子的一部分或區(qū)域存在完全互補性時，兩個單鏈分子之間的互補性可以是完全 的。核酸鏈之間的互補性的程度對核酸鏈之間的雜交的效率和強度具有顯著影響。如本文 使用的，術(shù)語"基本上互補的"或"部分互補的"意指兩個核酸序列至少在其核苷酸的約 50%、60%、70%、80%或90%處互補。在一些實施方案中，兩個核酸序列可以在其核苷酸的 約85 %、90 %、95 %、96 %、97 %、98 %、99 %或更多處互補。術(shù)語"基本上互補的"和"部分互 補的"還可以意指兩個核酸序列能夠在高嚴格度條件下雜交并且此類條件是本領(lǐng)域公知 的。
[0059] 貫穿本說明書，除非上下文另有需要，術(shù)語"包含（comprise )"、"包含 (comprises)"、"包含(comprising)"應被理解為暗示包括陳述的步驟或元素或者步驟或元 素的組，但是不排除任何其它步驟或元素或者步驟或元素的組。因此，術(shù)語"包含 (comprising)"等的使用表明所列出的元素是必需的或強制性的，但是其它元素是任可選 的并且可以存在或不存在。"由……組成（consisting of)"意指包括，并且限于，在短語 "由……組成"之后的任何元素。因此，短語"由……組成"表明所列出的元素是必需的或強 制性的，并且沒有其它元素可以存在。通過"基本上由……組成"意指包括在該短語之后列 出的任何元素，并且限于不干擾或者有助于本公開內(nèi)容中詳細說明的所列出的元素的活性 或作用的其它元素。因此，短語"基本上由……組成"表明所列出的元素是必需的或者強制 性的，但是其它元素是任選的并且根據(jù)它們是否影響所列出的元素的活性或作用可以存在 或不存在。
[0060] "組成型啟動子"是指指導可操作連接的可轉(zhuǎn)錄序列在生物體的許多或所有組織 中表達的啟動子。
[0061] 術(shù)語"構(gòu)建體"是指包含來自不同來源的一個或更多個分離的核酸序列的重組遺 傳分子。如本文使用的，術(shù)語"表達構(gòu)建體"、"重組構(gòu)建體"或"重組DNA構(gòu)建體"是指源自任 何來源、能夠基因組整合或自主復制、包含其中一個或更多個核酸分子已經(jīng)可操作連接的 核酸分子的任何重組核酸分子，諸如質(zhì)粒、粘粒、病毒、自主復制的多核苷酸分子、噬菌體、 或者線性或環(huán)狀單鏈或雙鏈DNA或RNA核酸分子。"表達構(gòu)建體" 一般至少包含與感興趣的核 苷酸序列可操作連接的控制序列。以這種方式，例如，在表達構(gòu)建體中提供與待表達的核苷 酸序列可操作連接的植物啟動子，用于在植物、植物部分、植物器官和/或植物細胞中表達。 將可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子轉(zhuǎn)錄為功能性mRNA分子，所述功能性mRNA分子被翻譯并且因此被表 達為蛋白質(zhì)產(chǎn)物，以如此方式將構(gòu)建體引入到細胞中的方法是已知的。還可以將構(gòu)建體制 備為能夠表達抑制性RNA分子，例如以抑制感興趣的特異性RNA分子的翻譯。對于本發(fā)明的 實踐，用于制備和使用構(gòu)建體和宿主細胞的常規(guī)組合物和方法本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的， 參見例如，Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 3.sup.rd版卷 1、2和3， J.F.Sambrook、D.W.Russell和N.Irwin,Cold Spring Harbor Laboratory Press,2000。
[0062] "控制元件"或"控制序列"意指影響可操作連接的核苷酸序列的表達(例如，轉(zhuǎn)錄、 RNA加工或穩(wěn)定性或者相關(guān)編碼序列的翻譯）的核酸序列（例如，DNA)。調(diào)控序列包括增強 子、啟動子、翻譯前導序列、內(nèi)含子和多腺苷酸化信號序列?？刂圃蚩刂菩蛄锌梢晕挥?編碼序列的上游(5'非編碼序列）、內(nèi)部或下游(3'非編碼序列）。它們包括天然序列和合成 序列以及可以為合成序列和天然序列的組合的序列。例如，適用于在原核細胞中表達可操 作連接的核苷酸序列的控制序列包括，例如，啟動子和任選的順式作用序列諸如操縱子序 列和核糖體結(jié)合位點。適用于真核細胞的控制序列包括轉(zhuǎn)錄控制序列諸如：啟動子;多腺苷 酸化信號;轉(zhuǎn)錄增強子;翻譯控制序列，諸如翻譯增強子和內(nèi)部核糖體結(jié)合位點（IRES);調(diào) 節(jié)RNA穩(wěn)定性的核酸序列；以及使由轉(zhuǎn)錄的多核苷酸編碼的產(chǎn)物靶向細胞內(nèi)的細胞內(nèi)區(qū)室 或細胞外環(huán)境的靶向序列。代表性控制序列包括天然序列和合成序列以及可以為合成序列 和天然序列的組合的序列。
[0063] "對應于（corresponds to)"或"對應于（corresponding to)"意指表現(xiàn)出與參考 核酸序列的基本的序列同一性(例如，與參考核酸序列的全部或一部分的至少約50、51、52、 53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、 78、79、80、81、82、83、84、85、86、97、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99%或甚至高達 100%的序列同一性）的核酸序列或者表現(xiàn)出與參考氨基酸序列的基本的序列相似性或同 一性(例如，與參考氨基酸序列的全部或一部分至少約50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、 60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、 85、86、97、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99%或甚至高達100%的序列相似性或同 一性)的氨基酸序列。
[0064] 術(shù)語"培養(yǎng)(culture)"、"培養(yǎng)的（cultured)"和"培養(yǎng)(culturing)"在本文中可互 換使用，以指胚胎或多能細胞藉以在體外生長的方法。
[0065] 如應用于核酸的術(shù)語"破壞"和"破壞的"在本文中可互換使用，以指減少或消除核 酸或其表達產(chǎn)物的表達和/或功能活性的任何遺傳修飾。例如，基因的破壞在其范圍內(nèi)包括 減少或消除基因的表達和/或相應的基因產(chǎn)物(例如，mRNA和/或蛋白質(zhì)）的功能活性的任何 遺傳修飾。遺傳修飾包括核酸（例如基因）的完全或部分的失活、抑制、缺失、中斷 (interruption)、阻斷(blockage)或下調(diào)。示例性遺傳修飾包括，但不限于:基因敲除；失 活;突變(例如，破壞基因產(chǎn)物的表達或活性的插入、缺失、點突變或移碼突變）；或者抑制性 核酸(例如，抑制性RNA諸如有義或反義RNA，介導RNA干擾的分子諸如s i RNA、s hRNA、m i RNA; 等）、抑制性多肽(例如，抗體、多肽結(jié)合伴侶、顯性負性多肽、酶等)或者抑制育性基因的活 性或育性基因的表達產(chǎn)物的水平或功能活性的任何其它分子。
[0066] "顯性負性"是指當與野生型基因產(chǎn)物在同一細胞中共表達時、甚至當細胞為雜合 的（野生型和顯性負性)時，不利地影響、阻斷或消除正常的野生型基因產(chǎn)物的功能的基因 產(chǎn)物。顯性負性突變體的表達一般導致野生型基因產(chǎn)物的正常功能的降低。
[0067]如本文使用的，"早期胚胎"包括開始于卵母細胞的受精（即，受精的卵母細胞)并 延伸通過2細胞期、4細胞期、8細胞期和桑椹胚（16至31細胞期胚胎）的全部胚胎發(fā)育期。如 本文所定義的，早期胚胎不包括發(fā)育的囊胚期。"囊胚"意指以被稱為囊胚腔的腔周圍的細 胞的中空球的發(fā)育為特征的胚胎發(fā)育期。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到，囊胚的整體結(jié)構(gòu)將根 據(jù)生物體而不同。例如，"囊胚"是指以由外滋養(yǎng)層細胞和內(nèi)細胞團組成的細胞的中空球為 特征的卵裂期哺乳動物胚胎。
[0068]術(shù)語"胚胎干細胞"和ES細胞在本文中可互換使用，來指能夠在胚胎或成體中引起 許多分化的細胞類型(包括生殖細胞）的細胞。ES細胞包括早期胚胎來源的培養(yǎng)的細胞，所 述ES細胞特征在于此類細胞能夠在保持退行發(fā)育(anaplasticity)(全能性）的同時增殖。 一般來說，胚胎干細胞為通過以下建立的細胞系:培養(yǎng)存在于動物的早期胚胎的囊胚內(nèi)部 為未分化的干細胞的內(nèi)細胞團的細胞，以使得細胞在維持其未分化狀態(tài)的同時保持增殖。
[0069] 如本文使用的，術(shù)語"胚胎生殖細胞"，也被稱為EG細胞，是指源自原生殖細胞的培 養(yǎng)的細胞，所述"胚胎生殖細胞"特征在于其具有幾乎等同于以上胚胎干細胞的能力的能 力。胚胎生殖細胞為通過以下建立的細胞系:培養(yǎng)從受精之后數(shù)天至數(shù)周的胚胎(例如，在 小鼠的情況中，大約8.5日齡的胚胎)獲得的原生殖細胞，以使得細胞在維持其未分化狀態(tài) 的同時保持增殖。
[0070] 如本文使用的，術(shù)語"編碼(encode)"、"編碼(encoding)"等是指核酸提供另一種 核酸或多肽的能力。例如，如果核酸序列能夠被轉(zhuǎn)錄和/或翻譯以產(chǎn)生多肽或者如果核酸序 列能夠被加工為能夠被轉(zhuǎn)錄和/或翻譯以產(chǎn)生多肽的形式，則稱所述核酸序列"編碼"多肽。 此類核酸序列可以包括編碼序列或者編碼序列和非編碼序列二者。因此，術(shù)語"編碼 (encode)"、"編碼(encoding)"等包括由DNA分子的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的RNA產(chǎn)物，由RNA分子的翻譯 產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，由DNA分子的轉(zhuǎn)錄以形成RNA產(chǎn)物以及隨后RNA產(chǎn)物的翻譯產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，或 者由DNA分子的轉(zhuǎn)錄以提供RNA產(chǎn)物、RNA產(chǎn)物的加工以提供加工的RNA產(chǎn)物(例如mRNA)和隨 后加工的RNA產(chǎn)物的翻譯產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。
[0071] 如本文使用的，"瀕危哺乳動物"屬于由于其數(shù)量很少或者受到改變的環(huán)境或捕食 參數(shù)的威脅而處于走向滅絕的風險的哺乳動物的群體，諸如大象、大型貓科動物和非人靈 長類動物，包括灰狼、紋兔袋鼠、美洲虎（jaguar)、亞洲象、高鼻羚羊和北白犀（北白犀 (ceratotherium simum cottoni))。
[0072] 在核酸或蛋白質(zhì)的上下文中，術(shù)語"內(nèi)源性"是指通常發(fā)現(xiàn)于宿主生物體或宿主細 胞中的核酸序列或區(qū)段或者氨基酸序列或區(qū)段。
[0073] 如本文使用的術(shù)語"內(nèi)源性配子"和"內(nèi)源性生殖細胞"是指"起源于或者產(chǎn)生自宿 主胚胎內(nèi)"的配子和生殖細胞并且排除宿主細胞內(nèi)的源自供體多能細胞的配子和生殖細 胞。
[0074] 關(guān)于基因序列的術(shù)語"表達"是指基因的轉(zhuǎn)錄以及所得到的mRNA轉(zhuǎn)錄物根據(jù)情況 翻譯為蛋白質(zhì)。因此，如從上下文中將變得清楚的，編碼序列的表達由編碼序列的轉(zhuǎn)錄和翻 譯引起。相對地，非編碼序列的表達由非編碼序列的轉(zhuǎn)錄引起。
[0075] 如本文使用的，"育性基因"是指涉及產(chǎn)生后代或者涉及懷孕的能力的基因。因此， 育性基因的破壞可以減小、損壞或消除非人類動物的懷孕或產(chǎn)生后代的能力，從而導致不 育。導致的不育能夠存在于雄性或雌性中。不育的非限制性實例包括:無精癥;與有缺陷的 精子發(fā)生相關(guān)的遺傳性紊亂(例如，克氏綜合征和性腺發(fā)育不全）；少精癥;精索靜脈曲張； 和與受損的精子功能相關(guān)的其它精子紊亂，包括但不限于低下的精子數(shù)目、精子活力和精 子形態(tài)；以及排卵功能異常（例如，多囊卵巢綜合征(PC0S)或慢性停止排卵）。如本文使用 的，可破壞的(例如通過破壞物分子)的育性基因被稱為"可破壞的育性基因"。
[0076]術(shù)語"側(cè)翼為(flanked by)"、"在......側(cè)翼(flanking)"等當其應用于本發(fā)明的革巴 向構(gòu)建體中的兩個或更多個核苷酸序列之間的關(guān)系時，不要求這些核苷酸序列中的一個位 于與另一個核苷酸序列直接鄰接處。例如，三個參考核苷酸序列(A、B和C)的側(cè)翼可以為重 組靶位點序列，或者重組靶位點序列可以在那些參考序列的側(cè)翼，即使參考序列B未與這些 位點直接鄰接。因此，術(shù)語"側(cè)翼為"等同于"在"重組位點"之間"并且術(shù)語"在……側(cè)翼"等 同于重組位點在參考序列的上游或下游。
[0077] "功能基因"是指產(chǎn)生執(zhí)行可定義的功能的基因產(chǎn)物的基因。在特定的實施方案 中，功能基因是內(nèi)源性基因。
[0078] 術(shù)語"配子(gamete)"和"配子(gametes)"可互換使用并且是指次級生殖細胞，包 括卵母細胞、卵細胞、精子(spermatozoa)和精子(sperm)。
[0079] 如本文使用的，術(shù)語"基因"是指能夠被用于產(chǎn)生mRNA、反義RNA、s i RNA、s h RNA、 miRNA等的核酸分子。基因可以或者可以不能夠被用于產(chǎn)生功能性蛋白質(zhì)。基因可包括編碼 區(qū)和非編碼區(qū)二者（例如，內(nèi)含子、調(diào)控元件、啟動子、增強子、終止序列以及5'非翻譯區(qū)和 3'非翻譯區(qū)）。
[0080]術(shù)語"遺傳修飾"是指在引入新核酸（即，對于細胞外源性的核酸)之后，在細胞中 引起的永久性或暫時性的遺傳改變。遺傳改變（"修飾"）能夠通過將新核酸并入到宿主細胞 的基因組中，或者通過瞬時或穩(wěn)定保持新核酸作為染色體外元件實現(xiàn)。當細胞為真核細胞 時，永久性遺傳改變能夠通過將核酸引入細胞的基因組中實現(xiàn)。遺傳修飾在其范圍內(nèi)包括 敲入(knock-in)和敲除遺傳改變。
[0081 ] 術(shù)語"生殖細胞(germ cell)"、"生殖細胞(germ cells)"和"種系"可互換使用并 且是指產(chǎn)生配子的細胞。這些術(shù)語包括原生殖細胞、對堿性磷酸酶呈陽性的細胞、初級卵母 細胞、卵原細胞、精原干細胞、精原細胞和初級精母細胞。
[0082]術(shù)語"異源的"是指不是來源于特定的生物體、組織或細胞內(nèi)的物體(例如，核酸分 子、多肽、細胞、組織等）。例如，"異源細胞"，包括"異源多能細胞"，是指通常地或天然地無 法發(fā)現(xiàn)于生物體中或者生物體的組織中的細胞。
[0083]術(shù)語"異源多核苷酸"、"外來多核苷酸"、"外源性多核苷酸"等在本文中可互換使 用以描述已經(jīng)或即將被人工引入宿主生物體的基因組中并且被傳遞到該宿主的后代的遺 傳物質(zhì)。異源多核苷酸可以包括在基因序列被引入或即將被引入至其的生物體中發(fā)現(xiàn)的所 述基因序列，只要引入的多核苷酸相對于天然存在的多核苷酸含有一些修飾(例如，點突 變、存在可選擇的標記物基因、存在LoxP位點等）。異源多核苷酸可以包含在合適的條件下 能夠被轉(zhuǎn)錄為RNA并且任選地被翻譯和/或表達的核酸序列。在一些實施方案中，其被轉(zhuǎn)錄 為干擾轉(zhuǎn)錄或翻譯的分子(例如，反義分子)或介導RNA干擾的分子(例如，s iRNA或shRNA)。 在一些實施方案中，異源多核苷酸包含肽或多肽的編碼序列。在一些實施方案中，異源多核 苷酸包含用于將遺傳修飾引入基因組中的靶向盒。
[0084] 術(shù)語"異源多肽"、"外來多肽"和"外源性多肽"可互換使用以指由如上文定義的 "異源多核苷酸"、"外來多核苷酸"和"外源性多核苷酸"編碼的任何肽或多肽。
[0085] 術(shù)語"宿主細胞"是指構(gòu)建體或本發(fā)明的構(gòu)建體被引入其中的細胞。本發(fā)明的宿主 細胞包括，但不需要限于，細菌、酵母、動物(包括脊椎動物）、昆蟲和植物細胞。宿主細胞可 以是單細胞的，或者可以在組織培養(yǎng)中作為液體培養(yǎng)物、單層等生長。宿主細胞還可以直接 或間接地源自組織，或者可以存在于包括動物在內(nèi)的生物體內(nèi)。在特定的實施方案中，宿主 細胞是動物宿主細胞，特別是脊椎動物宿主細胞，包括哺乳動物宿主細胞。
[0086]在本文中提及"免疫相互作用的"包括提及任何相互作用、反應或分子之間聯(lián)系的 其它形式并且特別是當分子之一是或者模擬免疫系統(tǒng)的組分時。
[0087] 術(shù)語"敲入(knock-in)" 一般是指已經(jīng)通過同源重組被插入基因組中的異源或外 來多核苷酸。敲入的多核苷酸可以是代替內(nèi)源性、野生型基因或基因部分的突變形式的基 因或基因部分。此類突變包括異源序列的插入、缺失、點突變、移碼突變和可阻止、破壞或改 變正常基因表達的任何其它突變。因此，如本文使用的"敲入"的動物是指其中異源或外來 多核苷酸被插入到動物的基因組中或者其中動物的基因組的特定基因或其部分被外源基 因或DNA序列代替的遺傳修飾的動物。"條件性敲入"在其范圍內(nèi)包括已經(jīng)通過同源重組被 插入到基因組中并且在指定的發(fā)育期或在特定的環(huán)境條件下引起活性(例如，轉(zhuǎn)錄或翻譯 的調(diào)控、包括編碼和/或非編碼序列在內(nèi)的核苷酸序列的產(chǎn)生等）的異源或外來多核苷酸。 "條件性敲入載體"是包含可以通過同源重組插入到基因組中并且可在指定的發(fā)育期或在 特定的環(huán)境條件下引起活性(例如，轉(zhuǎn)錄或翻譯的調(diào)控、包括編碼和/或非編碼序列在內(nèi)的 核苷酸序列的產(chǎn)生等)的異源或外來基因或其部分的載體。
[0088] 通過"敲除"意指基因的失活或破壞，所述基因的失活或破壞降低、消除或者以其 他方式抑制該基因的表達產(chǎn)物的水平或功能活性。"敲除"的動物是指其中基因被破壞的遺 傳修飾的動物。"條件性敲除"是指在特定條件下被破壞的基因，諸如以組織特異性或時間 特異性的模式被破壞的基因。"條件性敲除載體"是指包含能夠在特定的條件下被破壞的基 因的載體。
[0089] 通過"標記物基因"意指給予表達標記物基因的細胞一種不同的表型并由此允許 此類轉(zhuǎn)化的細胞區(qū)別于不具有該標記物的細胞的基因。可選擇的標記物基因賦予一種性 狀，由于該性狀，技術(shù)人員能夠基于對選擇劑(例如，除草劑、抗生素、射線、熱或?qū)ξ崔D(zhuǎn)化的 細胞的其它處理傷害）的耐受來'選擇'。可篩選的（screenable)標記物基因（或報告物基 因）賦予技術(shù)人員能夠通過觀察或測試，即通過'篩選'鑒定的性狀(例如，葡萄糖醛酸酶、 熒光素酶、綠色熒光蛋白或在未轉(zhuǎn)化的細胞中不存在的其它活性）。
[0090] 術(shù)語"微小RNA"或"miRNA"是指已經(jīng)在包括植物在內(nèi)的很多不同的真核細胞中發(fā) 現(xiàn)的小的非編碼R N A分子。m i R N A前體共有特征性次級結(jié)構(gòu)，形成短的'發(fā)夾' R N A。術(shù)語 "miRNA"包括經(jīng)加工的序列以及相應的長的初級轉(zhuǎn)錄物(pri-miRNA)和經(jīng)加工的前體(pre-miRNA)。遺傳學和生物化學研究已經(jīng)表明，miRNA被RNA酶III家族核酸酶Dicer加工為其成 熟形式，并且通過RNA介導的干擾（RNAi)和相關(guān)的途徑發(fā)揮作用以調(diào)控靶基因的表達 (Hannon，2002，Nature 418,244-251;Pasquinelli等，2002，Annu.Cell.Dev.Biol·18,495-513) miRNA可以被配置為合成的沉默引發(fā)物'短發(fā)夾RNA'（shRNA)以允許細胞中基因表達 的實驗操作（Paddison等，2002，Cancer Cell2，17-23)。通過shRNA的沉默涉及RNAi機器 (machinery)并且與小干擾RNA( s iRNA)的產(chǎn)生相關(guān)，這些是RNAi的特征。
[0091] 如本文使用的，"天然存在的"核酸分子是指具有天然存在的核苷酸序列的RNA或 DNA分子。例如，天然存在的核酸分子能夠編碼自然界中存在的蛋白質(zhì)。
[0092] 術(shù)語"非編碼序列"是指不促成基因的多肽產(chǎn)物的編碼的任何核酸序列。
[0093] 術(shù)語"非人類動物"意指排除人類之外的動物，并且意圖包括任何脊椎動物諸如哺 乳動物、鳥、爬行動物、兩棲動物和魚。合適的哺乳動物包括嚙齒動物、非人靈長類動物、馬 科動物諸如馬、綿羊、山羊、兔形目動物諸如兔子、狗、貓、牛、動物園動物以及瀕?；蛲鈦?(exotic)哺乳動物。在一些實施方案中，非人類動物選自包括大鼠和小鼠在內(nèi)的嚙齒動物 類。在特定的實施方案中，非人類動物是小鼠。
[0094] "核組（nucleome)"意指總的核酸組（nucleic acid complement)并且包括基因 組、染色體外核酸分子和所有RNA分子諸如mRNA、異源核RNA(hnRNA)、小核RNA( snRNA)、小核 仁RNA(snoRNA)、小胞質(zhì)RNA(scRNA)、核糖體RNA(rRNA)、翻譯控制RNA(tcRNA)、轉(zhuǎn)運RNA (tRNA)、eRNA、信使RNA干擾性互補RNA(micRNA)或干擾RNA(iRNA)、葉綠體或質(zhì)粒RNA (cpRNA)和線粒體RNA(mtRNA)。
[0095] 術(shù)語"可操作連接的（operably connected)"、"可操作連接的（operably linked)"、"可操作連接的（in operable linkage)"、"可操作連接的（in operable connection)"等在本文中被用來指多核苷酸元件在功能性關(guān)聯(lián)中的連接。當核酸被置于與 另一個核酸序列的功能性關(guān)聯(lián)中時，所述核酸被"可操作連接"。例如，當重組酶識別位點足 夠緊密靠近以促進宿主細胞基因組中靶向盒與靶位點之間的重組時，重組酶識別位點與靶 向盒可操作連接。在一些實施方案中，重組酶識別位點位于距離靶向盒不多于l〇kb、9kb、 8kb、7kb、6kb、5kb、4kb、3kb、2kb、lkb、900bp、800bp、700bp、600bp、500bp、400bp、300bp、 20(^口、10(^?、9(^?、8(^?、7(^?、6(^?、5(^?、4(^?、3(^?、2(^?或1(^?處。在其它實施方案中， "可操作連接"等是指將可轉(zhuǎn)錄序列放置在啟動子的調(diào)節(jié)性控制下，所述啟動子控制序列的 轉(zhuǎn)錄和任選地翻譯。在異源啟動子/可轉(zhuǎn)錄序列組合的構(gòu)建中，通常期望將遺傳序列或啟動 子放置在距離基因轉(zhuǎn)錄起始位點與該遺傳序列或啟動子與它在其天然設(shè)置（即，遺傳序列 或啟動子源自的基因）中控制的基因之間的距離大約相同處。如本領(lǐng)域已知的，以該距離的 一些變體能夠被適應而不會失去功能。類似地，另一個控制元件相對于待被放置在其控制 下的異源核酸序列或基因的期望的位置由該元件在其天然設(shè)置(即所述控制元件源自的基 因）中的位置限定。這些術(shù)語在其范圍內(nèi)還包括啟動子與可轉(zhuǎn)錄序列之間的可操作連接 (linkage)或連接(connection)，其中在第一條件下表達調(diào)節(jié)元件被用于抑制可轉(zhuǎn)錄序列 的轉(zhuǎn)錄，并且其中在第二條件下表達調(diào)節(jié)元件的破壞被用于允許或增強可轉(zhuǎn)錄序列的轉(zhuǎn) 錄。
[0096] 如本文使用的，術(shù)語"轉(zhuǎn)錄后基因沉默"（PTGS)是指基因沉默的一種形式，其中抑 制機制在轉(zhuǎn)錄后發(fā)生。這能夠?qū)е绿禺愋缘腞NA靶的降低的穩(wěn)態(tài)水平或翻譯的抑制(Tuschl 等，2001，ChemBiochem 2:239-245)。在文獻中，術(shù)語RNA干擾(RNAi)和轉(zhuǎn)錄后共抑制經(jīng)常被 用來表明轉(zhuǎn)錄后基因沉默。
[0097] 術(shù)語"多能"是指細胞分化為在成年生物體(例如，非人類動物）中存在的許多分化 的細胞類型的能力。與全能細胞相比，多能細胞的分化能力是受限制的。多能細胞包括，但 不限于，能夠分化為生殖細胞的干細胞諸如ES細胞、上胚層干細胞(EpiSC或epi干細胞）、胚 胎生殖(EG)細胞和誘導性多能干(iPS)細胞。術(shù)語"多能細胞"包括遺傳修飾的多能細胞。
[0098] 如本文使用的術(shù)語"多核苷酸"或"核酸"表示mRNA、RNA、cRNA、cDNA、iRNA、s iRNA、 shRNA、miRNA或DNA。該術(shù)語通常指長度大于30個核苷酸的寡核苷酸。
[0099] "多肽"、"肽"和"蛋白質(zhì)"在本文中可互換使用以指氨基酸殘基的聚合物以及氨基 酸殘基的聚合物的變體和合成的類似物。因此，這些術(shù)語適用于其中的一個或更多個氨基 酸殘基是合成的非天然存在的氨基酸(諸如相應的天然存在的氨基酸的化學類似物）的氨 基酸聚合物，以及適用于天然存在的氨基酸聚合物。
[0100]術(shù)語"后代"、"轉(zhuǎn)基因非人類動物的后代"等是指繼最初轉(zhuǎn)化的非人類動物之后的 每代的任何和所有后代。
[0101] "啟動子"意指至少部分控制轉(zhuǎn)錄的起始和水平的DNA區(qū)域。在本文中提及"啟動 子"將取其最廣的語境(broadest context)，并且包括經(jīng)典基因組基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列(包 括TATA盒和CCAAT盒序列），以及響應于發(fā)育和/或環(huán)境刺激或以組織特異性或細胞類型特 異性的方式改變基因表達的另外的調(diào)控元件（即，激活序列、增強子和沉默子）。啟動子通 常，但不必然位于其表達被所述啟動子調(diào)控的可轉(zhuǎn)錄序列（例如編碼序列或編碼功能RNA的 序列）的上游或5 '端。此外，包含啟動子的調(diào)控元件通常位于基因的轉(zhuǎn)錄起始位點的2kb內(nèi)。 根據(jù)本發(fā)明的啟動子可以含有位于距離起始位點更遠處的另外的特異性調(diào)控元件，以進一 步增強在細胞中的表達和/或改變與所述啟動子可操作連接的結(jié)構(gòu)基因的表達的時間控制 或可誘導性。術(shù)語"啟動子"在其范圍內(nèi)還包括誘導型啟動子、阻抑型啟動子和組成型啟動 子以及小啟動子。小啟動子通常指能夠起始與所述小啟動子可操作連接的選擇的DNA序列 的轉(zhuǎn)錄的小的表達控制元件。在一些實例中，小啟動子在基礎(chǔ)水平以上的另外的調(diào)控元件 (例如，增強子或其它順式作用調(diào)控元件）的不存在下不能起始轉(zhuǎn)錄。小啟動子經(jīng)常由TATA 盒或TATA樣盒組成。很多小啟動子序列是文獻中已知的。例如，小啟動子可以選自很多的已 知序列，包括除了很多其它的以外，來自f〇s、CMV、SV40和IL-2的啟動子區(qū)域。提供了使用小 CMV啟動子或小IL2基因啟動子(相對于起始位點-72至+45;SiebenliSt，1986)的示例性實 例。
[0102] 如本文使用的，"稀有或者瀕危物種"包括但不限于被任何組織列為受到威脅的或 者瀕危的任何動物，或者其種群或棲息地受到威脅的任何動物，或者被圈養(yǎng)而期望地繁殖 的任何動物。例如，顏危物種的列表可在U.S.Fish and wildlife Service,Endangered Species Program中找到或者在Endangered Species Act)(ESA)中被列出。
[0103] "重組酶識別位點"（RRS)意指重組酶與其結(jié)合或者以其它方式相互作用的核酸位 點或序列。此類結(jié)合或相互作用可以是直接的或者間接的。
[0104] 術(shù)語"可調(diào)控啟動子"是指并非組成型地而是以在時間上和/或在空間上調(diào)控的方 式指導基因表達的啟動子，并且包括組織特異性啟動子和誘導型啟動子二者。其包括天然 的序列和合成的序列以及可以為合成的序列和天然的序列的組合的序列。不同的啟動子可 以在不同的組織或細胞類型中，或者在不同的發(fā)育期，或者響應于不同的環(huán)境條件指導基 因的表達?？捎糜谒拗骷毎亩喾N類型的新啟動子被不斷發(fā)現(xiàn)。由于在大多數(shù)情況中調(diào)控 序列的精確邊界尚未被徹底界定，因此不同長度的核酸片段可以具有相同的啟動子活性。
[0105] 如本文使用的，術(shù)語"RNA干擾"和"RNAi"是指一種序列特異性的過程，通過所述過 程靶分子(例如，靶基因、蛋白質(zhì)或RNA)經(jīng)由表達的下調(diào)而被下調(diào)。不被束縛于特定的機制， 如本領(lǐng)域技術(shù)人員目前所理解的，RNAi涉及RNA分子例如細胞內(nèi)的mRNA分子通過酶性的RNA 誘導的沉默復合體(RISC)催化而降解。RNAi在細胞中天然地發(fā)生以去除外來RNA(例如病毒 RNA)，RNAi由從更長的dsRNA裂解得到的dsRNA片段引發(fā)，dsRNA片段將降解機制導向具有密 切同源的序列的其它RNA序列。隨著作為一項技術(shù)實踐，RNAi能夠通過人類介入被起始，以 使用外源地合成的dsRNA或在細胞中轉(zhuǎn)錄的dsRNA(例如，被合成為形成短的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的序 列)減少或者甚至沉默靶基因的表達。
[0106] 如本文使用的，術(shù)語"小干擾RNA"和"短干擾RNA"（ "siRNA"）是指短的RNA分子，通 常為長度約為約10-50個核苷酸(術(shù)語"核苷酸"包括核苷酸類似物）、優(yōu)選地長度在約15-25 個核苷酸之間的雙鏈RNA分子。在大多數(shù)情況中，s iRNA的長度為17、18、19、20、21、22、23、24 或25個核苷酸。此類siRNA能夠具有突出端(例如，1個、2個或3個核苷酸(或核苷酸類似物） 的3 ' -突出端）。此類s iRNA能夠介導RNA干擾。
[0107] 如與本發(fā)明相關(guān)使用的，術(shù)語"shRNA"是指具有莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的RNA分子。莖-環(huán)結(jié)構(gòu) 包括兩條相互互補的序列，其中各自的方向和互補性的程度允許兩個序列之間的堿基配 對。相互互補的序列通過環(huán)區(qū)域連接，環(huán)由環(huán)區(qū)域內(nèi)的核苷酸（或核苷酸類似物）之間缺乏 堿基配對產(chǎn)生。
[0108] 如本文使用的術(shù)語"序列同一性"是指序列在比較窗口中在核苷酸到核苷酸的基 礎(chǔ)上或者在氨基酸到氨基酸的基礎(chǔ)上相同的程度。因此，"序列同一性的百分數(shù)"通過以下 來計算:在比較窗口中比較兩個最佳對齊的序列；確定在兩個序列中均存在相同的核酸堿 基(例如，△、1'、0、6、1)或相同的氨基酸殘基(例如厶13、？1'〇、361'、1111'、617、'\^1、1^11、116、？116、 Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置數(shù)目，以得到匹配的位置的數(shù) 目；將匹配的位置的數(shù)目除以比較窗口中的位置的總數(shù)（即窗口大?。?；并且將結(jié)果乘以100 以得到序列同一性的百分數(shù)。為了本發(fā)明的目的，"序列同一性"將被理解為意指通過 DNASIS計算機程序（2.5版本用于windows;從Hitachi Software engineering Co·,Ltd·, South San Francisco,California,USA可得)使用如軟件所附的參考手冊中使用的標準默 認值計算的"匹配百分數(shù)"。
[0109] "相似性"是指相同的或者構(gòu)成如表1中限定的保守置換的氨基酸的百分數(shù)。
[0110] 表1
[0112] 相似性可是使用序列比較程序諸如GAP(Deveraux等1984，Nucleic Acids Research 12,387-395)來確定。以這種方式，與本文引用的那些序列長度相似或大體上不 同的序列可以通過將空位插入到對齊物中來比較，此類空位例如通過GAP使用的比較算法 來確定。
[0113]用于描述兩個或更多個多核苷酸或多肽之間的序列關(guān)系的術(shù)語包括"參考序列"、 "比較窗口"、"序列同一性"、"序列同一性的百分數(shù)"和"基本同一性"。"參考序列"的長度為 至少12個但經(jīng)常15至18個并且通常至少25個單體單位，所述單體單位包括核苷酸和氨基酸 殘基。因為兩個多核苷酸可以各自包含（1)兩個多核苷酸之間相似的序列（即，完整多核苷 酸序列的僅一部分），以及(2)兩個多核苷酸之間不同的序列，所以兩個(或更多個)多核苷 酸之間的序列比較通常通過比較"比較窗口"中的兩個多核苷酸的序列以鑒定并比較序列 相似性的局部區(qū)域來進行。"比較窗口"是指至少6個連續(xù)位置、通常約50個至約100個、更通 常約100個至約150個連續(xù)位置的概念區(qū)段，在所述概念區(qū)段中，在兩個序列被最佳對齊后， 一個序列被與具有相同數(shù)目的連續(xù)位置的參考序列比較。當與參考序列（其不包含添加或 缺失）比較時，比較窗口可以包含約20 %或更少的添加或缺失（即，空位）用于兩個序列的最 佳對齊。用于對齊比較窗口的最佳序列對齊可以通過算法的計算機化執(zhí)行（Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0,Genetics Computer Group，575Science Drive Madison，WI，USA中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)，或者通過觀察和由選擇的多種 方法中的任一種產(chǎn)生的最佳對齊（即，在比較窗口中產(chǎn)生最高百分比的同源性)來進行。如 例如由Altschul等，1997，Nucl.Acids Res.25:3389所公開的，參考還可以被制作成BLAST 程序族序列分析的詳細討論可在Ausubel等〃Current Protocols in Molecular Biology"，John Wiley&Sons Inc，1994-1998,第15章的 19.3單元中找到。
[0114] 術(shù)語"位點特異性同源重組"是指在核苷酸組成上基本上相似的核酸序列之間的 鏈交換交叉事件。這些交叉事件可發(fā)生于在本發(fā)明的靶向構(gòu)建體中包含的序列與內(nèi)源性基 因組核酸序列之間。另外，能夠發(fā)生多于一個位點特異性同源重組事件是可能的，這會導致 置換事件，在所述置換事件中，靶向構(gòu)建體中包含的核酸序列具有存在于內(nèi)源性基因組序 列中的被置換的特定序列。
[0115] 如應用于基因的破壞或者重組酶識別位點的識別，術(shù)語"特異性地"是指破壞該基 因或者識別那些重組酶識別位點，而基本上不破壞另一個基因或者基本上不識別其它重組 酶識別位點。例如，特異性地破壞育性基因的劑是表現(xiàn)出對該育性基因相對于另一個育性 基因或者與育性不相關(guān)的基因的破壞大約2倍、5倍、10倍、20倍、50倍或大約100倍、500倍、 1000倍的特異性的劑。在另一個實例中，特異性地識別指定重組酶的識別位點的劑是表現(xiàn) 出對那些識別位點相對于對另一個重組酶的識別位點的特異性大約2倍、5倍、10倍、20倍、 50倍或大約100倍、500倍、1000倍的特異性的劑。
[0116] 如本文使用的"嚴格度"是指在雜交和洗滌程序期間，溫度和離子強度條件以及某 些有機溶劑的存在或不存在。嚴格度越高，在固定化的靶核苷酸序列和洗滌后與靶維持雜 交的標記的探針多核苷酸序列之間的互補性程度將越高。
[0117] "嚴格條件"是指在其下只有具有高頻互補堿基的核苷酸序列將雜交的溫度和離 子條件。所需的嚴格度是核苷酸序列依賴性的，并且取決于在雜交和隨后的洗滌期間存在 的多種成分以及這些處理允許的時間。一般來說，為了最大化雜交比率，選擇非嚴格的雜交 條件；比熱力學熔點（T m)低約20°C至25°(：。1"是在特定的離子強度和pH的溶液中50%的特定 靶序列與完全互補的探針雜交的溫度。一般來說，為了獲得雜交序列的至少約85%的核苷 酸互補性，將高度嚴格的洗滌條件選擇為比T m低約5°C至15°C。為了獲得雜交序列的至少約 70%的核苷酸互補性，將中等嚴格的洗滌條件選擇為比Tm低約15°C至30°C。高度允許性(低 嚴格度)洗滌條件可以低到比1低50°(：，允許雜交序列之間高水平的錯配。本領(lǐng)域技術(shù)人員 將認識到，雜交和洗滌階段中的其它物理和化學參數(shù)也可被改變以影響來自靶和探針序列 之間特定的序列同一性水平的可檢測雜交信號的結(jié)果。
[0118]術(shù)語"祀向盒"、"靶向構(gòu)建體"等是指通過同源重組促進在生物體或宿主細胞的基 因組中破壞或插入特定核酸序列的核酸構(gòu)建體。一般來說，靶向盒包含：（1)至少一個同源 區(qū)或同源臂，所述同源區(qū)或同源臂具有與宿主細胞內(nèi)源性基因位點中存在的序列基本上相 同或者基本上互補的序列，和(2)靶向區(qū)，所述靶向區(qū)通過靶向構(gòu)建體同源區(qū)和內(nèi)源性基因 位點序列之間的同源重組變?yōu)楸徽系剿拗骷毎麅?nèi)源性基因位點中。靶向區(qū)可以包含與內(nèi) 源性基因序列基本上同源的序列和/或在一些實施方案中可以包含非同源序列，諸如可選 擇的標記物(例如，neo、tk、gpt)或者異源多核苷酸。術(shù)語"革E1向盒"、"革E1向構(gòu)建體"等不必然 表示靶向區(qū)包含變?yōu)楸徽系剿拗骰蚪M中的基因，也不必然表示靶向區(qū)包含完整的結(jié)構(gòu) 基因序列。如本領(lǐng)域中所使用的，術(shù)語"靶向盒"、"靶向構(gòu)建體"等與如本文所使用的術(shù)語 "轉(zhuǎn)基因"是同義的。
[0119] 術(shù)語"全能的"是指細胞分化成成年生物體(例如，非人類動物）的所有細胞類型的 能力。
[0120] 術(shù)語"可轉(zhuǎn)錄核酸序列"或"轉(zhuǎn)錄的核酸序列"不包括驅(qū)動轉(zhuǎn)錄的非轉(zhuǎn)錄的調(diào)控序 列。根據(jù)本發(fā)明的方面，可轉(zhuǎn)錄序列可以全部或者部分源自本領(lǐng)域已知的任何來源，所述來 源包括:植物;真菌;動物;細菌基因組或附加體;真核、核或質(zhì)粒DNA; cDNA;病毒DNA或化學 合成的DNA?？赊D(zhuǎn)錄序列可以在編碼區(qū)或非翻譯區(qū)含有一個或更多個修飾，所述修飾能夠影 響表達產(chǎn)物的生物學活性或化學結(jié)構(gòu)、表達的速度或表達控制的方式。此類修飾包括，但不 限于，一個或更多個核苷酸的插入、缺失和置換?？赊D(zhuǎn)錄序列可以含有不中斷的編碼序列或 者其可以包含一個或更多個通過合適的剪接點結(jié)合的內(nèi)含子?？赊D(zhuǎn)錄序列還可以編碼融合 蛋白。在其它實施方案中，可轉(zhuǎn)錄序列僅包含非編碼區(qū)。
[0121] "轉(zhuǎn)染"意指期間核酸分子(例如，質(zhì)?；駾NA片段)被插入到真核細胞中的過程。通 常，2-50 %的細胞攝入質(zhì)粒并持續(xù)~3天表達蛋白質(zhì)產(chǎn)物，而不將質(zhì)粒DNA或DNA片段并入到 細胞的染色體中（=瞬時轉(zhuǎn)染）。這些細胞的小部分將最終將質(zhì)粒DNA并入到它們的染色體 中并永久性地表達蛋白質(zhì)產(chǎn)物（=穩(wěn)定轉(zhuǎn)染）。
[0122] 術(shù)語"轉(zhuǎn)基因"在本文中被用來描述已經(jīng)或者即將被人工引入宿主生物體的基因 組中并且被傳遞到該宿主的后代的遺傳物質(zhì)。轉(zhuǎn)基因通常將包含多核苷酸，所述多核苷酸 包含通常但非必然影響或引起活性(例如，轉(zhuǎn)錄或翻譯的調(diào)控、包含編碼和/或非編碼序列 的核苷酸序列的產(chǎn)生，等)的非編碼和/或編碼序列。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)基因包含能夠在 合適的條件下轉(zhuǎn)錄為RNA并且任選地翻譯和/或表達的多核苷酸。在一些實施方案中，其轉(zhuǎn) 錄為干擾轉(zhuǎn)錄或翻譯的分子（例如，反義分子）或者介導R N A干擾的分子（例如，s i R N A或 shRNA)的分子。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)基因包含多肽的編碼序列。在一些實施方案中，轉(zhuǎn)基 因包含用于將遺傳修飾引入基因組中的靶向盒。可以使用多種個方法中的任一種可被用來 將轉(zhuǎn)基因引入到非人類動物中以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物。此類技術(shù)是本領(lǐng)域所公知的，并且包括， 但不限于，胚胎干細胞和iPS細胞的原核顯微注射、病毒轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)化?？墒褂玫挠糜诋a(chǎn)生轉(zhuǎn) 基因動物的方法包括，但不限于，J.P.Sundberg和T.Ichiki,編輯，Genetically Engineered Mice Handbook，CRC Press;2006;M.H.Hofker和I. van Deursen，編輯， Transgenic Mouse Methods and Protocols，Humana Press，2002;A·L Joyner，Gene Targeting:A Practical Approach,Oxford University Press,2000；Manipulating the Mouse Embryo:A Laboratory Manual，第3片反，Cold Spring Harbor Laboratory Press； 2002, ISBN-10:0879695919；K. Turksen(Ed.),Embryonic stem cells :methods and protocols in Methods Mol.Biol.2002；185,Humana Press；Current Protocols in Stem Cell Biology，ISBN:978047015180;Meyer等PNAS USA，第 107卷（34) ,15022-15026中記載 的那些方法。
[0123] 如本文使用的，關(guān)于宿主細胞、宿主部分、宿主組織或宿主的術(shù)語"轉(zhuǎn)基因的"或 "轉(zhuǎn)化的"意指包含已經(jīng)被引入宿主細胞、宿主部分、宿主組織或宿主動物的核組、特別是基 因組中的遺傳修飾的宿主細胞、宿主部分、宿主組織或宿主動物，所述引入通常通過轉(zhuǎn)基因 的方式。
[0124] "載體"意指核酸序列可以被插入或克隆到其中的核酸分子，適當?shù)貫樵醋岳缳|(zhì) 粒、噬菌體或植物病毒的DNA分子。載體通常含有一個或更多個獨特的限制位點，并且可以 能夠在特定的宿主細胞內(nèi)自主復制，所述特定的宿主細胞包括靶細胞或組織或者其祖細胞 或組織，或者可與特定的宿主的基因組整合以使得克隆的序列可復制。因此，載體可以是自 主復制的載體，即，作為染色體外實體存在的載體，其復制不依賴于染色體的復制，例如，閉 合的環(huán)狀質(zhì)粒、染色體外元件、微型染色體或人工染色體。載體可以包含用于保證自我復制 的任何手段?？蛇x地，載體可以是當被引入宿主細胞中時被整合到基因組中并與已經(jīng)被整 合入所述載體的基因組一起被復制的載體。載體系統(tǒng)可以包括:單種載體或質(zhì)粒;兩種或更 多種載體或質(zhì)粒，所述兩種或更多種載體或質(zhì)粒共同包含待被引入到宿主細胞的基因組的 總DNA;或者轉(zhuǎn)座子。載體的選擇將通常取決于載體與待引入該載體的宿主細胞的相容性。 載體還可以包含能夠被用來鑒定合適的轉(zhuǎn)化子的標記物，諸如抗生素抗性基因。此類抗性 基因的實例是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。
[0125] 術(shù)語"5'非編碼區(qū)"以其最廣泛的語境在本文中使用，以包括除了編碼包含基因的 多肽產(chǎn)物的氨基酸殘基的那些序列之外，源自可表達基因的上游區(qū)域的所有核苷酸序列， 其中5'非編碼區(qū)至少部分地賦予或者激活或者以其他方式促進基因的表達。
[0126] 如本文使用的，術(shù)語"5'非翻譯區(qū)"或者"5'UTR"是指位于啟動子區(qū)的3'和下游編 碼區(qū)的5'的序列。因此，此類序列當被轉(zhuǎn)錄時在翻譯起始密碼子的上游（即，5'）并因此通常 不被翻譯為多肽產(chǎn)物的一部分。
[0127] 術(shù)語"3'非翻譯區(qū)"或"3'UTR"是指在編碼序列的下游（即，3'）的核苷酸序列。其從 編碼序列的終止密碼子后的第一個核苷酸延伸至剛好在相應的轉(zhuǎn)錄的mRNA的多聚(A)尾之 前。3 ' UTR可以含有調(diào)控翻譯效率、mRNA穩(wěn)定性、mRNA靶向和/或聚腺苷酸化的序列。
[0128] 術(shù)語"野生型"是指具有從天然存在的來源分離的基因或基因產(chǎn)物的特征的基因 或基因產(chǎn)物。野生型基因是在群體中最常被觀察到的基因，并且因此被主觀武斷地指定為 基因的"正常"或"野生型"形式。相對地，術(shù)語"修飾的""變體"或"突變體"是指當與野生型 基因或基因產(chǎn)物比較時，表現(xiàn)出序列和或功能特性方面的修飾（即，改變的特征）的基因或 基因產(chǎn)物。人們注意到，能夠分離到天然存在的突變體;這些天然存在的突變體通過當與野 生型基因或基因產(chǎn)物比較時它們具有改變的特征的事實而被鑒定。
[0129] 如本文使用的，對基因的名字加下劃線或用斜體表示應該指示基因，與其蛋白質(zhì) 產(chǎn)物相對，蛋白質(zhì)產(chǎn)物以不存在任何下劃線或斜體的方式指示。例如，"GILZ"應該意指GILZ 基因，而"GILZ"應該指示"GILZ"基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。
[0130] 除非另有明確說明，本文描述的每個實施方案與每個和各個實施方案參照適用。
[0131] 2.縮寫
[0132] 以下縮寫貫穿本申請使用：
[0133] dpc =交配后天數(shù)
[0134] ES細胞=胚胎干細胞
[0135] epi干細胞=上胚層干細胞
[0136] EG細胞=胚胎生殖細胞
[0137] iPS細胞=誘導性多能干細胞
[0138] d =天
[0139] h =小時
[0140] s =秒
[0141] 3.具有破壞的育性基因的非人類胚胎用于增強供體多能細胞的種系傳遞的用途
[0142] 本發(fā)明提供了用于增強供體多能細胞的種系傳遞的組合物和方法，所述供體多能 細胞包括具有遺傳修飾的那些供體多能細胞。修飾起源于非人類宿主胚胎的生殖細胞，使 得至少一個有助于能育性的基因（即，育性基因）被破壞。然后使用修飾的非人類宿主胚胎 "寄養(yǎng)(host)"引入的具有功能性育性基因（即，未被破壞的育性基因）的供體多能細胞。在 替代的或代孕非人類動物中得到的非人類宿主胚胎的移植和孕育產(chǎn)生通常包括以下兩種 類型的嵌合后代的一窩幼崽：具有通常源自非人類宿主胚胎、帶有破壞的育性基因的內(nèi)源 性生殖細胞或配子的那些嵌合后代；以及包含通常源自供體多能細胞、帶有功能性育性基 因的生殖細胞或配子的那些嵌合后代。當與包含功能性育性基因的同類非人類動物交配 時，包含具有破壞的育性基因的內(nèi)源性生殖細胞或配子的嵌合非人類動物將具有受損的或 抑制的能育性。相反，包含源自供體多能細胞的生殖細胞或配子的嵌合非人類動物將具有 正常的或未受損的能育性，從而增強包含源自供體多能細胞的生殖細胞或配子的第一窩后 代的產(chǎn)生。
[0143] 3.1育性基因
[0144] 根據(jù)本發(fā)明，可以破壞任何適當?shù)挠曰蚧蛴曰虻慕M合以提供非人類宿主 胚胎以及衍生的非人類動物和后代。育性基因的非限制性實例連同引起育性基因破壞并導 致不育(例如，雄性不育）的示例性突變(其以上標呈現(xiàn))和等位基因組成一起被列于表2中。 在表2中還呈現(xiàn)了示例性的遺傳背景，在所述遺傳背景中這些育性基因的破壞導致不育(例 如，雄性不育）。
[0145] 表2:育性基因和導致不育的示例性突變
[0191]在其它實施方案中，育性基因選自精子發(fā)生基因，所述精子發(fā)生基因的示例性實 例包括在美國專利申請公開2005/0176943中公開的那些基因，所述專利申請公開的完整內(nèi) 容被通過引用并入本文。代表性基因包括:包含具有該公開的SEQ ID N0:1-89示出的核酸 序列的轉(zhuǎn)錄物的那些基因。這些基因的非限制性實例包括AKAP110、RBcc728、Trim36、 Noppl40、ATR、HSpb、Spergen_l、芳香基硫酸酯酶A(arylsulfatase A)、Drctnnbla、CDC14B、 半胱氨酸蛋白酶抑制劑相關(guān)的附睪精子發(fā)生蛋白、妊娠誘導的生長抑制劑、脂肪酸輔酶A連 接酶、長鏈、Fem、主要80,000Mr纖維鞘組分、甘油磷酸脫氫酶1、線粒體Lim結(jié)構(gòu)域包含1 (mitochondrial，Lim domains containing l)、oaz_t、pctp-l、睪丸特異性磷酸甘油酸酯 激酶、磷脂酶C54、精蛋白1、精蛋白2、scot-tl、scot-t2、線粒體外膜硒蛋白、Spehzin、 ορρο?、GalP_l、3_GalNAc_特異性GalNAca-2，6_唾液酸轉(zhuǎn)移酶（3_GalNAc_specific GalNAc alpha-2，6-sialyltransferase)、融合同系物的抑制子、t-肌動蛋白l、t_肌動蛋白2、t-復 合體Tcp-10a、筑絲蛋白_t、teek l、TP_2、tsec_l、tssk 1.2亞基、絲氨酸/蘇氨酸激酶22B (精子發(fā)生相關(guān)的）、tsga2、Gapd_S、meichroacidin、halap-X、Ssecks、gsgl、haspin、gsg3、 hilsl、shippol和推定的溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶。
[0192] 在有利的實施方案中，育性基因是位于性染色體上的基因。在這種類型的示例性 實例中，育性基因位于X染色體上（即，X-連鎖的育性基因）諸如，但不限于，GILZ(TSC22d3)。
[0193] 可使用任何適當?shù)募夹g(shù)破壞育性基因。在一些實施方案中，使用靶向構(gòu)建體進行 破壞，在所述靶向構(gòu)建體中育性基因的一部分可操作地位于靶向盒的兩個側(cè)翼部分之間， 所述靶向盒的兩個側(cè)翼部分與細胞基因組中靶位點的區(qū)域足夠同源以允許靶向盒與靶位 點之間的同源重組。例如，靶位點可以包含育性基因的外顯子或編碼序列或者控制序列（例 如，啟動子），并且在某些實施方案中，破壞物序列(例如，標記物基因）位于靶向盒的側(cè)翼部 分附近處以破壞或替換育性基因的至少一部分，從而使得育性基因失活并因此無功能。在 這種類型的示例性實例中，側(cè)翼部分中的一個與育性基因的5'非翻譯序列的一部分基本同 源，并且另一個與內(nèi)源性基因的3'非翻譯序列的至少一部分基本同源。在其它示例性實例 中，靶向盒的側(cè)翼部分與育性基因的鄰接干預性編碼序列的區(qū)域基本同源，所述干預性編 碼序列編碼由育性基因編碼的多肽的能育性所需的結(jié)構(gòu)域。在這些實施方案中，靶向構(gòu)建 體和靶位點之間的位點特異性同源重組隨后導致育性基因的至少一部分被標記物基因替 換以及育性基因的破壞。
[0194] 在特定的實施方案中，為育性基因提供了重組酶識別位點（也被稱為受體序列）， 所述重組酶識別位點位于該基因的內(nèi)部或者毗鄰該基因，并且被位點特異性重組酶蛋白識 另IJ，所述重組酶蛋白通過結(jié)合重組酶識別位點并催化導致該基因的破壞的重組酶識別位點 之間的位點特異性重組而充當育性基因破壞物分子。重組酶可以催化位點之間的分子內(nèi)或 分子間重組。例如，在分子內(nèi)重組的情況中，當具有相同方向的兩個重組位點存在于同一分 子內(nèi)時，位點之間的位點特異性重組將切除側(cè)翼為位點的DNA序列(切除反應），而在分子間 重組中，在不同分子上的兩個重組識別位點之間的位點特異性重組將導致共整合(插入反 應）。在這些實施方案的示例性實例中，包含與啟動子可操作連接的位點特異性重組酶編碼 序列的轉(zhuǎn)基因被用于條件性地破壞育性基因。示例性的位點特異性的重組酶包括Cre、修飾 的〇6、0代、冊、？1^-野生型(￥〇小1^-1^、？1^、？1?〇或？11丨031。重組酶識別位點的非限制性 實例包括l〇xP、FRT、rax和attP/B。重組可以通過任何本領(lǐng)域已知的方法產(chǎn)生，例如 Doetschman等（1987，Nature 330:576-578)的方法；Thomas等（1986，Cel 1 44:419-428)的 方法；Cre-loxP重組系統(tǒng)（Sternbergh和Hamilton, 1981，J.Mol，Biol · 150:467_486;Lakso 等，1992, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:6232-6236);釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)的FLP重組酶系統(tǒng)（0'Gorman等，1991，Science 251:1351-1355;Lyznik等， 1996，Nucleic Acids Res.24(19) :3784-3789) ;Cre-loxP-四環(huán)素控制開關(guān)（Gossen和 Bujard，1992，Proc · Natl · Acad · Sci · USA 89 : 5547-51);和配體調(diào)控的重組酶系統(tǒng) (1^11611(1〇1^等，1999，了.]\1〇1.8丨〇1.285:175-82)。期望地，重組酶具有高活性，例如，〇6-ΙοχΡ或FLPe系統(tǒng)，并且具有增強的熱穩(wěn)定性(Rodrguez等，2000，Nature Genetics 25:139-40)。在特定的實施方案中，育性基因的至少一部分(包括其調(diào)控序列，如果適當?shù)脑挘┑膫?cè) 翼為由Cre重組酶特異性識別的ΙοχΡ靶位點或被FLP重組酶特異性識別的FRT靶位點。LoxP 靶位點序列的示例性實例是5'-ATA ACTTCGTATAGCATACATTATACGAAG TTAT-3'[SEQ ID NO: 1 ] 。F R T靶位點序列的示例性實例是5'_ GAAGTTCCTATTCCGAAGTTCCTATTCTCTAGTAAGTATAGGAACTTC-3'[SEQ ID NO:2]〇
[0195] 在其它實施方案中，育性基因破壞物分子是通過RNA干擾(RNAi)或通過轉(zhuǎn)錄后基 因沉默(PTGS)抑制育性基因的表達的表達產(chǎn)物。在這種類型的示例性實例中，表達產(chǎn)物是 RNA分子(例如，818嫩、81^嫩、11^嫩、(188嫩等），所述1?嫩分子包含對應于育性基因的核苷酸 序列的靶向區(qū)域，并且減弱或者以其他方式破壞育性基因的表達。此類育性基因的非限制 性實例在表2中和本文其他處被列出。
[0196] 在示例性實例中，靶向序列表現(xiàn)出與育性基因的核苷酸序列至少60、61、62、63、 64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、 89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99%的同一性。在其它示例性實例中，靶向序列在至少 低嚴格度條件下、更適當?shù)卦谥辽僦械葒栏穸葪l件下并且甚至更加適當?shù)卦诟邍栏穸葪l件 下與靶基因的核苷酸序列雜交。本文提及低嚴格度條件包括和包含從至少約1% ν/ν至至少 約15 % v/v的甲酰胺和從至少約1M至至少約2M的鹽用于在42 °C雜交，以及至少約1M至至少 約2M的鹽用于在42°C洗滌。低嚴格度條件還可以包括1%牛血清白蛋白（BSA)、lmM EDTA、 0.5M NaHP〇4(pH 7.2)、7%SDS用于在65°C雜交，和（i)2xSSC、0.1%SDS;或（ii)0.5%BSA、 ImM EDTA、40mM NaHP〇4(pH 7.2)、5%SDS用于在室溫洗滌。中等嚴格度條件包括和包含從 至少約16 % v/v至至少約30 % v/v的甲酰胺和從至少約0.5M至至少約0.9M的鹽用于在42°C 雜交，和至少約〇. 5M至至少約0.9M的鹽用于在42 °C洗滌。中等嚴格度條件還可以包括1 %牛 血清白蛋白（BSA)、lmM EDTA、0.5M NaHP〇4(pH 7.2)、7%SDS用于在65°C雜交，和（i)2xSSC、 0.1%SDS;或（ii)0.5%BSA、lmM EDTA、40mM NaHP〇4(pH 7.2)、5%SDS用于在42°C洗滌。高 嚴格度條件包括和包含從至少約31 % v/v至至少約50 % v/v的甲酰胺和從至少約0.01M至至 少約0.15M的鹽用于在42°C雜交，并且至少約0.01M至至少約0.15M的鹽用于在42°C洗滌。高 嚴格度條件還可以包括l%BSA、lmM EDTA、0.5M NaHP〇4(pH 7.2)、7%SDS用于在65°C雜交， 和（i)0.2xSSC、0.1%SDS;或（ii)0.5%BSA、lmM EDTA、40mM NaHP〇4(pH 7.2)、1%SDS用于 在超過65°C的溫度洗滌。期望地，靶向序列在生理條件下與育性基因的核苷酸序列雜交。
[0197] 其它嚴格條件是本領(lǐng)域公知的。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到，多種因素可被操作以 優(yōu)化雜交的特異性。最后的洗滌的嚴格度的優(yōu)化可用來確保高程度的雜交。對于詳細的實 例，參見八1181^61等，同上，第2.10.1頁至2.10.16頁和33111131'〇〇1<:等，同上，第1.101節(jié)至第 1.104 節(jié)。
[0198] 適當?shù)?，靶向區(qū)域與育性基因的有義鏈或反義鏈具有序列同一性。在某些實施方 案中，RNA分子未被聚腺苷酸化，這可導致育性基因表達的有效降低，如例如由Waterhouse 等在美國專利號6，423，885中所描述的。
[0199] 通常，靶向區(qū)域的長度可以從約10個核苷酸(nt)最高至等于育性基因的長度（以 核苷酸計）的長度之間變化。一般地，靶向區(qū)域的長度為至少10、12、13、14、15、16、17、18、 19、20、21、22、23、24、25的，通常至少約501^，更通常至少約100的，特別地至少約1501^，更 特別地至少約200nt，甚至更特別地至少約500nt。除了育性基因的總長度之外，預期對靶向 區(qū)域的總長度沒有上限。但是出于實踐的原因（諸如例如，靶向構(gòu)建體的穩(wěn)定性），預期靶向 區(qū)域的長度不應超過5000nt，特別是不應超過2500nt，并且可以限于約lOOOnt。
[0200] RNA分子還可以包含一個或更多個其它的靶向區(qū)域(例如，從約1個至約10個，或者 從約1個至約4個，或者從約1個至約2個其它靶向區(qū)域），所述其它靶向區(qū)域中的每個與靶基 因的核苷酸序列具有序列同一性。一般地，靶向區(qū)域彼此相同或者與彼此共有至少60、61、 62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、 87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99%的序列同一性。
[0201] RNA分子還可以包含靶向區(qū)域的反向互補物。通常，在這些實施方案中，RNA分子還 包含將靶向區(qū)域與反向互補物間隔開的間隔序列。間隔序列可以包含長度為至少約100-500個核苷酸、或者可選地長度為至少約50-100個核苷酸、并且在另外的可選的方案中長度 為至少約10-50個核苷酸的核苷酸序列。通常，間隔序列是非編碼序列，在一些實例中間隔 序列是內(nèi)含子。在間隔序列是非內(nèi)含子間隔序列的實施方案中，核酸序列的轉(zhuǎn)錄將產(chǎn)生形 成發(fā)夾或莖環(huán)結(jié)構(gòu)的RNA分子，在莖環(huán)結(jié)構(gòu)中莖通過靶向序列與反向互補物的雜交形成，并 且環(huán)由連接這些'反向重復'的非內(nèi)含子間隔序列形成?？蛇x地，在間隔序列是內(nèi)含子間隔 序列的實施方案中，內(nèi)含子/外顯子剪接點序列在內(nèi)含子序列的任一側(cè)的存在促進會以其 他方式形成環(huán)結(jié)構(gòu)的序列的去除，并且得到的RNA將形成雙鏈RNA(dsRNA)分子，在一個末端 或兩個末端具有任選的突出的3'序列。此類dsRNA轉(zhuǎn)錄物在本文中被稱為"完全發(fā)夾"。RNA 分子可以包含單個發(fā)夾或者多個發(fā)夾，所述單個發(fā)酵或多個發(fā)夾包括毗鄰雙鏈RNA序列區(qū) 域存在的單鏈RNA的"凸出(bulge)"。
[0202]可選地，如上文所描述的dsRNA可使用包含靶向序列的反向互補物的另外的多核 苷酸便利地獲得，從所述另外的多核苷酸可以產(chǎn)生另外的RNA分子。在該實施方案中，靶向 區(qū)域的反向互補物與從第二多核苷酸轉(zhuǎn)錄的RNA分子的靶向區(qū)域雜交。
[0203]在另一個實例中，如上文所描述的dsRNA分子使用包含雙鏈體的第二多核苷酸制 備，在所述第二多核苷酸中雙鏈體的一條鏈與靶基因的核苷酸序列共有序列同一性，并且 另一條鏈與該核苷酸序列的互補物共有序列同一性。在該實施方案中，雙鏈體的側(cè)翼為兩 個啟動子，一個啟動子控制鏈中的一條的轉(zhuǎn)錄，并且另一個啟動子控制互補鏈的轉(zhuǎn)錄。兩條 鏈的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生一對RNA分子，每個RNA分子包含與另一個的區(qū)域互補的區(qū)域，從而產(chǎn)生抑制 育性基因表達的dsRNA分子。
[0204]在另一個實例中，育性基因的PTGS使用由Glassman等在美國專利申請公開號 2003/003619中描述的策略實現(xiàn)。在該策略中，適當?shù)暮怂嵝蛄屑捌浞聪蚧パa物可被用于改 變靠近所述適當?shù)暮怂嵝蛄屑捌浞聪蚧パa物的任何同源的內(nèi)源性靶RNA(即，包含育性基因 的轉(zhuǎn)錄物的）的表達。適當?shù)暮怂嵝蛄屑捌浞聪蚧パa物可與宿主中的任何內(nèi)源性RNA不相 關(guān)，或者可由宿主的基因組中的任何核酸序列編碼，條件是核酸序列不編碼任何靶mRNA或 者與靶RNA基本上相似的任何序列。因此，在本發(fā)明的一些實施方案中，RNA分子還包含兩個 互補的RNA區(qū)域，所述兩個互補的RNA區(qū)域與宿主細胞中的任何內(nèi)源性RNA不相關(guān)并且靠近 靶向區(qū)域。在其它實施方案中，RNA分子還包含兩個互補的RNA區(qū)域，所述兩個互補的RNA區(qū) 域由宿主的基因組中的任何核酸序列編碼，條件是該序列與育性基因的核苷酸序列不具有 序列同一性，其中該區(qū)域靠近靶向區(qū)域。在以上實施方案中，互補RNA區(qū)域中的一個可位于 靶向區(qū)域的上游并且另一個位于靶向區(qū)域的下游?？蛇x地，兩個互補區(qū)域均可位于靶向區(qū) 域的上游或下游，或者可位于靶向區(qū)域自身內(nèi)。
[0205] 在一些實施方案中，RNA分子是靶向由育性基因編碼的RNA的對于翻譯至關(guān)重要的 特定區(qū)域的反義分子。反義分子降低預定基因的表達水平的用途是本領(lǐng)域已知的。反義分 子可以被設(shè)計為對應于從育性基因轉(zhuǎn)錄的全長RNA或其片段或一部分。如例如上文所描述 的（參見，例如，Waterhouse等，（1998)Proc Natl Acad Sci USA 95:13959 13964)，該基因 沉默效應可通過轉(zhuǎn)基因地過度產(chǎn)生育性基因編碼序列的有義和反義RNA以使得產(chǎn)生大量的 dsRNA來增強。
[0206] 在仍然其它的實施方案中，育性基因破壞物分子是與育性基因的多肽產(chǎn)物免疫相 互作用的抗體。在這種類型的非限制性實例中，多肽產(chǎn)物是由在表2中和本文其他處所列出 的育性基因編碼的多肽產(chǎn)物。用于在本發(fā)明的實踐中使用的示例性抗體包括單克隆抗體、 Fv、Fab、Fab'和F(ab'）2免疫球蛋白片段，以及合成的抗體，諸如但不限于單結(jié)構(gòu)域抗體 (DAB)、合成的穩(wěn)定化的Fv片段，例如，單鏈Fa片段（scFv)、二硫化物穩(wěn)定化的Fv片段 (dsFv)、單可變區(qū)結(jié)構(gòu)域(dAb)微抗體、組合抗體(combibody)和多價抗體諸如雙價抗體和 多價-scFv或者工程化的人類等同物。用于制備和使用基于多種抗體的構(gòu)建體和片段的技 術(shù)是本領(lǐng)域公知的。用于制備和表征抗體的方法也是本領(lǐng)域公知的。在示例性實例中，可使 用在從菌體展示或核糖體展示文庫（例如，從Cambridge Antibody Technology, Biolnvent，Affitech and Biosite可得)選擇之后通常在大腸桿菌中表達的分離、純化或 重組的肽或蛋白質(zhì)通過常規(guī)免疫(例如，多克隆血清和雜交瘤)來制備抗體，所述分離、純化 或重組的肽或蛋白質(zhì)對應于育性基因的多肽產(chǎn)物的至少一部分，或作為對應于育性基因的 多肽產(chǎn)物的至少一部分的重組片段。此類抗體的抗原結(jié)合區(qū)（例如互補性決定區(qū)）的知識可 以被用于制備如例如上文所描述的合成的抗體。
[0207] 3.2用于產(chǎn)生具有破壞的育性基因的非人類胚胎的系統(tǒng)
[0208] 根據(jù)本發(fā)明，系統(tǒng)被用于產(chǎn)生具有破壞的育性基因的非人類宿主胚胎。例如，包含 破壞的育性基因的非人類胚胎可以通過使1)攜帶可破壞的育性基因的第一動物品系（"條 件性不育品系"）與2)攜帶包含破壞物核苷酸序列的不育性激活轉(zhuǎn)基因的第二動物品系 ("不育激活品系"）雜交產(chǎn)生，所述破壞物核苷酸序列編碼破壞可破壞的育性基因的育性基 因破壞物分子，從而產(chǎn)生包含具有破壞的育性基因的生殖細胞的轉(zhuǎn)基因非人類宿主胚胎。 在一些實施方案中，使第一動物品系的雌性成員與第二動物品系的雄性成員雜交。如本文 使用的，第一和第二動物品系的各自的成員是非人類動物繁殖對的繁殖配偶。
[0209] 在一些實施方案中，條件性不育品系的育性基因為轉(zhuǎn)基因的形式（"條件性不育轉(zhuǎn) 基因"），其中育性基因與啟動子并且與重組酶識別位點可操作連接，所述重組酶識別位點 在重組酶的存在下允許育性基因的破壞。在這些實施方案中，不育激活轉(zhuǎn)基因包含與啟動 子可操作連接的重組酶的編碼序列，并且重組酶識別位點通常位于育性基因內(nèi)或鄰接育性 基因，并且介導育性基因的破壞。在這種類型的非限制性實例中，由不育激活品系的不育激 活轉(zhuǎn)基因編碼的重組酶是Cre，并且在條件性不育品系的條件性不育轉(zhuǎn)基因中包含的重組 酶識別位點是loxP序列。在示例性的實例中，使條件性不育轉(zhuǎn)基因純合的條件性不育品系 的雌性成員與不育激活轉(zhuǎn)基因純合的不育激活品系的雄性成員雜交產(chǎn)生具有至少一些生 殖細胞具有雜合的育性基因破壞的非人類動物胚胎。在有利的實例中，條件性不育品系的 育性基因位于X染色體上（即，X-連鎖的育性基因），并且使條件性不育轉(zhuǎn)基因純合的條件性 不育品系的雌性成員與不育激活轉(zhuǎn)基因純合的不育激活品系的雄性成員雜交產(chǎn)生具有至 少一些生殖細胞具有純合的育性基因破壞的非人類動物胚胎，包括雄性胚胎。
[0210] 在其它實施方案中，通過使以下（1)與（2)雜交：（1)第一動物品系，所述第一動物 品系攜帶(a)包含第一可破壞的育性基因的第一條件性不育轉(zhuǎn)基因和(b)包含破壞第二可 破壞的育性基因的基因的第一不育激活轉(zhuǎn)基因（"第一條件性不育激活品系"（2)第二動 物品系，所述第二動物品系攜帶(a)包含第二可破壞的育性基因的第二條件性不育轉(zhuǎn)基因 和(b)包含破壞第一可破壞的育性基因的基因的第二不育激活轉(zhuǎn)基因（"第二條件性不育激 活品系"），其中第一不育激活轉(zhuǎn)基因特異性地破壞所述第二可破壞的育性基因，并且其中 第二不育性激活轉(zhuǎn)基因特異性地破壞第一可破壞的育性基因，從而產(chǎn)生包含具有破壞的育 性基因的生殖細胞的非人類宿主胚胎，來產(chǎn)生包含破壞的育性基因的非人類宿主胚胎。除 了在不育激活轉(zhuǎn)基因的存在下介導第一和第二可破壞的育性基因的破壞的第一和第二條 件性不育轉(zhuǎn)基因的元件之外，條件性不育轉(zhuǎn)基因的育性基因適當?shù)貫橄嗤蛳喈數(shù)幕颉?在這些實施方案中，使第一條件性不育轉(zhuǎn)基因和第一不育激活轉(zhuǎn)基因為純合的第一條件性 不育激活品系的繁殖配偶與第二條件性不育轉(zhuǎn)基因和第二不育激活轉(zhuǎn)基因為純合的第二 條件性不育激活品系的繁殖配偶雜交產(chǎn)生具有至少一些生殖細胞具有純合的育性基因破 壞的非人類動物胚胎。在一些實施方案中，使第一動物品系的雌性成員與第二動物品系的 雄性成員雜交。在其他實施方案中，使第一動物品系的雄性成員與第二動物品系的雌性成 員雜交。
[0211] 在一些實施方案中，第一條件性不育轉(zhuǎn)基因包含與啟動子并且與第一重組酶識別 位點可操作連接的第一可破壞的育性基因，所述第一重組酶識別位點在第一重組酶的存在 下介導第一可破壞的育性基因的破壞，并且第一不育激活轉(zhuǎn)基因包含與啟動子可操作連接 的第二重組酶的編碼序列，其中第二重組酶特異性地識別第二重組酶識別位點。第二條件 性不育轉(zhuǎn)基因適當?shù)匕c啟動子并且與第二重組酶識別位點可操作連接的第二可破壞 的育性基因，所述第二重組酶識別位點在第二重組酶的存在下介導第二可破壞的育性基因 的破壞，并且第二不育激活轉(zhuǎn)基因包含與啟動子可操作連接的第一重組酶的編碼序列，其 中第一重組酶特異性地識別第一重組酶識別位點。在這種類型的示例性實例中，由第一不 育激活轉(zhuǎn)基因編碼的第二重組酶是FLP，第一條件性不育轉(zhuǎn)基因中包含的重組酶識別位點 是ΙοχΡ序列，由第二不育激活轉(zhuǎn)基因編碼的第一重組酶是Cre，第二條件性不育轉(zhuǎn)基因中包 含的重組酶識別位點是Frt序列。在其它示例性實例中，由第一不育激活轉(zhuǎn)基因編碼的第二 重組酶是Cre，第一條件性不育轉(zhuǎn)基因中包含的重組酶識別位點是Frt序列，由第二不育激 活轉(zhuǎn)基因編碼的第一重組酶是FLP，并且第二條件性不育轉(zhuǎn)基因中包含的重組酶識別位點 是ΙοχΡ序列。
[0212] 在一些實施方案中，由第一不育激活轉(zhuǎn)基因編碼的第二重組酶是FLP，第一條件性 不育轉(zhuǎn)基因中包含的靶位點是loxP序列，由第二不育激活轉(zhuǎn)基因編碼的第一重組酶是Cre， 并且第二條件性不育轉(zhuǎn)基因中包含的靶位點是Frt序列。在這些實施方案中，使第一條件性 不育轉(zhuǎn)基因和第一不育激活轉(zhuǎn)基因為純合的第一條件性不育激活品系的雌性成員與第二 條件性不育轉(zhuǎn)基因和第二不育激活轉(zhuǎn)基因為純合的第二條件性不育激活品系的雄性成員 雜交，產(chǎn)生具有至少一些生殖細胞具有純合的育性基因破壞的非人類動物胚胎。
[0213] 在仍然其它的實施方案中，包含破壞的育性基因的非人類胚胎可以通過使以下1) 與2)雜交產(chǎn)生：1)第一動物品系，所述第一動物品系攜帶可破壞的育性基因（"條件性不育 品系"）；2)第二動物品系，所述第二動物品系攜帶包含破壞物核苷酸序列的不育激活轉(zhuǎn)基 因，所述破壞物核苷酸序列編碼破壞可破壞的育性基因的育性基因破壞物分子（"不育激活 品系"），其中育性基因破壞物選自抑制性核酸(例如，抑制性RNA諸如有義或反義RNA，介導 RNA干擾的分子諸如s iRNA、shRNA、miRNA;等）、抑制性多肽(例如，抗體、多肽-結(jié)合伴侶、顯 性負性多肽、酶等)或抑制育性基因的活性或者育性基因的表達產(chǎn)物的水平或功能活性的 任何其它分子。在這些實施方案中，不育激活轉(zhuǎn)基因適當?shù)匕c破壞物核苷酸序列可操 作連接的表達調(diào)節(jié)元件，其中該元件條件性地抑制破壞物核苷酸序列的表達，并且條件性 不育品系攜帶抑制該表達調(diào)節(jié)元件的活性的激活子轉(zhuǎn)基因，導致破壞物核苷酸序列的表 達。
[0214] 因此，當條件性不育品系的繁殖配偶與不育激活品系的繁殖配偶雜交時，將產(chǎn)生 如下胚胎:其中激活子轉(zhuǎn)基因被表達，導致表達調(diào)節(jié)元件的抑制并導致破壞物核苷酸序列 的表達的去抑制，產(chǎn)生育性基因破壞物分子，從而導致育性基因的破壞。在這些實施方案 中，激活子轉(zhuǎn)基因為純合的條件性不育品系的繁殖配偶與不育激活轉(zhuǎn)基因為純合的不育激 活品系的繁殖配偶的雜交產(chǎn)生具有至少一些生殖細胞具有純合的育性基因破壞的非人類 動物胚胎。
[0215] 在一些實施方案中，在第一條件下表達調(diào)節(jié)元件抑制破壞物核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄， 并且在第二條件下表達調(diào)節(jié)元件的破壞可以允許或增強破壞物核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄。在一些 實施方案中，表達調(diào)節(jié)元件包含抑制子核苷酸序列（例如轉(zhuǎn)錄終止子），所述抑制子核苷酸 序列抑制破壞物核苷酸序列的表達并且與重組酶識別位點可操作連接，其中重組酶識別位 點在重組酶的存在下介導抑制子核苷酸序列的破壞。在這種類型的示例性實例中，第二繁 殖配偶包含激活子轉(zhuǎn)基因，所述激活子轉(zhuǎn)基因包含與啟動子可操作連接的重組酶的編碼序 列。第二繁殖配偶的育性基因適當?shù)貫橐吧突?。在一些實施方案中，第一繁殖配偶是?性，并且第二繁殖配偶是雌性。
[0216] 在這種類型的示例性實例中，通過使破壞物核苷酸序列與可誘導的轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng) 可操作性地連接來條件性地表達破壞物核苷酸序列。從激活子轉(zhuǎn)基因產(chǎn)生的反式激活子與 被工程化為與破壞物核苷酸序列可操作連接的調(diào)控元件的序列特異性地相互作用，以在激 活子轉(zhuǎn)基因的表達產(chǎn)物的存在下誘導該核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄。因此，在這些實施方案中，激活 子轉(zhuǎn)基因通常包含編碼轉(zhuǎn)錄誘導物的核酸序列，并且表達調(diào)節(jié)元件包含轉(zhuǎn)錄誘導物的結(jié)合 位點，所述結(jié)合位點與破壞物核苷酸序列的啟動子可操作連接，由此轉(zhuǎn)錄誘導物的產(chǎn)生引 起破壞物核苷酸序列的表達以及育性基因破壞物分子的水平或功能活性的增加或升高。在 這種類型的代表性實例中，轉(zhuǎn)錄誘導物包含(a)至少一個轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，和(b)至少一個 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，所述DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合與破壞物核苷酸序列可操作連接的啟動子或者以 其他方式與所述啟動子相互作用，并且DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域與所述啟動子相互作用以激活破壞 物核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄。在操作中，激活子轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄導致轉(zhuǎn)錄誘導物的產(chǎn)生，所述轉(zhuǎn)錄誘 導物繼而經(jīng)由其DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域與破壞物核苷酸序列的啟動子相互作用，并且經(jīng)由其轉(zhuǎn)錄 激活結(jié)構(gòu)域與轉(zhuǎn)錄機制相互作用以激活破壞物核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄，這導致育性基因破壞物 分子的水平或功能活性的增加或升高。
[0217] 轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的非限制性實例包括HSV1-VP16的酸性反式激活結(jié)構(gòu)域(TAD)(例 如，氨基酸4〇6至4 88，Triezenberg等，I988，Genes&Development 2:718-729 ;Triezenberg, 1995,Current Opinions in Genetics and Development 5:190-196;或氨基酸413至490， Regier等，1993，Proc Natl Acad Sci U S A.90(3):883_887;或氨基酸411 至487;或氨基 酸453-499;或氨基酸413至454;或氨基酸410-452，Walker等，1993，Mol Cell Biol .13(9): 5233-5244;氨基酸411 至455，Nettelbeck等，1998，Gene Ther.5(12):1656-1664)、0ct-2的 激活結(jié)構(gòu)域（例如，氨基酸438至479，Tanaka等，1994，Mol Cell Biol.l4(9):6046-6055;或 氨基酸3至154，Das等，1995，Nature. 374(6523): 657-660)、SP1的激活結(jié)構(gòu)域(例如，氨基酸 340至485，Courey和Ti jan，1988，Cell. 55(5): 887-898)、NFY的激活結(jié)構(gòu)域（例如，氨基酸 1 至233，Li等，1992，J Biol Chem.267(13):8984-8990;van Hujisduijnen等，1990，EMB0 J.9(10):3119-3127;Sinha等，1995，Proc Natl Acad Sci U S Α·92(5):1624-1628; Coustry等 1995，J Biol Chem. 270( 1): 468-475)、ITF2的激活結(jié)構(gòu)域（例如，氨基酸2至452， Seipel等，1992，EMB0 J.l 1(13) :4961-4968)、c-Myc的激活結(jié)構(gòu)域(例如，氨基酸 1 至262， Eilers等 1991，EMB0 夂10(1):133-141)、0^的激活結(jié)構(gòu)域(例如，氨基酸399至499，]^現(xiàn)〇(1 等，1989，Cell 58(4):741-753;Das和Herr,1993，J Biol Chem 268(33):25026-25032)或 P65的激活結(jié)構(gòu)域(例如，氨基酸286-550)。在一些實施方案中，DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域選自Gal4蛋 白的 DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域（例如，氛基酸 1 至 147，Chasman和 Komberg，1990，M〇1 Cell Biol.10 (6):2916-2923)、1^14蛋白的0嫩結(jié)合結(jié)構(gòu)域（例如，氨基酸1至81，燈!11等，1991，3(^61?^10 ; 255( 5041): 203-206;或氨基酸2-202;或完整的LexA蛋白例如，氨基酸1至202, Brent和 Ptashne，1985，Cell 43(3Pt 2):729-736)、1&(：阻遏物〇^〇1)蛋白的0嫩結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如， Brown等，1987，Cell 49(5):603-612;Fuerst等，1989，Proc Natl Acad Sci U S Α·86(8): 2549-2553)、四環(huán)素阻遏物(TetR)蛋白的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如，Gossen等，1992，Proc Natl Acad Sci U S A.89(12):5547-5551;Dingermann等，1992，EMB0 J.ll(4):1487-1492)或 ZFHD1 蛋白的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（例如，Pomerantz等，1995,Science 267(5194):93-96)。將核 定位信號(NLS)添加到DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的3 '末端一般是有利的。
[0218]與破壞物核苷酸序列可操作連接的啟動子適當?shù)匕D(zhuǎn)錄誘導物與其相互作用 的順式作用序列。順式作用序列包含轉(zhuǎn)錄誘導物、并且特別地其DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)合序 列。因此，結(jié)合序列取決于表達系統(tǒng)所使用的轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的選擇，并且包括， 但不限于：（A)Gal4蛋白的結(jié)合序列，諸如但不限于:如例如由Chasman和Kornberg(1990,同 上)所描述的核苷酸序列：5 ' -CGGACAACTGTTGACCG-3 ' [ SEQ ID N0: 3];或核苷酸序列：5'_ CGGAGGACTGTCCTCCG 3'[SEQ ID N0:4];或如例如由Giniger等（1988，Proc Natl Acad Sci USA·85(2):382-386)所公開的核苷酸序列：5'-CGGAGTACTGTCCTCCG-3'[SEQIDN0:5] ; (B)Gal4蛋白的結(jié)合序列，諸如但不限于:核苷酸序列：5 '-TACTGTATGTACATACAGTA-3 ' [SEQ ID N0:6];或如例如由Brent和Ptashne(1984,Nature 312(5995) :612-615)所公開的LexA 操縱子；（C) lac操縱子，諸如但不限于如例如由Fuerst等（1989,同上）和Simons等（1984, Proc Natl Acad Sci U S A.81(6) :1624-1628)所描述的LacI阻遏物蛋白與其結(jié)合的核苷 酸序列：5 ' -GAATTGTGAGGCTCACAATTC-3 ' [SEQ ID NO: 7]; (D)四環(huán)素操縱子(tetO)，諸如但 不限于四環(huán)素阻遏物（T e t R )蛋白與其結(jié)合的核苷酸序列：5'_ TCGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAG-3' [SEQ ID N0:8]; (E)ZFHD-l蛋白的結(jié) 合序列，諸如但不限于：如例如由Pomeranz等（1995，同上）所描述的核苷酸序列：5'_ TAATGATGGGCG-3'[SEQ ID N0:9];(F)c-Myc 蛋白的結(jié)合序列，諸如但不限于：5'_ GGAAGCAGACCAGCTGGTCTGCTTCC-3'[SEQ ID N0:10]。
[0219] 在其它實施方案中，破壞物核苷酸序列的條件性表達受到被用于開啟該序列的表 達的重組酶系統(tǒng)的調(diào)控。在這種類型的非限制性實例中，重組酶系統(tǒng)包含插入到啟動子和 破壞物核苷酸序列之間的間插序列，所述間插序列抑制或者以其他方式破壞破壞物核苷酸 序列從啟動子的轉(zhuǎn)錄。適當?shù)?，間插序列包含抑制（inh i b i t)或者以其他方式阻抑 (suppress)下游序列的轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄終止子。期望地，間插序列包含重組酶識別位點，所述重 組酶識別位點被由激活子轉(zhuǎn)基因編碼的位點特異性重組酶特異性地識別，以在重組酶的存 在下破壞間插序列并且從而使得破壞物核苷酸序列與啟動子可操作連接并且允許該序列 的轉(zhuǎn)錄。可選地，重組酶系統(tǒng)包含分離的或分開的轉(zhuǎn)基因，所述轉(zhuǎn)基因包含破壞物核苷酸序 列的上游部分和下游部分以及插入到上游部分和下游部分之間的可切除的間插序列。上游 部分與啟動子可操作連接，但是間插序列抑制或者以其他方式阻抑下游部分的轉(zhuǎn)錄，從而 阻止功能性育性基因破壞物分子的表達。通過破壞物核苷酸序列的表達，位點特異性重組 酶的產(chǎn)生切除可切除的間插序列，以從而得到允許產(chǎn)生功能性育性基因破壞物分子的可轉(zhuǎn) 錄的全長破壞物核苷酸序列。
[0220] 因此，在一些如上所述的有利的實施方案中，雜交將導致非人類胚胎的產(chǎn)生，所述 非人類胚胎包含在其種系中的育性基因的破壞，在所述非人類胚胎中適當?shù)赜曰虻膬?個等位基因均被破壞，并且在所述非人類胚胎中能育性(例如，精子發(fā)生或精子功能)被抑 制。
[0221 ]本發(fā)明還擴展至如上文和本文其他處廣泛描述的非人類動物的繁殖對。
[0222] 3.3供體多能細胞
[0223] 供體多能細胞通常能夠分化為生殖細胞，諸如ES細胞、epi干細胞、EG細胞和iPS細 胞。在特定的實施方案中，多能細胞是ES細胞。供體多能細胞可以被遺傳修飾并且在這種類 型的示例性實例中包含轉(zhuǎn)基因。轉(zhuǎn)基因可以使用促進將轉(zhuǎn)基因引入到多能細胞的基因組中 的載體被引入多能細胞中（例如通過隨機整合或者同源重組），用于轉(zhuǎn)基因的示例性方法在 Transgenic Mouse:Methods and Protocols(Hofker,ΜΗ.,2003.Methods Mol Biol.209: 1-8)'Advanced Protocols for Animal Transgenesis(2011,由S.Pease和T.L.Saunders 編輯，Springer Protocols Handbooks)和Transgenic Animals generation and Use (1997,由L.M，Houdebine編輯，Hardwood Academic Publishers)中公開。
[0224] 供體多能細胞可以是雄性多能細胞(XY)或者雌性多能細胞(XX)，或者X0多能細 胞。在特定的實施方案中，供體多能細胞是雄性多能細胞。雄性(XY)、雌性(XX)和X0多能細 胞可使用任何適當?shù)募夹g(shù)被引入植入前宿主胚胎中。
[0225] 可將來自非人類哺乳動物的一個物種的供體多能細胞引入非人類哺乳動物的不 同的物種的宿主中，以產(chǎn)生源自供體多能細胞的生殖細胞。在這種類型的示例性實例中，供 體多能細胞源自非人靈長類動物、馬科動物諸如馬、綿羊、山羊、兔形目動物諸如兔子、狗、 貓、牛、動物園動物以及瀕?；蛲鈦聿溉閯游?。在一些實施方案中，供體多能細胞是iPS細 胞。 _] 3.4非人類宿主胚胎
[0227]可以用于引入多能細胞的非人類宿主胚胎包括任何非人類動物物種的胚胎，所述 非人類動物物種包括非人類哺乳動物，諸如非人靈長類動物和嚙齒動物。根據(jù)本發(fā)明的一 些實施方案，非人類宿主胚胎是嚙齒動物胚胎、特別地小鼠或大鼠胚胎。一般地，非人類宿 主胚胎來自與全能細胞相同的物種。但是，在一些實施方案中，非人類宿主胚胎來自與多能 細胞不同的動物物種(例如，不同的哺乳動物物種）。其中引入多能細胞的非人類宿主胚胎 通常是植入前非人類宿主細胞，包括為2-細胞期、4-細胞期、8-細胞期、16-細胞期、32-細胞 期、64-細胞期胚胎的胚胎、桑椹胚或囊胚。在一些實施方案中，植入前非人類宿主胚胎選自 桑椹胚前期和桑葚胚期、未密實的桑葚胚期、密實的桑葚胚期和囊胚期胚胎。在一些實施方 案中，植入前非人類宿主胚胎選自小鼠胚胎的胚齡期E1、E1.5、E2、E2.5、E3和E3.5。適當?shù)兀?植入前非人類宿主胚胎選自具有選自以下的發(fā)育期的宿主胚胎：參考由Theiler Springer-Verlag，NY在Theiler(1989)The House Mouse:Atlas of Mouse Development中 描述的Theiler期，Theiler期2〇32)333334335和了36。在特定的實施方案中，植入前非 人類宿主胚胎選自Theiler期TS3、TS4和TS5。在其它特定的實施方案中，植入前非人類宿主 胚胎是桑椹胚。在仍然其它特定的實施方案中，植入前非人類宿主胚胎是囊胚。
[0228]通常，將一個或更多個(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16個)供 體多能細胞引入植入前非人類(例如，小鼠或大鼠）宿主胚胎中，所述植入前非人類宿主胚 胎適當?shù)貫?-細胞期、4-細胞期、8-細胞期、16-細胞期、32-細胞期、64-細胞期胚胎、桑椹胚 或囊胚。在一些實施方案中，宿主植入前胚胎是囊胚并且被引入的供體多能細胞的數(shù)目是6 至12個細胞。在這種類型的示例性實例中，宿主胚胎是8-細胞期胚胎并且供體多能細胞的 數(shù)目是2至10個細胞。
[0229] 3.5多能細胞向宿主胚胎中的引入
[0230]可以使用任何適當?shù)姆椒▽⒐w多能細胞引入植入前非人類宿主胚胎中。例如， 使用精細拉長的玻璃針(20-25微米內(nèi)徑)選擇單一的供體多能細胞的組，并使用裝配有用 于囊胚的微操作器的倒置顯微鏡將其引入通過早期胚胎的胚胎透明帶并進入囊胚腔(囊胚 腔(blastocoel))中。每囊胚或8-細胞期胚胎注射9-10個干細胞(ES或iPS或epi干細胞），每 4_細胞期胚胎注射6-9個干細胞，并且每2-細胞期胚胎注射約6個干細胞?？梢允褂眉す饣?者壓電式脈沖鉆孔的開口的透明帶輔助干細胞注射。（參見Kraus等，2010，Genesis 48 : 394-399)?？蛇x地，可使干細胞與桑椹胚聚合，或者注射到具有或不具有透明帶的早期胚胎 (例如2-細胞、4-細胞、8-細胞、桑葚胚前期或桑椹胚)中。
[0231] 3.6胚胎、嵌合動物和后代的孕育
[0232] 根據(jù)標準方法學在適于胚胎的發(fā)育的條件下進行孕育胚胎。將包含供體多能細胞 的非人類胚胎移植到本領(lǐng)域已知的假孕雌性中（參見，Manipulating the Mouse Embryo:A Laboratory Manual，第三版（A.Nagy等2002，CSHL Press，ISBN-10:0879695919;Nagy等， 1990 development 110,815-821;美國專利號 7,576,259、美國專利號 7,659,442、美國專利 號7,294,754、1(抑118等2010,661168丨8 48,394-399)。簡言之，在特定的嚙齒動物實施方案 中，使6-8周齡的能生育的雌性嚙齒動物與切除輸精管的或不育的嚙齒動物雄性交配以誘 導易接受支持人工引入的嚙齒動物胚胎的激素狀態(tài)(hormonalstate)。此類雌性被稱為假 孕。在2.5dpc，將包含最多至15個干細胞的囊胚引入(移植)到子宮角中。對于早期胚胎和桑 椹胚，根據(jù)進入輸卵管的胚胎期，將此類胚胎在體外培養(yǎng)至移植到〇.5dpc或1.5dpc的假孕 雌性中。
[0233] 在轉(zhuǎn)移后，從移植的非人類胚胎發(fā)育的嵌合非人類動物發(fā)育成型，出生取決于移 植時的胚胎期和物種。通過該方法產(chǎn)生兩種類型的嵌合非人類動物:包含通常源于非人類 宿主胚胎、具有破壞的育性基因的內(nèi)源性生殖細胞或配子的那些嵌合非人類動物;和包含 通常源于供體多能細胞、具有功能性育性基因的生殖細胞或配子的那些嵌合非人類動物。
[0234] 當使這些嵌合非人類動物與包含功能性育性基因的同類非人類動物雜交以產(chǎn)生 后代時，包含具有破壞的育性基因的內(nèi)源性生殖細胞或配子的嵌合非人類動物將具有受損 的或被抑制的能育性，并且因此將不產(chǎn)生后代或者產(chǎn)生非常少的后代。但是，包含源自供體 多能細胞的生殖細胞或配子的嵌合非人類動物將具有正常的或未受損的能育性，從而增強 包含源自供體多能細胞的生殖細胞或配子的第一窩后代的產(chǎn)生。
[0235] 標準分析工具可以被用于測試精子或后代的一致性。方法包括，但不限于，測序、 DNA印跡分析、SNP分析、PCR技術(shù)以及蛋白質(zhì)標志物、毛色標記、同工酶分析(例如，GPI、葡萄 糖磷酸異構(gòu)酶同工酶分析)和使用本領(lǐng)域已經(jīng)確立的標準方法檢測存在于干細胞中的任何 報告基因或轉(zhuǎn)基因。
[0236] 可以收集第一窩后代的配子并用于體外授精（IVF)或人工授精(AI)。從第一窩后 代分離的配子還可被冷凍保存并利用本領(lǐng)域已知的方法貯存?？蛇x地，可收集第一窩后代 的生殖細胞、在體外或體內(nèi)成熟、并用于體外受精或人工授精。
[0237] IVF方法學被良好地建立。參見，例如，Nagy等（2002，Manipulating the Mouse Embryo:A Laboratory Manual，第三版，CSHL Press)。IVF-般包括：分別從雌性和雄性收 集卵母細胞和精子，用來自雄性的精子使來自雌性的卵母細胞受精，以及將所得到的受精 的卵母細胞在對于使受精的卵母細胞發(fā)育為胚胎合適的條件下維持。可以在不同階段收獲 胚胎。可以在收集卵母細胞用于IVF之前使雌性超數(shù)排卵。受精可以通過IVF、胞漿內(nèi)精子注 射或透明帶鉆孔來完成。參見，例如，Nagy等（2002,同上）；Byers等(2006，Theriogenology 65:1716-26);08七6現(xiàn)6丨61等（2008，？1^05 0116 3(7):62792)。1￥?可以是增加從單個雌性獲 得的胚胎數(shù)目的有用工具。
[0238] 胞漿內(nèi)精子注射(ICSI)可以被用于提高受精率或者實現(xiàn)受精。ICSI程序包括去除 卵母細胞周圍的卵丘細胞和通常通過玻璃移液管將精子或單倍體精細胞注射到卵母細胞 中（參見，Kimura等，1995，Biol R印rod. 53(4): 855-62)。精細胞、精原干細胞和雄性生殖細 胞可以在體外分化并且然后被用于ICSI(Marh等，2003，Biol Reprod 69(1):169-76; Movahedin等，2004，Andrologia 36(5):269_76;0gura等，1996，J Assist Reprod Genet.13(5):4-31-4;Shinohara等，2002，Hum Reprod 17(12):3039-45;Chuma等，2005， Development 132(1):117-22)。
[0239] 作為從雌性收集成熟卵母細胞用于IVF的替代方法，可以獲得未成熟的卵母細胞， 并允許其在體外成熟，該技術(shù)被稱為"體外成熟"。在其它實施方案中，可以從雌性分離卵 泡，例如，初級卵泡或生殖細胞，并在體外培養(yǎng)以獲得可用于受精的卵母細胞。在哺乳動物 中，只有一小部分未成熟的卵母細胞發(fā)育為成熟的卵母細胞;其余的退化并死亡。通過從動 物分離未成熟的卵母細胞并允許它們在體外成熟，技術(shù)人員能夠在短時間段內(nèi)從給定的雌 性獲得多很多的適用于IVF的卵母細胞。已知哺乳動物卵母細胞經(jīng)歷體外成熟。在小鼠、牛 和其它哺乳動物的情況中，體外成熟的卵母細胞已被體外受精并且當胚胎被轉(zhuǎn)移到適當?shù)?子宮中時產(chǎn)生正常健康的后代（Schroeder等，1984，Dev .Biol · 102:493; Sirard等，1988， Biol，Reprod. 39: 546)。體外成熟技術(shù)是本領(lǐng)域公知的。參見，例如，Chiu等（2003，Human R印rod·18:408-416)和0 'Brien等（2003，Biol·Reprod·68:1682-1686)。
[0240] 人工授精是通過人工注射或應用精子使雌性動物受精的方法。在此類程序中，在 授精時雄性動物不是必需的；可使用從動物獲得的貯存的精子（參見，Wo 1 fe，1967，Lab Anirn Care 17(4):426-32和Sato等，2002，J Assist Reprod Genet.l9(ll):523_30)〇
[0241] 可被用于從第一窩后代產(chǎn)生活的后代的其它方法包括外科手術(shù)卵母細胞取回，卵 巢轉(zhuǎn)移，卵巢分裂，卵巢碎片轉(zhuǎn)移，卵母細胞、卵泡、精原干細胞的體外成熟，生殖細胞的體 外分化和原始細胞的體外分化。
[0242] 在一些實施方案中，收集雄性第一窩后代的配子。在其它實施方案中，收集雄性第 一窩后代的生殖細胞或精原多能細胞。在其它實施方案中，冷凍保存配子、生殖細胞或精原 多能細胞。在其它實施方案中，使用雌性第一窩后代以通過繁殖產(chǎn)生后代。在仍然其它的實 施方案中，分離雌性第一窩后代的配子。在這種類型的示例性實例中，分離雌性第一窩后代 的卵巢。在其它示例性實例中，冷凍保存雌性第一窩后代的配子或卵巢。
[0243] 為了本發(fā)明可以被容易地理解并使生效，現(xiàn)將通過以下非限制性實施例的方式描 述特別優(yōu)選的實施方案。 實施例
[0244] 實施例1
[0245] 條件性GILZ (Ts c22d3)敲除小鼠的產(chǎn)生
[0246] 構(gòu)建靶向載體，以通過同源重組使小鼠 Tsc22d3(ENSMUSG00000031431)基因的外 顯子4(ENSMUSE00000815383)的側(cè)翼為ΙοχΡ位點。Cre-重組酶介導的ΙοχΡ位點的重組導致 (例如，具有以下Vega登錄號0TTMUST00000045354的轉(zhuǎn)錄物Tsc22d3-006的）外顯子4的缺 失。外顯子4的⑶S編碼TSC22(PF01166)結(jié)構(gòu)域的完整序列。靶向載體的示意圖在圖1中示 出。
[0247] 將用于在ES細胞中選擇的新霉素選擇盒(neo)插入到外顯子4的下游。選擇盒的側(cè) 翼為FRT位點以使能夠被FLP介導的重組去除。將單個ΙοχΡ位點插入到外顯子4的上游和選 擇盒的下游。載體的5'和3'同源臂分別為大約8.Okb和6.Okb。
[0248] 使線性化的革El向載體經(jīng)電穿孔進入Bruce4ES細胞中。選擇新霉素抗性克隆，并通 過DNA印跡分析篩選以鑒定正確靶向的克隆。將這些克隆注射到BALB/c囊胚中，隨后將所述 BALB/c囊胚轉(zhuǎn)移到假孕的CBB6F1代孕雌性中。使得到的嵌合體與C57BL/6雌性雜交。通過毛 色對它們的后代進行選擇，并通過DNA印跡分析對其進行另外的分析。通過使靶小鼠與 C57BL/6FLPe-重組酶品系雜交去除新霉素盒。
[0249] 實施例2
[0250] 使用雌性Tsc22d3條件性敲除小鼠作為胚囊供體產(chǎn)生靶小鼠
[0251] 用孕馬血清注射C57BL/6背景的21至25日齡Tsc22d3條件性敲除的雌性小鼠。兩天 后用人絨膜促性腺激素注射小鼠，并使其與C57BL/6Cre-重組酶雄性交配持續(xù)24小時。六天 后，從Tsc22d3條件性敲除的雌性取出第一注射囊胚。將這些囊胚用作靶BALC/c ES細胞的 微注射的接受者并且將微注射的囊胚轉(zhuǎn)移到假孕的CBB6F1代孕雌性中。使得到的嵌合體與 BALB/c雌性雜交。預期源自囊胚細胞的具有睪丸的雄性嵌合體是不育的。
[0252] 實施例3
[0253]作為囊胚供體的條件性敲除小鼠的產(chǎn)生
[0254]育性基因 R0SA26等位基因變體A的條件性敲除體含有編碼破壞物分子(例如，具有 作為靶的育性基因的轉(zhuǎn)錄物的shRNA，針對由育性基因編碼的蛋白質(zhì)的抗體，等）的核苷酸 序列。側(cè)翼為L〇XP(fl 〇xed)的終止盒抑制破壞物分子的表達。用于產(chǎn)生靶R0SA26等位基因 A 的示例性革E向載體在圖2中示出。
[0255] R0SA26等位基因變體B含有Cre重組酶的CDS。用于產(chǎn)生靶R0SA26等位基因 B的靶向 載體的非限制性實例在圖3中示出。
[0256] 繁殖配偶一的R0SA26等位基因變體A是純合的。
[0257] 繁殖配偶二的R0SA26等位基因變體B是純合的。
[0258] 繁殖配偶一可以是雄性或者雌性。繁殖配偶二反之亦然。
[0259] 如例如在圖4中所示出的，從繁殖配偶一與繁殖配偶二的雜交得到的后代將產(chǎn)生 具有一個R0SA26等位基因變體A和一個R0SA26等位基因變體B的胚胎。R0SA26等位基因變體 B的重組酶將去除R0SA26等位基因變體A中的終止(STOP)盒，并且將從而起始破壞物分子的 表達。破壞物分子現(xiàn)將導致靶育性基因的功能敲除。
[0260] 實施例4
[0261] 多能性細胞向具有靶育性基因的胚胎中的引入和第一窩后代的產(chǎn)生
[0262] 材料&方法
[0263] 用孕馬血清(PMS)注射21-25日齡的C57BL/6Tsc22d3conK0/conK0雌性小鼠或雌性 wt對照小鼠（在靶Bruce4C57BL/6ES-細胞的情況中BALB/c X C57BL/6白化刺鼠，并且在靶 BALB/c ES-細胞的情況中C57BL/6)。兩天后應用人絨膜促性腺激素的隨后注射。在同一天 使C57BL/6Tsc22d3conK0/conK0雌性小鼠或wtBALB/c X C57BL/6白化刺鼠小鼠（對照）分別 與在R0SA26基因座中具有Cre重組酶的敲入(KI)的雄性小鼠或雄性wt小鼠（對照）（雄性對 照小鼠的背景在靶BALB/c ES-細胞的情況中是C57BL/6，并且在靶Bruce4C57BL/6ES-細胞 的情況中是BALB/c)交配。第二天將交配配偶分開。分開后三天收獲交配得到的囊胚，并將 所述囊胚用于靶BALB/c和Bruce4C57BL/6ES細胞的注射。將改造的囊胚轉(zhuǎn)移到CBB6F1接受 者中。大約9周后，使雄性嵌合后代在靶BALB/c細胞的情況中與雌性BALB/c小鼠交配，并且 在靶Bruce4C57BL/6細胞的情況中與雌性C57BL/6小鼠交配。在10日齡時評價后代的毛色， 并在21日齡時通過DNA印跡分析對后代基因分型。
[0264] 題
[0265] 靶BALB/c ES-細胞系的注射
[0266] 將經(jīng)注射的Tsc22d3K0/K0囊胚轉(zhuǎn)移到三個接受者中，并產(chǎn)生16個嵌合體，16個嵌 合體中的11個是雄性，將11個雄性用于另外的繁殖。低百分比的5個嵌合體不產(chǎn)生后代。其 余的6個嵌合體總共產(chǎn)生181只幼崽。這些動物中的146只被用于評價毛色，35只未被確定。 如對源自靶BALB/c ES-細胞的動物預期的，所有146只評價的動物（100 % )具有白色毛色 (參見，圖5)。
[0267] 用DNA印跡分析對這些146只動物中的63只進行基因分型（參見，圖6，DNA印跡）。31 只（49 % )動物被確定為wt/靶小鼠，并且32只（51 % )被確定為wt/wt小鼠。
[0268] 作為對照，還將相同的BALB/c ES-細胞系注射到wt BALBx C57BL/6白化囊胚中， 并將所述囊胚轉(zhuǎn)移到14個接受者中。這產(chǎn)生總共6個嵌合體，所述6個嵌合體中的5個是雄性 并且1個是雌性。5個雄性嵌合體產(chǎn)生總共155只幼崽。這些動物中的119只被用于評價毛色。 60只（50 % )小鼠具有白色毛色(ES細胞衍生的），并且59只（50 % )具有刺鼠毛色(囊胚衍生 的)。
[0269]靶 C57BL/6Bruce4ES-細胞系的注射
[0270]將經(jīng)注射的Tsc22d3K0/K0囊胚轉(zhuǎn)移到兩個接受者中，并產(chǎn)生總共3個嵌合體，所述 3個嵌合體中的3個是雄性。嵌合體總共產(chǎn)生10只幼崽。由于Tsc22d3K0/K0囊胚(其被用于產(chǎn) 生嵌合體）的背景是C57BL/6xBALB/c F1，并且注射的ES細胞基于Bruce4C57BL/6背景，基于 毛色的基因分型是不可能的。相反，通過DNA印跡分析對8只小鼠基因分型，所述8只小鼠中 的4只（50% )被確定為wt/革E1小鼠，并且4只（50% )被確定為wt/wt小鼠。這與wt/革E1小鼠對 wt/wt小鼠的比率完全相關(guān)，如果嵌合體的后代僅源自靶ES-細胞，這是所預期的。
[0271] 作為對照，還將相同的Bruce4C57BL/6ES-細胞注射到wt BALB/c X C57BL/6白化 刺鼠囊胚中，并將所述囊胚轉(zhuǎn)移到11個接受者中。這產(chǎn)生總共13個嵌合體，所述13個嵌合體 中的8個是雄性，并且5個是雌性。8個雄性嵌合體產(chǎn)生總共324只幼崽。這些動物中的149只 被評價毛色。52只（35%)小鼠具有黑色毛色(ES細胞衍生的），并且97只（65%)具有刺鼠毛 色(囊胚衍生的）。
[0272] 因此，使用Tsc22d3K0/K0囊胚作為遺傳修飾的ES-細胞系的宿主顯著改進了遺傳 修飾到后代動物的種系傳遞。遵照該實驗，攜帶不同遺傳修飾的8種其它ES-細胞系已經(jīng)實 現(xiàn)了種系傳遞的可比較的改進。
[0273] 本文引用的每個專利、專利申請和出版物的公開內(nèi)容特此通過引用以其全文并入 本文。
[0274] 本文中任何參考的引用不應該被理解為承認此類參考是作為本申請的"現(xiàn)有技 術(shù)"可得的。
[0275] 貫穿說明書，目的是描述本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，而并非將本發(fā)明限制于任何一 個實施方案或者特定的特征集合。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，根據(jù)本公開內(nèi)容，在示例 的特定實施方案中可以進行多種改變和變化，而不偏離本發(fā)明的范圍。意欲將所有此類改 變和變化包含在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種植入前非人類宿主胚胎(例如，囊胚），所述植入前非人類宿主胚胎包含在其種 系中的破壞的育性基因。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的植入前非人類宿主胚胎，其中所述育性基因的兩個等位基因 均被破壞。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的植入前非人類宿主胚胎，其中所述育性基因位于 性染色體上。4. 根據(jù)權(quán)利要求1至3的任一項所述的植入前非人類宿主胚胎，其中所述性染色體是X 染色體。5. 根據(jù)權(quán)利要求1至3的任一項所述的植入前非人類宿主胚胎，其中所述性染色體是Y 染色體。6. 根據(jù)權(quán)利要求1至5的任一項所述的植入前非人類宿主胚胎，其中所述破壞的育性基 因抑制雄性能育性。7. 根據(jù)權(quán)利要求1至6的任一項所述的植入前非人類宿主胚胎，其中所述育性基因調(diào)節(jié) 精子的能育性。8. 根據(jù)權(quán)利要求1至7的任一項所述的植入前非人類宿主胚胎，其中所述育性基因調(diào)節(jié) 精子發(fā)生。9. 根據(jù)權(quán)利要求1至8的任一項所述的植入前非人類宿主胚胎，其中所述育性基因是 GILZ010. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的植入前非人類宿主胚胎，所述植入前非人類宿主胚胎還包含 供體多能細胞，所述供體多能細胞包含缺乏破壞的育性基因。11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的植入前非人類宿主胚胎，其中所述多能細胞是雄性多能細 胞。12. 根據(jù)權(quán)利要求10或權(quán)利要求11所述的植入前非人類宿主胚胎，其中所述多能細胞 是干細胞。13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的植入前非人類宿主胚胎，其中所述干細胞是胚胎干(ES)細 胞。14. 根據(jù)權(quán)利要求8至13的任一項所述的植入前非人類宿主胚胎，其中所述多能細胞在 其基因組中包含遺傳修飾。15. -種產(chǎn)生非人類動物的方法，所述方法包括將根據(jù)權(quán)利要求1至14的任一項所述的 植入前非人類宿主胚胎引入假孕的非人類動物中，并且在適合于所述胚胎的發(fā)育的條件下 孕育所述植入前非人類宿主胚胎，從而產(chǎn)生非人類動物。16. -種非人類宿主胚胎，所述非人類宿主胚胎包含如權(quán)利要求1至9的任一項中限定 的破壞的育性基因和如權(quán)利要求10至14的任一項中限定的供體多能細胞。17. -種替代或代孕非人類動物，所述替代或代孕非人類動物包含根據(jù)權(quán)利要求16所 述的非人類宿主胚胎。18. -種產(chǎn)生嵌合非人類動物的方法，所述方法包括將根據(jù)權(quán)利要求10至14的任一項 所述的植入前非人類宿主胚胎引入假孕的非人類動物中，并且在適合于所述胚胎的發(fā)育的 條件下孕育所述植入前非人類宿主胚胎，從而產(chǎn)生嵌合非人類動物。19. 一種產(chǎn)生非人類宿主胚胎的方法，所述非人類宿主胚胎包含破壞的育性基因，所述 方法包括:使以下1)與2)雜交：1)第一動物品系，所述第一動物品系攜帶條件性不育轉(zhuǎn)基 因，所述條件性不育轉(zhuǎn)基因包含可破壞的育性基因（"條件性不育品系"2)第二動物品系， 所述第二動物品系攜帶不育激活轉(zhuǎn)基因，所述不育激活轉(zhuǎn)基因包含破壞所述可破壞的育性 基因的基因（"不育激活品系"），從而產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因非人類宿主胚胎，所述轉(zhuǎn)基因非人類宿主 胚胎包含具有破壞的育性基因的生殖細胞。20. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中使所述第一動物品系的雌性成員與所述第二動 物品系的雄性成員雜交。21. -種非人類動物的繁殖對，所述繁殖對包括：1)第一繁殖配偶，所述第一繁殖配偶 包含通過育性基因破壞物分子可破壞的育性基因（"可破壞的育性基因"），其中所述可破壞 的育性基因與啟動子可操作連接;和(2)第二繁殖配偶，所述第二繁殖配偶包含破壞物轉(zhuǎn)基 因，所述破壞物轉(zhuǎn)基因包含編碼所述育性基因破壞物分子的核苷酸序列（"破壞物核苷酸序 列"），其中所述破壞物核苷酸序列與啟動子可操作連接。22. 根據(jù)權(quán)利要求21所述的繁殖對，其中所述育性基因破壞物是重組酶并且所述可破 壞的育性基因與重組酶識別位點可操作連接，所述重組酶識別位點在所述重組酶的存在下 介導所述育性基因的破壞。23. 根據(jù)權(quán)利要求21所述的繁殖對，其中所述育性基因破壞物是抑制性RNA分子，所述 抑制性RNA分子適當?shù)赝ㄟ^反義抑制或RNA干擾抑制所述育性基因的表達。24. 根據(jù)權(quán)利要求21所述的繁殖對，其中所述育性基因破壞物是抗體，所述抗體與所述 育性基因的多肽產(chǎn)物免疫相互作用。25. 根據(jù)權(quán)利要求21至24的任一項所述的繁殖對，其中所述破壞物核苷酸序列是條件 性地可表達的。26. 根據(jù)權(quán)利要求25所述的繁殖對，其中所述破壞物轉(zhuǎn)基因包含與所述破壞物核苷酸 序列可操作連接的表達調(diào)節(jié)元件，其中所述元件條件性地抑制所述破壞物核苷酸序列的表 達。27. 根據(jù)權(quán)利要求26所述的繁殖對，其中在第一條件下所述表達調(diào)節(jié)元件抑制所述破 壞物核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄，并且在第二條件下所述表達調(diào)節(jié)元件的破壞允許或增強所述破壞 物核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄。28. 根據(jù)權(quán)利要求26或權(quán)利要求27所述的繁殖對，其中所述表達調(diào)節(jié)元件包含抑制子 核苷酸序列（例如，轉(zhuǎn)錄終止子），所述抑制子核苷酸序列抑制所述破壞物核苷酸序列的表 達并且所述抑制子核苷酸序列與重組酶識別位點可操作連接，其中所述重組酶識別位點在 重組酶的存在下介導所述抑制子核苷酸序列的破壞，并且其中所述第一繁殖配偶包含激活 子轉(zhuǎn)基因，所述激活子轉(zhuǎn)基因包含與啟動子可操作連接的所述重組酶的編碼序列。29. 根據(jù)權(quán)利要求21至28的任一項所述的繁殖對，其中所述第一繁殖配偶是雌性并且 所述第二繁殖配偶是雄性。30. 根據(jù)權(quán)利要求28或權(quán)利要求29所述的繁殖對，其中所述第一繁殖配偶的所述激活 子轉(zhuǎn)基因是純合的。31. 根據(jù)權(quán)利要求21至30的任一項所述的繁殖對，其中所述第二繁殖配偶的所述破壞 物轉(zhuǎn)基因是純合的。32. -種非人類動物的繁殖對，所述繁殖對包括：（1)第一繁殖配偶，所述第一繁殖配偶 包含可破壞的轉(zhuǎn)基因，所述可破壞的轉(zhuǎn)基因包含可破壞的育性基因，所述可破壞的育性基 因與啟動子且與重組酶識別位點可操作連接，所述重組酶識別位點在重組酶的存在下介導 所述育性基因的破壞;和(2)第二繁殖配偶，所述第二繁殖配偶包含破壞物轉(zhuǎn)基因，所述破 壞物轉(zhuǎn)基因包含編碼育性基因破壞物分子的破壞物核苷酸序列，所述破壞物核苷酸序列與 啟動子可操作連接，其中所述育性基因破壞物分子包括所述重組酶。33. 根據(jù)權(quán)利要求32所述的繁殖對，其中所述第一繁殖配偶是雌性并且所述第二繁殖 配偶是雄性。34. 根據(jù)權(quán)利要求32或權(quán)利要求33所述的繁殖對，其中所述第一繁殖配偶的所述可破 壞的轉(zhuǎn)基因是純合的和/或所述第二繁殖配偶的所述破壞物轉(zhuǎn)基因是純合的。35. -種非人類動物的繁殖對，所述繁殖對包括：（1)第一繁殖配偶，所述第一繁殖配偶 包含第一可破壞的轉(zhuǎn)基因和第一破壞物轉(zhuǎn)基因，所述第一可破壞的轉(zhuǎn)基因包含與啟動子且 與第一重組酶識別位點可操作連接的育性基因，所述第一重組酶識別位點在第一重組酶的 存在下介導所述可破壞的育性基因的破壞，所述第一破壞物轉(zhuǎn)基因包含與啟動子可操作連 接的第二重組酶的編碼序列，其中所述第二重組酶特異性地識別第二重組酶識別位點，和 (2)第二繁殖配偶，所述第二繁殖配偶包含第二可破壞的轉(zhuǎn)基因和第二破壞物轉(zhuǎn)基因，所述 第二可破壞的轉(zhuǎn)基因包含與啟動子且與第二重組酶識別位點可操作連接的育性基因，所述 第二重組酶識別位點在所述第二重組酶的存在下介導所述可破壞的育性基因的破壞，所述 第二破壞物轉(zhuǎn)基因包含與啟動子可操作連接的所述第一重組酶的編碼序列，其中所述第一 重組酶特異性地識別所述第一重組酶識別位點。36. 根據(jù)權(quán)利要求35所述的繁殖對，其中所述第一繁殖配偶的所述第一可破壞的轉(zhuǎn)基 因和所述第一破壞物轉(zhuǎn)基因是純合的和/或所述第二繁殖配偶的所述第二可破壞的轉(zhuǎn)基因 和所述第二破壞物轉(zhuǎn)基因是純合的。37. -種非人類動物的繁殖對，所述繁殖對包括：（1)第一繁殖配偶，所述第一繁殖配偶 包含可破壞的育性基因和激活子轉(zhuǎn)基因，所述可破壞的育性基因與啟動子可操作連接，所 述激活子轉(zhuǎn)基因包含與啟動子可操作連接的重組酶的編碼序列;和(2)第二繁殖配偶，所述 第二繁殖配偶包含破壞物轉(zhuǎn)基因，所述破壞物轉(zhuǎn)基因包含編碼抑制性RNA分子(例如，反義 RNA、siRNA、shRNA等）的破壞物核苷酸序列，所述抑制性RNA分子抑制所述可破壞的育性基 因的表達，其中所述破壞物核苷酸序列與啟動子且與表達調(diào)節(jié)元件可操作連接，所述表達 調(diào)節(jié)元件包含抑制子核苷酸序列（例如，轉(zhuǎn)錄終止子），所述抑制子核苷酸序列在所述重組 酶的不存在下抑制所述破壞物核苷酸序列的表達并且所述抑制子核苷酸序列與重組酶識 別位點可操作連接，所述重組酶識別位點在所述重組酶的存在下介導所述抑制子核苷酸序 列的破壞。38. 根據(jù)權(quán)利要求37所述的繁殖對，其中所述第一繁殖配偶的所述激活子轉(zhuǎn)基因是純 合的和/或所述第二繁殖配偶的所述破壞物轉(zhuǎn)基因是純合的。39. 根據(jù)權(quán)利要求37或權(quán)利要求38所述的繁殖對，其中所述第一繁殖配偶是雌性并且 所述第二繁殖配偶是雄性。40. -種非人類動物的繁殖對，所述繁殖對包括：（1)第一繁殖配偶，所述第一繁殖配偶 包含可破壞的育性基因和激活子轉(zhuǎn)基因，所述可破壞的育性基因與啟動子可操作連接，所 述激活子轉(zhuǎn)基因包含與啟動子可操作連接的重組酶的編碼序列;和(2)第二繁殖配偶，所述 第二繁殖配偶包含破壞物轉(zhuǎn)基因，所述破壞物轉(zhuǎn)基因包含破壞物核苷酸序列，所述破壞物 核苷酸序列編碼與所述可破壞的育性基因的多肽產(chǎn)物免疫相互作用的抗體，其中所述破壞 物核苷酸序列與啟動子并且與表達調(diào)節(jié)元件可操作連接，所述表達調(diào)節(jié)元件包含抑制子核 苷酸序列（例如，轉(zhuǎn)錄終止子），所述抑制子核苷酸序列在重組酶的不存在下抑制所述破壞 物核苷酸序列的表達并且所述抑制子核苷酸序列與重組酶識別位點可操作連接，所述重組 酶識別位點在所述重組酶的存在下介導所述抑制子核苷酸序列的破壞。41. 根據(jù)權(quán)利要求40所述的繁殖對，其中所述第一繁殖配偶的所述激活子轉(zhuǎn)基因是純 合的和/或所述第二繁殖配偶的所述破壞物轉(zhuǎn)基因是純合的。42. 根據(jù)權(quán)利要求40或權(quán)利要求41所述的繁殖對，其中所述第一繁殖配偶是雌性并且 所述第二繁殖配偶是雄性。43. -種用于產(chǎn)生非人類宿主胚胎的方法，所述非人類宿主胚胎包含破壞的育性基因， 所述方法包括：（a)使根據(jù)權(quán)利要求21至42的任一項所述的非人類動物的繁殖對的第一繁 殖配偶與所述繁殖對的第二繁殖配偶交配;和(b)從所述繁殖對的雌性成員產(chǎn)生植入前非 人類胚胎，所述胚胎包含在其種系中的所述育性基因的破壞。44. 根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，所述方法還包括在允許所述植入前非人類宿主胚胎 的形成的條件下培養(yǎng)非人類宿主胚胎。45. 根據(jù)權(quán)利要求43或權(quán)利要求44所述的方法，其中所述第一繁殖配偶是雌性并且所 述第二繁殖配偶是雄性。46. 根據(jù)權(quán)利要求43至45的任一項所述的方法，所述方法還包括將如權(quán)利要求10至14 的任一項中限定的供體多能細胞引入到所述植入前非人類胚胎中。47. 根據(jù)權(quán)利要求46所述的方法，其中所述多能細胞包含遺傳修飾。48. 根據(jù)權(quán)利要求46或權(quán)利要求47所述的方法，其中所述多能細胞是雄性多能細胞。49. 一種產(chǎn)生嵌合非人類動物的方法，所述方法包括（1)移植植入前非人類胚胎，所述 植入前非人類胚胎包含在其種系中的育性基因的破壞(例如，如權(quán)利要求1至9的任一項中 限定的)并且所述植入前非人類胚胎還包含供體多能細胞(例如，如權(quán)利要求10至14的任一 項中限定的）；和(2)在適合于所述胚胎的發(fā)育的條件下孕育（1)的非人類宿主胚胎，從而產(chǎn) 生具有在其種系中的破壞的育性基因和遺傳修飾的嵌合非人類動物。50. 根據(jù)權(quán)利要求49所述的方法，其中所述嵌合非人類動物是雄性嵌合非人類動物。51. -種產(chǎn)生非人類動物的方法，所述非人類動物包含在其基因組中的遺傳修飾，所述 方法包括用在其基因組中包含其中缺乏破壞的育性基因的同類雌性非人類動物繁殖根據(jù) 權(quán)利要求50所述的方法產(chǎn)生的雄性嵌合非人類動物，以當所述雄性嵌合非人類動物包含源 自所述供體多能細胞的生殖細胞或配子時產(chǎn)生包含所述遺傳修飾的非人類動物。52. -種非人類動物(例如，替代或代孕非人類動物），所述非人類動物具有移植在其中 的根據(jù)權(quán)利要求1至14的任一項所述的植入前非人類宿主胚胎。53. -種嵌合非人類動物，所述嵌合非人類動物源自根據(jù)權(quán)利要求1至14的任一項所述 的植入前非人類宿主胚胎。54. -種根據(jù)權(quán)利要求51所述的方法產(chǎn)生的非人類動物。
【文檔編號】C12N15/877GK105899667SQ201480072361
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2014年11月7日
【發(fā)明人】弗蘭克·科恩特根
【申請人】奧茲吉恩控股有限公司