用于與眼科狀況有關(guān)的等位基因的多重檢測(cè)的方法
【專(zhuān)利摘要】公開(kāi)了用于檢測(cè)來(lái)自人受試者的樣品中與角膜營(yíng)養(yǎng)不良有關(guān)的至少兩種基因組等位基因的系統(tǒng)和方法，其中所述受試者的細(xì)胞(例如上皮)附著于基片的尖端。將基片的尖端在裂解溶液中攪動(dòng)，所述裂解溶液裂解附著于基片的細(xì)胞。當(dāng)該攪動(dòng)完成時(shí)從裂解溶液移出基片。溫育所得裂解溶液，然后從裂解溶液分離基因組DNA以形成gDNA溶液。從這之中，使用至少兩個(gè)寡核苷酸引物對(duì)和gDNA溶液鑒定出人TGFpI基因中存在的至少兩個(gè)核苷酸的身份。這至少兩個(gè)核苷酸位于TGFpI基因的分別的獨(dú)立位置，其對(duì)應(yīng)于與角膜營(yíng)養(yǎng)不良有關(guān)的分別的獨(dú)立的單核苷酸多態(tài)性(SNP)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】用于與眼科狀況有關(guān)的等位基因的多重檢測(cè)的方法 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本申請(qǐng)一般涉及用于分離和檢測(cè)疾病有關(guān)的遺傳等位基因的方法。具體地，本申 請(qǐng)涉及用于檢測(cè)Avellino角膜營(yíng)養(yǎng)不良有關(guān)的等位基因的改進(jìn)的方法。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 實(shí)時(shí)PCR可用于檢測(cè)具有基本相同序列的核酸序列之間的差異。通過(guò)使用差異標(biāo) 記的熒光核酸探針(例如一種結(jié)合野生型序列而一種結(jié)合突變體序列），能快速并可靠地檢 測(cè)人基因組中的單核苷酸變化。這種解析能力已被應(yīng)用于醫(yī)學(xué)診斷，其中單核苷酸多態(tài)性 (SNP)，即在蛋白質(zhì)的編碼和/或非編碼序列中發(fā)現(xiàn)的單堿基變化，與人疾病相關(guān)。
[0004] 然而，實(shí)時(shí)PCR分析高度依賴(lài)于高質(zhì)量樣品的收集和分離。不良樣品收集和/或分 離需要使用更長(zhǎng)的測(cè)定條件和更大量的實(shí)時(shí)PCR試劑，兩者都導(dǎo)致增加的成本和降低的生 產(chǎn)力。此外，實(shí)時(shí)PCR單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)測(cè)定的失敗可引起對(duì)收集額外的樣品的需要，從 而導(dǎo)致甚至更大的時(shí)間和資源損失。
[0005]因此，高度期望產(chǎn)生改進(jìn)的樣品收集和分離的方法，其改進(jìn)測(cè)定的總體成功率，減 少測(cè)定所需的試劑，且減少在后期收集額外樣品的需要。此外，用于以較低樣品材料量實(shí)施 實(shí)時(shí)PCR SNP檢測(cè)測(cè)定的方法還將降低與高質(zhì)量樣品的收集和分離有關(guān)的挑戰(zhàn)。
[0006] 角膜營(yíng)養(yǎng)不良可以是常染色體顯性的遺傳疾病，其開(kāi)始在患者的角膜中間具有模 糊的視力。此模糊視力逐漸蔓延至角膜周邊，且視力隨著患者年齡增加而惡化。有幾種類(lèi)型 的已表征過(guò)的角膜營(yíng)養(yǎng)不良，包括阿維利諾(Avel 1 ino)角膜營(yíng)養(yǎng)不良、顆粒狀(Granular) 角膜營(yíng)養(yǎng)不良、格子狀I(lǐng)型（lattice type I)角膜營(yíng)養(yǎng)不良、Thiel-Behnke、和Reis-bucklers角膜營(yíng)養(yǎng)不良。已知角膜營(yíng)養(yǎng)不良至少在一些情況中是由編碼WG-H3蛋白（也稱(chēng) 為T(mén)GFW蛋白，TGFBI蛋白和角膜上皮蛋白）的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子beta誘導(dǎo)（TGFW)基因中的突變 引起的。
[0007] 患有阿維利諾角膜營(yíng)養(yǎng)不良的雜合患者隨著年齡具有增加的視力喪失，在生命的 晚年變得嚴(yán)重。比較而言，純合患者到6歲齡呈現(xiàn)出嚴(yán)重到完全的視力喪失。阿維利諾角膜 營(yíng)養(yǎng)不良首先在約1988年被認(rèn)可為一種獨(dú)特的角膜營(yíng)養(yǎng)不良類(lèi)型。在那時(shí)之前，其可能被 錯(cuò)誤分類(lèi)為顆粒狀角膜營(yíng)養(yǎng)不良?，F(xiàn)今，已知阿維利諾角膜營(yíng)養(yǎng)不良是世界范圍內(nèi)最常見(jiàn) 的間質(zhì)角膜營(yíng)養(yǎng)不良形式。在韓國(guó)，據(jù)信阿維利諾角膜營(yíng)養(yǎng)不良具有870個(gè)人中約1的流行 率（參見(jiàn)Lee, J.H.等，Ophthalmic Epidemiol ·，17:160,2010;亦參見(jiàn)Hoi land，E · J ·等， Ophthalmology,99:1564,1992;Kennedy，S.M.等，Br.J.Ophthalmol·,80:489,1996; Dolmetsch，A.M.等，Can.J.Ophthalmol·，31:29,1996;Afshari，Ν·Α·等， Arch.Ophthalmol. , 119:16,2001 ；Stewart ,H. S.Hum.Mutat. , 14:126,1999) 〇
[0008] 之前發(fā)現(xiàn)雜合個(gè)體(例如，具有一個(gè)野生型WG-H3等位基因和一個(gè)突變體WG-H3 等位基因）在LASIK手術(shù)后高度易于視力喪失加劇。特別地，手術(shù)后兩年時(shí)，在具有增加的攻 擊性的這些患者中觀察到增加的角膜不透明性，最終導(dǎo)致視力的完全喪失(Jun，R.M.等， Opthalmology，111:463，2004)。之前，進(jìn)行眼手術(shù)，預(yù)期通過(guò)LASIK或Excimer激光手術(shù)將使 患有角膜營(yíng)養(yǎng)不良的患者擺脫視力模糊。假定有30萬(wàn)例LASIK手術(shù)，則300個(gè)人會(huì)失去其視 力，基于患有阿維利諾角膜營(yíng)養(yǎng)不良的雜合患者為1/1000的最小估測(cè)。經(jīng)歷LASIK手術(shù)的患 者主要在其進(jìn)行生產(chǎn)活動(dòng)的20多歲及30多歲中；因此，他們的視力喪失導(dǎo)致嚴(yán)重的社會(huì)和 經(jīng)濟(jì)問(wèn)題。
[0009] 另外，美國(guó)2000年批準(zhǔn)LASIK手術(shù)后，已發(fā)現(xiàn)經(jīng)歷LASIK手術(shù)的患有阿維利諾角膜 營(yíng)養(yǎng)不良的非洲裔美國(guó)患者喪失視力，其推斷許多相似的病例可發(fā)生在世界各地。
[0010] 因此，盡管為了預(yù)防由LASIK手術(shù)所致的阿維利諾角膜營(yíng)養(yǎng)不良的進(jìn)展需要對(duì)阿 維利諾角膜營(yíng)養(yǎng)不良的準(zhǔn)確診斷，但僅通過(guò)對(duì)角膜不透明度的顯微觀察(例如裂隙燈(slit lamp)檢查)進(jìn)行對(duì)阿維利諾角膜營(yíng)養(yǎng)不良的診斷，因而醫(yī)生經(jīng)常遺漏患者的潛在癥狀，從 而進(jìn)行LASIK手術(shù)，這導(dǎo)致視力喪失。因此，期望快速并準(zhǔn)確地對(duì)角膜營(yíng)養(yǎng)不良進(jìn)行遺傳診 斷。
[0011]已開(kāi)發(fā)了用于檢測(cè)WG-H3基因突變的DNA芯片，該突變?cè)斐砂⒕S利諾角膜營(yíng)養(yǎng)不 良（韓國(guó)專(zhuān)利早期公開(kāi)號(hào)10-2007-0076532)。然而，使用DNA芯片診斷阿維利諾角膜營(yíng)養(yǎng)不 良不利地需要幾個(gè)步驟，包括擴(kuò)增樣品中DNA的步驟，使擴(kuò)增的DNA與DNA芯片雜交的步驟， 洗滌雜交的DNA芯片的步驟，和檢測(cè)陽(yáng)性應(yīng)答的步驟。
[0012]鑒于上述背景，本領(lǐng)域中需要用于檢測(cè)與角膜營(yíng)養(yǎng)不良有關(guān)的多重突變等位基因 的改進(jìn)的方法。
[0013] 發(fā)明概述
[0014] 本公開(kāi)提供用于檢測(cè)與人疾病有關(guān)的一種或多種等位基因的改進(jìn)方法。下文描述 的方法降低實(shí)施得到關(guān)于受試者的醫(yī)學(xué)信息的測(cè)定法相關(guān)的時(shí)間和成本。例如，在一些實(shí) 施方案中，所述改進(jìn)的方法允許以對(duì)患者的降低的成本，同日檢測(cè)與阿維利諾角膜營(yíng)養(yǎng)不 良有關(guān)的基因組標(biāo)志物。
[0015] 在一些實(shí)施方案中，本公開(kāi)提供用于檢測(cè)來(lái)自受試者的樣品中與角膜營(yíng)養(yǎng)不良有 關(guān)的至少兩種基因組等位基因的方法，所述方法包括：（A)提供受試者的上皮細(xì)胞，其附著 于基片的尖端；（B)在裂解溶液中攪動(dòng)該基片的該尖端，所述裂解溶液裂解附著于該基片的 細(xì)胞；（C)在完成(B)攪動(dòng)時(shí)，從裂解溶液移出該基片；（D)在(C)移出后溫育該裂解溶液；（E) 從裂解溶液分離基因組DNA以形成gDNA溶液;和(F)使用至少兩種寡核苷酸引物對(duì)和該gDNA 溶液確定TGFW基因中存在的至少兩個(gè)核苷酸的身份，其中所述至少兩個(gè)核苷酸位于TGFW 基因的分別的獨(dú)立的位置處，所述位置對(duì)應(yīng)于與角膜營(yíng)養(yǎng)不良有關(guān)的分別的獨(dú)立的單核苷 酸多態(tài)性(SNP)。
[0016] 在一些實(shí)施方案中，所述TGFW基因中存在的至少兩個(gè)核苷酸在人基因組中相隔 至少一個(gè)核苷酸。
[0017] 在一些實(shí)施方案中，所述至少兩種寡核苷酸引物對(duì)的至少一對(duì)包含正向PCR引物， 其具有包含SEQ ID N0:1的核苷酸序列，和反向PCR引物，其具有包含SEQ ID N0:2的核苷酸 序列。
[0018] 在一些實(shí)施方案中，所述至少兩種寡核苷酸引物對(duì)的至少一對(duì)包含正向PCR引物， 其具有包含SEQ ID N0:43的核苷酸序列，和反向PCR引物，其具有包含SEQ ID N0:44的核苷 酸序列。
[0019] 在一些實(shí)施方案中，所述至少兩種寡核苷酸引物對(duì)包含第一擴(kuò)增引物對(duì)和第二擴(kuò) 增引物對(duì)。所述第一擴(kuò)增引物對(duì)包含正向PCR引物，其具有包含SEQ ID NO: 1的核苷酸序列， 和反向PCR引物，其具有包含SEQ ID NO:2的核苷酸序列。所述第二擴(kuò)增引物對(duì)包含正向PCR 引物，其具有包含SEQ ID NO:43的核苷酸序列，和反向PCR引物，其具有包含SEQ ID NO:44 的核苷酸序列。
[0020] 在一些實(shí)施方案中，（F)確定進(jìn)一步包括使用：（i)具有包含SEQ ID N0:25的核苷 酸序列的第一野生型檢測(cè)探針，和具有包含SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:48,或SEQ ID NO:49 的核苷酸序列的第一突變體檢測(cè)探針；和（ii)具有包含SEQ ID N0:45或SEQ ID N0:47的核 苷酸序列的第二野生型檢測(cè)探針，和具有包含SEQ ID NO:46或SEQ ID NO:50的核苷酸序列 的第二突變體檢測(cè)探針。
[0021] 在一些實(shí)施方案中，本公開(kāi)提供一種用于檢測(cè)角膜營(yíng)養(yǎng)不良的方法，該方法包括： (A)使用包含至少第一擴(kuò)增引物對(duì)和至少第二擴(kuò)增引物對(duì)的反應(yīng)混合物從來(lái)自人受試者的 生物樣品擴(kuò)增至少兩種TGFW基因序列，包括第一 TGFW基因序列和第二TGFW基因序列，所 述第一 TGFW基因序列包含編碼氨基酸殘基124的核苷酸，所述第二TGFW基因序列包含編 碼氨基酸殘基555的核苷酸；（B)將第一檢測(cè)寡核苷酸探針對(duì)的第一檢測(cè)探針雜交于第一 TGFW基因序列；（C)將第二檢測(cè)寡核苷酸探針對(duì)的第二檢測(cè)探針雜交于第二TGFW基因序 列；和(D)基于至少兩種檢測(cè)探針對(duì)的使用檢測(cè)第一 TGFW基因序列和/或第二TGFW基因序 列中的一個(gè)或多個(gè)突變，所述至少兩種檢測(cè)探針對(duì)包括第一檢測(cè)寡核苷酸探針對(duì)和第二檢 測(cè)寡核苷酸探針對(duì)。
[0022] 在一些實(shí)施方案中，檢測(cè)第一TGFW基因序列和/或第二TGFW基因序列中的一個(gè) 或多個(gè)突變包括檢測(cè)第一 TGFW基因序列和/或第二TGFW基因序列中的兩個(gè)或更多個(gè)突 變，且所述兩個(gè)或更多個(gè)突變?cè)谌嘶蚪M中相隔至少一個(gè)核苷酸。
[0023] 在一些實(shí)施方案中，所述至少第一擴(kuò)增引物對(duì)包含第一擴(kuò)增引物和第二擴(kuò)增引 物，其中所述第一擴(kuò)增引物包含核苷酸序列SEQ ID NO: 1且其中所述第二擴(kuò)增引物包含核 苷酸序列SEQ ID N0:2。
[0024] 在一些實(shí)施方案中，所述至少第二擴(kuò)增引物對(duì)包含第三擴(kuò)增引物和第四擴(kuò)增引 物，其中所述第三擴(kuò)增引物由核苷酸序列SEQ ID N0:43所示且其中所述第四擴(kuò)增引物由核 苷酸序列SEQ ID N0:44所示。
[0025] 在一些實(shí)施方案中，所述第一擴(kuò)增引物對(duì)包含第一擴(kuò)增引物和第二擴(kuò)增引物，所 述第一擴(kuò)增引物包含核苷酸序列SEQ ID N0:1，所述第二擴(kuò)增引物包含核苷酸序列SEQ ID N0:2,所述第二擴(kuò)增引物對(duì)包含第三擴(kuò)增引物和第四擴(kuò)增引物，所述第三擴(kuò)增引物包含核 苷酸序列SEQ ID N0:43,和所述第四擴(kuò)增引物包含核苷酸序列SEQ ID N0:44。
[0026] 在一些實(shí)施方案中，所述一個(gè)或多個(gè)突變之一對(duì)應(yīng)于在編碼的TGFBI蛋白中，在氨 基酸124處，精氨酸突變?yōu)榘腚装彼?R124C)，精氨酸突變?yōu)榻M氨酸(R124H)，和/或精氨酸突 變?yōu)榱涟彼?R124L)。
[0027] 在一些實(shí)施方案中，所述一個(gè)或多個(gè)突變之一對(duì)應(yīng)于在編碼的TGFBI蛋白中，在氨 基酸555處，精氨酸突變?yōu)樯彼?R555W)和/或精氨酸突變?yōu)楣劝滨０?R555Q)。
[0028] 在一些實(shí)施方案中，所述至少兩種檢測(cè)寡核苷酸探針對(duì)的每種各自包括第一檢測(cè) 寡核苷酸探針和第二檢測(cè)寡核苷酸探針，其中所述第一檢測(cè)寡核苷酸探針和第二檢測(cè)寡核 苷酸探針包含各自選自下組的核苷酸序列對(duì):SEQ ID N0s:25-26，SEQ ID N0s:25和48，SEQ ID NOs:25和49,SEQ ID NOs:27-28，SEQ ID NOs:29-30，SEQ ID NOs:31-32，SEQ ID NOs: 33-34,SEQ ID NOs:35-36,SEQ ID NOs:37-38,SEQ ID NOs:39-40,SEQ ID NOs:41-42,SEQ ID N0s:45-46和SEQ ID N0s:46-47,SEQ ID N0s:45和50,和SEQ ID N0s:47和50。
[0029] 在一些實(shí)施方案中，所述第一檢測(cè)寡核苷酸探針對(duì)包含第一檢測(cè)寡核苷酸探針和 第二檢測(cè)寡核苷酸探針，其中所述第一檢測(cè)寡核苷酸探針和第二檢測(cè)寡核苷酸探針?lè)謩e包 含核苷酸序列對(duì)SEQ ID N0:25和SEQ ID N0:26。
[0030] 在一些實(shí)施方案中，所述第二檢測(cè)寡核苷酸探針對(duì)包含第三檢測(cè)寡核苷酸探針和 第四檢測(cè)寡核苷酸探針，其中所述第三檢測(cè)寡核苷酸探針和第四檢測(cè)寡核苷酸探針?lè)謩e包 含核苷酸序列對(duì)SEQ ID N0:45和SEQ ID N0:46。
[0031] 在一些實(shí)施方案中，所述第二檢測(cè)寡核苷酸探針對(duì)包含第三檢測(cè)寡核苷酸探針和 第四檢測(cè)寡核苷酸探針，其中所述第三檢測(cè)寡核苷酸探針和第四檢測(cè)寡核苷酸探針?lè)謩e包 含核苷酸序列對(duì)SEQ ID N0:47和SEQ ID N0:46。
[0032] 在一些實(shí)施方案中，所述第二檢測(cè)寡核苷酸探針對(duì)包含第三檢測(cè)寡核苷酸探針和 第四檢測(cè)寡核苷酸探針，其中所述第三檢測(cè)寡核苷酸探針和第四檢測(cè)寡核苷酸探針?lè)謩e包 含核苷酸序列對(duì)SEQ ID N0:25和SEQ ID N0:48。
[0033] 在一些實(shí)施方案中，所述第二檢測(cè)寡核苷酸探針對(duì)包含第三檢測(cè)寡核苷酸探針和 第四檢測(cè)寡核苷酸探針，其中所述第三檢測(cè)寡核苷酸探針和第四檢測(cè)寡核苷酸探針?lè)謩e包 含核苷酸序列對(duì)SEQ ID N0:25和SEQ ID N0:49。
[0034] 在一些實(shí)施方案中，所述第二檢測(cè)寡核苷酸探針對(duì)包含第三檢測(cè)寡核苷酸探針和 第四檢測(cè)寡核苷酸探針，其中所述第三檢測(cè)寡核苷酸探針和第四檢測(cè)寡核苷酸探針?lè)謩e包 含核苷酸序列對(duì)SEQ ID N0:45和SEQ ID N0:50。
[0035] 在一些實(shí)施方案中，所述第二檢測(cè)寡核苷酸探針對(duì)包含第三檢測(cè)寡核苷酸探針和 第四檢測(cè)寡核苷酸探針，其中所述第三檢測(cè)寡核苷酸探針和第四檢測(cè)寡核苷酸探針?lè)謩e包 含核苷酸序列對(duì)SEQ ID N0:47和SEQ ID N0:50。
[0036] 在一些實(shí)施方案中，所述第一檢測(cè)探針與第一標(biāo)記物偶聯(lián)且所述第二檢測(cè)探針偶 聯(lián)于第二標(biāo)記物。
[0037] 在一些實(shí)施方案中，所述第一標(biāo)記物是VIC且所述第二標(biāo)記物是FAM。
[0038] 在一些實(shí)施方案中，（B)雜交和(C)雜交在相同溶液中同時(shí)實(shí)施。
[0039] 在一些實(shí)施方案中，所述(B)雜交和(C)雜交在相同溶液或不同溶液中同時(shí)或在不 同時(shí)間實(shí)施。
[0040] 在一些實(shí)施方案中，本公開(kāi)提供用于檢測(cè)人受試者中的角膜營(yíng)養(yǎng)不良的反應(yīng)混合 物，所述反應(yīng)混合物包含：（A)至少第一擴(kuò)增引物對(duì)和第二擴(kuò)增引物對(duì)，其用于擴(kuò)增和確定 (1)來(lái)自該受試者的生物樣品的至少兩種TGFW基因序列的第一TGFW基因序列，其包含編 碼氨基酸殘基124的核苷酸，和（2)來(lái)自該受試者的生物樣品的至少兩種TGFW基因序列的 第二TGFW基因序列，其包含編碼氨基酸殘基555的核苷酸；和(B)至少兩種檢測(cè)探針對(duì)，其 中所述至少兩種檢測(cè)探針對(duì)的每種中的檢測(cè)探針與至少兩種TGFW基因序列的至少一種雜 交。
[0041] 在一些實(shí)施方案中，所述第一擴(kuò)增引物對(duì)包含第一擴(kuò)增引物和第二擴(kuò)增引物，所 述第一擴(kuò)增引物包含核苷酸序列SEQ ID N0:1，且所述第二擴(kuò)增引物包含核苷酸序列SEQ ID N0:2〇
[0042] 在一些實(shí)施方案中，所述第二擴(kuò)增引物對(duì)包含第三擴(kuò)增引物和第四擴(kuò)增引物，所 述第三擴(kuò)增引物包含核苷酸序列SEQ ID N0:43,且所述第四擴(kuò)增引物包含核苷酸序列SEQ ID N0:44。
[0043] 在一些實(shí)施方案中，所述至少兩種檢測(cè)探針對(duì)的至少一種用于檢測(cè)對(duì)應(yīng)于編碼的 TGFBI蛋白中的以下突變:在氨基酸124處，精氨酸突變?yōu)榘腚装彼?R124C)，精氨酸突變?yōu)?組氨酸(R124H)，和/或精氨酸突變?yōu)榱涟彼?R124L)。
[0044] 在一些實(shí)施方案中，所述至少兩種檢測(cè)探針對(duì)的至少一種用于檢測(cè)對(duì)應(yīng)于編碼的 TGFBI蛋白中的以下突變:在氨基酸555處，精氨酸突變?yōu)樯彼?R555W)和/或精氨酸突變 為谷氨酰胺(R555Q)。
[0045] 在一些實(shí)施方案中，所述至少兩種檢測(cè)探針對(duì)的分別的檢測(cè)探針對(duì)各自包括第一 檢測(cè)寡核苷酸探針和第二檢測(cè)寡核苷酸探針，其中所述第一檢測(cè)寡核苷酸探針和第二檢測(cè) 寡核苷酸探針包含各自選自下組的核苷酸序列對(duì)：SEQ ID N0s:25-26，SEQ ID N0s:25和 48，SEQ ID NOs:25和49,SEQ ID NOs:27-28，SEQ ID NOs:29-30，SEQ ID NOs:31-32,SEQ ID NOs:33-34,SEQ ID NOs:35-36,SEQ ID NOs:37-38,SEQ ID NOs:39-40,SEQ ID NOs: 41-42,SEQ ID NOs:45-46和SEQ ID NOs:46-47,SEQ ID NOs:45和50,和SEQ ID NOs:47和 50 〇
[0046] 在一些實(shí)施方案中，所述至少兩種檢測(cè)探針對(duì)之一包含第一檢測(cè)寡核苷酸探針和 第二檢測(cè)寡核苷酸探針，其中所述第一檢測(cè)寡核苷酸探針和第二檢測(cè)寡核苷酸探針?lè)謩e包 含核苷酸序列對(duì)SEQ ID N0:25和SEQ ID N0:26。
[0047] 在一些實(shí)施方案中，所述至少兩種檢測(cè)探針對(duì)之一包含第一檢測(cè)寡核苷酸探針和 第二檢測(cè)寡核苷酸探針，其中所述第一檢測(cè)寡核苷酸探針和第二檢測(cè)寡核苷酸探針?lè)謩e包 含核苷酸序列對(duì)SEQ ID N0:45和SEQ ID N0:46。
[0048] 在一些實(shí)施方案中，所述至少兩種檢測(cè)探針對(duì)之一包含第一檢測(cè)寡核苷酸探針和 第二檢測(cè)寡核苷酸探針，其中所述第一檢測(cè)寡核苷酸探針和第二檢測(cè)寡核苷酸探針?lè)謩e包 含核苷酸序列對(duì)SEQ ID N0:47和SEQ ID N0:46。
[0049] 在一些實(shí)施方案中，所述至少兩種檢測(cè)探針對(duì)之一包含第一檢測(cè)寡核苷酸探針和 第二檢測(cè)寡核苷酸探針，其中所述第一檢測(cè)寡核苷酸探針和第二檢測(cè)寡核苷酸探針?lè)謩e包 含核苷酸序列對(duì)SEQ ID N0:25和SEQ ID N0:48。
[0050] 在一些實(shí)施方案中，所述至少兩種檢測(cè)探針對(duì)之一包含第一檢測(cè)寡核苷酸探針和 第二檢測(cè)寡核苷酸探針，其中所述第一檢測(cè)寡核苷酸探針和第二檢測(cè)寡核苷酸探針?lè)謩e包 含核苷酸序列對(duì)SEQ ID N0:25和SEQ ID N0:49。
[0051] 在一些實(shí)施方案中，所述至少兩種檢測(cè)探針對(duì)之一包含第一檢測(cè)寡核苷酸探針和 第二檢測(cè)寡核苷酸探針，其中所述第一檢測(cè)寡核苷酸探針和第二檢測(cè)寡核苷酸探針?lè)謩e包 含核苷酸序列對(duì)SEQ ID N0:45和SEQ ID N0:50。
[0052] 在一些實(shí)施方案中，所述至少兩種檢測(cè)探針對(duì)之一包含第一檢測(cè)寡核苷酸探針和 第二檢測(cè)寡核苷酸探針，其中所述第一檢測(cè)寡核苷酸探針和第二檢測(cè)寡核苷酸探針?lè)謩e包 含核苷酸序列對(duì)SEQ ID N0:47和SEQ ID N0:50。
[0053] 在一些實(shí)施方案中，所述至少兩種檢測(cè)探針的第一檢測(cè)探針與第一標(biāo)記物偶聯(lián)且 所述至少兩種檢測(cè)探針的第二檢測(cè)探針偶聯(lián)于第二標(biāo)記物。
[0054] 在一些實(shí)施方案中，所述第一標(biāo)記物是VIC且所述第二標(biāo)記物是FAM。
[0055] 在一些實(shí)施方案中，本公開(kāi)提供用于檢測(cè)人受試者中的角膜營(yíng)養(yǎng)不良的反應(yīng)混合 物，所述反應(yīng)混合物包含：（A)至少第一擴(kuò)增引物對(duì)，其用于擴(kuò)增和確定來(lái)自該受試者的生 物樣品的TGFW基因序列；和(B)至少三種檢測(cè)探針的組，其中所述至少三種檢測(cè)探針的組 的一種檢測(cè)探針在暴露于TGFW基因序列時(shí)與TGFW基因序列雜交。
[0056]在一些實(shí)施方案中，所述TGFW基因序列包含來(lái)自該受試者的生物樣品的編碼氨 基酸殘基124的核苷酸。
[0057]在一些實(shí)施方案中，所述至少三種檢測(cè)探針的組包括選自下組的至少一種檢測(cè)探 針：SEQ ID NOs :25-42和48-49。
[0058] 在一些實(shí)施方案中，所述至少三種檢測(cè)探針的組包括選自下組的至少兩種或更多 種檢測(cè)探針：SEQ ID NOs :25-42和48-49。
[0059] 在一些實(shí)施方案中，所述至少三種檢測(cè)探針的組包括選自下組的至少三種或更多 種檢測(cè)探針：SEQ ID NOs :25-42和48-49。
[0060] 在一些實(shí)施方案中，所述至少三種檢測(cè)探針的組包括第一檢測(cè)探針SEQ ID NO: 25 和第二檢測(cè)探針SEQ ID NO:26。
[0061] 在一些實(shí)施方案中，所述至少三種檢測(cè)探針的組包括選自下組的第三檢測(cè)探針： SEQIDN0:48和SEQIDN0:49。
[0062]在一些實(shí)施方案中，所述至少三種檢測(cè)探針的組包括不同于第三檢測(cè)探針且選自 下組的第四檢測(cè)探針：SEQ ID N0:48和SEQ ID N0:49。
[0063] 在一些實(shí)施方案中，所述至少三種檢測(cè)探針的組包括選自下組的兩種或更多種檢 測(cè)探針：SEQ ID NOs:26和48-49。
[0064] 在一些實(shí)施方案中，所述第一擴(kuò)增引物對(duì)包含第一擴(kuò)增引物和第二擴(kuò)增引物，所 述第一擴(kuò)增引物包含核苷酸序列SEQ ID N0:1，且所述第二擴(kuò)增引物包含核苷酸序列SEQ ID N0:2〇
[0065] 在一些實(shí)施方案中，反應(yīng)混合物還包含：（C)至少第二擴(kuò)增引物對(duì)，其用于擴(kuò)增和 確定來(lái)自所述生物樣品的第二TGFW基因序列；和(D)至少三種檢測(cè)探針的第二組，其中所 述至少三種檢測(cè)探針的第二組的一種檢測(cè)探針在暴露于第二TGFW基因序列時(shí)與第二TGF0 I基因序列雜交。
[0066]在一些實(shí)施方案中，所述第二TGFW基因序列包含來(lái)自該受試者的生物樣品的編 碼氨基酸殘基555的核苷酸。
[0067]在一些實(shí)施方案中，所述至少三種檢測(cè)探針的第二組包括選自下組的至少一種檢 測(cè)探針：SEQ ID NOs :45-47和50。
[0068] 在一些實(shí)施方案中，所述至少三種檢測(cè)探針的第二組包括選自下組的至少兩種或 更多種檢測(cè)探針：SEQ ID NOs :45-47和50。
[0069] 在一些實(shí)施方案中，所述至少三種檢測(cè)探針的第二組包括選自下組的至少三種或 更多種檢測(cè)探針：SEQ ID NOs :45-47和50。
[0070] 在一些實(shí)施方案中，所述至少三種檢測(cè)探針的第二組包括：第一檢測(cè)探針，其為 SEQ ID N0:45或SEQ ID N0:47,第二檢測(cè)探針，其為SEQ ID N0:46,和第三檢測(cè)探針，其為 SEQ ID N0:50〇
[0071] 在一些實(shí)施方案中，所述第二擴(kuò)增引物對(duì)包含第三擴(kuò)增引物和第四擴(kuò)增引物，第 三擴(kuò)增引物包含核苷酸序列SEQ ID N0:43,和第四擴(kuò)增引物包含核苷酸序列SEQ ID N0: 44〇
[0072] 在一些實(shí)施方案中，所述TGFW基因序列包含來(lái)自該受試者的生物樣品的編碼氨 基酸殘基555的核苷酸。
[0073]在一些實(shí)施方案中，所述至少三種檢測(cè)探針的組包括選自下組的至少一種檢測(cè)探 針：SEQ ID N0s:45-47和50。
[0074] 在一些實(shí)施方案中，所述至少三種檢測(cè)探針的組包括選自下組的至少兩種或更多 種檢測(cè)探針：SEQ ID N0s:45-47和50。
[0075] 在一些實(shí)施方案中，所述至少三種檢測(cè)探針的組包括選自下組的至少三種或更多 種檢測(cè)探針：SEQ ID N0s:45-47和50。
[0076] 在一些實(shí)施方案中，所述至少三種檢測(cè)探針的組包括:第一檢測(cè)探針，其為SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:47,第二檢測(cè)探針，其為SEQ ID NO:46,和第三檢測(cè)探針，其為SEQ ID N0:50〇
[0077] 在一些實(shí)施方案中，本公開(kāi)提供用于檢測(cè)角膜營(yíng)養(yǎng)不良的方法，包括：（A-1)使用 包含至少第一擴(kuò)增引物對(duì)和至少三種檢測(cè)探針的組的反應(yīng)混合物，從來(lái)自人受試者的生物 樣品擴(kuò)增第一TGFW基因序列；（B-1)將所述至少三種檢測(cè)探針的組的第一檢測(cè)探針與第一 TGFW基因序列雜交;并(C-1)基于以下檢測(cè)第一 TGFW基因序列中的突變：（i)所述至少三 種檢測(cè)探針的組的第一檢測(cè)探針雜交于第一TGFW基因序列，和（ii)所述至少三種檢測(cè)探 針的組的第二和第三檢測(cè)探針與第一 TGFW基因序列雜交的失敗。
[0078] 在一些實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括：（A-2)使用相同反應(yīng)混合物從所述生物 樣品擴(kuò)增第二TGFW基因序列，其中所述反應(yīng)混合物包含至少第二擴(kuò)增引物對(duì)和至少三種 檢測(cè)探針的第二組；（B-2)將所述至少三種檢測(cè)探針的第二組的第一檢測(cè)探針與第二TGFW 基因序列雜交;并(C-2)基于以下檢測(cè)第二TGFW基因序列中的突變：（i)所述至少三種檢測(cè) 探針的第二組的第一檢測(cè)探針雜交于第二TGFW基因序列，和（ii)所述至少三種檢測(cè)探針 的第二組的第二和第三檢測(cè)探針與第二TGFW基因序列雜交的失敗。
[0079] 在一些實(shí)施方案中，擴(kuò)增(A-1)，擴(kuò)增(A-2)，雜交(B-1)，雜交(B-2)，檢測(cè)(C-1)，和 檢測(cè)(C-2)用生物樣品的同一等分試樣實(shí)施。
[0080] 在一些實(shí)施方案中，擴(kuò)增第一TGFW基因序列(A-1)和擴(kuò)增第二TGFW基因序列(A-2)同時(shí)實(shí)施。
[0081] 在一些實(shí)施方案中，雜交(B-1)和雜交(B-2)同時(shí)實(shí)施。
[0082] 在一些實(shí)施方案中，檢測(cè)(C-1)和檢測(cè)(C-2)同時(shí)實(shí)施。
[0083]在一些實(shí)施方案中，所述反應(yīng)混合物具有上文描述的一些特征。為了簡(jiǎn)潔，本文中 不重復(fù)這類(lèi)細(xì)節(jié)。
[0084]在一些實(shí)施方案中，本公開(kāi)提供如上文任意處記載的反應(yīng)混合物用于預(yù)測(cè)受試者 中在激光眼科手術(shù)后的并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)的用途，所述預(yù)測(cè)經(jīng)由檢測(cè)人受試者中的雜合角膜營(yíng) 養(yǎng)不良進(jìn)行。
[0085] 在一些實(shí)施方案中，所述激光眼科手術(shù)包括Lasik和Excimer激光手術(shù)之一。
[0086]在一些實(shí)施方案中，本公開(kāi)提供用于檢測(cè)來(lái)自人受試者的樣品中與角膜營(yíng)養(yǎng)不良 有關(guān)的基因組突變的方法，該方法包括：（A)提供人受試者的上皮細(xì)胞，其附著于基片的尖 端；（B)在裂解溶液中攪動(dòng)該基片的該尖端，所述裂解溶液裂解附著于該基片的細(xì)胞；（C)在 完成(B)攪動(dòng)時(shí)，從裂解溶液移出該基片；（D)在(C)移出后溫育該裂解溶液；（E)從裂解溶液 分離基因組DNA以形成gDNA溶液;和(F)使用至少第一引物對(duì)、至少三種檢測(cè)探針的組和該 gDNA溶液，通過(guò)將該gDNA溶液同時(shí)暴露于所述至少三種檢測(cè)探針，確定TGFW基因中存在的 至少一個(gè)核苷酸的身份，其中：所述至少一個(gè)核苷酸位于TGFW基因的特定的位置處，所述 位置對(duì)應(yīng)于與角膜營(yíng)養(yǎng)不良有關(guān)的單核苷酸多態(tài)性(SNP)，且所述至少三種檢測(cè)探針的組 的至少兩種檢測(cè)探針的每種配置為檢測(cè)TGFW基因的特定位置處的不同突變。
[0087]在一些實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括：（G)使用至少第二引物對(duì)、至少三種檢測(cè) 探針的第二組和該gDNA溶液，通過(guò)將該gDNA溶液同時(shí)暴露于所述至少三種檢測(cè)探針的組和 所述至少三種檢測(cè)探針的第二組，確定TGFW基因中存在的至少第二核苷酸的身份，其中： 所述至少第二核苷酸位于TGFW基因的獨(dú)立于所述至少一個(gè)核苷酸的位置的第二特定位置 處，所述第二特定位置對(duì)應(yīng)于與角膜營(yíng)養(yǎng)不良有關(guān)的第二單核苷酸多態(tài)性(SNP)，且所述至 少三種檢測(cè)探針的第二組的至少兩種檢測(cè)探針配置為檢測(cè)TGFW基因的第二特定位置處的 分別的突變。
[0088] 在一些實(shí)施方案中，所述確定(F)和確定(G)同時(shí)實(shí)施。
[0089]在一些實(shí)施方案中，所述確定(F)和確定(G)使用同一gDNA溶液實(shí)施。
[0090] 附圖簡(jiǎn)述
[0091] 圖1A-1B例示根據(jù)一些實(shí)施方案，用于檢測(cè)與疾病有關(guān)的基因組等位基因的改進(jìn) 的方法100。
[0092] 圖2提供了根據(jù)一些實(shí)施方案，可用于與阿維利諾角膜營(yíng)養(yǎng)不良有關(guān)的單核苷酸 多態(tài)性的實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)的正向和反向PCR引物對(duì)的序列列表(SEQ ID N0s:l-24)。
[0093] 圖3提供了根據(jù)一些實(shí)施方案，可用于與阿維利諾角膜營(yíng)養(yǎng)不良有關(guān)的單核苷酸 多態(tài)性的實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)的野生型和突變體檢測(cè)探針對(duì)的序列列表(SEQ ID NOs :25-42)。
[0094] 圖4提供了用于圖5至圖8中顯示的等位基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中使用的探針序列和引物的 列表。
[0095] 圖5提供了使用圖4中描述的探針，對(duì)于1?124(：，1?124!1，1?12禮，1?5551和1?555〇突變體 的檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。圖5A提供了使用指定的試劑混合物和指定的循環(huán)條件(右手小圖）的等 位區(qū)分圖運(yùn)行(左手小圖）。圖5B提供了相比于正常對(duì)照的多種突變體的實(shí)時(shí)PCR圖。圖5C提 供了相比于純合對(duì)照的多種突變體的實(shí)時(shí)PCR圖。
[0096] 圖6提供關(guān)于使用圖4中描述的探針檢測(cè)1?124(：，1?124!1，1?12禮，1?5551和1?555〇突變 體的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。圖6A提供等位區(qū)分圖運(yùn)行（左手小圖），其使用指定的試劑混合物和指定的 循環(huán)條件(右手小圖）。圖6B提供相比于正常對(duì)照的多種突變體的實(shí)時(shí)PCR圖。圖6C提供了相 比于純合對(duì)照的多種突變體的實(shí)時(shí)PCR圖。
[0097] 圖7提供關(guān)于使用圖4中描述的探針檢測(cè)1?124(：，1?124!1，1?12禮，1?5551和1?555〇突變 體的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。圖7提供等位區(qū)分圖（左手小圖）運(yùn)行，其使用指定的試劑混合物和指定的循 環(huán)條件(右手小圖）。
[0098] 圖8提供關(guān)于使用圖4中描述的探針檢測(cè)1?124(：，1?124!1，1?12禮，1?5551和1?555〇突變 體的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。具體地，圖8提供等位區(qū)分圖運(yùn)行，其使用指定的試劑混合物和指定的循環(huán) 條件(右手小圖）。等位區(qū)分圖運(yùn)行(左手小圖）中的名稱(chēng)"B"指示樣品在實(shí)施實(shí)時(shí)PCR測(cè)定之 前用裂解緩沖液預(yù)處理。等位區(qū)分圖（左手小圖）中的名稱(chēng)"DW-A"指示樣品在實(shí)施實(shí)時(shí)PCR 測(cè)定之前用蒸餾水預(yù)處理。圍繞不同樣片點(diǎn)的圈顯示對(duì)于檢測(cè)的每種等位基因的兩種匹配 的樣品，分別為"B"和"DW-A"（見(jiàn)左手小圖）；在每個(gè)圈內(nèi)有兩個(gè)點(diǎn)，一個(gè)是樣品"B"，一個(gè)是 樣品 "DW-A"。
[0099] 發(fā)明詳述
[0100] I.引言
[0101] 對(duì)疾病相關(guān)的SNP的檢測(cè)是對(duì)多種醫(yī)學(xué)狀況的診斷和預(yù)后的一項(xiàng)越來(lái)越重要的工 具。例如，在TGFW基因的外顯子4中單核苷酸變化的存在與阿維利諾角膜營(yíng)養(yǎng)不良強(qiáng)烈相 關(guān)。發(fā)現(xiàn)該SNP雜合的個(gè)體在LASIK手術(shù)后有視力喪失的高風(fēng)險(xiǎn)。盡管LASIK是一種極大改進(jìn) 許多人的生活質(zhì)量的醫(yī)療規(guī)程，但對(duì)于攜帶G/A TGFf3I SNP的個(gè)體，其通常導(dǎo)致在4至18個(gè) 月時(shí)段內(nèi)的逐漸視力受損，這可能導(dǎo)致視力喪失。視力受損可能在或長(zhǎng)或短的時(shí)段內(nèi)發(fā)生。 幸運(yùn)的是，可以實(shí)施篩選來(lái)鑒定出攜帶該突變的個(gè)體，所述個(gè)體應(yīng)避免有LASIK規(guī)程。
[0102] 本公開(kāi)至少部分基于改進(jìn)樣品分離、制備和分析的方法的發(fā)現(xiàn)。在一些實(shí)施方案 中，提供允許患者樣品再使用的方法，例如當(dāng)測(cè)定失敗或需要實(shí)施另外的隨訪測(cè)試時(shí)。在一 些實(shí)施方案中，這些改進(jìn)的方法包括在室溫將攜帶從患者的口腔黏膜脫落的細(xì)胞的基片 (例如以人造絲為尖端或以棉為尖端的涂藥器)溫和地渦旋于裂解溶液中達(dá)30-45秒(而不 是在升高溫度的20分鐘的延長(zhǎng)溫育）。然后，將該裂解溶液在45°C溫育30分鐘來(lái)改進(jìn)裂解并 增加基因組樣品的產(chǎn)率。有利地，可隨后貯存(例如凍存或冷藏）以人造絲為尖端或以棉為 尖端的涂藥器用于重分離基因組DNA以用于再測(cè)試。
[0103] 在一些實(shí)施方案中，本文中提供的改進(jìn)是經(jīng)由使用更少量的用于實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)測(cè) 定法的基因組DNA樣品來(lái)提供的。在一些實(shí)施方案中，這通過(guò)增加實(shí)施的實(shí)時(shí)PCR循環(huán)數(shù)(例 如約40個(gè)循環(huán))和/或通過(guò)使用在95°C的3秒變性循環(huán)時(shí)間實(shí)現(xiàn)。有利地，由于需要的樣品量 被這些方法降低，因此對(duì)實(shí)時(shí)PCR試劑的要求也降低。由于用于診斷測(cè)定的許多試劑是專(zhuān)賣(mài) 的，試劑可能較昂貴。降低使用的試劑量也可以顯著降低與試劑有關(guān)的成本。
[0104] 涵蓋可以使用用于進(jìn)行這些各個(gè)步驟的每一個(gè)的特定條件（例如樣品處理、溫育 溫度、反應(yīng)體積、反應(yīng)循環(huán)數(shù)、反應(yīng)循環(huán)時(shí)間、反應(yīng)循環(huán)溫度)的所有組合來(lái)實(shí)施本文中描述 的方法以檢測(cè)疾病相關(guān)的SNP，如見(jiàn)于TGFW基因的外顯子4的阿維利諾角膜營(yíng)養(yǎng)不良相關(guān) 的 SNP。
[0105] II.選擇定義
[0106]術(shù)語(yǔ)"發(fā)明"或"本發(fā)明"如本文使用的不意圖限制為本發(fā)明的任一個(gè)具體的實(shí)施 方案，而是一般應(yīng)用于本發(fā)明的任意和所有實(shí)施方案，如權(quán)利要求和說(shuō)明書(shū)中描述的。
[0107] 如本文使用的，除非上下文另外清楚地指示，單數(shù)形式"一個(gè)/一種"和"該"包括復(fù) 數(shù)指代物。如此，例如對(duì)"該方法"的提述包括一種或多種方法，和/或本文描述的類(lèi)型的步 驟，其在閱讀本公開(kāi)時(shí)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員將變得明顯的。
[0108] 如本文使用的，術(shù)語(yǔ)"多態(tài)性"及其變體指不同基因組或個(gè)體之間或之中兩種或更 多種備選基因組序列或等位基因的存在。術(shù)語(yǔ)"遺傳突變"或"遺傳變異"及其變體包括多態(tài) 性。
[0109]如本文使用的，術(shù)語(yǔ)"單核苷酸多態(tài)性"（"SNP"）及其變體指在等位基因間變化的 一個(gè)核苷酸的位點(diǎn)。單核苷酸多態(tài)性（s N P)是單個(gè)堿基變化或點(diǎn)突變，但也包括所謂的 "indel"突變(核苷酸的插入或缺失），導(dǎo)致個(gè)體之間的遺傳變化。占據(jù)所有人遺傳變異的約 90%的SNP沿著30億堿基的人基因組每100至300個(gè)堿基發(fā)生一次。然而，SNP在其他生物體 如病毒中頻繁地多地發(fā)生。SNP可發(fā)生在基因組的編碼或非編碼區(qū)。編碼區(qū)中的SNP可以改 變或可以不改變蛋白質(zhì)產(chǎn)物的氨基酸序列。非編碼區(qū)中的SNP可以改變啟動(dòng)子或加工位點(diǎn)， 且可以影響基因轉(zhuǎn)錄和/或加工。對(duì)個(gè)體在感興趣的基因組區(qū)域中是否具有特定SNP的了解 可以提供開(kāi)發(fā)用于多種疾病的診斷、預(yù)防和治療應(yīng)用的充足信息。在一些實(shí)施方案中，本公 開(kāi)涉及檢測(cè)位于TGFW基因的外顯子4中的與阿維利諾角膜營(yíng)養(yǎng)不良有關(guān)的鳥(niǎo)嘌呤至腺嘌 呤 SNP。
[011 0]術(shù)語(yǔ)"引物"及其變體指在PCR反應(yīng)中充當(dāng)DNA合成啟動(dòng)點(diǎn)的寡核苷酸。引物通常長(zhǎng) 為約15至約35個(gè)核苷酸并與同祀序列互補(bǔ)的區(qū)域雜交。
[0111] 術(shù)語(yǔ)"探針"及其變體(例如檢測(cè)探針)指在PCR反應(yīng)中與靶核酸雜交的寡核苷酸。 靶序列指要分析的且包含感興趣的多態(tài)性位點(diǎn)的核酸區(qū)域。
[0112] 除非另外定義，本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本方面所屬領(lǐng)域的普通 技術(shù)人員通常理解的相同的含義。盡管在本發(fā)明的實(shí)踐或測(cè)試中可以使用與本文中描述的 那些類(lèi)似或等同的任意方法和材料，但本文中具體地描述了方法和材料的多個(gè)實(shí)施方案。
[0113] III.樣品制備
[0114] 在一些實(shí)施方案中，本公開(kāi)提供用于分離在實(shí)時(shí)PCR單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)測(cè)定法 中使用的基因組樣品的改進(jìn)的方法。在一些實(shí)施方案中，所述改進(jìn)的方法100使用圖1中概 述的步驟的組合。
[0115] 在一些實(shí)施方案中，方法包括提供來(lái)自受試者的細(xì)胞樣品。在一些實(shí)施方案中，通 過(guò)使患者的細(xì)胞表面與基片接觸來(lái)收集細(xì)胞，所述基片能可逆地將細(xì)胞固定化在基片上。
[0116] 所公開(kāi)的方法適用于從多種樣品獲得的多種細(xì)胞類(lèi)型。在一些實(shí)施方案中，用于 所公開(kāi)方法的細(xì)胞類(lèi)型包括但不限于，上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、結(jié)締組織細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、內(nèi) 分泌細(xì)胞、心臟細(xì)胞、泌尿器細(xì)胞、黑色素細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、血細(xì)胞、白細(xì)胞、血沉棕黃層 (buffy coat)、毛細(xì)胞(包括例如根毛細(xì)胞)和/或唾液細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞 是上皮細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是囊下-血管周（上皮類(lèi)型1);白色(pale)(上皮 類(lèi)型2);中間（上皮類(lèi)型3);黑色(上皮類(lèi)型4);未分化(上皮類(lèi)型5);和大髓質(zhì)（上皮類(lèi)型6)。 在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是口腔上皮細(xì)胞（例如使用口腔拭子（swap)收集的上皮細(xì) 胞）。在一些實(shí)施方案中，所公開(kāi)的方法中使用的細(xì)胞樣品包括上文確定的細(xì)胞類(lèi)型的任意 組合。
[0117] 在一些實(shí)施方案中，所述方法包括提供（102)來(lái)自受試者的細(xì)胞樣品。在一些實(shí)施 方案中，提供的細(xì)胞是口腔上皮細(xì)胞。
[0118] 細(xì)胞樣品通過(guò)允許受試者細(xì)胞可逆結(jié)合于基片的多種方法的任一種來(lái)收集。在一 些實(shí)施方案中，使基片與含有受試者細(xì)胞的樣品呈物理相互作用地采用，以將細(xì)胞可逆結(jié) 合于基片。在一些實(shí)施方案中，使基片與受試者身體呈物理相互作用地直接采用，以將細(xì)胞 可逆結(jié)合于基片。在一些實(shí)施方案中，樣品是口腔細(xì)胞樣品且通過(guò)將受試者的口腔黏膜(例 如其面頰內(nèi)）與基片接觸來(lái)收集口腔細(xì)胞的樣品，所述基片能可逆地固定化從黏膜取出的 細(xì)胞。在這類(lèi)實(shí)施方案中，以等同于刷牙的力度(例如輕量的力或壓力)對(duì)受試者的頰內(nèi)擦 拭拭子。涵蓋將允許受試者的細(xì)胞可逆結(jié)合于基片的任意方法用于所公開(kāi)的方法。
[0119] 在一些實(shí)施方案中，有利地，以非侵入性方式收集樣品，如此在任何地方且由幾乎 任何人完成此類(lèi)樣品收集。例如，在一些實(shí)施方案中，在內(nèi)科醫(yī)師辦公室、在受試者家里或 在進(jìn)行或要進(jìn)行LASIK手術(shù)的設(shè)施處收集樣品。在一些實(shí)施方案中，患者、患者的醫(yī)生、護(hù)士 或內(nèi)科醫(yī)師的助手或其他臨床人員收集樣品。
[0120] 在一些實(shí)施方案中，基片由細(xì)胞可逆結(jié)合的多種材料的任一種制備。例示性基片 包括由人造絲、棉、二氧化硅、彈性體、蟲(chóng)漆、琥珀、天然或合成橡膠、纖維素、BAKELITE、 NYL0N、聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚丙烯腈、或其他材料或其組合制備的那些。在一些實(shí)施 方案中，基片是具有人造絲尖端或棉尖端的拭子。
[0121] 然后，將基片的尖端(例如人造絲拭子或棉拭子的尖端)在裂解溶液中攪動(dòng)約10秒 至60秒（1分鐘），或約20秒至60秒，約20秒至約45秒，或約20秒至約30秒，約15秒至約60秒， 約15秒至約45秒，或約15秒至約30秒，約10秒至約60秒，約10秒至約45秒，或約10秒至約30 秒，約10秒至約15秒或約10秒至約20秒。在一些實(shí)施方案中，攪動(dòng)進(jìn)行約60秒或約1分鐘。在 一些實(shí)施方案中，攪動(dòng)進(jìn)行不到1分鐘（例如不到60秒）。在一些實(shí)施方案中，攪動(dòng)進(jìn)行不超 過(guò)15秒，20秒，30秒，45秒，60秒，90秒，120秒或更多。在一些實(shí)施方案中，攪動(dòng)進(jìn)行不超過(guò)45 秒。在一些實(shí)施方案中，攪動(dòng)進(jìn)行不超過(guò)30秒。在一些實(shí)施方案中，攪動(dòng)進(jìn)行不超過(guò)20秒。在 一些實(shí)施方案中，攪動(dòng)進(jìn)行不超過(guò)15秒。
[0122] 在一些實(shí)施方案中，攪動(dòng)包括基片在裂解溶液中的任何移動(dòng)。在一些實(shí)施方案中， 將基片的尖端(例如人造絲拭子或棉拭子的尖端)在裂解溶液中溫和移動(dòng)，從而使得多個(gè)口 腔細(xì)胞保持附著于基片以在后面的時(shí)間和/或隨后時(shí)間進(jìn)行分析。在裂解溶液中的這類(lèi)移 動(dòng)包括渦旋運(yùn)動(dòng)、側(cè)向運(yùn)動(dòng)、上下運(yùn)動(dòng)和/或浸漬運(yùn)動(dòng)，或基片在裂解溶液中的任何其他運(yùn) 動(dòng)，其導(dǎo)致多個(gè)口腔細(xì)胞保持附著于尖端同時(shí)允許一些口腔細(xì)胞分散到裂解溶液中。
[0123] 在一些實(shí)施方案中，在室溫進(jìn)行攪動(dòng)步驟，例如在約15°C和約30°C，約18°C和約28 。(：，約18 °C和約25 °C或約20 °C和約25 °C之間的溫度。
[0124] 在攪動(dòng)后，移出基片（例如具有人造絲尖端或棉尖端的拭子），并在一些實(shí)施方案 中貯存用于后期使用，如果需要重新測(cè)試或進(jìn)一步（例如不同或額外的）測(cè)試的話。在一些 實(shí)施方案中，將基片(例如具有人造絲尖端或棉尖端的口腔拭子)置于容器中并冷凍貯存。 在一些實(shí)施方案中，將基片(例如具有人造絲尖端或棉尖端的口腔拭子)冷藏。在一些實(shí)施 方案中，將基片在多種溫度的任一個(gè)貯存多種時(shí)段的任一個(gè)，同時(shí)仍保持對(duì)再一次或多次 提取可用。
[0125] 在一些實(shí)施方案中，將含有樣品的基片貯存0周，1周，2周，3周，4周，5周，6周，7周， 8周，9周，10周，11周或12周或更長(zhǎng)。在一些實(shí)施方案中，將含有樣品的基片貯存和/或能貯 存0周至12周，1周至12周，2周至12周，3周至12周，4周至12周，5周至12周，6周至12周，7周至 12周，8周至12周，9周，10周至12周，或11周至12周。在一些實(shí)施方案中，將含有樣品的基片 貯存1，2,3,4,5,6,8，10，12，14，16，18,20,22,24,30，或36個(gè)月或更長(zhǎng)。在一些實(shí)施方案中， 將含有樣品的基片貯存1個(gè)月至36個(gè)月，2個(gè)月至36個(gè)月，3個(gè)月至36個(gè)月，4個(gè)月至36個(gè)月，5 個(gè)月至36個(gè)月，6個(gè)月至36個(gè)月，7個(gè)月至36個(gè)月，8個(gè)月至36個(gè)月，9個(gè)月至36個(gè)月，10個(gè)月至 36個(gè)月，12個(gè)月至36個(gè)月，14個(gè)月至36個(gè)月，16個(gè)月至36個(gè)月，18個(gè)月至36個(gè)月。在一些實(shí)施 方案中，將含有樣品的基片貯存1個(gè)月至30個(gè)月，2個(gè)月至30個(gè)月，3個(gè)月至30個(gè)月，4個(gè)月至 30個(gè)月，5個(gè)月至30個(gè)月，6個(gè)月至30個(gè)月，7個(gè)月至30個(gè)月，8個(gè)月至30個(gè)月，9個(gè)月至30個(gè)月， 10個(gè)月至30個(gè)月，12個(gè)月至30個(gè)月，14個(gè)月至30個(gè)月，16個(gè)月至30個(gè)月或18個(gè)月至30個(gè)月。 在一些實(shí)施方案中，將含有樣品的基片貯存1個(gè)月至24個(gè)月，2個(gè)月至24個(gè)月，3個(gè)月至24個(gè) 月，4個(gè)月至24個(gè)月，5個(gè)月至24個(gè)月，6個(gè)月至24個(gè)月，7個(gè)月至24個(gè)月，8個(gè)月至24個(gè)月，9個(gè) 月至24個(gè)月，10個(gè)月至24個(gè)月，12個(gè)月至24個(gè)月，14個(gè)月至24個(gè)月，16個(gè)月至24個(gè)月，18個(gè)月 至24個(gè)月。在一些實(shí)施方案中，將含有樣品的基片貯存1個(gè)月至22個(gè)月，2個(gè)月至22個(gè)月，3個(gè) 月至22個(gè)月，4個(gè)月至22個(gè)月，5個(gè)月至22個(gè)月，6個(gè)月至22個(gè)月，7個(gè)月至22個(gè)月，8個(gè)月至22 個(gè)月，9個(gè)月至22個(gè)月，10個(gè)月至22個(gè)月，12個(gè)月至22個(gè)月，14個(gè)月至22個(gè)月，16個(gè)月至22個(gè) 月，18個(gè)月至22個(gè)月。在一些實(shí)施方案中，將含有樣品的基片貯存1個(gè)月至20個(gè)月，2個(gè)月至 20個(gè)月，3個(gè)月至20個(gè)月，4個(gè)月至20個(gè)月，5個(gè)月至20個(gè)月，6個(gè)月至20個(gè)月，7個(gè)月至20個(gè)月， 8至20個(gè)月，9至20個(gè)月，10個(gè)月至20個(gè)月，12個(gè)月至20個(gè)月，14個(gè)月至20個(gè)月，16個(gè)月至20個(gè) 月，18個(gè)月至20個(gè)月。在一些實(shí)施方案中，將含有樣品的基片貯存1個(gè)月至18個(gè)月，2個(gè)月至 18個(gè)月，3個(gè)月至18個(gè)月，4個(gè)月至18個(gè)月，5個(gè)月至18個(gè)月，6個(gè)月至18個(gè)月，7個(gè)月至18個(gè)月， 8個(gè)月至18個(gè)月，9個(gè)月至18個(gè)月，10個(gè)月至18個(gè)月，12個(gè)月至18個(gè)月，14個(gè)月至18個(gè)月，16個(gè) 月至18個(gè)月或17個(gè)月至18個(gè)月。在一些實(shí)施方案中，將含有樣品的基片保藏1個(gè)月至12個(gè) 月，2個(gè)月至12個(gè)月，3個(gè)月至12個(gè)月，4個(gè)月至12個(gè)月，5個(gè)月至12個(gè)月，6個(gè)月至12個(gè)月，7個(gè) 月至12個(gè)月，8個(gè)月至12個(gè)月，9個(gè)月至12個(gè)月，10個(gè)月至12個(gè)月或11個(gè)月至12個(gè)月。
[0126] 在一些實(shí)施方案中，將含有樣品的基片貯存在約2°C，約3°C，約4°C，約5°C，約6°C， 約7°C，或約8°C。在一些實(shí)施方案中，將含有樣品的基片貯存在約2°C至約8°C，約3°C至約8 °C，約4°C至約8°C，約5°C至約8°C，約6°C至約8°C或約7°C至約8°C。在一些實(shí)施方案中，將含 有樣品的基片貯存在約-25°C，約-24°C，約-23°C，約-22°C，約-21°C，約-20°C，約-19°C，約-18°C，約_17°C，約_16°C或約_15°C。在一些實(shí)施方案中，將含有樣品的基片貯存在約_25°C 至約-15°C，約_22°C至約_17°C,約_20°C至約_15°C或約_25°C至約_20°C。在一些實(shí)施方案 中，將含有樣品的基片貯存在約_90°C，約_89°C，約_88°C，約_87°C，約_86°C，約_85°C，約_ 84°C，約_83°C，約-82°C，約_81°C，約_80°C，約_79°C，約_78°C，約_77°C，約_76°C，約_75°C， 約-74°C，約_73°C，約_72°C，約_71°C，約_70°C，約_69°C，約_68°C，約_67°C，約-66°C或約-65°C。在一些實(shí)施方案中，將含有樣品的基片貯存在約_90°C至約_65°C，約_85°C至約-65 °C，約_80°C至約_65°C，約_75°C至約_65°C或約_70°C至約_65°C。在一些實(shí)施方案中，將含 有樣品的基片貯存在-90 °C至-65 °C。
[0127] 在一些實(shí)施方案中，將含有樣品的基片凍融一次或多次(例如，在冷凍后，將含有 樣品的基片解凍，依照所述方法使用并再冷凍)和/或用于本方法。在一些實(shí)施方案中，將含 有樣品的基片凍融1，2,3,4,5,6,7,8,9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19,20次或更多次。 在一些實(shí)施方案中，將含有樣品的基片在本方法中使用1，2,3,4,5,6,7,8,9，10，11，12，13， 14,15,16,17,18,19,20次或更多次。在一些實(shí)施方案中，將含有樣品的基片凍融1至20次，2 至20次，3至20次，4至30次，5至20次，6至20次，7至20次，8至20次，9至20次，10至20次，11至 20次，12至20次，13至20次，14至20次，15至20次，16至20次，17至20次，18至20次，19至20次， 5至15次，5至10次，1至10次或1至5次。在一些實(shí)施方案中，將含有樣品的基片在本方法中使 用1至20次，2至20次，3至20次，4至30次，5至20次，6至20次，7至20次，8至20次，9至20次，10 至20次，11至20次，12至20次，13至20次，14至20次，15至20次，16至20次，17至20次，18至20 次，19至20次，5至15次，5至10次，1至10次，1至5次，1至4次，1至3次或1至2次。
[0128] 在一些實(shí)施方案中，將含有樣品的基片在室溫或約15°C至約30°C貯存1周。在一些 實(shí)施方案中，將樣品在約2°C至約8°C或約4°C貯存約1，2或3周。在一些實(shí)施方案中，將含有 樣品的基片在約_25°C至約_15°C或約_20°C貯存約1，2,3,4,5,6,7,8,9，10，11或12個(gè)月。在 一些實(shí)施方案中，將含有樣品的基片在約_90°C至約_65°C或約_80°C貯存約1，2,3,4,5,6， 7,8,9，10，11或12個(gè)月。
[0129] 有利地且令人驚訝地，發(fā)現(xiàn)從基片提取的減少的細(xì)胞數(shù)被從個(gè)別細(xì)胞的核酸的增 加的提取所抵消。在一些實(shí)施方案中，增加的提取通過(guò)相比于標(biāo)準(zhǔn)實(shí)踐將細(xì)胞溫育更長(zhǎng)的 時(shí)間，相比于標(biāo)準(zhǔn)實(shí)踐在升高的溫度溫育細(xì)胞，或兩者的組合來(lái)實(shí)現(xiàn)。
[0130] 在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞的增加的核酸提取通過(guò)相比于標(biāo)準(zhǔn)實(shí)踐將提取溫育進(jìn)行 增加的或更長(zhǎng)的時(shí)段來(lái)實(shí)現(xiàn)。在一些實(shí)施方案中，所述提取溫育進(jìn)行約45分鐘，例如45±5， 45± 10，45 ± 15，或45 ± 20分鐘。在一些實(shí)施方案中，所述提取溫育進(jìn)行約25分鐘至約65分 鐘，約30分鐘至約60分鐘，約35分鐘至約55分鐘，約45分鐘至約65分鐘，約45分鐘至約55分 鐘，或約40分鐘至約50分鐘。在一些實(shí)施方案中，所述提取溫育時(shí)間為約25分鐘，約30分鐘， 約35分鐘，約40分鐘，約45分鐘，約50分鐘，約55分鐘，約60分鐘或約65分鐘。
[0131] 在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞的增加的核酸提取通過(guò)相比于標(biāo)準(zhǔn)實(shí)踐將提取溫育在增 加的或更高的溫度進(jìn)行來(lái)實(shí)現(xiàn)。在一些實(shí)施方案中，所述提取溫育在約45°C，例如45±2°C， 45±5°C，或45±10°C進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，所述提取溫育溫度為約35°C至約55°C，約40 。(:至約50°C或約43°C至約47°C。在一些實(shí)施方案中，提取溫度為約43°C，約44°C，約45°C，約 46 °C，約47 °C，約48 °C，約49 °C，約50 °C，約51°C，約52 °C，約53 °C，約54 °C 或約55 °C。在一些實(shí) 施方案中，使用超過(guò)一種提取溫度。例如，在一些實(shí)施方案中，對(duì)于提取的一部分使用標(biāo)準(zhǔn) 溫度而對(duì)于提取的另一部分使用升高的溫度。
[0132] 在一些實(shí)施方案中，從基片釋放實(shí)質(zhì)上少數(shù)的細(xì)胞用于依照本系統(tǒng)和方法的后續(xù) 裂解。在一些實(shí)施方案中，在攪動(dòng)期間從基片釋放至少1個(gè)細(xì)胞，至少2個(gè)細(xì)胞，至少5個(gè)細(xì) 胞，至少10個(gè)細(xì)胞，至少15個(gè)細(xì)胞，至少20個(gè)細(xì)胞，至少50個(gè)細(xì)胞，至少75個(gè)細(xì)胞，至少100個(gè) 細(xì)胞，至少125個(gè)細(xì)胞，至少150個(gè)細(xì)胞，至少175個(gè)細(xì)胞，至少200個(gè)細(xì)胞，至少250個(gè)細(xì)胞，至 少300個(gè)細(xì)胞，至少350個(gè)細(xì)胞，至少400個(gè)細(xì)胞，至少450個(gè)細(xì)胞，至少500個(gè)細(xì)胞或更多。
[0133] 在一些實(shí)施方案中，使用所描述的方法從單個(gè)受試者采用(獲得)純度為約0.55至 2.00，約0.6至約2.00，約0.7至約2.00約0.8至約2.00，約0.9至約2.00，約1.0至約2.00約 1.1至約2.00，約1.2至約2.00，約1.3至約2.00，約1.4至約2.00，約1.5至約2.00約1.6至約 2.00約1.7至約2.00約1.8至約2.00或約1.9至約2.00的約Ing/yL至約50ng/yL，約Ing/yL至 約40ng/yL，約 Ing/yL 至約30ng/yL，約 Ing/yL 至約20ng/yL，約 Ing/yL 至約 lOng/yL，約 lng/μ L至約 5ng/yL，約 Ing/yL至約4ng/yL，約 Ing/yL 至約 3ng/yL 或約 Ing/yL 至約 2ng/yL的核酸。 在一些實(shí)施方案中，使用所描述的方法從單個(gè)受試者采用（獲得)純度為約0.55至2.00的 lng/yL 至 50ng/yL 核酸。
[0134] IV.裂解溶液
[0135] 已描述且本領(lǐng)域技術(shù)人員已知多種裂解溶液?？蓪⑦@些公知的裂解溶液的任意一 種用于所述方法以從樣品分離核酸。例示性裂解溶液包括那些商品化的，如由 INVITROGEN?:，QIAGEN?，l IFE TECHNOLOGIES? 和其他制造商銷(xiāo)售的那些， 以及可由實(shí)驗(yàn)室背景的技術(shù)人員生成的那些。裂解緩沖液也已經(jīng)得到完善描述，且可將多 種裂解緩沖液用于所公開(kāi)的方法中，包括例如在Molecular Cloning(three volume set, Cold Spring Harbor Laboratory Press，2012)和Current Protocols(Genetics and Genomics;Molecular Biology; 2003-2013)中描述的那些，兩者均通過(guò)提述并入本文用于 所有目的。
[0136] 細(xì)胞裂解是用于從細(xì)胞內(nèi)回收核酸的常見(jiàn)實(shí)踐方法。在許多情況中，使細(xì)胞與裂 解溶液，通常為包含去污劑的堿性溶液或裂解酶的溶液接觸。這類(lèi)裂解溶液通常含有鹽、去 污劑和緩沖劑，以及本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解去使用的其他試劑。在全部和/或部分裂解后， 從裂解溶液回收核酸。
[0137] 在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞重懸于水性緩沖液中，所述水性緩沖液具有范圍從約pH 4至約10,約5至約9,約6至約8或約7至約9的pH。
[0138] 在一些實(shí)施方案中，緩沖鹽濃度為約l〇mM至約200mM,約10mM至約100mM或約20mM 至約80mM。
[0139] 在一些實(shí)施方案中，緩沖液還包含螯合劑，如乙二胺四乙酸(EDTA)或乙二醇四乙 酸（EGTA)。
[0140] 在一些實(shí)施方案中，裂解溶液進(jìn)一步包含其他化合物以協(xié)助核酸從細(xì)胞釋放，如 多元醇，包括例如但不限于蔗糖，以及糖醇如麥芽糖醇、山梨糖醇、木糖醇、赤藻糖醇和/或 異麥芽（isomalt)。在一些實(shí)施方案中，多元醇在約2%至約15%w/w,或約5%至約15%w/w 或約5 %至約10 % w/w的范圍內(nèi)。
[0141] 在一些實(shí)施方案中，裂解溶液進(jìn)一步包含表面活性劑，如例如但不限于1^切11父-100，SDS，CTAB，X-114，CHAPS，D0C，和/或NP-40。在一些實(shí)施方案中，這類(lèi)表面活性劑在約 1%至約5%w/w,約1%至約4%w/w,或約1%至約3%w/w的范圍內(nèi)。
[0142] 在實(shí)施方案中，裂解溶液進(jìn)一步包含離液劑，如例如但不限于尿素、十二烷基硫酸 鈉和/或硫脲。在一些實(shí)施方案中，以范圍為約0.5M至8M，約1M至約6M，約2M至約6M或約1M至 3M的濃度使用離液劑。
[0143] 在一些實(shí)施方案中，裂解溶液進(jìn)一步包含一種或多種別的裂解試劑且這類(lèi)裂解試 劑是本領(lǐng)域公知的。在一些實(shí)施方案中，這類(lèi)裂解試劑包括細(xì)胞壁裂解酶，如例如但不限于 溶菌酶。在一些實(shí)施方案中，裂解試劑包括堿性去污劑溶液，如含有〇. 5 %十二烷基硫酸鈉 的0.1M氫氧化鈉水溶液（aqueous sodium hydroxide)。
[0144] 在一些實(shí)施方案中，裂解溶液進(jìn)一步包含水性糖溶液，如蔗糖溶液和螯合劑如 EDTA，例如STET緩沖液。在某些實(shí)施方案中，裂解試劑通過(guò)將細(xì)胞懸液和等體積的裂解溶液 混合來(lái)制備，所述裂解溶液具有期望濃度的兩倍(例如〇. 2M氫氧化鈉，1.0%十二烷基硫酸 鈉)。
[0145] 在一些實(shí)施方案中，在實(shí)現(xiàn)期望的裂解程度后，使包含裂解溶液和裂解細(xì)胞的混 合物與中和試劑或猝滅試劑接觸以調(diào)整條件，使得裂解試劑不會(huì)對(duì)期望產(chǎn)物有不利影響。 在一些實(shí)施方案中，將pH調(diào)整至約5至約9，約6至約8，約5至約7，約6至約7或約6.5至7.5的 pH以最小化和/或防止細(xì)胞內(nèi)含物(包括例如但不限于核酸）的降解。在一些實(shí)施方案中，當(dāng) 裂解試劑包含堿性溶液時(shí)，中和試劑包含酸性緩沖劑，例如堿金屬乙酸鹽/乙酸緩沖劑。在 一些實(shí)施方案中，選擇裂解條件，如溫度和裂解試劑的組成，使得基本完成裂解，同時(shí)最小 化期望產(chǎn)物(包括例如但不限于核酸)的降解。
[0146] 在一些實(shí)施方案中，將第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或20種裂解溶 液用于所述方法。在一些實(shí)施方案中，使用的裂解緩沖液的體積是約l〇yL，約20yL，約30yL， 約40yL，約50yL，約60yL，約70yL，約80yL，約90yL，約100yL，約120yL，約130yL，約140yL，約 150yL，160yL，約170yL，約180yL，約190yL，約200yL，約220yL，約230yL，約240yL，約250yL， 約260yL，約270yL，約280yL，約290yL，約300yL，約320yL，約330yL，約340yL，約350yL，約360 yL，約370yL，約380yL，約390yL，約400yL，約450yL，約500yL，約550yL，約600yL，約650yL，約 700yL，約 750yL，約 800yL，約 850yL，900yL，950yL，1000yL，1500yL 或 2000yL。在一些實(shí)施方 案中，裂解緩沖液在約10yL和約1000yL，約10yL和約800yL，約10yL和約600yL，約10yL和約 400yL，約20yL 和約 400yL，約 50yL 和約 300yL，約 50yL 和約200yL，約 50yL 和約400yL，約 100yL 和約400yL，約1 OyL和約300yL或約1 OOyL和約200yL之間。
[0147] 上述內(nèi)容的任意組合均可由技術(shù)人員采用以及與其他已知且常規(guī)的方法組合，且 這類(lèi)組合涵蓋在本發(fā)明中。
[0148] V.從裂解緩沖液純化核酸
[0149] 在一些實(shí)施方案中，在實(shí)施后續(xù)分析之前從裂解緩沖液分離核酸，包括例如但不 限于基因組DNA。在一些實(shí)施方案中，在實(shí)施另外的分析，如例如但不限于實(shí)時(shí)PCR分析之前 從裂解緩沖液分離核酸。所公開(kāi)方法的多個(gè)實(shí)施方案使用可用于分離少量核酸的多種方法 中的任意方法。這些包括但不限于，沉淀、凝膠過(guò)濾、密度梯度和固相結(jié)合。這類(lèi)方法也記載 于例如Molecular Cloning(三卷集，Cold Spring Harbor Laboratory Press,2012)和 Current Protocols(Genetics and Genomics;Molecular Biology;2003-2013)，通過(guò)提述 并入本文用于所有目的。
[0150] 核酸沉淀是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的用于分離的公知方法。多種固相結(jié)合方法也是 本領(lǐng)域已知的，包括但不限于使用珠子(例如二氧化硅、磁性）、柱、膜的形式或本領(lǐng)域已知 的多種其他物理形式之任一的固相的固相結(jié)合方法。在一些實(shí)施方案中，用于所公開(kāi)方法 的固相可逆地結(jié)合核酸。這類(lèi)固相的例子包括所謂的"混合床(mixed-bed)"固相，其為至少 兩種不同固相的混合物，每種具有在不同溶液條件下結(jié)合核酸的容量，和在不同條件下釋 放核酸的能力和/或容量;如在美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)No. 2002/0001812中描述的那些，其通過(guò)提述 完整并入本文用于所有目的。根據(jù)所公開(kāi)方法的對(duì)核酸的固相親和力可經(jīng)由通常用于將溶 質(zhì)結(jié)合于基質(zhì)的多種手段中的任一種。這類(lèi)手段的例子包括但不限于，離子相互作用(例如 陰離子交換層析)和疏水相互作用（例如反向?qū)游觯?、pH差異和變化、鹽差異和變化(例如濃 度變化，使用離液鹽/劑）。例示性的基于P Η的固相包括但不限于在IN VI T R 0 G E N ChargeSwitch Normalized Buccal Kit磁珠中使用的那些，其在低ρΗ(〈6·5)結(jié)合核酸并在 高ρΗ(>8.5)釋放核酸，和單氨基-Ν-氨基乙基(ΜΑΝΑΕ)，其在低于7.5的pH結(jié)合核酸并在大于 8的pH釋放核酸。例示性的基于離子交換的基質(zhì)包括但不限于，來(lái)自PHARMACIA (Piscataway，N · J ·)的DEA-SEPHAR0SE?，Q-SEPHAR0SE?，和DEAE-SEPHADEX?，來(lái)自 Dow Chemical公司（Midland，Mich ·)的 DOWEX㊣ I，來(lái)自 R〇hm&Haas(Philadelphia，Pa ·)的 AMBERLITE?，來(lái)自 Duolite International，In · (Cleveland，Ohio)的 DUQLITE⑩， DIAL0N TI和DIAL0N Til。
[0151] 涵蓋任何單個(gè)方法單獨(dú)或與其他方法組合使用，且這類(lèi)可用組合是公知的并被本 領(lǐng)域技術(shù)人員所領(lǐng)會(huì)的。
[0152] VI.核酸分析
[0153]所公開(kāi)的方法用于分離核酸，如基因組DNA(gDNA)，以用于多種核酸分析，包括基 因組分析。在一些實(shí)施方案中，這類(lèi)分析包括多種遺傳突變的檢測(cè)，其包括但不限于一個(gè)或 多個(gè)缺失、插入、轉(zhuǎn)換和顛換。在一些實(shí)施方案中，突變是單核苷酸多態(tài)性(SNP)。
[0154]用于分析這類(lèi)分離的核酸，例如但不限于基因組DNA(gDNA)的多種方法是本領(lǐng)域 已知的，且包括PCR方法，如實(shí)時(shí)PCR分析、微陣列分析、雜交分析和核酸序列分析，以及分析 核酸組成且本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種其他方法。參見(jiàn)例如，Molecular Cloning(三卷集， Cold Spring Harbor Laboratory Press，2012)和Current Protocols(Genetics and Genomics；Molecular Biology；2003-2013)〇
[0155] a.實(shí)時(shí) PCR
[0156] 為了設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)PCR測(cè)定法，將幾個(gè)部分協(xié)調(diào)起來(lái)，包括被兩個(gè)引物側(cè)接且隨后擴(kuò)增 的DNA片段(經(jīng)常稱(chēng)為擴(kuò)增子）、兩個(gè)引物和要使用的檢測(cè)探針(一種或多種）。
[0157] 實(shí)時(shí)PCR依賴(lài)于與短多核苷酸(稱(chēng)為"檢測(cè)探針"）綴合的熒光染料的視覺(jué)發(fā)射，所 述短多核苷酸以序列特異性方式與基因組等位基因聯(lián)合。相差單個(gè)核苷酸的實(shí)時(shí)PCR探針 可在實(shí)時(shí)PCR測(cè)定法中區(qū)分，其通過(guò)以不同波長(zhǎng)發(fā)熒光的探針的綴合和檢測(cè)。實(shí)時(shí)PCR適用 于檢測(cè)應(yīng)用(診斷應(yīng)用）、定量應(yīng)用和基因型分型應(yīng)用。
[0158] 用于實(shí)施實(shí)時(shí)PCR的幾種相關(guān)方法在本領(lǐng)域中披露，包括依賴(lài)于以下的測(cè)定法： 丁八(^4八\嗯探針（美國(guó)專(zhuān)利化8.5,210,015和5,487,972，和1^6等，_(：16化八(^(18 Res .21:3761-6,1993)、分子信標(biāo)探針（美國(guó)專(zhuān)利Nos .5,925,517和6,103,476,和Tyagi和 Kramer，Nat ·Biotechno 1 · 14: 303-8，1996)、自探測(cè)擴(kuò)增子（scorpions)(美國(guó)專(zhuān)利No · 6， 326，145，和Whitcombe等，Nat · Biotechno 1.17:804-7,1999)、Amp 1 i sensor (Chen等， Appl · Environ .Microbiol .64:4210-6,1998)、Ampl if luor (美國(guó)專(zhuān)利No .6,117,635,和 Nazarenko等，Nucleic Acids Res.25:2516-21,1997、置換雜交探針（Li等，Nucleic Acids Res · 30 :E5，2002)，DzyNA-PCR(Todd等，Clin. Chem.46 :625-30,2000)、熒光限制酶檢測(cè) (Cairns等，Biochem.Biophys · Res · Commun · 318:684-90，2004)和鄰近雜交探針（美國(guó)專(zhuān)利 No·6，174，670和Wittwer等，Biotechniques 22:130-1，134-8，1997)〇
[0159] 在一些情況中，實(shí)時(shí)PCR可實(shí)現(xiàn)對(duì)多種基因突變(包括例如但不限于SNP)的檢測(cè)。 在一些實(shí)施方案中，使用實(shí)時(shí)PCR進(jìn)行對(duì)特定基因候選物中SNP的檢測(cè)，其基于通過(guò)使用拴 系的猝滅模塊對(duì)熒光分子的分子內(nèi)猝滅的用途。因此，根據(jù)例示性實(shí)施方案，實(shí)時(shí)PCR方法 還包括使用分子信標(biāo)技術(shù)。分子信標(biāo)技術(shù)利用具有內(nèi)部猝滅的焚光團(tuán)的發(fā)夾形分子，其焚 光通過(guò)結(jié)合感興趣的DNA革E物恢復(fù)（參見(jiàn)例如，Kramer，R.等Nat · Biotechno 1 · 14:303-308， 1996)。在一些實(shí)施方案中，利用分子信標(biāo)探針對(duì)積累的PCR產(chǎn)物的增加的結(jié)合來(lái)特異性檢 測(cè)基因組DNA中存在的SNP。
[0160] 許多適宜的基因型分型規(guī)程之一是TAQMAN?等位區(qū)分測(cè)定法。在該測(cè)定法的 一些情況中，利用在探針的5'端用熒光報(bào)道物染料標(biāo)記且在探針的3'端用猝滅劑染料標(biāo)記 的寡核苷酸探針。猝滅劑對(duì)完整探針的接近性保持報(bào)道物的較小熒光。在PCR反應(yīng)期間，DNA 聚合酶的5'核酸酶活性切割探針，并分離染料與猝滅劑。這導(dǎo)致報(bào)道物的熒光增加。通過(guò)監(jiān) 測(cè)報(bào)道物染料的熒光增加來(lái)直接檢測(cè)PCR產(chǎn)物的積累。僅當(dāng)探針與靶物雜交并在PCR期間擴(kuò) 增時(shí)，DNA聚合酶的5'核酸酶活性在報(bào)道物和猝滅劑之間切割探針。探針設(shè)計(jì)為跨過(guò)目標(biāo) SNP位置，并僅當(dāng)存在特定SNP等位基因時(shí)與核酸分子雜交。
[0161]舉例而言，為了擴(kuò)增位于TGFW基因外顯子4中的與阿維利諾角膜營(yíng)養(yǎng)不良有關(guān)的 SNP，構(gòu)建正向和反向PCR引物對(duì)（圖2中的SEQ ID N0s:l至24)，如美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)文本 No.2012/0077200中描述的。在一些實(shí)施方案中，將其中披露的正向和反向引物對(duì)之任一種 用于本文公開(kāi)的改進(jìn)方法中。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，將SEQ ID N0:1(正向）和SEQ ID NO: 2 (反向）的正向和反向引物對(duì)用于本文提供的改進(jìn)方法中。
[0162] 為了檢測(cè)TGFW基因外顯子4的鳥(niǎo)嘌呤到腺嘌呤突變，如美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)文本2012/ 0077200中描述的，構(gòu)建了熒光標(biāo)記的實(shí)時(shí)PCR探針對(duì)，用于檢測(cè)野生型（"G"）和阿維利諾角 膜營(yíng)養(yǎng)不良有關(guān)的突變體（"A"）等位基因，其具有根據(jù)如圖3中顯示的SEQ ID NOs: 25至42 的核苷酸序列。在一些實(shí)施方案中，將任意的野生型和突變體探針用于本文公開(kāi)的改進(jìn)方 法中。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，將SEQ ID N0:25(野生型）和SEQ ID N0:26(突變體）的野 生型和突變體探針對(duì)用于本文提供的改進(jìn)方法中。為了將野生型等位基因與疾病相關(guān)的等 位基因區(qū)分，將野生型探針用VIC標(biāo)記，突變體探針用FAM標(biāo)記。小溝結(jié)合劑(MGB)附接于探 針以促進(jìn)對(duì)互補(bǔ)基因片段的結(jié)合。
[0163] b.實(shí)時(shí)PCR循環(huán)
[0164] 實(shí)時(shí)PCR方法包括多個(gè)步驟或循環(huán)作為擴(kuò)增方法的一部分。這些循環(huán)包括將雙鏈 核酸變性、將正向引物、反向引物和檢測(cè)探針與靶基因組DNA序列退火，和從退火的正向引 物和反向引物合成（即復(fù)制)第二鏈DNA。這種三步驟過(guò)程在本文稱(chēng)為循環(huán)。
[0165] 在一些實(shí)施方案中，采用約10，15,20,25,30,35,40,45,50,55,或60個(gè)循環(huán)。在一 些實(shí)施方案中，采用約10至約60個(gè)循環(huán)，約20至約50或約30至約40個(gè)循環(huán)。在一些實(shí)施方案 中，采用40個(gè)循環(huán)。
[0166] 在一些實(shí)施方案中，將雙鏈核酸變性的步驟在約80°C至100°C，約85°C至約99°C， 約90 °C至約95°C的溫度進(jìn)行約1秒至約5秒，約2秒至約5秒，或約3秒至約4秒。在一些實(shí)施方 案中，將雙鏈核酸變性的步驟在95 °C的溫度進(jìn)行約3秒。
[0167] 在一些實(shí)施方案中，將正向引物、反向引物和檢測(cè)探針與靶基因組DNA序列退火的 步驟在約40°C至約80°C，約50°C至約70°C，約55°C至約65°C進(jìn)行約15秒至約45秒，約20秒至 約40秒，約25秒至約35秒。在一些實(shí)施方案中，將正向引物、反向引物和檢測(cè)探針與靶基因 組DNA序列退火的步驟在約60 °C進(jìn)行約30秒。
[0168] 在一些實(shí)施方案中，從退火的正向引物和反向引物合成（即復(fù)制）第二鏈DNA在約 40°C至約80°C，約50°C至約70°C，約55°C至約65°C進(jìn)行約15秒至約45秒，約20秒至約40秒， 約25秒至約35秒。在一些實(shí)施方案中，將正向引物、反向引物和檢測(cè)探針與靶基因組DNA序 列退火的步驟在約60 °C進(jìn)行約30秒。
[0169] 在一些實(shí)施方案中，發(fā)現(xiàn)根據(jù)本文描述的方法制備的約lyL，約2yL，約3yL，約4yL 或約5yL的基因組DNA樣品與僅約0.05yL，約0.10yL約0.15yL，約0.20yL，約0.25yL或約0.25 yL的30X，35X，40X，45X，50X或100X實(shí)時(shí)PCR測(cè)定混合物及蒸餾水組合以形成PCR主混合物。 在一些實(shí)施方案中，所述PCR主混合物具有約5yL，約6yL，約7yL，約8yL，約9yL，約OyL，約11μ L，約12yL，約13yL，約14yL，約15yL，約16yL，約17yL，約18yL，約19yL或約20yL或更高的終體 積。在一些實(shí)施方案中，發(fā)現(xiàn)如上文描述制備的2yL基因組DNA樣品與僅約0.15yL的40X實(shí)時(shí) PCR測(cè)定混合物和2.85yL蒸餾水組合以形成PCR主混合物。
[0170] 盡管本文描述了例示性反應(yīng)，但技術(shù)人員理解如何基于探針設(shè)計(jì)改變溫度和時(shí) 間。而且，所述方法涵蓋上述時(shí)間和溫度的任何組合。
[0171] c.PCR引物和引物設(shè)計(jì)
[0172] 在一些實(shí)施方案中，在實(shí)驗(yàn)室設(shè)置下測(cè)試和設(shè)計(jì)引物。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)基 于計(jì)算機(jī)的計(jì)算機(jī)方法(in silico method)來(lái)設(shè)計(jì)引物。引物序列基于要擴(kuò)增的擴(kuò)增子或 靶核酸序列的序列。較短的擴(kuò)增子通常比更長(zhǎng)的擴(kuò)增子更有效復(fù)制且實(shí)現(xiàn)更有效的擴(kuò)增。
[0173] 在設(shè)計(jì)引物時(shí)，技術(shù)人員會(huì)理解需要考慮熔解溫度(Tm;-半的引物-靶物雙鏈體 解離且變成單鏈的溫度，其是雙鏈體穩(wěn)定性的指示；增加的T m指示增加的穩(wěn)定性），其基于 所設(shè)計(jì)的引物的GC和AT含量，以及二級(jí)結(jié)構(gòu)考慮(增加的GC含量可導(dǎo)致增加的二級(jí)結(jié)構(gòu)）。 可使用本領(lǐng)域已知的多種方法計(jì)算Tm且技術(shù)人員會(huì)容易地理解用于計(jì)算T M的這類(lèi)多種方 法；此類(lèi)方法包括例如但不限于那些可獲的在線工具，如可在萬(wàn)維網(wǎng)上promega.com/ techserv/tools/biomath/calcll .htm處得到的Tm計(jì)算器。引物特異性由其完整序列與3' 端序列(其為被Taq聚合酶延伸的部分)的組合限定。在一些實(shí)施方案中，3'端應(yīng)具有未在革巴 序列中任何他處發(fā)現(xiàn)的至少5至7個(gè)獨(dú)特的核苷酸，以幫助減少錯(cuò)誤引發(fā)和創(chuàng)造不正確的擴(kuò) 增產(chǎn)物。正向和反向引物通常以相似的效率結(jié)合靶物。在一些情況下，采用工具如NCBI BLAST(位于萬(wàn)維網(wǎng)上ncbi . nlm. nih. gov處)來(lái)實(shí)施比對(duì)和輔助引物設(shè)計(jì)。
[0174] 本領(lǐng)域技術(shù)人員公知針對(duì)靶核酸序列的引物設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)，且許多參考手冊(cè)和教科 書(shū)關(guān)于這類(lèi)方法具有詳細(xì)的教導(dǎo)，包括例如，Molecular Cloning(three volume set,Cold Spring Harbor Laboratory Press，2012)和Current Protocols(Genetics and Genomics;Molecular Biology;2003_2013)和Real-time PCR in Microbiology:From Diagnostics to Characterization(Ian M.MacKay,Calster Academic Press;2007);可 在萬(wàn)維網(wǎng)上primerdigital · com/tools/PrimerAnalyser · html處得至lj的PrimerAnalyser java工具，和Kalendar R,等(Genomics,98(2) :137-144(2011)),其所有完整并入本文用于 所有目的。
[0175] 引物設(shè)計(jì)的另一個(gè)方面是引物復(fù)雜性或語(yǔ)言序列復(fù)雜性（參見(jiàn)，Kalendar R，等 (Gen〇miCS，98(2): 137-144(2011))。具有更大語(yǔ)言序列復(fù)雜性(例如核苷酸排列和組成）的 引物通常更有效。在一些實(shí)施方案中，使用語(yǔ)言序列復(fù)雜性計(jì)算方法來(lái)尋找比較的序列之 間的保守區(qū)，以用于檢測(cè)低復(fù)雜性區(qū)域，包括簡(jiǎn)單序列重復(fù)、不完美的直接或倒置重復(fù)、多 嘌呤和多嘧啶三鏈cDNA結(jié)構(gòu)和四鏈結(jié)構(gòu)（如G-四鏈體）。在一些實(shí)施方案中，沿全序列長(zhǎng)度 使用字母表-能力（&]^11&&61：-〇&口&(3；^7)]^-8^1]1方法實(shí)施語(yǔ)言復(fù)雜性（]^〇測(cè)量（參見(jiàn) A·Gabrielian，A.Bolshoy，Computer&Chemistry 23:263-274(1999)和Y.L.Orlov, V.N.Potapov, Complexity :an internet resource for analysis of DNA sequence complexity，Nucleic Acids Res · 32 :W628_W633(2004))，并計(jì)算為序列中觀察范圍（xi)從 1至L大小字的總和除以該序列長(zhǎng)度的預(yù)期(E)值的總和。一些富含G(和富含C)的核酸序列 折疊成四鏈DNA結(jié)構(gòu)，其含有G-四重體的堆積(參見(jiàn)萬(wàn)維網(wǎng)上quadruplex. org處）。一些情況 中，這些四鏈體通過(guò)兩個(gè)或四個(gè)DNA分子的分子內(nèi)聯(lián)合，含有兩個(gè)G堿基的序列的二聚化，或 通過(guò)含有4個(gè)鳥(niǎo)嘌呤塊的單鏈的分子內(nèi)折疊形成(參見(jiàn)P. S. Ho，PNAS，91:9549-9553(1994); I·Α·II'icheva，V.L.Florent'ev,Russian Journal of Molecular Biology26:512-531 (1992)；D.Sen,ff.Gilbert,Methods Enzymol.211:191-199(1992)；P.A.Rachwal,K.R.Fox, Methods 43:291-301(2007)；S.Burge,G.N.Parkinson,P.Hazel,A.K.Todd,K.Neidle, Nucleic Acids Res.34:5402-5415(2006)；A.Guedin,J.Gros,P.Alberti,J.Mergny, Nucleic Acids Res.38:7858-7868(2010)；0.Stegle,L.Payet,J.L.Mergny,D.J.MacKay, J.H.Leon,Bioinformatics 25: i374-i382(2009);在一些情況中，由于其低語(yǔ)言復(fù)雜性(對(duì) 于(TTAGGG) 4為L(zhǎng)C = 32 % )，將這些從引物設(shè)計(jì)除去。
[0176] 這些方法包括多種生物信息學(xué)工具用于在具有GC偏倚(skew)，（G_C)/(G+C)，AT偏 倚，（A-T)/(A+T)，CG-AT偏倚，（S-W)/(S+W)、或嘌呤-嘧啶(R-Y)/(R+Y)偏倚的序列中關(guān)于GC 含量和熔解溫度的模式分析，并提供用于測(cè)定語(yǔ)言序列復(fù)雜性概況的工具。例如，在η(其中 η是正整數(shù))的滑窗中的GC偏倚，堿基用一個(gè)堿基一步計(jì)算，根據(jù)公式(G-C)/(G+C)，其中對(duì) 于窗口中的所有序列G是鳥(niǎo)嘌呤的總數(shù)且C是胞嘧啶的總數(shù)(Y. Beni ta，等，Nuc 1 ei c Acids Res. 31: e99 (2003))。正GC-偏倚值指示G堿基過(guò)多，而負(fù)GC-偏倚值代表C堿基過(guò)多。類(lèi)似地， 在序列中計(jì)算其他偏倚。在一些實(shí)施方案中，采用這類(lèi)方法以及其他方法來(lái)確定引物復(fù)雜 性。
[0177] 根據(jù)非限制性實(shí)施方案例子，使用外切核酸酶引物實(shí)施實(shí)時(shí)PCR(TAQMAN?探 針）。在這類(lèi)實(shí)施方案中，引物利用熱穩(wěn)定性聚合酶如Taq的5'外切核酸酶活性來(lái)切割擴(kuò)增 反應(yīng)中存在的雙重標(biāo)記的探針（參見(jiàn)例如，Wittwer，C.等Biotechniques 22 : 130-138， 1997)。盡管與PCR產(chǎn)物互補(bǔ)，該測(cè)定中使用的引物探針不同于PCR引物且用能發(fā)熒光的分子 和能猝滅熒光的分子雙重標(biāo)記。當(dāng)探針完整時(shí)，DNA探針內(nèi)的熒光信號(hào)的分子內(nèi)猝滅導(dǎo)致極 小信號(hào)。當(dāng)熒光分子被擴(kuò)增期間Taq的外切核酸酶活性釋放時(shí)，猝滅極大降低，導(dǎo)致增加的 熒光信號(hào)。熒光探針的非限制性例子包括6-羧基-熒光素模塊等。例示性猝滅劑包括Black Hole Quencher 1 模塊等。
[0178] 多種PCR引物可以適用于所公開(kāi)的方法。例示性引物包括但不限于本文中描述的 那些。用于所公開(kāi)方法的引物亦見(jiàn)于美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)文本No. 20120077200,其通過(guò)提述并入 本文用于所有目的。在一些實(shí)施方案中，用于本公開(kāi)方法的PCR引物包括但不限于表1中列 出的以下內(nèi)容，且適用于檢測(cè)TGFW基因。表2和3提供每種引物的生物物理參數(shù)，如使用萬(wàn) 維網(wǎng)上primerdigital · com/tools/PrimerAnalyser.html處計(jì)算的。
[0179] 表1:用于TGFW基因的例示性引物
[0182]
[0183] 表2:用于正向引物的生物物理參數(shù)
[0184]
[0185]
[0186] 表3:反向引物的生物物理參數(shù)
[0188]
[0189] 在一些實(shí)施方案中，用于所公開(kāi)方法的實(shí)時(shí)PCR引物具有至少70%，至少72%，至 少75 %，至少77 %，至少80 %，至少82 %，至少85 %，至少88 %，至少90 %，至少92 %，至少 95%，至少97%或至少99%的語(yǔ)言序列復(fù)雜性。
[0190] d.檢測(cè)探針設(shè)計(jì)和檢測(cè)探針
[0191] 多種檢測(cè)探針可以適用于所公開(kāi)的方法并用于基因型分型和/或定量。本領(lǐng)域技 術(shù)人員通常采用的檢測(cè)探針包括但不限于，水解探針(也稱(chēng)為T(mén)AQMAN?探針、5'核酸酶 探針或雙標(biāo)記探針），雜交探針，和Scorpion引物(其在一個(gè)分子中組合引物和檢測(cè)探針）。 在一些實(shí)施方案中，本領(lǐng)域技術(shù)人員基于期望的探針靶物決定檢測(cè)探針設(shè)計(jì)，使得探針與 采用的PCR引物相容(例如，引物和探針不應(yīng)在實(shí)時(shí)PCR測(cè)定中干擾彼此的功能）。在一些實(shí) 施方案中，探針設(shè)計(jì)為具有比引物更高的Tm，以促進(jìn)有效的信號(hào)產(chǎn)生。使用本領(lǐng)域已知的多 種方法的任一種來(lái)計(jì)算!》且技術(shù)人員會(huì)容易地理解用于計(jì)算Tm的多種這類(lèi)方法;這類(lèi)方法 包括例如在線可獲的那些工具，如可在萬(wàn)維網(wǎng)上promega · com/techserv/tools/biomath/ calcll.htm處獲得的計(jì)算器。在一些實(shí)施方案中，檢測(cè)探針的增加的Tm提供了在引物被聚 合酶延伸前檢測(cè)探針已結(jié)合。
[0192] 在一些實(shí)施方案中，檢測(cè)探針含有多種修飾。在一些實(shí)施方案中，檢測(cè)探針包括經(jīng) 修飾的核酸殘基，如但不限于2'-0_甲基核糖核苷酸修飾、硫代磷酸酯主鏈修飾、二硫代磷 酸酯主鏈修飾、氨基磷酸酯（p h 〇 s p h 〇 r a m i d a t e )主鏈修飾、甲基膦酸酯 (methy lphosphonate)主鏈修飾、3 '末端磷酸根修飾和/或3 '經(jīng)基取代。
[0193] 在一些實(shí)施方案中，所述檢測(cè)探針由于修飾對(duì)于靶序列具有增加的親和力。這類(lèi) 檢測(cè)探針包括具有增加的長(zhǎng)度的檢測(cè)探針，以及含有化學(xué)修飾的檢測(cè)探針。這類(lèi)修飾包括 但不限于2 ' -氟(2 ' -脫氧-2 ' -氟-核苷)修飾、LNA(鎖核酸）、PNA(肽核酸）、ZNA(zip核酸）、嗎 啉代、膦酸甲酯、氨基磷酸酯、聚陽(yáng)離子綴合物和2'-芘(pyrene)修飾。在一些實(shí)施方案中， 檢測(cè)探針含有一種或多種修飾，包括2 '氟修飾(又稱(chēng)為，2 脫氧-2 氟-核苷）、LNA(鎖核 酸）、PNA(肽核酸）、ZNA(zip核酸）、嗎啉代、膦酸甲酯、氨基磷酸酯、和/或聚陽(yáng)離子綴合物。
[0194] 在一些實(shí)施方案中，所述檢測(cè)探針含有可檢測(cè)的模塊，如本文中描述的那些，以及 本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何可檢測(cè)模塊。這類(lèi)可檢測(cè)模塊包括例如但不限于熒光標(biāo)記物和 化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物。這類(lèi)可檢測(cè)模塊的例子還包括FRET對(duì)的成員。在一些實(shí)施方案中，所述檢 測(cè)探針含有可檢測(cè)實(shí)體。
[0195] 熒光標(biāo)記物的例子包括但不限于AMCA，DEAC(7-二乙基氨基香豆素-3-羧酸）；7_羥 基-4-甲基香豆素-3; 7-羥基香豆素-3 ;MCA(7-甲氧基香豆素-4-乙酸）；7-甲氧基香豆素-3; AMF(4'_(氨基甲基）熒光素）；5-DTAF(5-(4,6-二氯三嗪基）氨基熒光素）；6-DTAF(6-(4,6-二氯三嗪基）氨基熒光素）；6-FAM(6-羧基熒光素；又稱(chēng)為FAM;包括TAQMAN?FAM?); TAQMAN VIC?; 5 (6) -FAM尸胺；5-FAM尸胺；5 (6) -FAM乙二胺；5-FAM乙二胺；5-FITC (FITC 異 構(gòu)體I;熒光素-5-異硫氰酸酯）；5-FITC尸胺;熒光素-5-馬來(lái)酰亞胺;5-IAF(5-碘乙酰氨基 熒光素）；6-J0E (6-羧基-4 '，5 ' -二氯-2 '，7 ' -二甲氧基熒光素）；5-CR1 10( 5-羧基羅丹明 110) ;6-CRl 10(6-羧基羅丹明 110) ;5-CR6G(5-羧基羅丹明6G) ;6-CR6G(6-羧基羅丹明6G); 5(6)-駿基羅丹明6G尸胺（5(6)-Caroxyrhodamin 6G cadaverine); 5(6)-駿基羅丹明6G乙 二胺；5-R0X( 5-羧基-X-羅丹明）；6-R0X(6-羧基-X-羅丹明）；5-TAMRA( 5-羧基四甲基羅丹 明）；6-TAMRA(6-羧基四甲基羅丹明）；5-TAMRA尸胺;6-TAMRA尸胺;5-TAMRA乙二胺;6-TAMRA 乙二胺；5-TMR C6馬來(lái)酰亞胺;6-TMR C6馬來(lái)酰亞胺;TR C2馬來(lái)酰亞胺;TR尸胺;5-TRITC;G 異構(gòu)體（四甲基羅丹明-5-異硫氰酸）；6-TRITC;R異構(gòu)體（四甲基羅丹明-6-異硫氰酸酯）；丹 酰尸胺（5-二甲基氨基萘-1-(Ν-(5-氨基戊基））磺酰胺）；EDANS C2馬來(lái)酰亞胺；熒光胺； NBD;和吡略甲川（pyrromethene)及其衍生物。
[0196] 化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物的例子包括但不限于用于Southern印跡和Western印跡方案的那 些標(biāo)記物（參見(jiàn)例如Sambrook和Russell,Molecular Cloning:A Laboratory Manual, (3rd ed. )(2001);通過(guò)提述完整并入本文）。例子包括但不限于_(2'_螺旋金剛烷)-4-甲氧基ΙΟ"-磷?；? 苯基-1 ， 2-二氧雜環(huán)丁燒 (dioxetane) (AMPPD); B 丫啶酯和金剛烷基-穩(wěn)定化 的1，2-二氧雜環(huán)丁烷，及其衍生物。
[0197] 探針的標(biāo)記是本領(lǐng)域已知的。使用經(jīng)標(biāo)記的探針以在擴(kuò)增期間在經(jīng)擴(kuò)增區(qū)域內(nèi)雜 交。修飾探針以避免其充當(dāng)用于擴(kuò)增的引物。檢測(cè)探針用兩種熒光染料標(biāo)記，一種能將另一 種染料的熒光猝滅。一種染料附接于探針的5'末端而另一種附接于內(nèi)部位點(diǎn)，從而使得當(dāng) 探針處于非雜交狀態(tài)時(shí)發(fā)生猝滅。
[0198] 實(shí)時(shí)PCR探針通常由涉及熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)的一對(duì)染料(報(bào)導(dǎo)染料和接受 者染料)組成，其中接受者染料猝滅報(bào)導(dǎo)染料的發(fā)射。一般地，用熒光標(biāo)記的探針增加擴(kuò)增 子定量的特異性。
[0199] 在所公開(kāi)方法的在一些實(shí)施方案中使用的實(shí)時(shí)PCR還包括使用一種或多種雜交探 針（即檢測(cè)探針），如由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本公開(kāi)確定的。作為非限制性的例子，這類(lèi)雜交 探針包括但不限于所描述方法中提供的那些探針的一種或多種。例示性探針，如HEX通道 和/或FAM通道探針，是本領(lǐng)域技術(shù)人員了解的。
[0200] 根據(jù)示例實(shí)施方案，便利地選擇檢測(cè)探針和引物，例如使用利用引物設(shè)計(jì)軟件的 計(jì)算機(jī)分析和對(duì)存儲(chǔ)在國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)的基因和基因組的可獲核苷酸數(shù)據(jù) 庫(kù)進(jìn)行交叉參照。在一些實(shí)施方案中，可以使用一些另外的指導(dǎo)來(lái)選擇引物和/或探針。例 如，在一些實(shí)施方案中，選擇引物和探針使得其彼此靠近，但不重疊。在一些實(shí)施方案中，弓丨 物可具有相同（或接近的Tm)(例如在約58°C和約60°C之間）。在一些實(shí)施方案中，探針的Tm比 對(duì)引物的T M選擇的TM高約10°C。在一些實(shí)施方案中，選擇探針和引物的長(zhǎng)度為約17至39個(gè)堿 基對(duì)等。在一些情況中本領(lǐng)域技術(shù)人員使用這些和其他指導(dǎo)來(lái)選擇適宜的引物和/或探針。
[0201]用于本發(fā)明方法的探針包括但不限于表4中所列的以下例示性探針。
[0202] 表4:TGFW基因的例示性探針
[0203]
[0205]
[0206] VIL·診斷測(cè)試
[0207] 在一些實(shí)施方案中，采用診斷測(cè)試通過(guò)檢測(cè)多種突變中的任一種來(lái)確定一種或多 種遺傳條件。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)基于例如身體表現(xiàn)、跡象和/或癥狀以及家族史信息懷 疑特定疾患時(shí)，使用診斷測(cè)試來(lái)確認(rèn)診斷。在一些實(shí)施方案中，診斷測(cè)試的結(jié)果有助于醫(yī)學(xué) 領(lǐng)域的那些技術(shù)人員確定對(duì)于給定患者的適宜治療方案并允許更個(gè)體化和更有效的治療 方案。在一些實(shí)施方案中，治療方案包括多種藥物治療、手術(shù)治療、生活方式改變或其組合 的任一種，如由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定的。
[0208] 通過(guò)所公開(kāi)方法獲得的核酸可用于多種診斷測(cè)試，包括用于檢測(cè)突變?nèi)缛笔?、?入、顛換和轉(zhuǎn)換的測(cè)試。在一些實(shí)施方案中，這類(lèi)診斷可用于鑒定攜帶針對(duì)某疾病的基因的 一個(gè)拷貝的未受影響的個(gè)體，所述疾病需要表達(dá)針對(duì)該疾病的兩個(gè)拷貝，鑒定攜帶針對(duì)某 疾病的基因的一個(gè)拷貝的未受影響的個(gè)體，其中信息可適用于形成治療方案，植入前 (口代；[11^|131^31：；[011)遺傳診斷，出生前診斷測(cè)試，新生篩選，系譜0嫩測(cè)試（用于遺傳系譜目 的），用于預(yù)測(cè)成人發(fā)作病癥如亨廷頓氏病(Huntington's disease)的癥狀前測(cè)試，用于估 測(cè)形成成人發(fā)作的癌癥和阿耳滋海默氏病的風(fēng)險(xiǎn)的癥狀前測(cè)試，癥狀性個(gè)體的確認(rèn)性診 斷，和/或法醫(yī)/身份測(cè)試。在一些實(shí)施方案中，本方法適用于檢測(cè)角膜營(yíng)養(yǎng)不良。在一些實(shí) 施方案中，經(jīng)由例如檢測(cè)阿維利諾角膜營(yíng)養(yǎng)不良相關(guān)的SNP來(lái)檢測(cè)角膜營(yíng)養(yǎng)不良，如導(dǎo)致 TGFW基因中R124突變的那些(包括例如但不限于TGFW基因的核苷酸418處由G至A轉(zhuǎn)換導(dǎo) 致的R124H突變，也稱(chēng)為C(G/A)C SNP)。在一些實(shí)施方案中，經(jīng)由檢測(cè)例如顆粒狀角膜營(yíng)養(yǎng) 不良相關(guān)的SNP來(lái)檢測(cè)角膜營(yíng)養(yǎng)不良，如導(dǎo)致TGFW基因中R555突變的那些(包括例如但不 限于TGFW基因的核苷酸1663處由C至T轉(zhuǎn)換導(dǎo)致的R555W突變，也稱(chēng)為(C/T)GG SNP)。在一 些實(shí)施方案中，經(jīng)由例如檢測(cè)格子狀營(yíng)養(yǎng)不良相關(guān)的SNP來(lái)檢測(cè)角膜營(yíng)養(yǎng)不良，如導(dǎo)致TGF0 I基因中R124和/或626突變的那些(包括例如但不限于TGFW基因的核苷酸417處由C至T轉(zhuǎn) 換導(dǎo)致的R124C突變，也稱(chēng)為(C/T)GC SNP，或TGFW基因的核苷酸1924處由A至C轉(zhuǎn)換導(dǎo)致的 H626P突變）。在一些實(shí)施方案中，經(jīng)由檢測(cè)例如Reis-bucklers角膜營(yíng)養(yǎng)不良相關(guān)的SNP來(lái) 檢測(cè)角膜營(yíng)養(yǎng)不良，如導(dǎo)致TGFW基因中R124突變的那些(包括例如但不限于TGFW基因的 核苷酸418處由G至T轉(zhuǎn)換導(dǎo)致的R124L突變，也稱(chēng)為C(G/T)C SNP)。在一些實(shí)施方案中，經(jīng)由 檢測(cè)例如Thiel-Behnke角膜營(yíng)養(yǎng)不良相關(guān)的SNP來(lái)檢測(cè)角膜營(yíng)養(yǎng)不良，如導(dǎo)致TGFW基因中 R555突變的那些(包括例如但不限于TGFW基因的核苷酸1664處由G至A轉(zhuǎn)換導(dǎo)致的R555Q突 變，也稱(chēng)為C(G/A)G SNP)。
[0209] 在一些實(shí)施方案中，新生兒篩選包括剛出生后采用的任何遺傳篩選以鑒定遺傳病 癥。在一些實(shí)施方案中，新生兒篩選適用于鑒定遺傳病癥，從而在生命早期確定治療方案。 這類(lèi)測(cè)試包括但不限于測(cè)試嬰兒的苯丙酮尿和先天甲狀腺機(jī)能減退。
[0210] 在一些實(shí)施方案中，采用攜帶者測(cè)試(carrier testing)來(lái)鑒定攜帶單拷貝的基 因突變的人。在一些情況中，當(dāng)存在兩拷貝時(shí)，突變可導(dǎo)致遺傳病癥。在一些情況中，一個(gè)拷 貝足以導(dǎo)致遺傳病癥。在一些情況中，兩拷貝的存在是禁用特定治療方案的，如阿維利諾突 變的存在和在進(jìn)行手術(shù)規(guī)程之前的預(yù)篩選以確保對(duì)給定的患者進(jìn)行適宜的治療方案。在一 些實(shí)施方案中，這類(lèi)信息也可用于個(gè)體考慮生育和協(xié)助個(gè)體制定知情的決策，以及協(xié)助醫(yī) 學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員對(duì)個(gè)體患者以及患者家屬提供重要的建議。
[0211] 在一些實(shí)施方案中，使用預(yù)測(cè)性和/或癥狀前測(cè)試類(lèi)型來(lái)檢測(cè)與多種病癥有關(guān)的 基因突變。在一些情況中，這些測(cè)試協(xié)助有患遺傳病癥的家族成員但在測(cè)試時(shí)可以不顯示 病癥特征的人。在一些實(shí)施方案中，預(yù)測(cè)性測(cè)試鑒定提高人的形成具有遺傳基礎(chǔ)的病癥的 幾率的突變，所述病癥包括例如但不限于某些癌癥類(lèi)型。在一些實(shí)施方案中，癥狀前測(cè)試可 用于在出現(xiàn)任何身體跡象或癥狀之前確定人是否會(huì)形成遺傳病癥。預(yù)測(cè)性和癥狀前測(cè)試的 結(jié)果提供了關(guān)于人形成特定病癥的風(fēng)險(xiǎn)的信息，且?guī)椭贫▽?duì)于患者以及患者家屬的適宜 醫(yī)學(xué)治療方案的決策。在一些實(shí)施方案中，還采用預(yù)測(cè)性測(cè)試來(lái)檢測(cè)某些治療方案禁用的 突變，如存在阿維利諾突變則不當(dāng)實(shí)施LASIK手術(shù)和/或其他屈光手術(shù)（refractive procedure)，如但不限于光治療性角膜切除術(shù)(PTK)和/或光折射性角膜切除術(shù)(PRK)。例 如，展現(xiàn)阿維利諾突變的患者不應(yīng)進(jìn)行LASIK手術(shù)或其他屈光手術(shù)。
[0212] 在一些實(shí)施方案中，診斷測(cè)試還包括藥物基因組學(xué)(口1^1'1]^(3〇861101]1；^8)，其包括 確定遺傳變異對(duì)藥物應(yīng)答的影響的遺傳測(cè)試。來(lái)自這類(lèi)藥物基因組學(xué)分析的信息適用于確 定和形成適宜的治療方案。醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員在設(shè)計(jì)適宜治療方案時(shí)采用關(guān)于遺傳變異 的存在和/或缺乏的信息。
[0213]在一些實(shí)施方案中，使用本公開(kāi)的方法確定遺傳概況(profile)的疾病包括但不 限于，眼科病癥、癌癥、糖尿病、高血壓、精神分裂癥、和最常見(jiàn)的先天畸形，如唇裂、顎裂、神 經(jīng)管缺陷、軟骨發(fā)育不全、Alpha-Ι抗胰蛋白酶缺陷、抗磷脂綜合征、孤獨(dú)癥、常染色體顯性 多囊性腎病、〇^1'0〇1：-]\^146-1'〇〇1：11、結(jié)腸癌、(]1^(111(31131：、克羅恩病、囊性纖維化病 (Cystic fibrosis)、德卡姆病（Dercum Disease)、唐氏綜合征、杜安綜合征（Duane Syndrome)、迪謝內(nèi)肌營(yíng)養(yǎng)不良（Duchenne Muscular Dystrophy)、因子 V Leiden 血檢形成 傾向、家族性血膽脂醇過(guò)多、家族性地中海熱、脆性X綜合征(Fragile X Syndrome)、戈謝病 (Gaucher Disease)、血色素沉積癥、血友病、前腦無(wú)裂畸形(Holoprosencephaly)、亨延頓 氏舞蹈?。℉untington' s disease)、克蘭費(fèi)爾特綜合征(Klinefelter syndrome)、馬方綜 合征（Marfan syndrome)、強(qiáng)直性肌營(yíng)養(yǎng)不良、神經(jīng)纖維瘤病、努南綜合征（Noonan Syndrome)、成骨不全(Osteogenesis imperfecta)、帕金森病、苯丙酮尿、Poland異常、卟啉 癥(Porphyria)、早衰癥(Progeria)、視網(wǎng)膜色素變性(Retinitis Pigmentosa)、重癥聯(lián)合 免疫缺陷（SCID)、鐮狀細(xì)胞病、脊髓性肌萎縮（Spinal Muscular Atrophy)、戴薩克斯癥 (Tay-Sachs)、地中海貧血（Thalassemia)、三甲基胺尿（Trimethylaminuria)、特納綜合征 (Turner Syndrome)、Velocardiofacial綜合征、WAGR綜合征、威爾遜?。╓ilson Disease)、 以及具有遺傳組分的任何其他疾病。眼科病癥和/或包括眼科組分的病癥包括但不限于，瞼 板腺囊腫（chalazion)、麥粒腫（stye)、倒睫（trichiasis)、瞼內(nèi)翻（entropion)、瞼外翻 (ectropion)、兔眼癥（lagophthalmos)、bleharitis、淚囊炎（dacryocystitis)、眶蜂窩織 炎（orbital cellulitis)、ptergium、翼狀胬肉（pterygium)角膜營(yíng)養(yǎng)不良、結(jié)膜炎 (conjuctivitis)、新生兒眼炎(ophtalmia neonatorum)、細(xì)菌性角膜潰瘍、真菌性角膜潰 瘍、青光眼、富克斯?fàn)I養(yǎng)不良（Fuchs Dystrophy)、圓錐角膜(keratoconus)、老年黃斑變性 (Advanced Macular Degeneration)、視網(wǎng)膜色素變性（Retinitis pigmentosa)、白內(nèi)障、 retinal disorecers、黃斑變性、糖尿病眼問(wèn)題(例如糖尿病視網(wǎng)膜病變）、瞼裂狹小-下垂-內(nèi)恥[；贅皮-倒向綜合征(BPES)、眼皮膚白化病(oculocutaneous albinism)、馬方綜合征、 Stickle綜合征、和CHARGE (缺損（coloboma)、心異常、后鼻孔閉鎖（atresia of the choanae)、生長(zhǎng)和發(fā)育遲滯、生殖/泌尿道異常、耳異常或耳聾)綜合征。角膜營(yíng)養(yǎng)不良包括 但不限于，阿維利諾角膜營(yíng)養(yǎng)不良、顆粒狀角膜營(yíng)養(yǎng)不良、格子狀I(lǐng)型（lattice type I)角 膜營(yíng)養(yǎng)不良、富克斯?fàn)I養(yǎng)不良（Fuchs Dystrophy)、Thiel_Behnke和Reis-bucklers角膜營(yíng) 養(yǎng)不良。癌癥包括但不限于，癌、肉瘤、母細(xì)胞瘤、淋巴瘤、白血病、生殖細(xì)胞瘤、和未知起源 的癌癥。在一些實(shí)施方案中，癌癥包括但不限于，頭和頸癌、皮膚癌、結(jié)腸癌、口腔癌、成膠質(zhì) 細(xì)胞瘤、乳腺癌、喉癌、食道癌、內(nèi)皮癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌、肺癌、泌尿生殖器癌、直腸癌、 前列腺癌、腎癌、黑素瘤、腎癌、胰腺癌、胃腸癌、血液癌、肝癌、子宮癌和腦癌以及病毒誘導(dǎo) 的癌癥，如乳頭狀瘤病毒誘導(dǎo)的癌癥。
[0214] 在一些實(shí)施方案中，本方法適用于開(kāi)發(fā)個(gè)體化的醫(yī)學(xué)治療方案，其通過(guò)提供用于 測(cè)定個(gè)體的遺傳概況的基因組DNA。在一些實(shí)施方案中，本領(lǐng)域技術(shù)人員采用這類(lèi)遺傳概況 信息以決定和/或形成治療方案。在一些實(shí)施方案中，本領(lǐng)域技術(shù)人員使用在通過(guò)所描述的 方法分離的核酸中鑒定的多種遺傳變異和突變的存在和/或缺乏作為個(gè)體化醫(yī)學(xué)方案或計(jì) 劃的一部分。例如，在一些實(shí)施方案中，將使用所公開(kāi)方法獲得的信息與數(shù)據(jù)庫(kù)或其他建立 的信息比較以確定對(duì)指定疾病的診斷和/或確定治療方案。在一些情況中，將關(guān)于特定患者 中遺傳突變的存在或缺乏的信息與數(shù)據(jù)庫(kù)或其他標(biāo)準(zhǔn)信息來(lái)源比較以做出關(guān)于提出的治 療方案的決定。在一些情況中，遺傳突變的存在指示采納特定治療方案。在一些情況中，遺 傳突變的缺乏指示不采納特定治療方案。
[0215] 在一些實(shí)施方案中，使用關(guān)于特定遺傳突變的存在和/或缺乏的信息來(lái)確定用治 療實(shí)體治療的治療功效，以及修改治療方案以用治療實(shí)體治療。在一些實(shí)施方案中，采用關(guān) 于遺傳突變的存在和/或缺乏的信息來(lái)確定是否采納某個(gè)治療方案。在一些實(shí)施方案中，采 用關(guān)于遺傳突變的存在和/或缺乏的信息來(lái)確定是否持續(xù)治療方案。在一些實(shí)施方案中，采 用遺傳突變的存在和/或缺乏來(lái)確定是否中斷治療方案。在其他實(shí)施方案中，利用遺傳突變 的存在和/或缺乏來(lái)確定是否修改治療方案。在一些實(shí)施方案中，利用遺傳突變的存在和/ 或缺乏來(lái)確定是否增加或降低作為治療方案的一部分施用的治療劑量。在其他實(shí)施方案 中，利用遺傳突變的存在和/或缺乏來(lái)確定是否改變作為治療方案的一部分施用的治療的 給藥頻率。在一些實(shí)施方案中，利用遺傳突變的存在和/或缺乏來(lái)確定是否改變每日、每周 的劑量數(shù)，每治療日的次數(shù)。在一些實(shí)施方案中，利用遺傳突變的存在和/或缺乏來(lái)確定是 否改變治療的劑量量。在一些實(shí)施方案中，在啟動(dòng)治療方案之前和/或在開(kāi)始治療方案之后 確定遺傳突變的存在和/或缺乏。在一些實(shí)施方案中，確定遺傳突變的存在和/或缺乏，并與 關(guān)于遺傳突變的存在或缺乏的預(yù)確定的標(biāo)準(zhǔn)信息比較。
[0216] 在一些實(shí)施方案中，使用所公開(kāi)的方法生成了超過(guò)一種遺傳突變的存在和/或缺 乏的復(fù)合(composite )，且這類(lèi)復(fù)合包括關(guān)于超過(guò)一種遺傳突變的存在和/或缺乏的信息的 任意集合。在一些實(shí)施方案中，檢查2種或更多種、3種或更多種、4種或更多種、5種或更多 種、6種或更多種、7種或更多種、8種或更多種、9種或更多種、10種或更多種、20種或更多種、 30種或更多種、或40種或更多種遺傳突變的存在或缺乏，并用于生成復(fù)合。在一些實(shí)施方案 中，例示信息包括核酸或蛋白質(zhì)信息，或關(guān)于核酸和/或蛋白質(zhì)遺傳突變兩者的信息的組 合。一般地，復(fù)合包含關(guān)于遺傳突變的存在和/或缺乏的信息。在一些實(shí)施方案中，這些復(fù)合 用于與預(yù)確定的標(biāo)準(zhǔn)信息比較以采納、維持或中斷某治療方案。
[0217] 在一些實(shí)施方案中，經(jīng)由例如檢測(cè)選自但不限于以下的2,3,4或5種SNP來(lái)檢測(cè)角 膜營(yíng)養(yǎng)不良：阿維利諾角膜營(yíng)養(yǎng)不良相關(guān)的SNP、顆粒狀角膜營(yíng)養(yǎng)不良相關(guān)的SNP、格子狀營(yíng) 養(yǎng)不良相關(guān)的SNP、Rei S-BuCkler角膜營(yíng)養(yǎng)不良相關(guān)的SNP、和/或Thiel-Behnke角膜營(yíng)養(yǎng)不 良相關(guān)的SNP。在一些實(shí)施方案中，經(jīng)由例如檢測(cè)阿維利諾角膜營(yíng)養(yǎng)不良相關(guān)的SNP與顆粒 狀角膜營(yíng)養(yǎng)不良相關(guān)的SNP、格子狀營(yíng)養(yǎng)不良相關(guān)的SNP、Rei S-BuCkler角膜營(yíng)養(yǎng)不良相關(guān) 的SNP、和/或Thiel-Behnke角膜營(yíng)養(yǎng)不良相關(guān)的SNP的組合來(lái)檢測(cè)角膜營(yíng)養(yǎng)不良角膜營(yíng)養(yǎng) 不良。在一些實(shí)施方案中，經(jīng)由例如檢測(cè)顆粒狀角膜營(yíng)養(yǎng)不良相關(guān)的SNP與阿維利諾角膜營(yíng) 養(yǎng)不良相關(guān)的SNP、格子狀營(yíng)養(yǎng)不良相關(guān)的SNP、Rei S-BuCkler角膜營(yíng)養(yǎng)不良相關(guān)的SNP、和/ 或Thiel-Behnke角膜營(yíng)養(yǎng)不良相關(guān)的SNP的組合來(lái)檢測(cè)角膜營(yíng)養(yǎng)不良。在一些實(shí)施方案中， 經(jīng)由例如檢測(cè)格子狀營(yíng)養(yǎng)不良相關(guān)的SNP與阿維利諾角膜營(yíng)養(yǎng)不良相關(guān)的SNP、顆粒狀角膜 營(yíng)養(yǎng)不良相關(guān)的SNP、Rei S-BuCkler角膜營(yíng)養(yǎng)不良相關(guān)的SNP、和/或Thiel-Behnke角膜營(yíng)養(yǎng) 不良相關(guān)的SNP的組合來(lái)檢測(cè)角膜營(yíng)養(yǎng)不良。在一些實(shí)施方案中，經(jīng)由例如檢測(cè)Reis-Buckler角膜營(yíng)養(yǎng)不良相關(guān)的SNP與阿維利諾角膜營(yíng)養(yǎng)不良相關(guān)的SNP、顆粒狀角膜營(yíng)養(yǎng)不 良相關(guān)的SNP、格子狀營(yíng)養(yǎng)不良相關(guān)的SNP、和/或Thiel-Behnke角膜營(yíng)養(yǎng)不良相關(guān)的SNP的 組合來(lái)檢測(cè)角膜營(yíng)養(yǎng)不良。在一些實(shí)施方案中，經(jīng)由例如檢測(cè)Thiel-Behnke角膜營(yíng)養(yǎng)不良 相關(guān)的SNP與阿維利諾角膜營(yíng)養(yǎng)不良相關(guān)的SNP、顆粒狀角膜營(yíng)養(yǎng)不良相關(guān)的SNP、格子狀營(yíng) 養(yǎng)不良相關(guān)的SNP、和/或Reis-Buckler角膜營(yíng)養(yǎng)不良相關(guān)的SNP的組合來(lái)檢測(cè)角膜營(yíng)養(yǎng)不 良。
[0218]在一些實(shí)施方案中，經(jīng)由例如檢測(cè)選自阿維利諾角膜營(yíng)養(yǎng)不良相關(guān)的SNP的2,3， 4，5和/或6種SNP來(lái)檢測(cè)角膜營(yíng)養(yǎng)不良。在一些實(shí)施方案中，所述SNP包括導(dǎo)致人TGFW基因 編碼的多肽的位置124,555和/或626處突變的3即。這些突變包括導(dǎo)致了6邱1基因中1?124突 變的那些(包括例如但不限于由TGFW基因的核苷酸418處的G至A轉(zhuǎn)換導(dǎo)致的R124H突變，也 稱(chēng)為C(G/A)C SNP)，顆粒狀角膜營(yíng)養(yǎng)不良相關(guān)的SNP，如導(dǎo)致TGFW基因中R555突變的那些 (包括例如但不限于由TGFW基因的核苷酸1663處的C至T轉(zhuǎn)換導(dǎo)致的R555W突變，也稱(chēng)為(C/ T)GG SNP)，格子狀營(yíng)養(yǎng)不良相關(guān)的SNP，如導(dǎo)致TGFW基因中R124突變的那些(包括例如但 不限于由TGFW基因的核苷酸417處的C至T轉(zhuǎn)換導(dǎo)致的R124C突變，也稱(chēng)為(C/T)GC SNP)， Reis-Buckler角膜營(yíng)養(yǎng)不良相關(guān)的SNP，如導(dǎo)致TGFW基因中R124突變的那些(包括例如但 不限于由TGFW基因的核苷酸418處的G至T轉(zhuǎn)換導(dǎo)致的R124L突變，也稱(chēng)為C(G/T)C SNP)和/ 或Thiel-Behnke角膜營(yíng)養(yǎng)不良相關(guān)的SNP，如導(dǎo)致TGFW基因中R555突變的那些(包括例如 但不限于由TGFI3I基因的核苷酸1664處的G至A轉(zhuǎn)換導(dǎo)致的R555Q突變，也稱(chēng)為C(G/A)G SNP)。在一些實(shí)施方案中，經(jīng)由例如以下的檢測(cè)來(lái)檢測(cè)角膜營(yíng)養(yǎng)不良：阿維利諾角膜營(yíng)養(yǎng)不 良相關(guān)的SNP，如導(dǎo)致TGFW基因中R124突變的那些(包括例如但不限于由TGFW基因的核苷 酸418處的G至A轉(zhuǎn)換導(dǎo)致的R124H突變，也稱(chēng)為C(G/A)C SNP)與顆粒狀角膜營(yíng)養(yǎng)不良相關(guān)的 SNP，如導(dǎo)致TGFW基因中R555突變的那些(包括例如但不限于由TGFW基因的核苷酸1663處 的C至T轉(zhuǎn)換導(dǎo)致的R555W突變，也稱(chēng)為(C/T)GG SNP)的組合。在一些實(shí)施方案中，經(jīng)由例如 以下的檢測(cè)來(lái)檢測(cè)角膜營(yíng)養(yǎng)不良：阿維利諾角膜營(yíng)養(yǎng)不良相關(guān)的SNP，如導(dǎo)致TGFW基因中 H626P突變的那些（包括例如但不限于由TGFI3I基因的核苷酸1924處的A到C轉(zhuǎn)換導(dǎo)致的 H626P 突變）。
[0219] 在一些實(shí)施方案中，經(jīng)由例如 1?124(：，1?124!1，1?12禮，1?5551，1?5550和/或!1626?中2， 3,4,5和/或6種的檢測(cè)來(lái)檢測(cè)角膜營(yíng)養(yǎng)不良。在一些實(shí)施方案中，經(jīng)由例如1?124(：，1?124!1， R124L，R555W和/或R555Q中2,3,4和/或5種的檢測(cè)來(lái)檢測(cè)角膜營(yíng)養(yǎng)不良。在一些實(shí)施方案 中，經(jīng)由例如檢測(cè)R124C與R124H，R124L，R555W和/或R555Q中一種或多種的組合來(lái)檢測(cè)角膜 營(yíng)養(yǎng)不良。在一些實(shí)施方案中，經(jīng)由例如檢測(cè)R124H與R124C，R124L，R555W和/或R555Q中一 種或多種的組合來(lái)檢測(cè)角膜營(yíng)養(yǎng)不良。在一些實(shí)施方案中，經(jīng)由例如檢測(cè)R555W與R124C， R124H，R124L和/或R555Q中一種或多種的組合來(lái)檢測(cè)角膜營(yíng)養(yǎng)不良。在一些實(shí)施方案中，經(jīng) 由例如檢測(cè)R555Q與R124C，R124H，R124L和/或R555W中一種或多種的組合來(lái)檢測(cè)角膜營(yíng)養(yǎng) 不良。在一些實(shí)施方案中，檢測(cè)R124H與R555W的組合。在一些實(shí)施方案中，經(jīng)由例如檢測(cè) H262P與1?124(：，1?124!1，1?12禮，1?5551和/或1?555〇中一種或多種的組合來(lái)檢測(cè)角膜營(yíng)養(yǎng)不良。 在一些實(shí)施方案中，1?124(：，1?124!1，1?12禮，1?5551和/或1?555〇都檢測(cè)。在一些實(shí)施方案中， R124C，R124H，R124L，R555W，R555Q和/或 H626P都檢測(cè)。
[0220] VIII.診斷試劑盒
[0221] 在一些實(shí)施方案中，將上文描述的任何或所有試劑包裝到診斷試劑盒中。這類(lèi)試 劑盒包括本文中描述的，以任意組合的任何和/或所有的引物、探針、緩沖劑、和/或其他試 劑。在一些實(shí)施方案中，該試劑盒包含用于檢測(cè)1?124(：，1?124!1，1?12禮，1?5551，1?555〇和/或 H626P中的2,3,4,5和/或6種的試劑。在一些實(shí)施方案中，試劑盒包含用于檢測(cè)1?124(：， R124H，R124L，R555W和R555Q中的2,3,4,和/或5種的試劑。在一些實(shí)施方案中，試劑盒包含 用于檢測(cè)R124C，R124H和R124L的試劑。在一些實(shí)施方案中，試劑盒包含用于檢測(cè)R555W和 R555Q的試劑。在一些實(shí)施方案中，試劑盒包含用于檢測(cè)R124C的試劑。在一些實(shí)施方案中， 試劑盒包含用于檢測(cè)R124H的試劑。在一些實(shí)施方案中，試劑盒包含用于檢測(cè)R124L。在一些 實(shí)施方案中，試劑盒包含用于檢測(cè)R555W的試劑。在一些實(shí)施方案中，試劑盒包含用于檢測(cè) R555Q的試劑。
[0222] 在一些實(shí)施方案中，試劑盒包含用于檢測(cè)町24(：，1?124!1，1?12禮，1?5551，1?555〇和/或 H626P中2，3，4，5和/或6種的引物和探針。在一些實(shí)施方案中，試劑盒包含用于檢測(cè)R124C， R124H，R124L，R555W和R555Q中2,3,4,和/或5種的引物和探針。在一些實(shí)施方案中，試劑盒 包含用于檢測(cè)R124C，R124H和R124L的引物和探針。在一些實(shí)施方案中，試劑盒包含用于檢 測(cè)R555W和R555Q的引物和探針。在一些實(shí)施方案中，試劑盒包含用于檢測(cè)R124C的引物和探 針。在一些實(shí)施方案中，試劑盒包含用于檢測(cè)R124H的引物和探針。在一些實(shí)施方案中，試劑 盒包含用于檢測(cè)R124L的引物和探針。在一些實(shí)施方案中，試劑盒包含用于檢測(cè)R555W的引 物和探針。在一些實(shí)施方案中，試劑盒包含用于檢測(cè)R555Q的引物和探針。在一些實(shí)施方案 中，試劑盒包含用于檢測(cè)H626P的引物和探針。
[0223] 在一些實(shí)施方案中，試劑盒中的試劑作為凍干粉末納入。在一些實(shí)施方案中，試劑 盒中的試劑作為凍干粉末納入，并有重建的用法說(shuō)明。在一些實(shí)施方案中，試劑盒中的試劑 作為液體納入。在一些實(shí)施方案中，試劑包含在塑料和/或玻璃管形瓶或其他適宜容器中。 在一些實(shí)施方案中，引物和探針均含有在試劑盒中的各個(gè)容器中。在一些實(shí)施方案中，將引 物一起包裝在一個(gè)容器中，而將探針一起包裝在另一個(gè)容器中。在一些實(shí)施方案中，將引物 和探針一起包裝在單個(gè)容器中。
[0224] 在一些實(shí)施方案中，試劑盒還包括對(duì)照gDNA和/或DNA樣品。在一些實(shí)施方案中，包 含的對(duì)照DNA樣品是TGFBI R124正常的。在一些實(shí)施方案中，包含的對(duì)照DNA樣品對(duì)應(yīng)于所 檢測(cè)的突變，包括R124C，R124H，R124L，R555W，R555Q和/或H626P。在一些實(shí)施方案中，納入 對(duì)應(yīng)于TGFBI R124正常的對(duì)照DNA樣品，和對(duì)應(yīng)于1?124(：，1?124!1，1?12禮，1?5551，1?555〇和/或 H626P的突變DNA樣品。在一些實(shí)施方案中，納入對(duì)應(yīng)于TGFBI R124正常的對(duì)照DNA樣品，和 對(duì)應(yīng)于1?124(：，1?124!1，1?12禮，1?5551和/或1?555〇的突變0嫩樣品。在一些實(shí)施方案中，納入對(duì) 應(yīng)于TGFBI R124正常的對(duì)照DNA樣品，和對(duì)應(yīng)于R124C，R124H和/或R124L的突變DNA樣品。在 一些實(shí)施方案中，納入對(duì)應(yīng)于TGFBI R124正常的對(duì)照DNA樣品，和對(duì)應(yīng)于R555W和/或R555Q 的突變DNA樣品。在一些實(shí)施方案中，納入對(duì)應(yīng)于TGFBI R124正常的對(duì)照DNA樣品，和對(duì)應(yīng)于 R124C的突變DNA樣品。在一些實(shí)施方案中，納入對(duì)應(yīng)于TGFBI R124正常DNA的對(duì)照DNA樣品， 和對(duì)應(yīng)于R124H的突變DNA樣品。在一些實(shí)施方案中，納入對(duì)應(yīng)于TGFBI R124正常的對(duì)照DNA 樣品，和對(duì)應(yīng)于R124L的突變DNA樣品。在一些實(shí)施方案中，納入對(duì)應(yīng)于TGFBI R124正常的對(duì) 照DNA樣品，和對(duì)應(yīng)于R555W的突變DNA樣品。在一些實(shí)施方案中，納入對(duì)應(yīng)于TGFBI R124正 常的對(duì)照DNA樣品，和對(duì)應(yīng)于R555Q的突變DNA樣品。在一些實(shí)施方案中，納入對(duì)應(yīng)于TGFBI R124正常的對(duì)照DNA樣品，和對(duì)應(yīng)于H626P的突變DNA樣品。在一些實(shí)施方案中，對(duì)照DNA樣品 的濃度是 5ng/yL，1 Ong/yL，20ng/yL，30ng/yL，40ng/yL，50ng/yL，60ng/yL，70ng/yL，80ng/y L,90ng/yL,100ng/yL,110ng/yL,120ng/yL,130ng/yL,140ng/yL,150ng/yL,160ng/yL, 170ng/yL，180ng/yL，190ng/yL或200ng/yL。在一些實(shí)施方案中，對(duì)照DNA樣品的濃度是 50ngAiL，100ngAxL，150ngAiL或200ng/yL。在一些實(shí)施方案中，對(duì)照DNA樣品的濃度是 lOOng/yL。在一些實(shí)施方案中，對(duì)照DNA樣品具有相同的濃度。在一些實(shí)施方案中，對(duì)照DNA 樣品具有不同的濃度。
[0225] 在一些實(shí)施方案中，試劑盒可進(jìn)一步包含緩沖劑，例如GTXpress TAQMAN?試 劑混合物或任何等同緩沖劑。在一些實(shí)施方案中，緩沖劑包括本文描述的任何緩沖劑。
[0226] 在一些實(shí)施方案中，試劑盒可進(jìn)一步包含用于克隆的試劑，如載體(包括例如M13 載體)。
[0227] 在一些實(shí)施方案中，試劑盒進(jìn)一步包含用于DNA純化的試劑。
[0228] 在一些實(shí)施方案中，試劑盒進(jìn)一步包含用于使用試劑盒來(lái)檢測(cè)受試者中角膜營(yíng)養(yǎng) 不良的用法說(shuō)明書(shū)。在一些實(shí)施方案中，這些用法說(shuō)明書(shū)包含本文描述的方案的多個(gè)方面。 實(shí)施例
[0229] 實(shí)施例 1 :DNA提?。―NA Extract All Reagents，ThermoFisher)
[0230] 如下文描述的且依照本文提供的公開(kāi)內(nèi)容從口腔上皮或發(fā)根或全血提取DNA。
[0231] 對(duì)于從口腔上皮或發(fā)根的DNA提取，首先將樣品在IX PBS 300yL中預(yù)處理。接著， 向管添加30yL裂解溶液并渦旋振蕩混合物。然后將混合物在95°C溫育3min。然后，添加30yL 的0嫩穩(wěn)定溶液(來(lái)自1^€6 16〇1111〇1(^丨68/1'1161'1]1〇3(^6111:丨打〇，1]34)并禍旋振蕩混合物。接 著將混合物以13,000RPM離心lmin。
[0232] 對(duì)于從全血的DNA提取，以3yL全血開(kāi)始，首先將樣品在IX PBS 300yL中預(yù)處理。接 著，向管添加30yL裂解溶液并渦旋振蕩混合物。然后將混合物在95°C溫育3min。然后，添加 30yL 的DNA 穩(wěn)定溶液（來(lái)自Life Technologies/Thermo Scientific，USA)并禍旋振蕩混合 物。接著將混合物以13，000RPM離心lmin。
[0233] 在完成上述規(guī)程后，使用商品化Tecan? Infinite_200PR0 NanoQuant的讀出DNA 濃度。為了定量，將l〇〇yL的洗脫液移液到透明的96孔板中。接著，向孔HI2添加100yL制備的 空白溶液。然后使用與NanoQuant提供的制造商指導(dǎo)來(lái)讀出濃度。
[0234] 使用下文表5和6種描述的探針和引物來(lái)制備反應(yīng)混合物。
[0235] 表5:探針序列
[0236]
[0237] 表6:引物序列
[0238]
[0239]
[0240] 用于例示性反應(yīng)混合物中的組分和比率顯示于下文表7中。
[0241] 表7:反應(yīng)混合物
[0243] 例示性PCR循環(huán)條件顯示于下文表8中。
[0244] 表8:PCR 循環(huán)
[0246] 使用上文方案來(lái)生成圖4-8中提供的實(shí)時(shí)PCR數(shù)據(jù)。
[0247] 參考
[0248] 所有標(biāo)題和節(jié)段命名僅用于清楚和參考目的且不意圖以任何方式限制。例如，本 領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)領(lǐng)會(huì)根據(jù)本文中描述的發(fā)明的精神和范圍在適宜時(shí)從不同的標(biāo)題組合多 個(gè)方面的有用性。
[0249] 本文中引用的所有參考文獻(xiàn)通過(guò)提述完整并入本文并用于所有目的，其程度如同 每個(gè)公開(kāi)文本或?qū)＠驅(qū)＠暾?qǐng)具體地且分別地通過(guò)提述完整并入用于所有目的的。
[0250] 可以進(jìn)行對(duì)本申請(qǐng)的許多修改和變化而不背離其精神和范圍，如對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù) 人員將是明顯的。本文描述的具體實(shí)施方案和實(shí)例僅通過(guò)例子提供，且本申請(qǐng)僅由所附權(quán) 利要求的項(xiàng)以及權(quán)利要求所賦予的等同物的完整范圍限制。
[0251] TGFgl 基因序列（NCBI 參考號(hào) NG_012646.1):
[0262] TGFPI基因蛋白產(chǎn)物(gIG-H3蛋白序列；NCBI參考號(hào)NG_012646.1):
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 用于檢測(cè)來(lái)自受試者的樣品中與角膜營(yíng)養(yǎng)不良有關(guān)的至少兩種基因組等位基因的 方法，所述方法包括： (A) 提供受試者的上皮細(xì)胞，其附著于基片的尖端； (B) 在裂解溶液中攪動(dòng)該基片的該尖端，所述裂解溶液裂解附著于該基片的細(xì)胞； (C) 在完成(B)攪動(dòng)時(shí)，從所述裂解溶液移出該基片； (D) 在(C)移出后溫育該裂解溶液； (E) 從所述裂解溶液分離基因組DNA以形成gDNA溶液;和 (F) 使用至少兩種寡核苷酸引物對(duì)和該gDNA溶液確定TGFW基因中存在的至少兩個(gè)核 苷酸的身份，其中所述至少兩個(gè)核苷酸位于TGFW基因的分別的獨(dú)立的位置處，所述位置對(duì) 應(yīng)于與角膜營(yíng)養(yǎng)不良有關(guān)的分別的獨(dú)立的單核苷酸多態(tài)性(SNP)。2. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述TGFW基因中存在的至少兩個(gè)核苷酸在人基因組中 相隔至少一個(gè)核苷酸。3. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述至少兩種寡核苷酸引物對(duì)的至少一對(duì) 包含正向PCR引物和反向PCR引物，所述正向PCR引物具有包含SEQ ID NO: 1的核苷酸序列， 所述反向PCR引物具有包含SEQ ID NO:2的核苷酸序列。4. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述至少兩種寡核苷酸引物對(duì)的至少一對(duì) 包含正向PCR引物和反向PCR引物，所述正向PCR引物具有包含SEQ ID N0:43的核苷酸序列， 所述反向PCR引物具有包含SEQ ID NO:44的核苷酸序列。5. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述至少兩種寡核苷酸引物對(duì)包含第一擴(kuò) 增引物對(duì)和第二擴(kuò)增引物對(duì)，其中： 所述第一擴(kuò)增引物對(duì)包含正向PCR引物和反向PCR引物，所述正向PCR引物具有包含SEQ ID NO: 1的核苷酸序列，所述反向PCR引物具有包含SEQ ID NO: 2的核苷酸序列；和 所述第二擴(kuò)增引物對(duì)包含正向PCR引物和反向PCR引物，所述正向PCR引物具有包含SEQ ID N0:43的核苷酸序列，所述反向PCR引物具有包含SEQ ID N0:44的核苷酸序列。6. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述(F)確定進(jìn)一步包括使用： (i) 具有包含SEQ ID N0:25的核苷酸序列的第一野生型檢測(cè)探針，和具有包含SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:48,或SEQ ID NO:49的核苷酸序列的第一突變體檢測(cè)探針；和 (ii) 具有包含SEQ ID N0:45或SEQ ID N0:47的核苷酸序列的第二野生型檢測(cè)探針，和 具有包含SEQ ID NO:46或SEQ ID NO:50的核苷酸序列的第二突變體檢測(cè)探針。7. 用于檢測(cè)角膜營(yíng)養(yǎng)不良的方法，包括： (A) 使用包含至少第一擴(kuò)增引物對(duì)和至少第二擴(kuò)增引物對(duì)的反應(yīng)混合物從來(lái)自人受試 者的生物樣品擴(kuò)增至少兩種TGFW基因序列，包括第一 TGFW基因序列和第二TGFW基因序 列，所述第一TGFW基因序列包含編碼氨基酸殘基124的核苷酸，所述第二TGFW基因序列包 含編碼氨基酸殘基555的核苷酸； (B) 將第一檢測(cè)寡核苷酸探針對(duì)的第一檢測(cè)探針雜交至所述第一 TGFW基因序列； (C) 將第二檢測(cè)寡核苷酸探針對(duì)的第二檢測(cè)探針雜交至所述第二TGFW基因序列;和 (D) 基于至少兩種檢測(cè)探針對(duì)的使用檢測(cè)第一 TGFgI基因序列和/或第二TGFgI基因序 列中的一個(gè)或多個(gè)突變，所述至少兩種檢測(cè)探針對(duì)包括第一檢測(cè)寡核苷酸探針對(duì)和第二檢 測(cè)寡核苷酸探針對(duì)。8. 根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中檢測(cè)第一 TGFW基因序列和/或第二TGFW基因序列中的 一個(gè)或多個(gè)突變包括檢測(cè)所述第一 TGFW基因序列和/或所述第二TGFW基因序列中的兩個(gè) 或更多個(gè)突變，且所述兩個(gè)或更多個(gè)突變?cè)谌嘶蚪M中相隔至少一個(gè)核苷酸。9. 根據(jù)權(quán)利要求7或8的方法，其中所述至少第一擴(kuò)增引物對(duì)包含第一擴(kuò)增引物和第二 擴(kuò)增引物，其中所述第一擴(kuò)增引物包含核苷酸序列SEQ ID NO: 1且其中所述第二擴(kuò)增引物 包含核苷酸序列SEQ ID NO:2。10. 根據(jù)權(quán)利要求7-9中任一項(xiàng)的方法，其中所述至少第二擴(kuò)增引物對(duì)包含第三擴(kuò)增引 物和第四擴(kuò)增引物，其中所述第三擴(kuò)增引物由核苷酸序列SEQ ID N0:43所示且其中所述第 四擴(kuò)增引物由核苷酸序列SEQ ID NO:44所示。11. 根據(jù)權(quán)利要求7或8的方法，其中： 所述第一擴(kuò)增引物對(duì)包含第一擴(kuò)增引物和第二擴(kuò)增引物， 所述第一擴(kuò)增引物包含核苷酸序列SEQ ID NO: 1， 所述第二擴(kuò)增引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:2， 所述第二擴(kuò)增引物對(duì)包含第三擴(kuò)增引物和第四擴(kuò)增引物， 所述第三擴(kuò)增引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:43,和 所述第四擴(kuò)增引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:44。12. 根據(jù)權(quán)利要求7-11中任一項(xiàng)的方法，其中所述一個(gè)或多個(gè)突變之一對(duì)應(yīng)于在編碼 的TGFBI蛋白中，在氨基酸124處，精氨酸突變?yōu)榘腚装彼幔≧124C)，精氨酸突變?yōu)榻M氨酸 (R124H)，和/或精氨酸突變?yōu)榱涟彼?R124L)。13. 根據(jù)權(quán)利要求7-12中任一項(xiàng)的方法，其中所述一個(gè)或多個(gè)突變之一對(duì)應(yīng)于在編碼 的TGFBI蛋白中，在氨基酸555處，精氨酸突變?yōu)樯彼?R555W)和/或精氨酸突變?yōu)楣劝滨?胺（R555Q)。14. 根據(jù)權(quán)利要求7-13中任一項(xiàng)的方法，其中所述至少兩種檢測(cè)寡核苷酸探針對(duì)的每 種各自包括第一檢測(cè)寡核苷酸探針和第二檢測(cè)寡核苷酸探針，其中所述第一檢測(cè)寡核苷酸 探針和所述第二檢測(cè)寡核苷酸探針包含各自選自下組的核苷酸序列對(duì) ：SEQIDN0S:25-26,SEQ ID NOs:25和48,SEQ ID NOs:25和49,SEQ ID NOs:27-28,SEQ ID NOs:29-30,SEQ ID NOs:31-32,SEQ ID NOs:33-34,SEQ ID NOs:35-36,SEQ ID NOs:37-38,SEQ ID NOs: 39-40,SEQ ID NOs:41-42,SEQ ID NOs:45-46和SEQ ID NOs:46-47,SEQ ID NOs:45和50， 和SEQ ID NOs:47和50。15. 根據(jù)權(quán)利要求7-14中任一項(xiàng)的方法，其中所述第一檢測(cè)寡核苷酸探針對(duì)包含第一 檢測(cè)寡核苷酸探針和第二檢測(cè)寡核苷酸探針，其中所述第一檢測(cè)寡核苷酸探針和所述第二 檢測(cè)寡核苷酸探針?lè)謩e包含核苷酸序列對(duì)SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26。16. 根據(jù)權(quán)利要求7-15中任一項(xiàng)的方法，其中所述第二檢測(cè)寡核苷酸探針對(duì)包含第三 檢測(cè)寡核苷酸探針和第四檢測(cè)寡核苷酸探針，其中所述第三檢測(cè)寡核苷酸探針和所述第四 檢測(cè)寡核苷酸探針?lè)謩e包含核苷酸序列對(duì)SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46。17. 根據(jù)權(quán)利要求7-15中任一項(xiàng)的方法，其中所述第二檢測(cè)寡核苷酸探針對(duì)包含第三 檢測(cè)寡核苷酸探針和第四檢測(cè)寡核苷酸探針，其中所述第三檢測(cè)寡核苷酸探針和所述第四 檢測(cè)寡核苷酸探針?lè)謩e包含核苷酸序列對(duì)SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:46。18. 根據(jù)權(quán)利要求7-15中任一項(xiàng)的方法，其中所述第二檢測(cè)寡核苷酸探針對(duì)包含第三 檢測(cè)寡核苷酸探針和第四檢測(cè)寡核苷酸探針，其中所述第三檢測(cè)寡核苷酸探針和所述第四 檢測(cè)寡核苷酸探針?lè)謩e包含核苷酸序列對(duì)SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:48。19. 根據(jù)權(quán)利要求7-15中任一項(xiàng)的方法，其中所述第二檢測(cè)寡核苷酸探針對(duì)包含第三 檢測(cè)寡核苷酸探針和第四檢測(cè)寡核苷酸探針，其中所述第三檢測(cè)寡核苷酸探針和第四檢測(cè) 寡核苷酸探針?lè)謩e包含核苷酸序列對(duì)SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:49。20. 根據(jù)權(quán)利要求7-15中任一項(xiàng)的方法，其中所述第二檢測(cè)寡核苷酸探針對(duì)包含第三 檢測(cè)寡核苷酸探針和第四檢測(cè)寡核苷酸探針，其中所述第三檢測(cè)寡核苷酸探針和所述第四 檢測(cè)寡核苷酸探針?lè)謩e包含核苷酸序列對(duì)SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:50。21. 根據(jù)權(quán)利要求7-15中任一項(xiàng)的方法，其中所述第二檢測(cè)寡核苷酸探針對(duì)包含第三 檢測(cè)寡核苷酸探針和第四檢測(cè)寡核苷酸探針，其中所述第三檢測(cè)寡核苷酸探針和所述第四 檢測(cè)寡核苷酸探針?lè)謩e包含核苷酸序列對(duì)SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:50。22. 根據(jù)權(quán)利要求7-21中任一項(xiàng)的方法，其中所述第一檢測(cè)探針與第一標(biāo)記物偶聯(lián)且 所述第二檢測(cè)探針與第二標(biāo)記物偶聯(lián)。23. 根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中所述第一標(biāo)記物是VIC且所述第二標(biāo)記物是FAM。24. 權(quán)利要求7的方法，其中(B)雜交和(C)雜交在相同溶液中同時(shí)實(shí)施。25. 權(quán)利要求7的方法，其中所述(B)雜交和(C)雜交在相同溶液或不同溶液中同時(shí)或在 不同時(shí)間實(shí)施。26. 用于檢測(cè)人受試者中的角膜營(yíng)養(yǎng)不良的反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含： (A) 至少第一擴(kuò)增引物對(duì)和第二擴(kuò)增引物對(duì)，其用于擴(kuò)增和確定（1)來(lái)自該受試者的生 物樣品的至少兩種TGFW基因序列的第一TGFW基因序列，其包含編碼氨基酸殘基124的核 苷酸，和(2)來(lái)自該受試者的生物樣品的至少兩種TGFW基因序列的第二TGFW基因序列，其 包含編碼氨基酸殘基555的核苷酸;和 (B) 至少兩種檢測(cè)探針對(duì)，其中所述至少兩種檢測(cè)探針對(duì)的每種中的檢測(cè)探針與所述 至少兩種TGFW基因序列的至少一種雜交。27. 根據(jù)權(quán)利要求26的反應(yīng)混合物，其中所述第一擴(kuò)增引物對(duì)包含第一擴(kuò)增引物和第 二擴(kuò)增引物，所述第一擴(kuò)增引物包含核苷酸序列SEQ ID NO: 1，且所述第二擴(kuò)增引物包含核 苷酸序列SEQ ID NO:2。28. 根據(jù)權(quán)利要求26或27的反應(yīng)混合物，其中所述第二擴(kuò)增引物對(duì)包含第三擴(kuò)增引物 和第四擴(kuò)增引物，所述第三擴(kuò)增引物包含核苷酸序列SEQ ID N0:43,且所述第四擴(kuò)增引物 包含核苷酸序列SEQ ID NO:44。29. 根據(jù)權(quán)利要求26-28中任一項(xiàng)的反應(yīng)混合物，其中所述至少兩種檢測(cè)探針對(duì)的至少 一種用于檢測(cè)對(duì)應(yīng)于編碼的TGFBI蛋白中的以下突變:在氨基酸124處，精氨酸突變?yōu)榘腚?氨酸(R124C)，精氨酸突變?yōu)榻M氨酸(R124H)，和/或精氨酸突變?yōu)榱涟彼?R124L)。30. 根據(jù)權(quán)利要求26-29中任一項(xiàng)的反應(yīng)混合物，其中所述至少兩種檢測(cè)探針對(duì)的至少 一種用于檢測(cè)對(duì)應(yīng)于編碼的TGFBI蛋白中的以下突變:在氨基酸555處，精氨酸突變?yōu)樯?酸(R555W)和/或精氨酸突變?yōu)楣劝滨０?R555Q)。31. 根據(jù)權(quán)利要求26-30中任一項(xiàng)的反應(yīng)混合物，其中所述至少兩種檢測(cè)探針對(duì)的分別 的檢測(cè)探針對(duì)各自包括第一檢測(cè)寡核苷酸探針和第二檢測(cè)寡核苷酸探針，其中所述第一檢 測(cè)寡核苷酸探針和第二檢測(cè)寡核苷酸探針包含各自選自下組的核苷酸序列對(duì)：SEQ ID N0s:25-26，SEQIDN0s:25和48，SEQIDN0s:25和49，SEQIDN0s:27-28，SEQIDN0s:29-30,SEQ ID NOs:31-32,SEQ ID NOs:33-34,SEQ ID NOs:35-36,SEQ ID NOs:37-38,SEQ ID NOs:39-40,SEQ ID NOs:41-42,SEQ ID NOs:45-46和SEQ ID NOs:46-47,SEQ ID NOs:45和 50,和SEQ ID NOs:47和50。32. 根據(jù)權(quán)利要求26-31中任一項(xiàng)的反應(yīng)混合物，其中所述至少兩種檢測(cè)探針對(duì)之一包 含第一檢測(cè)寡核苷酸探針和第二檢測(cè)寡核苷酸探針，其中所述第一檢測(cè)寡核苷酸探針和所 述第二檢測(cè)寡核苷酸探針?lè)謩e包含核苷酸序列對(duì)SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26。33. 根據(jù)權(quán)利要求26-32中任一項(xiàng)的反應(yīng)混合物，其中所述至少兩種檢測(cè)探針對(duì)之一包 含第一檢測(cè)寡核苷酸探針和第二檢測(cè)寡核苷酸探針，其中所述第一檢測(cè)寡核苷酸探針和第 二檢測(cè)寡核苷酸探針?lè)謩e包含核苷酸序列對(duì)SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46。34. 根據(jù)權(quán)利要求26-32中任一項(xiàng)的反應(yīng)混合物，其中所述至少兩種檢測(cè)探針對(duì)之一包 含第一檢測(cè)寡核苷酸探針和第二檢測(cè)寡核苷酸探針，其中所述第一檢測(cè)寡核苷酸探針和所 述第二檢測(cè)寡核苷酸探針?lè)謩e包含核苷酸序列對(duì)SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:46。35. 根據(jù)權(quán)利要求26-34中任一項(xiàng)的反應(yīng)混合物，其中所述至少兩種檢測(cè)探針對(duì)之一包 含第一檢測(cè)寡核苷酸探針和第二檢測(cè)寡核苷酸探針，其中所述第一檢測(cè)寡核苷酸探針和所 述第二檢測(cè)寡核苷酸探針?lè)謩e包含核苷酸序列對(duì)SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:48。36. 根據(jù)權(quán)利要求26-35中任一項(xiàng)的反應(yīng)混合物，其中所述至少兩種檢測(cè)探針對(duì)之一包 含第一檢測(cè)寡核苷酸探針和第二檢測(cè)寡核苷酸探針，其中所述第一檢測(cè)寡核苷酸探針和所 述第二檢測(cè)寡核苷酸探針?lè)謩e包含核苷酸序列對(duì)SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:49。37. 根據(jù)權(quán)利要求24-36中任一項(xiàng)的反應(yīng)混合物，其中所述至少兩種檢測(cè)探針對(duì)之一包 含第一檢測(cè)寡核苷酸探針和第二檢測(cè)寡核苷酸探針，其中所述第一檢測(cè)寡核苷酸探針和所 述第二檢測(cè)寡核苷酸探針?lè)謩e包含核苷酸序列對(duì)SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:50。38. 根據(jù)權(quán)利要求24-36中任一項(xiàng)的反應(yīng)混合物，其中所述至少兩種檢測(cè)探針對(duì)之一包 含第一檢測(cè)寡核苷酸探針和第二檢測(cè)寡核苷酸探針，其中所述第一檢測(cè)寡核苷酸探針和所 述第二檢測(cè)寡核苷酸探針?lè)謩e包含核苷酸序列對(duì)SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:50。39. 根據(jù)權(quán)利要求26-38中任一項(xiàng)的反應(yīng)混合物，其中所述至少兩種檢測(cè)探針的第一檢 測(cè)探針與第一標(biāo)記物偶聯(lián)且所述至少兩種檢測(cè)探針的第二檢測(cè)探針與第二標(biāo)記物偶聯(lián)。40. 根據(jù)權(quán)利要求39的反應(yīng)混合物，其中所述第一標(biāo)記物是VIC且所述第二標(biāo)記物是 FAM041. 用于檢測(cè)人受試者中的角膜營(yíng)養(yǎng)不良的反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)混合物包含： (A) 至少第一擴(kuò)增引物對(duì)，其用于擴(kuò)增和確定來(lái)自該受試者的生物樣品的TGFW基因序 列;和 (B) 至少三種檢測(cè)探針的組，其中所述至少三種檢測(cè)探針的組的一種檢測(cè)探針在暴露 于所述TGFW基因序列時(shí)與所述TGFW基因序列雜交。42. 根據(jù)權(quán)利要求41的反應(yīng)混合物，其中所述TGFW基因序列包含來(lái)自該受試者的生物 樣品的編碼氨基酸殘基124的核苷酸。43. 根據(jù)權(quán)利要求41或42的反應(yīng)混合物，其中所述至少三種檢測(cè)探針的組包括選自下 組的至少一種檢測(cè)探針：SEQ ID NOs :25-42和48-49。44. 根據(jù)權(quán)利要求41-43中任一項(xiàng)的反應(yīng)混合物，其中所述至少三種檢測(cè)探針的組包括 選自下組的至少兩種或更多種檢測(cè)探針:SEQ ID N0s:25-42和48-49。45. 根據(jù)權(quán)利要求41-44中任一項(xiàng)的反應(yīng)混合物，其中所述至少三種檢測(cè)探針的組包括 選自下組的至少三種或更多種檢測(cè)探針:SEQ ID N0s:25-42和48-49。46. 根據(jù)權(quán)利要求41-45中任一項(xiàng)的反應(yīng)混合物，其中所述至少三種檢測(cè)探針的組包括 第一檢測(cè)探針SEQ ID NO:25和第二檢測(cè)探針SEQ ID NO:26。47. 根據(jù)權(quán)利要求46的反應(yīng)混合物，其中所述至少三種檢測(cè)探針的組包括選自下組的 第三檢測(cè)探針：SEQ ID NO:48和SEQ ID NO:49。48. 根據(jù)權(quán)利要求47的反應(yīng)混合物，其中所述至少三種檢測(cè)探針的組包括不同于所述 第三檢測(cè)探針且選自下組的第四檢測(cè)探針:SEQ ID N0:48和SEQ ID N0:49。49. 根據(jù)權(quán)利要求41-45中任一項(xiàng)的反應(yīng)混合物，其中所述至少三種檢測(cè)探針的組包括 選自下組的兩種或更多種檢測(cè)探針:SEQ ID N0s:26和48-49。50. 根據(jù)權(quán)利要求41 -49中任一項(xiàng)的反應(yīng)混合物，其中所述第一擴(kuò)增引物對(duì)包含第一擴(kuò) 增引物和第二擴(kuò)增引物，所述第一擴(kuò)增引物包含核苷酸序列SEQ ID NO: 1，且所述第二擴(kuò)增 引物包含核苷酸序列SEQ ID NO:2。51. 根據(jù)權(quán)利要求41-50中任一項(xiàng)的反應(yīng)混合物，還包含： (C) 至少第二擴(kuò)增引物對(duì)，其用于擴(kuò)增和確定來(lái)自所述生物樣品的第二TGFW基因序 列;和 (D) 至少三種檢測(cè)探針的第二組，其中所述至少三種檢測(cè)探針的第二組的一種檢測(cè)探 針在暴露于所述第二TGFW基因序列時(shí)與所述第二TGFW基因序列雜交。52. 根據(jù)權(quán)利要求51的反應(yīng)混合物，其中所述第二TGFW基因序列包含來(lái)自該受試者的 生物樣品的編碼氨基酸殘基555的核苷酸。53. 根據(jù)權(quán)利要求51或52的反應(yīng)混合物，其中所述至少三種檢測(cè)探針的第二組包括選 自下組的至少一種檢測(cè)探針：SEQ ID NOs :45-47和50。54. 根據(jù)權(quán)利要求51-53中任一項(xiàng)的反應(yīng)混合物，其中所述至少三種檢測(cè)探針的第二組 包括選自下組的至少兩種或更多種檢測(cè)探針:SEQ ID N0s:45-47和50。55. 根據(jù)權(quán)利要求51-54中任一項(xiàng)的反應(yīng)混合物，其中所述至少三種檢測(cè)探針的第二組 包括選自下組的至少三種或更多種檢測(cè)探針:SEQ ID N0s:45-47和50。56. 根據(jù)權(quán)利要求51-55中任一項(xiàng)的反應(yīng)混合物，其中所述至少三種檢測(cè)探針的第二組 包括：第一檢測(cè)探針，其為SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:47,第二檢測(cè)探針，其為SEQ ID NO: 46,和第三檢測(cè)探針，其為SEQ ID NO:50。57. 根據(jù)權(quán)利要求51 -56中任一項(xiàng)的反應(yīng)混合物，其中所述第二擴(kuò)增引物對(duì)包含第三擴(kuò) 增引物和第四擴(kuò)增引物，所述第三擴(kuò)增引物包含核苷酸序列SEQ ID N0:43,和第四擴(kuò)增引 物包含核苷酸序列SEQ ID NO:44。58. 根據(jù)權(quán)利要求41的反應(yīng)混合物，其中所述TGFW基因序列包含來(lái)自該受試者的生物 樣品的編碼氨基酸殘基555的核苷酸。59. 根據(jù)權(quán)利要求41或58的反應(yīng)混合物，其中所述至少三種檢測(cè)探針的組包括選自下 組的至少一種檢測(cè)探針：SEQ ID NOs :45-47和50。60. 根據(jù)權(quán)利要求41和58-59中任一項(xiàng)的反應(yīng)混合物，其中所述至少三種檢測(cè)探針的組 包括選自下組的至少兩種或更多種檢測(cè)探針:SEQ ID N0s:45-47和50。61. 根據(jù)權(quán)利要求41和58-60中任一項(xiàng)的反應(yīng)混合物，其中所述至少三種檢測(cè)探針的組 包括選自下組的至少三種或更多種檢測(cè)探針:SEQ ID NOs:45-47和50。62. 根據(jù)權(quán)利要求41和58-61中任一項(xiàng)的反應(yīng)混合物，其中所述至少三種檢測(cè)探針的組 包括：第一檢測(cè)探針，其為SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:47,第二檢測(cè)探針，其為SEQ ID NO: 46,和第三檢測(cè)探針，其為SEQ ID NO:50。63. 用于檢測(cè)角膜營(yíng)養(yǎng)不良的方法，包括： (A-I)使用包含至少第一擴(kuò)增引物對(duì)和至少三種檢測(cè)探針的組的反應(yīng)混合物，從來(lái)自 人受試者的生物樣品擴(kuò)增第一 TGFW基因序列； (B-I)將所述至少三種檢測(cè)探針的組的第一檢測(cè)探針與所述第一 TGFW基因序列雜交； 并 (C-I)基于以下檢測(cè)所述第一 TGFW基因序列中的突變：（i)所述至少三種檢測(cè)探針的 組的第一檢測(cè)探針雜交于所述第一TGFW基因序列，和（ii)所述至少三種檢測(cè)探針的組的 第二和第三檢測(cè)探針與第一 TGFW基因序列雜交的失敗。64. 根據(jù)權(quán)利要求63的方法，其中所述反應(yīng)混合物包含如權(quán)利要求41-50和58-62的任 一項(xiàng)中記載的反應(yīng)混合物。65. 根據(jù)權(quán)利要求63或64的方法，進(jìn)一步包括： (A-2)使用相同反應(yīng)混合物從所述生物樣品擴(kuò)增第二TGFW基因序列，其中所述反應(yīng)混 合物包含至少第二擴(kuò)增引物對(duì)和至少三種檢測(cè)探針的第二組； (B-2)將所述至少三種檢測(cè)探針的第二組的第一檢測(cè)探針與所述第二TGFW基因序列 雜交;并 (C-2)基于以下檢測(cè)所述第二TGFW基因序列中的突變：（i)所述至少三種檢測(cè)探針的 第二組的第一檢測(cè)探針雜交于所述第二TGFW基因序列，和（ii)所述至少三種檢測(cè)探針的 第二組的第二和第三檢測(cè)探針與所述第二TGFW基因序列雜交的失敗。66. 根據(jù)權(quán)利要求65的方法，其中所述反應(yīng)混合物包含如權(quán)利要求51-57的任一項(xiàng)中記 載的反應(yīng)混合物。67. 根據(jù)權(quán)利要求65或66的方法，其中所述擴(kuò)增(A-I)，擴(kuò)增(A-2)，雜交(B-I)，雜交(B-2)，檢測(cè)(C-I)，和檢測(cè)(C-2)用生物樣品的同一等分試樣實(shí)施。68. 根據(jù)權(quán)利要求65-67中任一項(xiàng)的方法，其中所述擴(kuò)增第一 TGFW基因序列(A-I)和擴(kuò) 增第二TGFW基因序列(A-2)同時(shí)實(shí)施。69. 根據(jù)權(quán)利要求65-68中任一項(xiàng)的方法，其中所述雜交(B-1)和雜交(B-2)同時(shí)實(shí)施。70. 根據(jù)權(quán)利要求65-69中任一項(xiàng)的方法，其中所述檢測(cè)(C-1)和檢測(cè)(C-2)同時(shí)實(shí)施。71. 如權(quán)利要求7-70的任一項(xiàng)中記載的反應(yīng)混合物用于預(yù)測(cè)受試者中在激光眼科手術(shù) 后的并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)的用途，所述預(yù)測(cè)經(jīng)由檢測(cè)人受試者中的雜合角膜營(yíng)養(yǎng)不良進(jìn)行。72. 根據(jù)權(quán)利要求71的用途，其中所述激光眼科手術(shù)包括Lasik和Excimer激光手術(shù)之 〇73. 用于檢測(cè)來(lái)自人受試者的樣品中與角膜營(yíng)養(yǎng)不良有關(guān)的基因組突變的方法，該方 法包括： (A) 提供受試者的上皮細(xì)胞，其附著于基片的尖端； (B) 在裂解溶液中攪動(dòng)該基片的該尖端，所述裂解溶液裂解附著于該基片的細(xì)胞； (C) 在完成(B)攪動(dòng)時(shí)，從裂解溶液移出該基片； (D) 在(C)移出后溫育該裂解溶液； (E) 從裂解溶液分離基因組DNA以形成gDNA溶液;和 (F) 使用至少第一引物對(duì)、至少三種檢測(cè)探針的組和該gDNA溶液，通過(guò)將該gDNA溶液同 時(shí)暴露于所述至少三種檢測(cè)探針，確定所述TGFW基因中存在的至少一個(gè)核苷酸的身份，其 中： 所述至少一個(gè)核苷酸位于所述TGFW基因的特定的位置處，所述位置對(duì)應(yīng)于與角膜營(yíng) 養(yǎng)不良有關(guān)的單核苷酸多態(tài)性(SNP)，且 所述至少三種檢測(cè)探針的組的至少兩種檢測(cè)探針的每種配置為檢測(cè)所述TGFW基因的 特定位置處的不同突變。74. 根據(jù)權(quán)利要求73的方法，進(jìn)一步包括： (G) 使用至少第二引物對(duì)、至少三種檢測(cè)探針的第二組和該gDNA溶液，通過(guò)將該gDNA溶 液同時(shí)暴露于所述至少三種檢測(cè)探針的組和所述至少三種檢測(cè)探針的第二組，確定所述 TGFW基因中存在的至少第二核苷酸的身份，其中： 所述至少第二核苷酸位于所述TGFW基因的獨(dú)立于所述至少一個(gè)核苷酸的位置的第二 特定位置處，所述第二特定位置對(duì)應(yīng)于與角膜營(yíng)養(yǎng)不良有關(guān)的第二單核苷酸多態(tài)性(SNP)， 且 所述至少三種檢測(cè)探針的第二組的至少兩種檢測(cè)探針配置為檢測(cè)所述TGFW基因的第 二特定位置處的分別的突變。75. 根據(jù)權(quán)利要求75的方法，其中所述確定(F)和確定(G)同時(shí)實(shí)施。76. 根據(jù)權(quán)利要求74或75的方法，其中所述確定(F)和確定(G)使用同一gDNA溶液實(shí)施。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK105899681SQ201480072417
【公開(kāi)日】2016年8月24日
【申請(qǐng)日】2014年11月17日
【發(fā)明人】C.查奧-謝恩, S.喬, G.李
【申請(qǐng)人】阿維利諾美國(guó)實(shí)驗(yàn)室股份有限公司