從純化溶液中去除的假病毒顆粒的定量方法及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及確定從作為通過純化技術(shù)處理結(jié)果溶液中去除的假病毒顆粒(MVP)的數(shù)量的方法。該方法涉及步驟：向溶液中加入MVP、通過純化技術(shù)處理所述溶液、以及確定從所述溶液中去除的MVP的數(shù)量。本發(fā)明也涉及試劑盒，所述試劑盒可以與所述方法聯(lián)合使用。該試劑盒包括至少一種MVP儲液以及至少一種定量溶液。
【專利說明】
從純化溶液中去除的假病毒顆粒的定量方法及試劑盒
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及確定從作為通過純化技術(shù)處理結(jié)果的溶液中去除的假病毒顆粒(MVP) 的數(shù)量的方法。該方法涉及步驟:向溶液中加入MVP、通過純化技術(shù)處理所述溶液、以及確定 從所述溶液中去除的MVP的數(shù)量。本發(fā)明也涉及試劑盒，所述試劑盒可以與所述方法聯(lián)合使 用。優(yōu)選地，該試劑盒包括至少一種MVP儲液以及至少一種定量溶液。
【背景技術(shù)】
[0002] 生物醫(yī)藥產(chǎn)品，例如單克隆抗體、重組蛋白、疫苗、血液衍生產(chǎn)品以及動物制品具 有傳播感染性病毒的風(fēng)險(Burnouf，2005; Aranha，2011)。這是由于用于制備生物醫(yī)藥產(chǎn)品 的原材料含有內(nèi)源病毒，或者在制備過程中外源的"外來"病毒污染含溶液的生物醫(yī)藥產(chǎn)品 的風(fēng)險(Ker r，2010)。因此，國際監(jiān)管機(jī)構(gòu)要求生物醫(yī)藥制品的制備應(yīng)在其制備過程中包含 充分的病毒清除步驟，并且通過提供有力的病毒清除數(shù)據(jù)確保這些病毒清除步驟有效 (EMEA，2008;EMEA，2008;ICH，1997;ICH，998;FDA，1997)。
[0003] 為了使病毒有效去除進(jìn)行了病毒"尖峰研究"，其中，將活病毒加入生物醫(yī)藥材料 中，并且進(jìn)行縮小純化過程(Darling，2002)。然后通過傳染性試驗(yàn)(TCID 5Q)或定量聚合酶鏈 反應(yīng)技術(shù)(Q-PCR)定量溶液中殘余的病毒，從而分析該方法去除病毒的能力。由于繁殖和定 量活病毒顆粒所要求的專業(yè)性和附加安全措施，因此這些研究通常由第三方簽約實(shí)驗(yàn)室進(jìn) 行。因此，這些研究是極度昂貴，并且是現(xiàn)實(shí)難以實(shí)施的。事實(shí)上，這些處理步驟在用于評估 病毒去除效果之前就典型地開發(fā)了數(shù)月或數(shù)年。由于在監(jiān)管授權(quán)驗(yàn)證研究過程中研究這些 處理步驟投入了時間和金錢，但是可能最終失敗未能重復(fù)去除病毒，因此這些實(shí)踐增加了 監(jiān)控風(fēng)險。因此，需要一種在純化方法發(fā)展過程中就能確定病毒去除效率的新的改進(jìn)方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明涉及一種從溶液中去除的假病毒顆粒(MVP)的定量方法，其中所述溶液為 通過純化技術(shù)處理結(jié)果。所述方法包括步驟：向溶液中加入MVP，通過純化技術(shù)處理該溶液， 以及確定從溶液中去除的MVP的數(shù)量。在優(yōu)選實(shí)施方式中，加入MVP的溶液包括目的生物。在 更優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述目的生物為抗體、非抗體蛋白、疫苗、核酸產(chǎn)品、血液或血漿衍生 物。在另一更優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述目的生物為通過利用人細(xì)胞、動物細(xì)胞、植物細(xì)胞、昆 蟲細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞、酵母細(xì)胞或細(xì)菌細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)過程或發(fā)酵過程所產(chǎn)生的目的生物。 在另一優(yōu)選實(shí)施例中，通過純化技術(shù)處理溶液純化該溶液中存在的目的生物。
[0005] 在另一優(yōu)選實(shí)施方式中，所述處理包含MVP的溶液的純化技術(shù)為層析、過濾、超濾、 離心或病毒滅火技術(shù)。在另一優(yōu)選實(shí)施方式中，在通過純化技術(shù)處理溶液前加入該溶液的 MVP的量大于處理后溶液中殘留的MVP的量。
[0006] 在優(yōu)選實(shí)施方式中，MVP包括病毒殼蛋白、病毒包膜蛋白，或"病毒殼蛋白和病毒包 膜蛋白"。在另一優(yōu)選實(shí)施方式中，所述殼蛋白或包膜蛋白由細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、植物細(xì) 胞、昆蟲細(xì)胞、和/或動物細(xì)胞和/或人細(xì)胞產(chǎn)生。在另一優(yōu)選實(shí)施例中，所述病毒殼蛋白或 包膜蛋白來自微小病毒科(Parvoviridae)或逆轉(zhuǎn)錄病毒(Retroviridae source.)。在另一 優(yōu)選實(shí)施方式中，所述病毒殼蛋白或包膜蛋白包括異源表位。在另一優(yōu)選實(shí)施方式中，所述 MVP包括離體核酸。
[0007] 根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，確定從溶液中去除的MVP的數(shù)量包括利用確定溶液 中MVP數(shù)量的定量技術(shù)，具體包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、納米 圖像(nanoimaging)、焚光、酶促法、顯微法、分光光度法、透射電鏡(TEM)，或western雜交技 術(shù)。根據(jù)本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方式，所述定量技術(shù)使用能夠與所述MVP表面存在的殼蛋白 表位、包膜蛋白表位或異源表位結(jié)合的抗體。根據(jù)本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方式，所述定量技 術(shù)使用能夠結(jié)合與MVP連接的連接分子的抗體。根據(jù)本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方式，所述定量 技術(shù)使用與MVP連接的分子以及能夠與該分子結(jié)合的抗體，或能夠與連接于所述分子的核 酸片段結(jié)合的引物。根據(jù)本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施例，所述定量技術(shù)使用能夠與MVP內(nèi)包含的 離體核酸序列結(jié)合的引物。
[0008] 根據(jù)本發(fā)明的方法，包括步驟:將MVP加入溶液中，通過純化技術(shù)處理所述溶液，以 及確定從溶液中移除的MVP的量。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，向溶液中加入第二種的MVP，通 過純化技術(shù)處理所述溶液，以及確定從溶液中去除的第二種的MVP的量。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選 實(shí)施例，將所述第一和第二種MVP同時或順序加入溶液中。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，將 兩種或多種附加種MVP加入溶液中。
[0009] 本發(fā)明也涉及試劑盒，所述試劑盒包括：至少一個包含MVP儲液的容器，以及至少 一個包含定量溶液的容器。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，所述定量溶液包括能與MVP或者與 MVP連接的分子結(jié)合的抗體。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，所述試劑盒進(jìn)一步包括第二抗體， 所述第二抗體能夠結(jié)合所述能與MVP或者與MVP連接的分子結(jié)合的抗體。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選 實(shí)施方式，所述能結(jié)合MVP的抗體與酶連接。根據(jù)本發(fā)明再一優(yōu)選實(shí)施方式，所述第二抗體 與酶連接，其中所述第二抗體能夠結(jié)合所述能與MVP或者與MVP連接的分子結(jié)合的抗體。根 據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，所述試劑盒進(jìn)一步包括ELLSA板，所述ELISA板包括能結(jié)合MVP的 固定的抗體或分子。根據(jù)本發(fā)明再一優(yōu)選實(shí)施方式，所述定量溶液包含引物，所述引物結(jié)合 離體核酸序列或能夠結(jié)合能與MVP連接的分子連接的核酸片段。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方 式，所述試劑盒還包括用于實(shí)施ELISA或其他PCR技術(shù)的附加反應(yīng)試劑。
【附圖說明】
[0010] 通過附圖和實(shí)施例說明本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】，但附圖和實(shí)施例并不限定本發(fā)明 的保護(hù)范圍，其中同樣的附圖標(biāo)記代表相同的原件。
[0011] 圖1:MMVMVP片段的純度。
[0012 ] 圖2: MMV MVP儲液的透射電鏡圖。
[0013] 圖3:異源表位MMV MVP片段的的純度。
[0014] 圖4:異源表位MMV MVP儲液的透射電鏡圖。
【具體實(shí)施方式】
[0015]通過實(shí)施例1和2所述的方法純化鼠微小病毒(MMV)MVP。為了確定氯化銫密度梯度 組分的純度，濃縮各密度組分(泳道1-13)的樣品，并且在4~12%聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電 泳。通過考馬斯亮藍(lán)染色顯示蛋白條帶。泳道"S"為VP2蛋白標(biāo)準(zhǔn)樣(alpha diagnostic，貨 號為MVMVP25-R-10)，作為對照(VP2蛋白分子量為64KDa)，分子量標(biāo)記蛋白在泳道"Μ"。如圖 1，分析由天然VP2蛋白形成的MVP。組分11 -13富集形成MVP儲液?；谌旧Y(jié)果，包含MVP的 富集儲液的濃度大于95%。如圖3所示，分析由重組VP2蛋白結(jié)構(gòu)形成的MVP。富集組分11-13，形成MVP儲液?；谌旧Y(jié)果，包含MVP的富集儲液的濃度為90%。
[0016] 通過實(shí)施例1和2所述的方法制備MMV MVP儲液。如圖2所示，顯示由60個拷貝的天 然(未修飾)VP2蛋白獲得的MMVMVP儲液的ΤΕΜ圖。如圖4所示，顯示由60個拷貝的重組VP2蛋 白獲得的MMV MVP儲液的ΤΕΜ圖，其中，各VP2重組蛋白包含異源表位(strep II標(biāo)簽氨基酸 序列）。圖像是負(fù)染色后捕獲的。將各儲液2微升置于單獨(dú)的formva/碳涂覆的電子顯微網(wǎng) 格，然后置于空氣中干燥。十分鐘后，吸走所述網(wǎng)格上的殘余物。然后固定網(wǎng)格，向各網(wǎng)格滴 加2微升2.0%、pH7.0的磷鎢酸（PTA)，放置一分鐘進(jìn)行染色。然后取出多余，使用FEI Tecnai Spirit Twin顯微鏡放大165，000倍對網(wǎng)格進(jìn)行檢查、定量以及拍照。結(jié)果顯示MMV MVP儲液的濃度分別為3.06x 1013MMV MVP/ml(圖2)、3.56x 1013MMV MVP/ml(圖4)。 詳細(xì)描述
[0017] 在本發(fā)明中，術(shù)語"假病毒顆粒(MVP)"指非傳染性、非復(fù)制的組裝單元，其包括合 成制備(如重組表達(dá)或化學(xué)合成）的病毒殼蛋白、包膜蛋白或殼蛋白和包膜蛋白。MVP不指天 然發(fā)現(xiàn)的病毒顆粒，但不限于活病毒顆粒，已經(jīng)自然地喪失了傳染性能的天然發(fā)現(xiàn)的病毒 顆粒，或已經(jīng)體外喪失傳染能力的病毒顆粒，例如"紫外線照射"、"熱殺死"或"熱滅火"的病 毒顆粒。因此，MVP的合成特性使其與其他形式的現(xiàn)有技術(shù)中使用的病毒顆粒相比能夠易制 備、易在市售套裝中使用。術(shù)語"病毒殼蛋白"指任何包含圍繞基因組的殼的病毒的蛋白。術(shù) 語"病毒包膜蛋白"指包被殼蛋白外殼、且為部分病毒外層的任何病毒蛋白。特定的病毒殼 蛋白和包膜蛋白對于特定病毒分類族的病毒是常見的。MVP可以由這些病毒家族的殼或包 膜蛋白制備，從而獲得與來自這些家族的特定病毒類似的生化特性的單元。然而，MVP的組 裝單元缺少與這些病毒類似的遺傳特性(MVP不包含任何核酸）。以下表1列出了主要病毒殼 蛋白和包膜蛋白的實(shí)例(這些蛋白的通用名稱是現(xiàn)有技術(shù)已知的），與其相關(guān)的病毒家族， 以及可以由這些蛋白中的一種或多種蛋白組裝的MVP的實(shí)例。 表1


[0018] 根據(jù)本發(fā)明，MVP作為體外重組表達(dá)或化學(xué)合成病毒殼或包膜蛋白的結(jié)果而組裝。 優(yōu)選地，組裝形成MVP的病毒殼和包膜蛋白為天然發(fā)生的病毒蛋白核酸序列的表達(dá)產(chǎn)物?？?選擇地，組裝形成MVP的病毒殼和包膜蛋白為已被體外改變或修飾的病毒蛋白核酸序列的 表達(dá)產(chǎn)物。在本發(fā)明中，"重組"蛋白指由作為改變或修飾的核酸序列的表達(dá)結(jié)果的被改變 或修飾的氨基酸序列組成的蛋白產(chǎn)物。改變或修飾天然發(fā)生的病毒蛋白核酸序列以表達(dá)重 組病毒殼或包膜蛋白的方式是本領(lǐng)域公職的（例如，參見Gillockl998)。優(yōu)選地，根據(jù)基于 BLAST同源性分析的標(biāo)準(zhǔn)蛋白，重組MVP殼或包膜蛋白與其天然病毒蛋白來源的同源性為 99%或更高?？蛇x擇地，根據(jù)基于BLAST同源性分析的標(biāo)準(zhǔn)蛋白，重組MVP殼或包膜蛋白與其 天然殼和/或包膜蛋白來源的同源性至少為50%、60%、70%、80%、81 %、82%、83%、84%、 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 更尚。
[0019] 優(yōu)選地，組裝形成MVP的病毒殼或包膜蛋白通過在細(xì)菌、酵母、植物、昆蟲、動物或 人細(xì)胞中表達(dá)其基因而被制備。替代組裝MVP制備這些蛋白的方式是本領(lǐng)域公知的（例如， 參見Makarova，2011)。例如，首先將天然或修飾的病毒核酸蛋白序列克隆到表達(dá)載體中。優(yōu) 選地，所述表達(dá)載體為基于酵母的表達(dá)載體、基于細(xì)菌的表達(dá)載體、基于桿狀病毒的表達(dá)載 體、和/或基于哺乳動物的表達(dá)載體、和/或基于植物的表達(dá)載體。然后以表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì) 胞。優(yōu)選地，可以被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞包括、但不限于:細(xì)菌、酵母、植物、昆蟲、動物、哺乳動物和/ 或人細(xì)胞。優(yōu)選地，天然或重組病毒殼或包膜蛋白表達(dá)后，所述蛋白自發(fā)地組裝為MVP。可選 擇地，MVP的組裝不會自發(fā)發(fā)生。在這些實(shí)例中，可以用化學(xué)試劑和/或蛋白質(zhì)處理未組裝的 蛋白包含液，以增加 MVP組裝的發(fā)生。可選擇地，純化所述未組裝的蛋白包含液，以增加溶液 中殼或包膜蛋白相對于溶液中其他分子的數(shù)量。
[0020] 優(yōu)選地，表達(dá)制備用于組裝形成MVP的病毒殼或包膜蛋白的所述核酸序列來自 Parvoviridae或Retroviridae基因組來源。源自Parvoviridae的核酸序列來源的實(shí)例包 括、但不限于鼠微小病毒(Mouse Minute Virus)、犬細(xì)小病毒(Canine Parvovirus)、貓細(xì) 小病毒(Feline Parvovirus)、豬細(xì)小病毒(Porcine Parvovirus)、B_19 病毒(B 19vims)、 腺相關(guān)病毒l(Adeno_associated virus 1)、鹿眼峽蝶濃核病毒（Junonia coenia densovirus)、家香病毒（Bombyx mori virus)以及埃及伊蚊濃核病毒(Aedes aegypti densovirus)的基因組?？梢杂蛇@些基因組制備并組裝形成MVP的病毒殼蛋白的實(shí)例包括、 但不限于:VP1、VP2、VP3或VP4蛋白。源自Retroviridae的核酸序列來源的實(shí)例包括、但不限 于以下病毒的基因組:鳥類成紅細(xì)胞增多癥病毒(Avian Erythroblastosis Virus)、鳥類 白血病病毒（Avian Leukosis Virus)、禽成髓細(xì)胞瘤病毒（Avian Myeloblastosis Virus)、鳥類肉瘤病毒（Avian Sarcoma Virus)，禽髓細(xì)胞瘤病病毒（Avian Myelocytomatos is Virus)、ESH肉瘤病毒（Esh Sarcoma Virus)、弗吉納米腫瘤病毒 (Fujinami Sarcoma Virus)、金黃色病毒（Golden Pheasant Virus)、誘導(dǎo)白血病病毒 (Induced Leukemia Virus)、造淋巴組織細(xì)胞增生病毒(Lymphoid Leukosis Virus)、骨髓 母細(xì)胞增多癥相關(guān)病毒(]^61〇131&8〖0818-&880(^&〖6(1￥；!_1'118)、髓細(xì)胞組織增生病毒 (Myelocytomatosis Virus)、魯斯相關(guān)病毒(Rous-associated Virus)、環(huán)頸雉病毒(Ring-necked Pheasant Virus)、勞氏肉瘤病毒（Rous Sarcoma Virus)、NK_24、SKV、沸沸內(nèi)源性 病毒（Baboon Endogenous Virus)、BEV、CCC、CERV_CI、CPC4、玉米蛇逆轉(zhuǎn)錄病毒（Corn Snake Retrovirus)、雞合胞體病毒(Chicken Syncytial Virus)，鴨傳染性貧血病毒(Duck InfectiousAnemia Virus)、鹿腎病毒(Deer Kidney Virus)、DPC4、馬皮膚纖維肉瘤病毒 (Equine Dermal Fibrosarcoma Virus)、貓白血病毒；（Feline Leukemia Virus)、FeLV-AIDS、貓肉瘤病毒(Feline Sarcoma ￥化1^);廣]\&^{『-5卩卩￥{5-1、長臂猿白血病病毒 (GibbonApe Leukemia Vims)、倉鼠白血病病毒（Hamster Leukemia Virus)、淋巴組織增生 病病毒（Lymphoproliferative Disease Virus)、紹致細(xì)胞灶病毒（Mink Cell Focus-inducing Virus)、MAIDS、MDEV、紹白血病病毒（Mink Leukemia Virus)、鼠白血病病毒 (Murine Leukemia Virus)、MMCA、鼠肉瘤病毒（Murine Sarcoma Virus)、髓系白血病病毒 (Myeloid Leukemia Virus)、0MCA、PK_lS、R-35、RadLV、大鼠白血病病毒（Rat Leukemia Virus)、Ra-MCF、Ra-MLV、Ra-SFFV、大鼠肉瘤病毒（Rat Sarcoma Virus)、RDL14、網(wǎng)狀內(nèi)皮組 織增殖相關(guān)病毒（Reticuloendotheliosis-associated Virus)、形成脾臟病灶病毒 (Spleen Focus-forming Virus)、毛猿肉瘤相關(guān)病毒（Simian Sarcoma Virus)、猴淋巴瘤 病毒（Simian Lymphoma Virus)、猴髓細(xì)胞白血病病毒（Simian Myelogenous Leukemia Virus)、脾壞死病毒（Spleen Necrosis Virus)、猿猴肉瘤相關(guān)病毒（Simian Sarcoma-associated Virus)、毛猿肉瘤相關(guān)病毒（Simian Sarcoma Virus)、TRV4、Vand C_I、蜂蛇逆 病毒（Viper Retrovirus)、毛猴病毒(Woolly Monkey Virus)、毛猴白血病病毒(Woolly Monkey Leukemia Virus)、牛白血病病毒；（Bovine Leukemia Virus)、BoLV、人 T細(xì)胞白血 病病毒(Human T-cell Leukemia Virus)、猿Τ細(xì)胞白血病病毒（Simian T-cell Leukemia Virus)、STLVpan-p、牛合胞病毒（Bovine Syncytial Virus)，貓合胞體病毒（Feline Syncytium-forming Virus)、人合胞病毒（Human Foamy Virus)、猿合胞病毒（Simian Foamy Virus)、牛免疫缺損病毒(Bovine Immunodeficiency Virus)、山羊關(guān)節(jié)炎-腦炎病 毒（Caprine Encephalitis-arthritis Virus)、馬傳染性貧血病毒(Equine Infectious Anemia Virus)、貓免疫缺陷病毒(Feline Immunodeficiency Virus)、山羊腦白質(zhì)炎病毒 (Goat Leukoencephalitis Virus)、人免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus)、 維斯那-梅迪病毒（Jembrana，Maedi/visna Virus)、進(jìn)行性肺炎病毒（Progressive Pneumonia Virus)、猿猴免疫缺損病毒（Simian Immunodeficiency Virus)、鼠乳腺癌病毒 (Mouse Mammary Tumor Virus)、M432，M832、MNV、梅森-菲澤猴病毒（Mason-Pfizer Monkey Virus)，、PMFV、P〇-l_Lu、松鼠猴逆轉(zhuǎn)錄病毒（Squirrel Monkey Retrovirus)、猴逆轉(zhuǎn)錄病 毒（Simian Retrovirus，、綿羊肺腺瘤病毒(Jaagsiekte Retrovirus)、大眼梭f盧皮膚肉瘤 病毒（Walleye Dermal Sarcoma Virus)、大眼梭自盧魚表皮過度增生病毒(Walleye Dermal Hyperplasia Virus)以及Gypsy基因組?？梢杂蛇@些源自Retroviridae的基因組制備并組 裝形成MVP的病毒殼蛋白的實(shí)例包括、但不限于:gag蛋白（MA、CA、NC)env蛋白（SU、TM、LP)、 以及sag蛋白。更優(yōu)選地，Retroviridae源的蛋白源包括哺乳動物細(xì)胞內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒及 逆轉(zhuǎn)錄病毒樣顆粒的基因組序列。哺乳動物細(xì)胞內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒及逆轉(zhuǎn)錄病毒樣顆粒的 實(shí)例包括、但不限于：小鼠白血病病毒（Ab、AKT8、Cas-Br-E、Du5H MAIDS、FMCF-98、Fr、 Graff i、Gr o s s、LP-BM5、K i、Mo、MPLV、NT40、PVC-211、Ra、RadLV、SL3-3、TRI -3、XMuLV)以及內(nèi) 淋巴間隙A型顆粒。可能包含內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒及逆轉(zhuǎn)錄病毒樣顆粒的哺乳細(xì)胞的實(shí)例包 括 CH0、NS0、NS-1、Sp20Agl4、MH、BHK、以及 RH 細(xì)胞。
[0021 ]優(yōu)選地，病毒殼或包膜蛋白組裝形成表面顯示表位的MVP。在本發(fā)明中，"表位"是 MVP的外表面顯示的特定氨基酸序列。表位可以用于定量溶液中存在的MVP的量(及其從溶 液中去除），而無需傳染性試驗(yàn)、QPCR，或其它傳染性或非傳染性病毒顆粒去除的定量領(lǐng)域 的繁榮且昂貴的常規(guī)方法。在一些實(shí)例中，重組病毒殼或包膜蛋白組裝形成MVP。在這些實(shí) 例中，MVP在其表面是可能具有異源表位。在本發(fā)明中，"異源表位"指重組殼或包膜蛋白的 表達(dá)所形成表位。此外，MVP在其由重組蛋白組裝時可以包含異源表位。異源表位的實(shí)例包 括、但不限于：strep-tag(例如氨基酸序列WSHPQFEK(SEQ ID No:l))、flag tag(例如氨基 酸序列DYKDDDDK(SEQIDNo:2))以及His-tag(例如氨基酸序列HHHHHH(SEQIDNo:3))。優(yōu) 選地，MVP的每個蛋白單元可以包含一個拷貝的表位或異源表位?？蛇x擇地，MVP的每個蛋白 單元可以包含多個拷貝的表位或異源表位。異源表位可以將確定溶液中MVP數(shù)量所用定量 方法的靈敏性提高至超過本領(lǐng)域常規(guī)使用的傳染性試驗(yàn)、QPCR，或其它常規(guī)試驗(yàn)的水平。 [0022]優(yōu)選地，MVP不包含任何核酸?？蛇x擇地，MVP可以包含離體核酸片段。在本發(fā)明中， "離體核酸片段"指在顆粒組裝時特意引入MVP溶液的特定核酸序列，從而所得MVP包含一個 拷貝的該序列。因此，與所有其他本領(lǐng)域已知的顆粒不同，MVP不依賴于用于確定溶液中MVP 數(shù)量的病毒基因組的遺傳材料。在本發(fā)明中，術(shù)語"遺傳材料"指復(fù)制或復(fù)制缺陷病毒顆粒 中存在的所有天然包括的核酸。例如，在現(xiàn)有技術(shù)中，傳染性病毒顆粒的定量涉及感染性測 量(天然包含的基因組核酸表達(dá)的結(jié)果），或QPCR(使用其天然包含的基因組核酸的引物） (Shi，2004)。此外，現(xiàn)有技術(shù)中，非復(fù)制內(nèi)源逆轉(zhuǎn)錄病毒樣顆粒的定量涉及利用天然包含的 基因組核酸的引物的QPCR，或者測量病毒逆轉(zhuǎn)錄酶活性的定量產(chǎn)物增強(qiáng)逆轉(zhuǎn)錄酶(Q-PERT) (Zhang，2008)。優(yōu)選地，離體核酸片段可以指核酸的合成衍生序列?？蛇x擇地，離體核酸序 列可以指天然衍生的序列。優(yōu)選地，在天然衍生序列的實(shí)例中，序列的長度約為衍生序列源 自的生物體的基因組的約1 %或更少，5 %或更少，10 %或更少，25 %或更少，30 %或更少， 40 %或更少，50 %或更少，60 %或更少，70 %或更少，75 %或更少，90 %或更少，95 %或更少， 99 %或更少。如本領(lǐng)域的常規(guī)方法所測量，離體核酸的量不夠MVP的復(fù)制和傳染。本領(lǐng)域常 規(guī)使用的測量傳染性的方法之一是TCID 5Q。與其他本領(lǐng)域的常規(guī)病毒顆粒不同，MVP不具有 正被感染或曾經(jīng)感染的風(fēng)險。在一些實(shí)施例中，離體核酸片段可以源自病毒源。在其他實(shí)例 中，離體核酸源自非病毒源。離體核酸來源的實(shí)例包括但不限于:病毒、細(xì)菌、酵母、昆蟲、動 物和/或植物。優(yōu)選地，在離體核酸源自病毒來源的實(shí)例中，所述病毒來源可以與MVP的殼或 包膜蛋白源自同一來源?？蛇x擇地，在離體核酸源自病毒來源的實(shí)例中，所述病毒來源與 MVP的殼或包膜蛋白來源不同。更優(yōu)選地，在任何情況下，所述離體核酸的5'端和3'端可以 包含該序列源自的基因組不存在的特定序列。
[0023] 優(yōu)選地，組裝后，使用本領(lǐng)域已知的方法純化MVP(Hernando，2000)。并且，純化后， 在其組裝溶液中MVP的純度可以達(dá)到溶液中所有蛋白的不到65 %為非MVP相關(guān)的，溶液中所 有蛋白的不到55%為非MVP相關(guān)的，溶液中所有蛋白的不到35%為非MVP相關(guān)的，溶液中所 有蛋白的不到25%為非MVP相關(guān)的，溶液中所有蛋白的不到15%為非MVP相關(guān)的，溶液中所 有蛋白的不到5%為非MVP相關(guān)的。在本發(fā)明中，術(shù)語"非MVP相關(guān)蛋白"指沒有組裝形成MVP 的所有非殼和/或非包膜蛋白。純化MVP的方法的實(shí)例之一為蔗糖密度梯度。另一實(shí)例為離 心。再一實(shí)例為層析。儲液中MVP的純度可以通過本領(lǐng)域的常規(guī)方法確定，所述方法包括但 不限于:聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)、高壓液相色譜、質(zhì)譜、流式細(xì)胞、ELISA、動態(tài)光散射、 凝膠過濾或超濾。在一些實(shí)例中，組裝后，引入MVP，并與連接分子反應(yīng)，從而MVP連接該連接 分子至其表面。在本發(fā)明中，術(shù)語"連接分子"指能夠與另一分子共價地或離子相連的合成 聚合物或天然聚合物(例如蛋白）。
[0024] 如前所述，MVP由病毒殼或包膜蛋白組裝。在本發(fā)明中，根據(jù)其病毒蛋白來源指代 MVP。例如，由鼠微小病毒的VP2蛋白（或VP2蛋白的重組版)組裝的MVP被稱作"MMV MVP"。另 一實(shí)例是，將由異嗜性小鼠白血病病毒(XMuLV)的env和/或gag蛋白（或env和/或gag蛋白的 重組版）組裝的MVP被稱作"XMuLV MVP"。在本發(fā)明中，優(yōu)選地，MVP包括微小病毒科 (Parvoviridae)或逆轉(zhuǎn)錄病毒科(Retroviridae)核酸來源所制備的天然或重組蛋白。可選 擇地，MVP包括其他病毒家族的核酸來源所制備的病毒蛋白，這些病毒家族包括但不限于杯 狀病毒科（Caliciviridae)、逆轉(zhuǎn)錄病毒科（Retroviridae)、憲菁黃花葉病毒科 (丁5^1110￥；[1^(1&6)，披膜病毒科（1'08&￥；[1^(1&6)、皰疼病毒科(!16印6 8￥；[1^(1&)、冠狀病毒科 (Coronavirida)、·正黏液病毒科(Orthomyxo viridae)、絲狀病毒科(Filoviridae)、肝病 毒科（此。&(111&￥；[1'丨(1&6，）、副粘病毒科（？&1&1115^0￥；[1'丨(1&6)、？10￥；[￥；^(1&6，小1?財病毒科 (Picronaviridae)和/或多瘤病毒科(Polyomaviridae)。優(yōu)選地，MVP由源自一個病毒來源 的蛋白組裝。MVP由源自一個病毒來源的蛋白組裝的實(shí)例為"MMV MVP"，由天然或重組麗V VP2殼蛋白組裝?？蛇x擇地，MVP可以由源自多個病毒來源的蛋白組裝。MVP由多于一個病毒 蛋白來源組裝的實(shí)例為XMuLV MVP，其由天然或重組XMuL V gag蛋白和天然或重組HIV env 蛋白組裝而成。
[0025] 在本發(fā)明中，術(shù)語"MVP種類"指包括相同的蛋白、且具有這些蛋白的同樣拷貝數(shù)的 所有蛋白。例如，一類MVP是所有包括60個拷貝的MMV VP2蛋白的MVP。根據(jù)MVP的進(jìn)一步優(yōu)選 限定，蛋白的重組形式被認(rèn)為與其起源的天然蛋白相同。例如，包括60個拷貝的重組MMV VP2蛋白的MVP與包括60個拷貝的天然MMV VP2蛋白的MVP是同一種類。
[0026] 優(yōu)選地，向溶液中添加 MVP的操作指向溶液中僅添加一種MVP?？蛇x擇地，所述向溶 液中添加 MVP的操作指向溶液中添加再一種MVP。優(yōu)選地，在這些實(shí)例中，同時向溶液中加入 第一和第二種MVP?？蛇x擇地，在這些實(shí)例中，順序添加第一、第二種MVP。向溶液中順序添加 兩種MVP的實(shí)例是向溶液中首先加入MMV MVP，然后向同一溶液中再加入XMuLV MVP。向溶液 中同時加入兩種MVP的實(shí)例為將包含MMV MVP和XMuLV MVP的溶液加入另一溶液中。在另一 實(shí)施例中，向溶液中加入MVP的操作指向溶液中加入兩種或多種MVP。
[0027] 優(yōu)選地，向溶液中加入MVP指向另一不含特定種類MVP的溶液中加入一定體積的含 義特定種類MVP的溶液。在本發(fā)明中，所述不含特定種類MVP的溶液直至向其中加入該種類 的MVP的過程稱作"處理溶液"。例如，將麗V MVP溶液加入還未含有MMV MVP的CHO細(xì)胞懸浮 液的處理溶液。在另一實(shí)例中，將XMuLV MVP溶液加入含有MMV MVP但還未包含XMuLV MVP的 CHO細(xì)胞懸浮液的處理溶液。在本發(fā)明中，加入到處理溶液中的含MVP的溶液可以被稱作 "MVP儲液"。優(yōu)選地，與本領(lǐng)域常規(guī)使用的非傳染顆粒的儲液不同，MVP儲液具有已知濃度的 MVP。例如，本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】中的試劑盒內(nèi)包含的MVP儲液包括MVP濃度信息。而且MVP 儲液具有高于本領(lǐng)域其它非傳染性顆粒的濃度的MVP。例如，儲液中MVP的濃度至少為lx 105MVP/mL lx 106MVP/mi,lx 107MVP/ml,lx 108MVP/ml,lx 109MVP/ml,lx 1010MVP/ml, lx 10nMVP/ml,lx 1012MVP/ml, lx 1013MVP/ml lx 1014MVP/ml, lx 1015MVP/mL lx 1016MVP/mL 或更高。此外，MVP儲液含有比本領(lǐng)域常規(guī)使用的其它非感染顆粒更高純度的MVP。例如，MVP 儲液中非MVP相關(guān)蛋白不到溶液中所有蛋白的65%，不到溶液中所有蛋白的55%，不到溶液 中所有蛋白的45%，不到溶液中所有蛋白的35%，不到溶液中所有蛋白的25%，不到溶液中 所有蛋白的15 %，不到溶液中所有蛋白的5 %。儲液中MVP的純度可以通過本領(lǐng)域的常規(guī)方 法確定，所述方法包括但不限于:聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)、高壓液相色譜、質(zhì)譜、流式細(xì) 胞、ELI SA、動態(tài)光散射、凝膠過濾或超濾。在實(shí)施例部分描述制備MVP儲液的實(shí)例。優(yōu)選地， MVP儲液含有一種MVP。含有一種MVP的MVP儲液的實(shí)例之一為含有MMV MVP的MVP儲液?？蛇x 擇地，MVP儲液可以含有多種MVP。含有多種MVP的MVP儲液的實(shí)例為含有MMVMVP和XMuLV MVP 的MVP儲液。
[0028] 加入到操作液中的MVP溶液的量隨多種因素而變化，這些因素包括但不限于:操作 液的體積，添加后在所述操作液中MVP儲液的目的比例(v/v)，以及MVP儲液中MVP的濃度。優(yōu) 選地，MVP儲液的添加體積可以為微升或毫升的數(shù)量級。例如，添加體積可以為約100微升或 更少，約200微升或更少，約500微升或更少，約1毫升或更少，約2毫升或更少，約5毫升或更 少，約10毫升或更少，約100毫升或更少，約1000毫升或更少。可選擇地，添加體積為升。例 如，添加體積可以為約1升或更少，約2升或更少，約5升或更少，約10升或更少。優(yōu)選地，添加 后，在所述操作液中MVP儲液的比例為約1 % (v/v)或更少，約2 % (v/v)或更少，約3 % (v/v) 或更少，約4% (v/v)或更少，約5% (v/v)或更少，約10% (v/v)或更少，約25% (v/v)或更少， 或約50% (v/v)或更少。
[0029] 優(yōu)選地，所述操作液含有目的生物。在本發(fā)明中，術(shù)語"目的生物"指通過可以展示 治療潛能的生物學(xué)過程制備的任何分子。在本發(fā)明中所述生物學(xué)過程的實(shí)例為細(xì)胞蛋白表 達(dá)。在有些情況下，目的生物可以包括蔗糖、蛋白、核酸或這些物質(zhì)的組合體。或者，目的生 物可以為如細(xì)胞和/或組織的活體。優(yōu)選地，目的生物為抗體、非抗體蛋白、疫苗、核酸、血液 或血漿衍生物。作為目的生物的抗體的實(shí)例為曲妥單抗，其以Herceptin?的商品名稱銷售。 另一實(shí)例為Rituxiniab，其以Rituxan?的商品名稱銷售。另一實(shí)例為貝泛單抗，其以 asrin?的商品名稱銷售。作為目的生物的非抗體蛋白的實(shí)例包括但不限于:粒細(xì)胞集落刺 激因子(GCSF)、干細(xì)胞因子、瘦素（leptin，）、荷爾蒙，細(xì)胞素、成血因子、生長因子、肥胖因 子、營養(yǎng)因子、抗炎癥因子、受體、，可溶性受體、酶、和/或這些蛋白任一一種的突變體、衍生 物或類似物。其他目的生物的優(yōu)選實(shí)例包括但不限于:胰島素、胃泌素，催乳素、促腎上腺皮 質(zhì)激素(AC'Ili)、促甲狀腺激素(TSH)、黃體化激素(LH)、促卵泡激素(FSH)、人絨毛膜促性 腺激素(HCG)、胃動素、干擾素(如α、β、或γ )、白細(xì)胞介素(例如，IL-1、IL-2、IL-3、IL_4、IL- 5、11^-6、11^-7、11^-8、11^-9、11^-10、11^-3.1和/或11^-12)、腫瘤壞死因子(了冊）、腫瘤壞死因子 結(jié)合蛋白（TNF-bp)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、膠質(zhì)源性神經(jīng)生長因子(GDNF)，神經(jīng)營養(yǎng) 因子3(NT3)、成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)、神經(jīng)營養(yǎng)生長因子(NGF)、骨生長因子such as， for example，骨保護(hù)素(OPG)、胰島素樣生長因子（IGFs)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)、 粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、外細(xì)胞衍生生長因子(MGDF)、角質(zhì)化細(xì)胞生長因 子(GF)、促血小板生成素、血小板源生長因子(PGDF)、菌落生長因子(CSFs)、骨形態(tài)生成蛋 白（BMP)、超氧化物歧化酶(SOD)、組織纖維蛋白溶酶原激活劑(TPA)、尿激酶、鏈激酶、或激 肽釋放酶，和/或這些蛋白任一一種的變體、衍生物或類似物。疫苗作為目的生物的優(yōu)選實(shí) 施例為乙肝疫苗(Recombivax HB)。另一疫苗優(yōu)選實(shí)施例為Gaxdasil。另一疫苗優(yōu)選實(shí)施例 為Optaflu。另一疫苗優(yōu)選實(shí)施例為Cervarix。目的生物為核酸的優(yōu)選實(shí)施例為 fomivirsen，其市場銷售名稱為Vitravene?。另一目的生物為核酸的優(yōu)選實(shí)施例為 mipomersen，其市場銷售名稱為Kynamro?。另一優(yōu)選實(shí)施例為Pegaptanib，其市場銷售名稱 為Macugen?。血液或血漿衍生物作為目的生物的實(shí)例為白蛋白。另一血液或血漿衍生物作 為目的生物的實(shí)例為抗血友病因子。另一優(yōu)選實(shí)施例為抗血友病因子/血管假性血友病因 子復(fù)合體。本發(fā)明中其它目的生物的實(shí)例包括但不限于:抗凝血復(fù)合抑制劑抗凝血酶（重 組），氯酯酶抑制劑、凝血因子、corifact、纖維蛋白、，纖維蛋白原、免疫球蛋白、profilnine SD復(fù)合因子、kcentra凝血酶原復(fù)合體濃縮物，人）、蛋白C濃縮物(人）、凝血酶、骨髓制品、以 及胚胎液產(chǎn)品。
[0030]優(yōu)選地，所述操作液中的目的生物通過細(xì)胞組織培養(yǎng)方法或發(fā)酵方法制備。在本 發(fā)明中，術(shù)語"細(xì)胞組織培養(yǎng)"指細(xì)胞在可控條件下生長以表達(dá)特定基因（典型地體外誘導(dǎo)） 的過程。在本發(fā)明中，術(shù)語"發(fā)酵表達(dá)方法"指微生物在特性條件下生長以表達(dá)特定基因（典 型地體外誘導(dǎo)）的過程。優(yōu)選地，用于細(xì)胞組織培養(yǎng)和發(fā)酵表達(dá)的細(xì)胞系為人、動物、植物、 昆蟲、雜交瘤、酵母或細(xì)菌來源的。人細(xì)胞系的實(shí)例包括但不限于:HeLa、NCI60、DU 145、 10?-7、？03^冊-77、和/或冊1(-293細(xì)胞。動物細(xì)胞系的實(shí)例包括但不限于 ：010、8冊、奶0、 1?)0(、￥6^、6!13、？(：12、和/或抓3了3細(xì)胞。植物細(xì)胞系的實(shí)例包括但不限于 ：1^3(^〇8￥-2ceiIs。昆蟲細(xì)胞系的實(shí)例包括但不限于：sf9、High Five、和/或C6/36細(xì)胞.酵母細(xì)胞系來 自的酵母種類的實(shí)例包括但不限于:啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和/或畢赤細(xì) 胞系。細(xì)菌細(xì)胞系來源的細(xì)菌種類的實(shí)例包括但不限于:大腸桿菌和/或乳酸菌?？蛇x擇地， 用于細(xì)胞組織培養(yǎng)或發(fā)酵表達(dá)的細(xì)胞系是其他來源的。其他細(xì)胞系的實(shí)例包括但不限于 ZF4、AB9和/或非洲爪蟾A6腎上皮細(xì)胞。
[0031 ]在本發(fā)明中，術(shù)語"雜交瘤"指在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)由抗體生成淋巴細(xì)胞和非抗體生成癌細(xì) 胞融合制備的細(xì)胞，優(yōu)選骨髓瘤或淋巴瘤。此外，本發(fā)明的雜交瘤細(xì)胞能夠繁殖和產(chǎn)生連續(xù) 供給的特定單克隆抗體。雜交瘤細(xì)胞系的實(shí)例包括但不限于RFT5、SP2/o細(xì)胞和/或HB54細(xì) 胞。
[0032]在一些實(shí)例中，表達(dá)目的生物的細(xì)胞組織培養(yǎng)或發(fā)酵過程共表達(dá)其他生物物質(zhì)或 分子。在本發(fā)明中，在細(xì)胞組織培養(yǎng)或發(fā)酵過程中共表達(dá)非目的生物物質(zhì)的所有生物物質(zhì) 或分子被稱作"雜質(zhì)"。雜質(zhì)的實(shí)例包括但不限于:宿主細(xì)胞蛋白（除目的生物物質(zhì)外表達(dá)的 其他蛋白），核酸(除了目的生物外的核酸），目的生物物質(zhì)的電荷變體，聚合復(fù)合體，葡聚 糖，和/或病毒。此外，雜質(zhì)指所有加入到含目的生物的溶液中的所有生物物質(zhì)、分子或化學(xué) 物質(zhì)。因此，雜質(zhì)的實(shí)例為向操作液中加入MVP后的MVP。在一些實(shí)例中，在原始細(xì)胞培養(yǎng)或 發(fā)酵表達(dá)溶液中，操作液與所有的初始雜質(zhì)共存。在其他實(shí)例中，這些溶液在加入MVP之前， 可能通過本領(lǐng)域公知的"純化技術(shù)"由其初始狀態(tài)被純化。在本發(fā)明中，術(shù)語"純化"指降低 同一溶液中雜質(zhì)相對于非雜質(zhì)的數(shù)量的操作。優(yōu)選地，非雜質(zhì)指溶液中存在的目的生物物 質(zhì)。在加入MVP前已純化操作液的純化技術(shù)的實(shí)例包括但不限于:離心、層析、過濾、沉淀、濃 縮、滲濾、巴氏殺菌或病毒滅活。在某些實(shí)例中，在加入MVP前，對溶液進(jìn)行其他技術(shù)操作或 嚴(yán)格操作，這些操作包括但不限于:冷凍、融化、pH調(diào)節(jié)，和/或稀釋。
[0033]本發(fā)明的第一【具體實(shí)施方式】涉及"通過純化技術(shù)處理溶液"。在所述方法的該步驟 中，術(shù)語"溶液"指已經(jīng)加入一定量的MVP儲液的操作液。優(yōu)選地，該溶液包括目的生物物質(zhì)。 如前所述，也可能存在包括MVP的非目的生物物質(zhì)，雜質(zhì)。在本發(fā)明的第一實(shí)施例中，該溶液 "通過純化技術(shù)被處理"。在本發(fā)明中，術(shù)語"純化技術(shù)"指純化溶液的技術(shù)，即，降低同一溶 液中存在的相對于非雜質(zhì)的雜質(zhì)數(shù)量。優(yōu)選地，非雜質(zhì)指目的生物物質(zhì)。因此，本發(fā)明的再 一優(yōu)選實(shí)施方式為純化操作液中的目的生物物質(zhì)，其中，所述純化為通過純化技術(shù)處理所 述操作液的操作。
[0034]優(yōu)選地，用于處理操作液的純化技術(shù)為層析、過濾、超濾、離心、或病毒滅活技術(shù)。 在本發(fā)明中，層析、過濾、超濾、或離心可以被稱作"分離技術(shù)"。分離技術(shù)是將溶液的組分分 散至兩種或多種不同溶液中的質(zhì)量轉(zhuǎn)移方法。分離技術(shù)基于溶看淡液的各種組分之間的不 同物理和化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行的，包括但不限于:大小、形狀、和/或化學(xué)親和力。分離技術(shù)的實(shí)例 包括但不限于:親和層析、離子交換層析、疏水層析、逆向?qū)游?、混合式層析、深度過濾、基于 粒徑的過濾(包括納米過濾、無菌過濾或超濾），以及離心。病毒滅活技術(shù)指旨在減少其病毒 功能至保留其正確結(jié)構(gòu)或復(fù)制的任何方法。病毒滅活技術(shù)的實(shí)例包括暴露于溶劑或試劑， 或者化學(xué)處理、低PH、加熱或紫外線照射。
[0035]本發(fā)明的第一實(shí)施方式涉及通過純化技術(shù)"處理"溶液。在本發(fā)明中，術(shù)語"處理" 指物理地實(shí)施純化技術(shù)的操作。處理分離技術(shù)的不同物理操作包括但不限于：加栗、施壓、 離心、重力、或震蕩。在一些實(shí)例中，根據(jù)分離技術(shù)的形式，一種分離技術(shù)可以實(shí)施多種操 作。例如，離子交換層析技術(shù)的形式可以為填充柱、過濾、或96孔板。因此，該離子交換層析 技術(shù)的處理操作可以包括加栗、施壓、離心、重力、或震蕩。實(shí)施病毒滅活技術(shù)的不同物理處 理包括但不限于:加入有機(jī)溶劑、試劑或酸溶液，微波，暴露于紫外光，熱水浴中浸沒，巴氏 滅菌，或蒸汽處理。
[0036]在一些實(shí)例中，通過分離技術(shù)處理溶液降低溶液中的雜質(zhì)的數(shù)量，因而稱之為溶 液"純化"。向操作液中加入MVP后，MVP當(dāng)作雜質(zhì)。優(yōu)選地，通過處理操作，與操作之前相比， 降低了操作液中存在的MVP的量?？蛇x擇地，通過處理未減少操作液中MVP的量。純化技術(shù)降 低溶液中雜質(zhì)的數(shù)量的能力依賴于本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的系列技術(shù)參數(shù)或"可變輸入"?？?變輸入的實(shí)例包括但不限于:被處理溶液的PH、電導(dǎo)率、以及溫度。另一可變輸入的實(shí)例包 括但不限于:施加的壓力、暴露的時間、或溶液的流速。另一實(shí)例是溶液中組分的濃度。其他 實(shí)例為用于處理溶液的緩沖液的PH、電導(dǎo)率、或化學(xué)組成。另一實(shí)例為在處理過程中或處理 后，收集操作液所用的標(biāo)準(zhǔn)。因此，通過純化技術(shù)處理溶液所用的系列參數(shù)影響純化技術(shù)減 少雜質(zhì)(如MVP)相對于非雜質(zhì)(例如目的生物物質(zhì)）的量的能力和效率。
[0037]在一些實(shí)例中，在處理過程中或處理后收集操作液所用有效的參數(shù)使雜質(zhì)更少。 一旦處理操作開始，收集操作液的方法論是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的。在本發(fā)明中，從處 理操作開始就已經(jīng)收集的操作液為稱作"操作收集物"。在純化過程中，用于收集操作收集 物的方法包括但不限于:光吸收檢測以及設(shè)定體積。優(yōu)選地，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在操作過 程中或操作之后可以利用有效的收集參數(shù)，從而操作收集物包含較處理前包含更少的雜 質(zhì)。更優(yōu)選地，利用收集標(biāo)準(zhǔn)，從而操作收集物較處理前的操作液相比含有更少的MVP。 [0038]在本發(fā)明中，在處理過程中收集不同的操作收集物。在處理過程中如何收集不同 的操作收集物的實(shí)例為在層析分離技術(shù)的負(fù)載相的過程中收集柱洗脫液。另一實(shí)例為在層 析分離技術(shù)的清洗相的過程中收集柱洗脫液。另一實(shí)例為在層析分離技術(shù)的洗脫相的過程 中收集柱洗脫液。另一實(shí)例為收集過濾的濾液。另一實(shí)例為在低pH滴定過程中收集溶液。另 一實(shí)例為在UV光照射或化學(xué)處理過程中收集溶液?？蛇x擇地，在處理后可以收集各種不同 的處理收集物。處理后如何收集不同的操作液的實(shí)例為通過在層析分離技術(shù)的剝離相的過 程在收集柱洗脫液。另一實(shí)例為在低pH滴定、隨后提高pH并過濾后收集溶液。另一實(shí)例為在 UV光照射或化學(xué)處理后收集溶液。
[0039]本發(fā)明的第一實(shí)施例涉及"從溶液中去除MVP的量的定量"。在該特定實(shí)施方式中， "定量"操作指本領(lǐng)域普通技術(shù)人員數(shù)學(xué)計算從操作液中被去除的MVP的量的方法。優(yōu)選地， 該數(shù)值可以表示為"對數(shù)下降值"（LRV)?？蛇x擇地，該數(shù)值可以表示為MVP總克數(shù)中的、和/ 或MVP總分子數(shù)中的摩爾濃度(mo 1/L)。優(yōu)選地，本領(lǐng)域普技術(shù)人員通過將處理后的溶液中 殘留MVP的量與處理前溶液中MVP的量相關(guān)聯(lián)的等式可以數(shù)學(xué)計算從溶液中去除的MVP的 量。優(yōu)選地，通過將加入到操作液中的MVP儲液的體積乘以MVP儲液的MVP濃度，就可以獲知 處理前溶液中MVP的量。更優(yōu)選地，可以實(shí)證檢驗(yàn)確定處理前溶液中存在的MVP的數(shù)量。此 外，優(yōu)選地，可以實(shí)證檢驗(yàn)確定操作收集物中殘留的MVP的量?？梢岳貌煌夹g(shù)實(shí)證檢驗(yàn) 確定溶液中存在的MVP的量。在本發(fā)明中，這些技術(shù)被稱作"定量技術(shù)"。在實(shí)施例部分說明 如何確定從溶液中去除的MVP的量的優(yōu)選實(shí)施例。
[0040]優(yōu)選地，實(shí)證檢驗(yàn)確定溶液中MVP的量所用的"定量技術(shù)"包括ELISA、PCR、納米圖 像(nanoimaging)、焚光、酶促法、顯微法、分光光度法、透射電鏡（TEM)，或western雜交技 術(shù)。在本發(fā)明的實(shí)施例中，從中確定MVP的數(shù)量的"溶液"指加入MVP后的操作液、操作收集 物、或從上述兩種取得的液體。在該實(shí)施例中，所述溶液可以被稱作"MVP包含液"。優(yōu)選地， 當(dāng)實(shí)施定量技術(shù)時，將包含能夠結(jié)合MVP的試劑或與MVP連接的分子的溶液加入MVP包含液 中。所述試劑的實(shí)例為抗體。可選擇地，當(dāng)實(shí)施定量技術(shù)時，向MVP包含液中加入含PCR引物 的溶液，所述PCR引物能夠結(jié)合離體核酸，或者能夠結(jié)合與分子連接的核酸序列，其中所述 分子可以事先與MVP連接。在本發(fā)明中，含試劑或PCR引物的溶液被稱作"定量溶液"。
[0041 ]優(yōu)選地，在確定溶液中MVP的數(shù)量的操作中，制備溶于操作液的MVP的系列稀釋液， 并通過定量技術(shù)分析。優(yōu)選地，此分析的數(shù)據(jù)將溶液中的MVP的量與作為定量技術(shù)的結(jié)果接 收的信號關(guān)聯(lián)。作為定量技術(shù)的一部分被接收的信號的實(shí)例包括但不限于:直觀密度(0D)、 吸收單位、每mL pRNA拷貝、每mL pDNA、每mL RNA拷貝數(shù)、每mLDNA拷貝數(shù)、或逆轉(zhuǎn)錄酶活性 單位。更優(yōu)選地，使用最佳的試劑盒，結(jié)合將由未知數(shù)量的MVP所產(chǎn)生的定量信號與已知量 的MVP所產(chǎn)生的信號關(guān)聯(lián)的數(shù)據(jù)。在實(shí)施例部分詳細(xì)說明相關(guān)實(shí)施例，其中制備并利用稀釋 液確定溶液中MVP的數(shù)量，替代定量從溶液中去除的MVP。
[0042]在某些實(shí)例中，MVP包括天然或重組病毒殼或包膜蛋白，并且在其表面具有表位或 異源表位。優(yōu)選地，在這些實(shí)例中，在使用定量技術(shù)確定溶液中存在的MVP的量的過程中可 以使用結(jié)合這些表位或異源表位的抗體。結(jié)合MVP上的表位的抗體如何被用于確定MVP的量 的實(shí)例為在ELISA定量技術(shù)過程中，向MMV MVP包含溶液中加入直接抗天然或重組VP2殼蛋 白的抗-VP2抗體。結(jié)合MVP上的異源表位的抗體如何被用于確定MVP的量的實(shí)例為在ELISA 定量技術(shù)過程中，向MVP包含溶液中加入直接抗其His標(biāo)簽(MVP表面上存在的異源表位）的 抗-His抗體。優(yōu)選地，本領(lǐng)域中已知的能夠結(jié)合MVP所包含的表位或異源表位的抗體可以為 定量溶液中使用的試劑。更優(yōu)選地，通過使用MVP作為生物體的免疫原制備的新型抗體可以 為定量溶液中所使用的試劑。因此，通過本領(lǐng)域常規(guī)的基于非遺傳材料的技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)驚 人靈敏的定量測量和MVP去除計算。
[0043] 在其他實(shí)例中，MVP與連接分子相連。優(yōu)選地，在這些實(shí)例中，在定量技術(shù)確定溶液 中存在的MVP的量的過程中，結(jié)合連接分子的抗體可以被加入MVP包含液中。在其他實(shí)例中， 在加入定量溶液前，可以將含分子的溶液加入MVP包含液中。在本發(fā)明中，術(shù)語"分子"指具 有MVP親和性的天然或人造小分子或蛋白。
[0044] 在一些實(shí)例中，向MVP包含液中加入分子，以形成MVP-分子復(fù)合物。優(yōu)選地，在這些 實(shí)例中，分子不具有在其表面上連接和顯示的核酸序列。在其他實(shí)例中，分子可以具有在其 表面上連接和顯示的核酸序列。優(yōu)選地，例如，當(dāng)向MVP包含溶液中加入含分子的溶液時，然 后加入定量溶液以通過定量技術(shù)確定溶液中存在的MVP的量。如何通過加入含分子的溶液 確定溶液中存在的MVP的量的實(shí)例是:首先向含Strep標(biāo)簽-MVP的溶液(MVP包括Strep標(biāo)簽 異源表位）中加入含鏈霉肌動蛋白的溶液，然后通過ELISA定量技術(shù)使用抗-鏈霉肌動蛋白 抗體確定MVP的數(shù)量。另一實(shí)例是，首先向MVP包含溶液中加入核酸共聯(lián)的鏈霉肌動蛋白溶 液(鏈霉肌動蛋白含有核酸的連接片段），然后通過PCR定量技術(shù)使用核酸片段的引物確定 MVP的量。
[0045] 在一些實(shí)例中，MVP在其結(jié)構(gòu)內(nèi)部包含離體核酸片段。優(yōu)選地，在這些實(shí)例中，含與 MVP結(jié)構(gòu)內(nèi)包含的離體核酸結(jié)合的引物的定量溶液可以被用于通過PCR定量技術(shù)確定MVP的 量。在這些實(shí)例中，可以使用本領(lǐng)域公知的增強(qiáng)通過定量技術(shù)產(chǎn)生的信號的方法。增強(qiáng)通過 定量技術(shù)產(chǎn)生的信號的方法的實(shí)例涉及金屬增強(qiáng)熒光。
[0046]優(yōu)選地，去除的MVP的量的定量指MVP的種類。優(yōu)選地，在這些實(shí)例中，將一種MVP加 入通過純化技術(shù)處理的操作液中?？蛇x擇地，當(dāng)將兩種或多種MVP加入通過純化技術(shù)處理的 操作液中時，去除的MVP的量的定量可以指多種MVP。優(yōu)選地，在這些實(shí)例中，在確定溶液中 多種MVP數(shù)量中使用相同定量技術(shù)的實(shí)例是在分別的ELI SA定量技術(shù)中使用抗VP2抗體和抗 env-抗體，其中，所述抗VP2抗體結(jié)合MMV MVP，所述抗env-抗體結(jié)合XMuLV MVP?？蛇x擇地， 不同定量技術(shù)可以用于確定溶液中的多種MVP的量。使用不同定量技術(shù)的實(shí)例為使用基于 ELISA的技術(shù)確定溶液中MMV MVP的量，以及使用PCR技術(shù)確定相同溶液中XMuLVMVP的量。 [0047] 優(yōu)選地，不間斷地順序?qū)嵤┮韵虏襟E：向溶液中加入MVP、通過純化技術(shù)處理溶液、 以及確定從溶液中去除的MVP的量?？蛇x擇地，根據(jù)合理的試驗(yàn)設(shè)計可以包括附加步驟?？?以根據(jù)合理的試驗(yàn)設(shè)計包括的附加步驟的實(shí)例包括但不限于:在將操作液加入儲液之前進(jìn) 一步純化MVP儲液(經(jīng)過濾、層析或其他技術(shù)），在將MVP儲液加入操作液之前進(jìn)行透析或滲 濾，在加入MVP之前或之后，向操作液加入非-MVP溶液。非MVP溶液的實(shí)例為不含病毒的活病 毒制劑的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物。其他附加步驟的實(shí)例可以包括在添加 MVP之后、但在通過純化技 術(shù)處理之前取操作液試樣，在實(shí)施定量技術(shù)之前離心或稀釋操作收集物或操作收集物的試 樣，和/或在實(shí)施定量技術(shù)之前冷凍或溶解用于定量技術(shù)的試樣。
[0048] 因此，本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】之一為確定從溶液去除的MVP的量的方法。本發(fā)明的 另一【具體實(shí)施方式】為用于實(shí)施所述方法的試劑盒。優(yōu)選地，所述試劑盒包括包含單一種類 MVP的儲液的容器，以及包含定量溶液的容器?？蛇x擇地，所述試劑盒包含多種MVP的MVP儲 液的容器。優(yōu)選地，在該實(shí)施例中，所述試劑盒還包括用于實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證確定儲液瓶中存在的各 MVP種類的數(shù)量的多個定量溶液的容器。根據(jù)納米的實(shí)施例，其中所述試劑盒包含多個MVP 儲液瓶(含不同種MVP)，所述試劑盒還包括用于確定各種MVP的數(shù)量的多個定量溶液瓶。
[0049] 在本發(fā)明中，包含MVP儲液的容器指試劑盒內(nèi)包含的瓶，所述試劑盒包含已知濃度 (MVP濃度)的MVP儲液。此外，儲液容器中的MVP的濃度和純度超過本領(lǐng)域常規(guī)的其他非傳染 性顆粒的濃度和純度水平。例如，儲液容器中的Μ V P濃度可以至少為1X 105 Μ V P / m L、1X 106MVP/mL、lx 107MVP/mL、lx 108MVP/ml，lx 109MVP/mL，lx 1010MVP/mL、lx 10nMVP/mL、I x 10i2MVP/mL、lx 1013MVP/mL、lx 10i4MVP/mL、lx I015MVP/mL、lx 10lb MVT/mL或更高，并且， 非MVP相關(guān)蛋白的比例不到溶液中所有蛋白的65%，不到溶液中所有蛋白的55%，不到溶液 中所有蛋白的45%，不到溶液中所有蛋白的35%，不到溶液中所有蛋白的25%，不到溶液中 所有蛋白的15 %，不到溶液中所有蛋白的5 %。優(yōu)選地，儲液瓶中的MVP可以為MVP組裝成的 源細(xì)胞培養(yǎng)物或基于發(fā)酵的表達(dá)溶液。更優(yōu)選地，純化溶液儲液的MVP，從而與MVP組成的原 始表達(dá)溶液相比降低了非MVP相關(guān)蛋白的濃度、核酸的濃度、或溶液中脂類的濃度。更優(yōu)選， 儲液瓶中的MVP從MVP組裝的原始表達(dá)溶液中被高度純化。在一些實(shí)例中，MVP儲液可以包含 加入的緩沖液組分。優(yōu)選地，單個MVP儲液瓶僅含一種特定的MVP?？蛇x擇地，單一的儲液瓶 含多種MVP。
[0050] 在本發(fā)明中，"含定量溶液的容器"指試劑盒內(nèi)包含的瓶，所述試劑盒包括含能夠 結(jié)合MVP試劑的定量溶液，離體核酸，與MVP連接的分子，或與所述分子連接的核酸序列。優(yōu) 選地，定量瓶包括含抗體的定量溶液，所述抗體能結(jié)合MVP或者能與MVP連接的分子。包括含 抗體的定量溶液的定量瓶的實(shí)例為包括含抗-VP2抗體的定量溶液的定量溶液瓶，其中，可 以在ELISA定量技術(shù)中使用抗-VP2抗體，以確定溶液中MMV MVP的量。在這些實(shí)例中，抗體可 以結(jié)合MVP上存在的表位或異源表位，或結(jié)合分子上存在的表位。在本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施 方式中，所述試劑盒還包括第二抗體的溶液，所述第二抗體能夠結(jié)合主要抗體，所述主要抗 體結(jié)合MVP或與MVP連接的分子。優(yōu)選地，在加入能夠結(jié)合MVP或分子的抗體后，在實(shí)施定量 技術(shù)的過程中，加入第二抗體溶液。
[0051 ] 在一些實(shí)例中，能夠結(jié)合MVP或結(jié)合與MVP連接的分子的抗體不與酶連接?？蛇x擇 地，在本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方式中，定量溶液中所包含的能結(jié)合MVP或結(jié)合與MVP連接的 分子的抗體與酶連接?？梢耘c抗體連接的酶的實(shí)例為辣根過氧化物酶(HRP)和堿性磷酸酶。 此外，在另一優(yōu)選實(shí)施方式中，第二抗體與酶連接，其中，所述第二抗體結(jié)合能結(jié)合MVP或結(jié) 合與MVP相連的分子的抗體。
[0052] 在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，所述試劑盒進(jìn)一步包括含結(jié)合MVP的固定抗體或分子 的ELI SA板。優(yōu)選地，該板包括96個孔?？蛇x擇地，該板包含少于96個孔。優(yōu)選地，ELI SA板內(nèi) 固定的抗體或分子結(jié)合同一試劑盒的MVP儲液瓶內(nèi)包含的MVP。
[0053] 可選擇地，在另一優(yōu)選實(shí)施方式中，定量瓶包括含引物的定量溶液，所述引物能夠 結(jié)合離體核酸序列或與分子連接的核酸片段，所述分子可以與MVP連接。優(yōu)選地，在這些實(shí) 例中，定量溶液瓶可以包含MVP內(nèi)包含的離體核酸片段的特異性PCR引物?？蛇x擇地，在這些 實(shí)例中，在定量步驟中，定量溶液瓶可以包含于分子連接的核酸片段的特異性PCR引物，所 述分子可以先與MVP連接。
[0054]在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施中，所述試劑盒包括能夠結(jié)合MVP分子的溶液。該分子的溶液 的實(shí)例為含鏈霉肌動蛋白的溶液。該分子的溶液的另一實(shí)例為含有顯示短核酸序列的鏈霉 肌動蛋白的溶液。優(yōu)選地，在加入定量溶液前，在實(shí)施定量技術(shù)過程中加入該溶液。
[0055]在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，試劑盒中包括實(shí)施ELISA或PCR的附加試劑。實(shí)施ELISA 或PCR的附加試劑的實(shí)例包括本領(lǐng)域常規(guī)使用的緩沖液、酶、或分子。
[0056]盡管結(jié)合具體的實(shí)施例描述了實(shí)施方式，顯然對這些實(shí)施例進(jìn)行各種修飾和改變 沒，而不超出本發(fā)明的本質(zhì)和保護(hù)范圍。因此，說明書和附圖被認(rèn)為是用于說明的，而非限 制含義。 實(shí)施例 實(shí)施例1:鼠微小病毒(MMV)假病毒克隆的克隆、表達(dá)及純化，制備儲液
[0057]鼠微小病毒(MMV)為含屬于感染脊椎動物宿主的微小病毒科(Parvoviridae)的病 毒單鏈DNA。使用各種桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)可以克隆并表達(dá)鼠微小病毒殼蛋白基因 VP2，以產(chǎn) 生MVP(Hernando，2000)。為了克隆并表達(dá)MMV MVP，由公開的MMVVP2模板合成殼蛋白基因 VP2(GenBank J02275.1，nucleotides2794-4557，SEQ ID Νο·4)。在合成過程中優(yōu)化特定的 密碼子，從而提高翻譯的效率(SEQ ID No.5)。所得氨基酸序列（SEQ ID No.6)與公開的VP2 序列100%同源(GenBank AAA67114.1，SEQ ID如.7)。將該基因插入克隆載體?1^57，然后 被亞克隆至pFastBac表達(dá)字體。然后該載體被用于轉(zhuǎn)化DHlOBac細(xì)胞。篩選陽性克隆后，桿 狀病毒質(zhì)粒DNA被用于轉(zhuǎn)化Sf9細(xì)胞。從Sf9細(xì)胞培養(yǎng)懸浮液收集攜帶MMV VP2基因的重組桿 狀病毒。然后擴(kuò)大初始的重組桿狀病毒儲液，并且在感染后4天收集。在Grace培養(yǎng)基中培養(yǎng) 該儲液，并補(bǔ)充10 %FBS，然后在多重感染為4.0時轉(zhuǎn)化Sf9細(xì)胞。然后在感染后3天收集細(xì) 胞，然后在水解緩沖液中懸浮。然后冷凍、融化該懸浮液3次。通過離心回收可溶性的溶菌 液，然后通過以下公開的程序純化所得MVP(Hernando,2000)。通過考馬斯亮藍(lán)染色的SDS-PAGE(圖1)和western雜交(未顯示)確定氯化銫密度梯度分離后的MVP的純度?；诖私Y(jié)果， 收集組分形成MMV MVP儲液。通過利用負(fù)染色的透射電鏡（圖2)實(shí)現(xiàn)MMV MVP儲液的可視化 以及濃度確定。 實(shí)施例2:克隆、表達(dá)以及純化異源表位MMV MVP以制備儲液 [0058] 制備MMV MVP，在其表面顯示異源表位，因此能夠用作MVP定量的靶標(biāo)。為了克隆顯 示異源表位的MMV MVP，首先合成MMV VP2基因的天然核苷酸序列(利用GenBank J02275.1， nucleotides 2794-4557，SEQ ID No.4作為模板），同時優(yōu)化特定的密碼子，以增加翻譯效 率（SEQ ID No.5)。然后在氨基酸位置2處突變該序列（SEQ ID No.8)，獲得包括插入含 strepll標(biāo)簽的10個氨基酸序列的氨基酸序列（SEQ ID No.9)。然后使用與實(shí)施例1相同的 方法和程序克隆、表達(dá)、純化以及制備含異源表位(strepll標(biāo)簽)的MVP儲液。通過考馬斯亮 藍(lán)染色的SDS-PAGE(圖3)和western雜交(未顯示）確定氯化銫密度梯度分離后的MVP的純 度?；诖私Y(jié)果，收集組分形成MMV MVP儲液。通過利用負(fù)染色的透射電鏡（圖4)實(shí)現(xiàn)MMVMVP 儲液的可視化以及濃度確定。通過利用鏈霉肌動蛋白和抗標(biāo)簽的mAb(未顯示）的ELISA試驗(yàn) 進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)所得顯示str印II標(biāo)簽的可視化。 實(shí)施例3:克隆、表達(dá)以及純化異嗜性小鼠白血病病毒(XMuLV)MVP以制備儲液 之前已顯示使用共表達(dá)XMRV env和gag基因的Ad5載體感染細(xì)胞導(dǎo)致產(chǎn)生非感染顆粒 (Makarova，2011)。首先，可以使用基因的公開序列作為模板定制合成XMuLV gag和env基因 (分別為：GenBank accession number JF908817.1，nucleotides546_2156，SEQ ID No.10， and accession number K02730.1,nucleotides 291_2225，SEQ ID No.ll)。然后可以將核 實(shí)序列克隆至PUC57載體。然后，將env序列亞克隆至pDPl穿梭載體的CMV驅(qū)動的表達(dá)卡盒， 并且，將gag序列亞克隆至同一載體的MCMV驅(qū)動的表達(dá)卡盒，得到pDPl-XMuLV Venvgag。然 后，在共轉(zhuǎn)染293-AD細(xì)胞以制備重組Ad5-XMuLV之前，可以將所述pDPl-XMuLV Venvgag質(zhì)粒 線性化，并與pAdEasy-1質(zhì)?；旌??？梢酝ㄟ^在氯化銫梯度上雙離心純化重組腺病毒。為了 制備MVP儲液，可以使用用友病毒吸收的Ad5-XMuLV感染MvlLu。然后，感染48小時后收集培 養(yǎng)基，通過0.45mm過濾，并且通過鹿糖梯度超濾進(jìn)行濃縮/純化。 實(shí)施例4:克隆、表達(dá)以及純化含異源表位的XMuLV MVP，以制備儲液 可以通過Suomalainen等1994中討論的方法制備在其結(jié)構(gòu)的表面含異源表位的XMuLV MVP?？蛇x擇地，可以合成XMuLV gag和/或env基因（分別為GenBank accession number JF908817.1,nucleotides 546-2156,SEQ ID No.10,and accession number K02730.1, nucleotides 291-2225，SEQ ID No. 11)之一的核苷酸序列，以包括用于異源標(biāo)簽的序列， 所述異源標(biāo)簽包括但不限于astrep-tag(氨基酸序列WSHPQFEK(SEQ ID No:l))、Flag tag (氨基酸序列DYKDDDDK(SEQIDNo:2))、或His-tag(氨基酸序列HHHHHH(SEQIDNo:3))。通 過以上實(shí)施例3所述的方法克隆、表達(dá)以及純化。 實(shí)施例5:組裝含核酸的XMuLV MVP
[0059] 為了制備含核酸片段的XMuLV MVP，如實(shí)施例4所述，可以首先從哺乳動物細(xì)胞表 達(dá)XMuLV gag和/或env蛋白。然后，根據(jù)公開的試驗(yàn)手冊可以實(shí)施XMuLV gag和/或env蛋白 的離體組裝，以包含可以我DNA或RNA的核酸(Gross等，1997; Yu等，2001)。 實(shí)施例6:通過離子交換樹脂定量處理后從含mAb溶液中去除的MMV MVP
[0060] 取出-8 0 °C保藏的含單克隆抗體（m A b 1)的N S 0收獲細(xì)胞培養(yǎng)液體，并融化。以 lMTris滴定材料至pH7.5，然后通過0.22μπι濾膜過濾。將100微升的含60個拷貝的顯示異源 表位strep II標(biāo)簽表位的VP2殼蛋白的MMV MVP(濃度為lx 109MVP/ml)儲液加入10mLd mAb 操作液中（1%ν/ν添加）。因此，操作液的濃度為9.9x 106MVP/ml((0.1ml x lx 109MVP/ml)/ 10.lmLs)。然后按照供應(yīng)商（GE healthcare)建議的說明書組裝0.66cm x 2cm的Q Sepharose Fast Flow，并且用AKTA explorer以50mM Tris-HCl，50mM NaCl(pH 7.5)、 60cm/hr流速進(jìn)行平衡。平衡后，將lO.lmls的含MVP操作液以60cm/hr的流速負(fù)載柱子。收集 操作收集物作為蛋白流過所顯示的UV280痕跡。取200yL的收集物樣品。
[0061 ]然后實(shí)施ELISA定量技術(shù)，確定從純化處理中各個操作收集物去除的MVP的量。事 先以兔多克隆抗MMVVP2抗體(Alpha Diagnostic，Cat#MVMVP21-S)覆蓋微孔板。向涂覆的微 孔中加入50yL各操作收集物樣品，孵育1小時，并且以1X的磷酸緩沖液(PBS)清洗3次。在初 始處理材料時制備MMV MVP儲液的系列稀釋液，獲得MVP濃度為lx 108MVP/ml、lx 106MVP/ ml、和lx 104MVP/ml。將50yL的各稀釋液加入微孔、孵育并清洗。然后向各微孔加入兔多克 隆抗MMV VP2抗體，孵育1小時，并以1X的磷酸緩沖液(PBS)清洗3次。然后加入HRP連接的抗 兔抗體(1:500)，孵育1小時，并以1X的磷酸緩沖液(PBS)清洗3次。加入TMB底物溶液，通過加 入停止液停止反應(yīng)。測量450nm處的光密度(OD)。以下表2顯示OD450結(jié)果。 表2:MMV MVP去除研究的0D45Q測量值
[0062]以三種已知濃度的稀釋液樣品（相關(guān)OD450和MVP濃度)確定了最佳試劑盒的線性方 程。該線性方程的等式為： Υ = 0·05251η(χ)+0·1235
[0063] 通過處理兩種操作收集物的0D45Q結(jié)果，確定這些樣品中的MVP濃度。因此，試驗(yàn)確 定任一已知操作收集物中殘留〇MVP/ml。由于該ELISA試劑盒的檢測限值是未知的，因此設(shè) 定該限值為最低測試MVP濃度（lx 104MVP/ml)。由操作液中MVP的已知數(shù)量計算MMV MVP的 對數(shù)減少值。該值>9.9x 102，因此為通過純化技術(shù)處理溶液后從該溶液中去除的MVP的量。 實(shí)施例7:通過細(xì)小病毒過濾處理后從含Mab的溶液中去除的XMuLV MVP的定量
[0064] 可以通過使用本領(lǐng)域常規(guī)的方法，利用蛋白親和以及離子交換層析柱純化含單克 隆抗體的生物技術(shù)操作液。該溶液可以在_80°C冷凍數(shù)月，然后融化，并通過0.22μπι濾膜過 濾。然后將12.5mL的XMuLV MVP儲液滴加到250mL的過濾的操作液(5 %峰值v/v)。取lmL該添 加了MVP的操作液樣品，用于隨后的定量。將所述操作液(含XMuLV MVP)以30psi加壓通過 Vpro細(xì)小病毒過濾，收集過濾物。取lmL的該過濾物樣品(操作液）。
[0065]以MVP稀釋液制備系列XMuLV MVP操作液的系列稀釋液，操作液的MVP濃度為1X 109、lx 107、lx 105、以及l(fā)x 103MVP/ml的稀釋液。然后向涂覆抗XMuLV env表位的抗體的微 孔加入50yL的各稀釋液。然后孵育1小時，并以lx PBS清洗3次。加入TMB底物溶液，通過加入 停止液停止反應(yīng)。測量450nm處的光密度(0D)，以生成反應(yīng)0D和MVP濃度關(guān)系的數(shù)據(jù)曲線。以 下表3顯不0D45Q結(jié)果。
[0066] 表3:XMuLV MVP去除研究的0D45Q測量值
[0067] 通過細(xì)小病毒過濾出來去除的XMuLV MVP的數(shù)量可以試驗(yàn)定量。如上系列稀釋液 樣品所述，將lmL的操作液樣品（添加 MVP后）和操作收集物進(jìn)行相同的ELISA方法。將所得 〇D45Q值帶入最符合表3數(shù)據(jù)的等式，預(yù)測過濾前后溶液中MVP的數(shù)量。如實(shí)施例6所述，根據(jù) 定量去除病毒領(lǐng)域的常規(guī)方法，由該數(shù)據(jù)可以計算XMuLV MVP LRV。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 確定從溶液中去除的MVP的數(shù)量的方法，其特征在于，所述方法包括步驟： a) 向溶液中添加 MVP; b) 通過純化技術(shù)處理溶液；以及 c) 定量從溶液中去除的MVP的量。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述溶液包含目的生物物質(zhì)。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述目的生物物質(zhì)為抗體、非抗體、疫苗、 核酸制品、以及血液或血漿衍生物。4. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于，通過處理制備所述生物物質(zhì)，其中，所 述處理為細(xì)胞培養(yǎng)方法或發(fā)酵方法，并且，所述處理利用人細(xì)胞、動物細(xì)胞、植物細(xì)胞、昆蟲 細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞、酵母細(xì)胞或細(xì)菌細(xì)胞。5. 根據(jù)權(quán)利要求2-4任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，通過權(quán)利要求1的步驟b)純化 所述目的生物物質(zhì)。6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述純化技術(shù)為層析、過濾、超 濾、離心、或病毒滅活技術(shù)。7. 根據(jù)權(quán)利要求1-6任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，在步驟a)中的所述溶液中的 MVP的量大于b)步驟后的溶液中的MVP的量。8. 根據(jù)權(quán)利要求1-7任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述MVP包括病毒殼蛋白、包膜 蛋白、或病毒殼蛋白和病毒包I吳蛋白。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，在細(xì)菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、植物細(xì)胞、昆蟲細(xì) 胞、動物、或哺乳動物細(xì)胞中制備所述病毒殼蛋白或包膜蛋白。10. 根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的方法，其特征在于，病毒包膜蛋白或殼蛋白來自微小病毒 科或逆轉(zhuǎn)錄病毒科。11. 根據(jù)權(quán)利要求8-10任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述病毒殼蛋白或包膜蛋白 進(jìn)一步包括異源表位。12. 根據(jù)權(quán)利要求1-11任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述MVP包括離體核酸。13. 根據(jù)權(quán)利要求1-12任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，確定從溶液中去除的MVP的 數(shù)量包括利用用于確定溶液中M V P數(shù)量的定量技術(shù)，包括E L I S A、P C R、納米圖像 (nano imaging )、焚光、酶促法、顯微法、分光光度法、透射電鏡，或western雜交技術(shù)。14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述定量技術(shù)使用能結(jié)合MVP表面上存 在的殼蛋白表位、包膜蛋白表位、或異源表位的抗體。15. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述定量技術(shù)使用能夠結(jié)合與MVP連接 的連接分子的抗體。16. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述定量技術(shù)使用與MVP連接的分子，能 結(jié)合所述分子的抗體，或能結(jié)合與所述分子連接的核酸片段的引物。17. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述定量技術(shù)使用能結(jié)合MVP內(nèi)包含的 離體核酸序列的引物。18. 根據(jù)權(quán)利要求1-17任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述方法進(jìn)一步包括： a) 向溶液中添加第二種MVP; b) 通過純化技術(shù)處理溶液；以及 C)定量從溶液中去除的第二種MVP的量。19. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其特征在于，將第一種MVP和第二種MVP同時或順序加 入所述溶液中。20. 根據(jù)權(quán)利要求18或19任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，向所述溶液中加入兩種或 多種附加種類的MVP。21. -種試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括： a) 至少一個含MVP儲液的容器； b) 至少一個含定量溶液的容器。22. 根據(jù)權(quán)利要求21所述的試劑盒，其特征在于，所述定量溶液包括能夠結(jié)合MVP或結(jié) 合與MVP連接的分子的抗體。23. 根據(jù)權(quán)利要求21或22所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒進(jìn)一步包括第二抗體 溶液，所述第二抗體能夠結(jié)合能與MVP結(jié)合的抗體，或者結(jié)合能與MVP連接的分子。24. 根據(jù)權(quán)利要求21或22所述的試劑盒，其特征在于，所述抗體與酶連接。25. 根據(jù)權(quán)利要求23所述的試劑盒，其特征在于，所述第二抗體與酶連接。26. 根據(jù)權(quán)利要求21-25中任意一項(xiàng)所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒進(jìn)一步包 括含固定的抗體或能與MVP連接的分子的ELISA板。27. 根據(jù)權(quán)利要求21-26中任意一項(xiàng)所述的試劑盒，其特征在于，所述定量溶液包括引 物，所述引物能結(jié)合離體核酸序列，或結(jié)合能與分子連接的核酸片段，所述分子能與MVP連 接。28. 根據(jù)權(quán)利要求21-27中任意一項(xiàng)所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒進(jìn)一步包 括能結(jié)合MVP分子的溶液。29. 根據(jù)權(quán)利要求21-28中任意一項(xiàng)所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括用于 實(shí)施ELISA或PCR技術(shù)的附加反應(yīng)試劑。
【文檔編號】B01D35/00GK105899684SQ201480049583
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2014年9月9日
【發(fā)明人】大衛(wèi)·賽特琳, 阿魯·達(dá)爾
【申請人】默克維溶液