一種金剛烷胺人工抗原及其制備方法與應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種金剛烷胺半抗原和相應(yīng)的人工抗原，同時(shí)本發(fā)明也公開了所述金剛烷胺半抗原和相應(yīng)的人工抗原的制備方法及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的金剛烷胺半抗原是式1所示產(chǎn)物，用式1所示產(chǎn)物與載體蛋白連接可以得到金剛烷胺抗原。所述金剛烷胺抗原可應(yīng)用于制備金剛烷胺特異性抗體。本發(fā)明制備方法簡便可行、成本較低，半抗原產(chǎn)率較高。本發(fā)明的金剛烷胺人工抗原，通過免疫動(dòng)物可產(chǎn)生了針對金剛烷胺的特異性抗體，可用于制備檢測金剛烷胺殘留的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，具有簡單、快速、處理樣品量大、靈敏度高、特異性強(qiáng)等諸多優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】
一種金剛烷胺人工抗原及其制備方法與應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于食品安全檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種金剛烷胺半抗原、抗原制備方 法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 金剛燒胺（Amantadine，l-adamantanamine)合成于1960年，又稱金剛胺、三環(huán)癸 胺，它是1-金剛胺或1-氨基金剛烷的有機(jī)化合物，意味著它的結(jié)構(gòu)組成是一個(gè)金剛烷主鏈 和四個(gè)次甲基位中有一個(gè)取代氨基。為白色結(jié)晶性粉末，味苦，易溶于水或乙醇。主要用于 由甲型流感病毒所致的呼吸道感染的預(yù)防以及用于甲型流感病毒感染患者的治療，美國于 亞洲感冒流行的1966年批準(zhǔn)其作為預(yù)防藥，并于1976年在預(yù)防藥的基礎(chǔ)上確認(rèn)其為治療 藥，此外也用于帕金森綜合征;其抗病毒譜較窄，對A型流感病毒有明顯抑制作用，用藥后可 明顯降低死亡率。2005年，報(bào)道稱，中國家禽農(nóng)戶已經(jīng)使用金剛烷胺來保護(hù)禽類抗禽流感， 那時(shí)起，中國政府監(jiān)管機(jī)構(gòu)已經(jīng)禁止它作為獸藥使用。
[0003] 金剛烷胺對成年患者的療效及安全性已得到廣泛認(rèn)同。但治療劑量與產(chǎn)生副作用 的劑量很接近，對高齡者及有慢性心肺疾病或腎臟疾病者的劑量和給藥計(jì)劃很難確定，因 此尚未在臨床上推廣應(yīng)用。在日本，金剛烷胺一直作為帕金森病的治療藥，直到1998年才被 批準(zhǔn)用于流感病毒A型感染性疾病的治療。常見不良反應(yīng)有中樞神經(jīng)系統(tǒng)和胃腸道反應(yīng)，表 現(xiàn)為頭暈?zāi)垦?、注意力不集中、頭痛、失眠、焦慮和食欲減退、惡心等，停藥后不良反應(yīng)立即 消失，少見的不良反應(yīng)有便秘、口鼻干燥等。農(nóng)業(yè)部2005年發(fā)出《關(guān)于清查金剛烷胺等抗病 毒藥物的緊急通知》，明確要求金剛烷胺、金剛乙胺等立即停止生產(chǎn)、經(jīng)營和使用，違者按生 產(chǎn)、經(jīng)營假獸藥和使用禁用獸藥處理。因此，為確保動(dòng)物源性食品的安全和對外出口貿(mào)易的 發(fā)展，建立準(zhǔn)確可靠，靈敏度高的定性定量方法是十分必要的。
[0004] 國外現(xiàn)已開發(fā)出檢測金剛烷胺的酶聯(lián)免疫試劑盒，但是國內(nèi)生產(chǎn)的試劑盒在準(zhǔn)確 性、靈敏度、特異性等方面還不能完全達(dá)到檢測的要求。本發(fā)明公開的金剛烷胺半抗原、抗 原為進(jìn)一步研制金剛烷胺抗體及金剛烷胺酶聯(lián)免疫試劑盒提供了原料。金剛烷胺酶聯(lián)免疫 反應(yīng)試劑盒利用競爭性酶聯(lián)免疫反應(yīng)原理，對組織(牛肉、雞肉和豬肉）和其他樣品中金剛 烷胺的殘留進(jìn)行定量檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種金剛烷胺半抗原、抗原制備方法及其應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明提供的金剛烷胺半抗原，是式1所示化合物： 式1。
[0007] 本發(fā)明還公開了式1所示產(chǎn)物的制備方法，包括如下步驟： 0.94g金剛烷胺鹽酸鹽溶于30ml無水吡啶，加入馬來酸酐0.49g，溶解后，加入4-二甲氨 基吡啶10mg，70°C回流反應(yīng)3h，旋蒸除去吡啶，加去離子水10ml，冰醋酸調(diào)pH5.0，析出大量 沉淀，過濾，水洗沉淀，干燥后得半抗原。
[0008] 本發(fā)明提供的金剛烷胺抗原，是將式1所示產(chǎn)物和載體蛋白偶聯(lián)得到的偶聯(lián)物。
[0009] 本發(fā)明還保護(hù)所述金剛烷胺抗原的制備方法，包括如下步驟： 稱取5.57mg半抗原溶于lml DMF，加入EDC 4.3mg，NHS 5.2mg，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2h;50mg BSA溶于5ml 0.1M碳酸氫鈉緩沖液，將上述活化藥物逐滴加入到蛋白溶液中，室溫?cái)嚢柽^ 夜，PBS 4度透析72小時(shí)，期間換透析液6次。將透析液在無菌條件下過0.22 μπι孔徑的濾膜， 分裝于安培瓶中，-20度保存。
[0010]同法制備包被原。
[0011]常用載體蛋白均可采用，包括牛血清白蛋白（BSA)，卵清蛋白（OVA)，人血清白蛋白 (HSA)，鼠血清白蛋白（MSA)，甲狀腺蛋白（TG)或血藍(lán)蛋白（KLH)等。
[0012] 所述金剛烷胺抗原可以作為免疫原免疫動(dòng)物制備金剛烷胺特異性抗體，也可以作 為包被原制備酶標(biāo)板。
[0013] 所述抗體具體可為單克隆抗體。
[0014] 式1所示產(chǎn)物、所述金剛烷胺抗原、所述抗體均可應(yīng)用于檢測金剛烷胺。
[0015] 本發(fā)明還公布了應(yīng)用金剛烷胺抗原和金剛烷胺單克隆抗體制備得到的酶聯(lián)免疫 試劑盒。
[0016] 所述酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，是由包被有金剛烷胺抗原的酶標(biāo)板、酶標(biāo)抗體工作液、 金剛烷胺系列標(biāo)準(zhǔn)品、底物顯色液、終止液、濃縮復(fù)溶液、濃縮洗滌液。
[0017] 本發(fā)明依靠免疫學(xué)、免疫化學(xué)基本原理和殘留分析技術(shù)手段，設(shè)計(jì)、合成小分子目 標(biāo)分析物半抗原，并與載體蛋白偶聯(lián)，制備有效人工抗原。本發(fā)明制備方法簡便可行、成本 較低，半抗原產(chǎn)率較高。本發(fā)明的金剛烷胺人工抗原，通過免疫動(dòng)物可產(chǎn)生了針對金剛烷胺 的特異性抗體，用于快速檢測食品中的金剛烷胺殘留。
【附圖說明】
[0018] 圖1為金剛烷胺半抗原的質(zhì)譜檢測結(jié)果。
[0019] 圖 2 為BSA 的 MALDI-TOF-MAS 圖。
[0020] 圖3為金剛烷胺抗原"金剛烷胺半抗原+BSA"的MALDI-TOF-MAS圖。
[0021] 圖4為金剛烷胺酶聯(lián)免疫檢測試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn) 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購買得到的。
[0023]實(shí)施例1、金剛烷胺半抗原的制備 一、金剛烷胺半抗原的制備 0.94g金剛烷胺鹽酸鹽溶于30ml無水吡啶，加入馬來酸酐0.49g，溶解后，加入4-二甲氨 基吡啶10mg，70°C回流反應(yīng)3h，旋蒸除去吡啶，加去離子水10ml，冰醋酸調(diào)pH5.0，析出大量 沉淀，過濾，水洗沉淀，干燥后得半抗原。
[0024]二、金剛烷胺半抗原的鑒定 對所得產(chǎn)品進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，-MS: Μ-1=248.7 (圖1)。
[0025]結(jié)果顯示其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如式1所示，即為金剛烷胺半抗原。
[0026] 式1。
[0027] 實(shí)施例2、金剛烷胺人工抗原的制備和鑒定 一、金剛烷胺免疫抗原的合成 稱取5.57mg半抗原溶于lml DMF，加入EDC 4.3mg，NHS 5.2mg，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2h; 50mg BSA溶于5ml 0.1M碳酸氫鈉緩沖液，將上述活化藥物逐滴加入到蛋白溶液中，室溫?cái)嚢柽^ 夜，PBS 4度透析72小時(shí)，期間換透析液6次。將透析液在無菌條件下過0.22 μπι孔徑的濾膜， 分裝于安培瓶中，-20度保存。
[0028]同法制備包被原。
[0029]二、金剛烷胺人工抗原的鑒定 免疫原 MALDI-T0F-MS 鑒定結(jié)果顯示偶聯(lián)比為：R=(AMD-MH-BSA)-(BSA)/249.7 = (73828.009-67485.901 )/249.7=25.40(圖2和圖3)。即免疫原中，所述金剛烷胺半抗原（式 I)與牛血清白蛋白（BSA)偶聯(lián)的摩爾比為25.40:1。
[0030] 實(shí)施例3、酶標(biāo)單抗的制備和特異性鑒定 一、金剛烷胺單抗的制備 1、用上述制備出的免疫原按l〇〇yg/只，以生理鹽水溶解免疫原與弗氏完全佐劑等體積 混勻，頸背部皮下注射免疫6~8周齡Balb/c雌鼠，初次免疫后第7、14、28天以免疫原與弗氏 不完全佐劑等體積混勻，各追加免疫一次，融合前3天以免疫復(fù)合物lOOyg/只，不加弗氏佐 劑再追加免疫一次。
[0031] 2、按常規(guī)方法進(jìn)行，取免疫小鼠的脾細(xì)胞與處于對數(shù)生長期的小鼠骨髓瘤細(xì)胞 (SP2/0)混合，然后在45 s內(nèi)緩慢加入預(yù)熱的融合劑(PEG4000)進(jìn)行融合，用HAT培養(yǎng)基懸浮 均勻，再加入適量的飼養(yǎng)細(xì)胞，培養(yǎng)于96孔培養(yǎng)板，于37 °C，5 % C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，5天后用 HT培養(yǎng)基半換液，9天時(shí)候進(jìn)行全換液。
[0032] 3、細(xì)胞融合后，待細(xì)胞長到培養(yǎng)孔面積的1/4時(shí)，采用分步篩選法篩選雜交瘤細(xì) 胞。初選采用間接ELISA方法，以包被抗原(預(yù)先用方陣法常規(guī)滴定其最佳包被濃度和陽性 血清稀釋度)包被酶標(biāo)板，加入被測孔培養(yǎng)上清，孵育，清洗后加入羊抗鼠 IgG-HRP和IgM-HRP，(PD進(jìn)行顯色反應(yīng)。篩選出的陽性孔再用間接競爭ELISA方法篩選，先將細(xì)胞上清與100 yg/mL的金剛烷胺等體積混合，37°C水浴作用30min，再加入到包被好的酶標(biāo)板中。同時(shí)用 PBS取代金剛烷胺作對照，其余步驟同上。若經(jīng)金剛烷胺阻斷后的0D45Qnm值下降到對照孔的 50%以下，則判為陽性，經(jīng)2~3次檢測都為陽性的孔，立即用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆化。 [0033] 4、將2~3次亞克隆建株后的雜交瘤細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，收集上清液用間接ELISA測定效 價(jià)，凍存;并取8~10周齡Balb/c小鼠腹腔注射液體石蠟0.5mL/只，7~10日后腹腔注射雜交瘤 細(xì)胞1~2X106/只，7~10日后抽取小鼠腹水，離心取上清，測定效價(jià)，并凍存?zhèn)溆谩?br>[0034]二、酶標(biāo)抗體的制備 1、 稱取辣根過氧化物酶(HRP)2 mg溶解于0.5 mL水中，加入0.5 mL 0.06 mol/L NaI〇4 溶液，4°C避光作用30 min; 2、 加入160 mmol/L的乙二醇0.5mL，室溫作用30 min; 3、 加入步驟一制備的金剛烷胺單抗2 mg，混勻后裝入處理過的透析袋中，置1000 mL的 0 · 05 mmo 1/L碳酸鈉緩沖液中透析，4°C過夜； 4、 透析液吸至10 mL的離心管中，加0.25mL 5g/L的NaBH4溶液，混勻后置4°C2 h; 5、 加入等體積的飽和硫酸銨溶液，4°C作用30 min后4°C下3000 r/min離心25 min，棄 上清； 6、 將沉淀溶于1.5 mL0.02 mol/L pH 7.4的PBS中，吸入透析袋內(nèi)，在0.02mol/L pH 7.4 PBS透析，4°C過夜（中途更換PBS 3次）； 7、 將透析袋中液體吸至微量離心管中，4°C下10000r/min離心30min，將上清液吸出，加 等量甘油，混勻，-20 °C保存?zhèn)溆谩?br>[0035]三、酶標(biāo)金剛烷胺抗體效價(jià)的測定 金剛燒胺標(biāo)準(zhǔn)品購自Sigma公司。
[0036] 用方陣滴定法確定金剛烷胺包被抗原和步驟一制備的單抗的工作濃度，金剛烷胺 包被抗原的工作濃度為2.5yg/mL，單克隆抗體的工作濃度為1:60000。
[0037] 用不同濃度的金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)品溶液做實(shí)驗(yàn)溶液，其濃度如下：0、0.5、1.5、4.5、 13 · 5、40 · 5yg/L。采用8組平行試驗(yàn)(n=8)。
[0038] 競爭性ELISA方法： (1)用上述工作濃度的金剛烷胺抗原包被酶標(biāo)板，將金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)品實(shí)驗(yàn)溶液與酶標(biāo) 抗體溶液同時(shí)加入酶標(biāo)板微孔中，同時(shí)設(shè)置空白孔(將添加的抗體溶液換成高純水，其它一 致）和陰性對照孔(將標(biāo)準(zhǔn)品實(shí)驗(yàn)溶液用PBS溶液代替，其它一致），25°C避光環(huán)境中反應(yīng) 30min； (2 )倒出孔內(nèi)液體，用洗滌液洗滌3~5次，將酶標(biāo)板倒置在吸水紙上拍干； (3 )加入底物顯色溶液到酶標(biāo)板微孔中，25 °C避光環(huán)境中反應(yīng)15min; (4)加入終止液，輕輕振蕩混勻，用酶標(biāo)儀在波長450nm處測定0D值。
[0039] 以0D值為縱坐標(biāo)，以金剛烷胺實(shí)驗(yàn)溶液濃度的loglO值為橫坐標(biāo)，繪制半對數(shù)標(biāo)準(zhǔn) 曲線圖。標(biāo)準(zhǔn)曲線具有完整的反S形狀，并具有上平臺(tái)和下平臺(tái)，標(biāo)準(zhǔn)曲線的平行測定次數(shù)8 次，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性良好，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(變異系數(shù))均在1 〇 %以內(nèi)。
[0040] 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出半數(shù)抑制量(IC5Q)，確定檢測靈敏度。
[0041] 抑制率用以下式計(jì)算：
式中：0Dmax:為個(gè)力μ你怔漢冗俚，υυχ乃你怔面ΧΗ、」?jié)h冗俚，uumin為空白對照 孔的吸光值。
[0042]由上述公式計(jì)算得金剛烷胺抗體在緩沖液中的半數(shù)抑制量(IC50)為1.3yg/L。
[0043]實(shí)施例4、檢測金剛烷胺的酶聯(lián)免疫試劑盒及其制備 一、酶聯(lián)免疫試劑盒由下述物質(zhì)組成： 1、 包被金剛烷胺半抗原的酶標(biāo)板； 2、 酶標(biāo)金剛烷胺抗體工作液:實(shí)施例3中所述酶標(biāo)抗體溶液； 3、 金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)品:金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度分別為0、0.5、1.5、4.5、13.5、40.5yg/L; 4、 底物顯色液：由A液和B液組成，A液為2%過氧化脲的水溶液，B液為1%四甲基聯(lián)苯胺 (TMB)的水溶液； 5、 終止液:0.2M硫酸水溶液； 6、 濃縮洗滌液:每1升所述洗滌液是按照如下方法配制得到的:將10mL吐溫-20、5g疊氮 化鈉和990mL磷酸鹽緩沖液混合，得到所述洗滌液;所述磷酸鹽緩沖液的濃度為0.01M pH值 為 7.4; 二、包被有AMD-0VA的酶標(biāo)板及其制備 包被AMD-0VA的聚苯乙烯酶標(biāo)板：用0.05M的碳酸鹽溶液將抗原稀釋至2.5yg/mL，包被 96孔聚苯乙烯酶標(biāo)板，每孔100yL，37°C溫育2h，傾去包被液，用洗滌液洗滌3次，每次10s， 拍干，然后在每孔中加入150yL封閉液，37 °C溫育2h，傾去孔內(nèi)液體，干燥后用鋁膜真空密封 保存。
[0044]包被緩沖液:pH9.6，0.05mol/L的碳酸鈉緩沖液； 封閉液:每1升封閉液按照如下方法配制：將5mL馬血清、lg疊氮化鈉、30g酪蛋白混合， 用磷酸鹽緩沖液溶解并定容至l〇〇〇mL，得到封閉液;其中，磷酸鹽緩沖液的濃度為0.02M， pH值為7.2。
[0045]三、試劑盒檢測方法 (一)樣品前處理 雞肉、豬肉、鴨肉、雞蛋(稀釋系數(shù):2) 1、 準(zhǔn)確稱取2±0.01 g均質(zhì)后的樣品于50 mL離心管中； 2、 加入1 mL 1%乙酸溶液、7mL乙腈，劇烈渦動(dòng)3 min; 3、 室溫（25±2 Γ)下4000 g 離心5min; 4、 取2 mL上清液于干凈離心管中； 5、 60-70 °C水浴氮?dú)獯蹈桑?6、 加入0.5mL樣品稀釋液，劇烈渦動(dòng)30 s; 7、 取200 uL上清液于新的離心管中，加入200UL樣品稀釋液，劇烈渦動(dòng)30 s; 8、 取50 yL進(jìn)行檢測。
[0046](二)用試劑盒檢測 1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 向包被有AMD-0VA的酶標(biāo)板微孔中加入金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)品溶液50yL，然后加入酶標(biāo)抗體 工作液50yL/孔，輕輕振蕩混合均勻，用蓋板膜蓋板后置25°C避光環(huán)境中反應(yīng)30min。小心揭 開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，加入洗滌工作液250mL/孔，充分洗滌4~5次，每次間隔10s，潑掉 板孔內(nèi)洗滌液，用吸水紙拍干。加入底物A液50yL/孔、底物B液50μ!7孔，輕輕振蕩混勻，25 °C 恒溫箱避光顯色15min，每孔加入終止液50yL，輕輕振蕩混勻，用酶標(biāo)儀，測定每孔吸光度 值。
[0047]用每個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光度平均值除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品溶液(0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光 度值(Bo)再乘以100%，得到百分吸光度值。以金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)品濃度(yg/L)的半對數(shù)值為X 軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖4所示。
[0048]百分吸光度值(％)=(Β/Β0) Χ100% 2、樣品中金剛烷胺濃度的測定 用每個(gè)檢測樣本溶液的吸光度平均值(Β)除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品溶液(0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值 (Bo)再乘以100%，得到百分吸光度值。相對應(yīng)每一個(gè)檢測樣本溶液的百分吸光度值，則可從 標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出檢測樣本溶液的吸光度值，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度值換算出樣本溶液中 金剛烷胺的殘留量，最后再乘以各樣品前處理過程的稀釋倍數(shù)，即可計(jì)算出樣品中金剛烷 胺的濃度。
[0049]四、試劑盒檢測效果評(píng)價(jià) (一)準(zhǔn)確度和精密度試驗(yàn) 向不含金剛烷胺的雞肉樣品中添加金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)品，使金剛烷胺標(biāo)準(zhǔn)品在樣品中的終 濃度分別為l、2、4yg/L;將添加后的樣品分別按照實(shí)驗(yàn)三中所述方法進(jìn)行前處理，得到檢測 樣本溶液。
[0050] 從三個(gè)不同批次的試劑盒中各抽取3個(gè)試劑盒進(jìn)行檢測，檢測方法如實(shí)驗(yàn)三中所 述，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次，分別計(jì)算變異系數(shù)。結(jié)果分別見表1。
[0051] 表1準(zhǔn)確度和精密度試驗(yàn)結(jié)果
批內(nèi)變異系數(shù):同一次測定中各平行樣本的變異系數(shù)。
[0052] 批間變異系數(shù):同一樣本在不同批次測定結(jié)果的變異系數(shù)，取其平均值。
[0053] 結(jié)果表明：雞肉樣品的平均添加回收率在86.9~97.3%，批內(nèi)變異系數(shù)在6.4~ 13.6%，批間變異系數(shù)在9.8~10.1 %。
[0054](二)試劑盒保存期 試劑盒保存條件為2~8°C，經(jīng)過15個(gè)月的測定，試劑盒的最大吸光度值(0標(biāo)準(zhǔn)），50%抑 制濃度、金剛烷胺添加實(shí)際測定值均在正常范圍之內(nèi)?？紤]到運(yùn)輸和使用過程中，會(huì)有非正 常保存條件出現(xiàn)，將試劑盒在37°C保存的條件下放置9天，進(jìn)行加速老化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明該 試劑盒的各項(xiàng)指標(biāo)完全符合要求?？紤]到試劑盒冷凍情況發(fā)生，將試劑盒放入_20°C冰箱冷 凍9天，測定結(jié)果也表明試劑盒各項(xiàng)指標(biāo)完全正常。從以上結(jié)果可得出試劑盒可以在2~8°C 至少可以保存12個(gè)月以上。
[0055](三)交叉反應(yīng)率試驗(yàn) 選擇與AMD結(jié)構(gòu)或功能相似的其他藥物進(jìn)行交叉反應(yīng)試驗(yàn)，通過各種藥物的標(biāo)準(zhǔn)曲線 分別得到其50%抑制濃度。用下式計(jì)算試劑盒對其它類似物的交叉反應(yīng)率。與其他藥物的交 叉反應(yīng)率越小，說明金剛烷胺酶聯(lián)免疫檢測試劑盒對金剛烷胺的檢測特異性越好。結(jié)果見 表2。
[0056] 表2金剛烷胺試劑盒交叉反應(yīng)率
試驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明試劑盒對金剛烷胺的交叉反應(yīng)率為100%、阿莫西林、氯唑西林、 苯唑西林、頭孢噻呋的交叉反應(yīng)率均小于1%，所以試劑盒對金剛烷胺的特異性好，即本發(fā)明 試劑盒可以檢測金剛烷胺。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種金剛燒胺半抗原，為式I所示產(chǎn)物： 式1。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的式1所示產(chǎn)物的制備方法，包括如下步驟:0.94g金剛燒胺鹽酸 鹽溶于30ml無水化晚，加入馬來酸酢0.49g，溶解后，加入4-二甲氨基化晚IOmg，70°C回流反 應(yīng)化，旋蒸除去化晚，加去離子水IOml，冰醋酸調(diào)P冊.0，析出大量沉淀，過濾，水洗沉淀，干 燥后得半抗原。3. -種金剛燒胺抗原，是將式1所示產(chǎn)物和載體蛋白偶聯(lián)得到的偶聯(lián)物。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的金剛燒胺抗原，其特征在于，所述載體蛋白包括牛血清白蛋 白，卵清蛋白，人血清白蛋白，鼠血清白蛋白，甲狀腺蛋白或血藍(lán)蛋白。5. 權(quán)利要求3所述金剛燒胺抗原的制備方法，包括如下步驟：稱取5.57mg半抗原溶于 Iml DMF，加入邸C 4.3mg，N服5.2mg，室溫?cái)埌璺磻?yīng)化;50mg BSA溶于5ml 0.1M碳酸氨鋼緩 沖液，將上述活化藥物逐滴加入到蛋白溶液中，室溫?cái)埌柽^夜，PBS 4°C透析72小時(shí)，期間換 透析液6次;將透析液在無菌條件下過0.22 WIi孔徑的濾膜，分裝于安培瓶中，-20°C保存，同 法制備包被原。6. 權(quán)利要求3所述金剛燒胺抗原在制備金剛燒胺特異性抗體中的應(yīng)用。7. 應(yīng)用權(quán)利要求3所述金剛燒胺抗原制備得到的特異性抗體。8. 權(quán)利要求1所述產(chǎn)物、權(quán)利要求3所述金剛燒胺抗原、權(quán)利要求7所述抗體在檢測金剛 燒胺中的應(yīng)用。9. 應(yīng)用權(quán)利要求1所述產(chǎn)物、權(quán)利要求3所述金剛燒胺抗原、權(quán)利要求7所述特異性抗體 制備得到的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒。10. 權(quán)利要求9所述酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其特征在于，它包括:包被有金剛燒胺抗原的 酶標(biāo)板、酶標(biāo)抗體工作液、金剛燒胺系列標(biāo)準(zhǔn)品、底物顯色液、終止液、濃縮復(fù)溶液、濃縮洗 涂液。
【文檔編號(hào)】C07C233/09GK105906522SQ201610280030
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年4月29日
【發(fā)明人】秦譽(yù), 丁亞芳, 李延山, 張秀芹, 吳雨洋, 王照鵬, 楊柳, 李向梅, 聶麗, 賈良曦
【申請人】北京維德維康生物技術(shù)有限公司