異槲皮苷制備方法及其抗哮喘方面的用圖
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物藥物領(lǐng)域，具體涉及異槲皮苷(槲皮素?3?O?β?D?吡喃葡萄糖苷，I)的生物轉(zhuǎn)化制備方法，本發(fā)明還公開了其在抗哮喘方面的用途。
【專利說(shuō)明】
異槲皮苷制備方法及其抗哮喘方面的用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及生物藥物領(lǐng)域，具體涉及異槲皮苷(槲皮素-3-〇-i3-D-吡喃葡萄糖苷， I)的生物轉(zhuǎn)化制備方法，本發(fā)明還公開了其在抗哮喘方面的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 哮喘是是一種由嗜酸性粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞(Th2)等炎癥細(xì)胞、肥大細(xì)胞、氣道上皮 細(xì)胞參與的氣道慢性過(guò)敏反應(yīng)炎癥性疾病。哮喘是一種常見(jiàn)病、多發(fā)病，對(duì)人類健康造成了 很多不利影響。目前全球哮喘患者約3億人，我國(guó)哮喘患者約3000萬(wàn)，每年有近20萬(wàn)人死于 哮喘，且大量研究表明近20年內(nèi)哮喘的患病率尚有逐漸增高的趨勢(shì)。哮喘的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜， 至今尚未完全明確。在當(dāng)前的哮喘治療中，一般使用糖皮質(zhì)激素來(lái)控制氣道的慢性炎癥。然 而，激素類藥物只能減輕癥狀，無(wú)法針對(duì)哮喘的根本原因進(jìn)行治療，并且長(zhǎng)期使用副作用較 大。因此天然來(lái)源的小分子藥物的開發(fā)和結(jié)構(gòu)改造，及其藥理作用機(jī)制的研究成為當(dāng)前新 藥研發(fā)的熱點(diǎn)。槲皮素是黃酮類化合物中最具代表性的一種黃酮醇類化合物，在自然界中 分布廣泛，具有抗氧化、抗炎、保護(hù)心血管系統(tǒng)等多種生物活性。研究表明，槲皮素可調(diào)節(jié) Thl/Th2平衡，降低組胺含量和磷脂酶A2的活性，改善嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，抑 制氣管收縮，達(dá)到治療哮喘的目的。然而槲皮素水溶性較低，生物利用度較差，限制了其臨 床應(yīng)用。
[0003]微生物轉(zhuǎn)化是利用微生物產(chǎn)生的特異酶對(duì)外源性化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾的特定生 化反應(yīng)。微生物轉(zhuǎn)化具有高度的立體結(jié)構(gòu)選擇性，能專一地催化特定的反應(yīng)、無(wú)需繁瑣的保 護(hù)與脫保護(hù)操作，具有高效、環(huán)保的優(yōu)點(diǎn)，是天然活性化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾的一種有效方 法。因此，我們選擇微生物轉(zhuǎn)化的方式，對(duì)槲皮素的3位羥基進(jìn)行糖基化修飾，以提高生物利 用度，同時(shí)保持或增加其活性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明公開了結(jié)構(gòu)式I的化合物：
[0005]
[0006] 命名為異槲皮苷(槲皮素-3-0-?Η)_吡喃葡萄糖苷）。本發(fā)明同時(shí)也包括結(jié)構(gòu)式I的 化合物的溶劑化物。其13C-NMR(500MHz，DMS0)與底物槲皮素相比增加了六個(gè)碳信號(hào)，分別是 δαοο · 8，SC74 · 0，δ〇76 · 4，SC69 · 9，SC77 · 5，δ〇60 · 9ppm 這與 D-葡萄糖的化學(xué)位移值相符。4-NMR(500MHz，DMS0)與底物槲皮素相比，在化學(xué)位移δ3.09-δ5.46處，出現(xiàn)了D-吡喃葡萄糖的 氫及羥基氫信號(hào)：63.0943.59(6!1，1114111上的!〇45.46(1!1，(1，1 = 7.0他，!1-1〃）；端基質(zhì)子 的化學(xué)位移在5.46處，可以判斷糖基化位點(diǎn)位于3位，端基質(zhì)子的耦合常數(shù)為7.0Hz，表明連 接的D-葡萄糖立體構(gòu)型為β型。藥理試驗(yàn)表明，本發(fā)明的式I的化合物具有抗哮喘的活性。
[0007] 本發(fā)明的式I化合物優(yōu)選用微生物轉(zhuǎn)化法，以槲皮素為底物進(jìn)行轉(zhuǎn)化制備，方法如 下：
[0008]
[0009] 為尋找槲皮素轉(zhuǎn)化生成異槲皮苷的適宜菌種，本發(fā)明篩選了多種微生物，結(jié)果發(fā) 現(xiàn)保藏號(hào)為NRRL 1086的菌種對(duì)槲皮素有較好的轉(zhuǎn)化能力(見(jiàn)表1)。
[0010] 篩選所用的液體培養(yǎng)基為復(fù)合馬鈴薯培養(yǎng)基(PDA): 200克新鮮去皮馬鈴薯切成碎 塊，加蒸餾水適量煮沸15min后過(guò)濾，濾液加葡萄糖20g、KH2P〇4 3 · Og、MgS〇4 0 · 75g、Vbi 10.0 mg，加蒸餾水定容至1. OL，加 NaOH或HC1調(diào)pH值至6.0，150mL三角燒瓶每瓶分裝30mL液 體培養(yǎng)基，121°C、0.15MPa滅菌20min。
[0011] 篩選菌種時(shí)，保存菌種所用斜面培養(yǎng)基是在上述液體培養(yǎng)基加入1.5 %的瓊脂， 15mL具塞試管每管5mL，121 °C、0.15MPa滅菌20min冷卻后制成。
[0012] 菌種的保存與活化:菌種活化采用兩步活化法，參見(jiàn):Nair，M. S. R.，and Basile， D.V.Bioconversion of artenium B to artmisinn·天然產(chǎn)物雜志（Jounal of Natural Products) 1993，56(9): 1559。先將菌種接種于液體培養(yǎng)基，28°C、180r/min旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)24-48h 后，轉(zhuǎn)接于另一液體培養(yǎng)基，接種量1 -5 % (V/V)，同條件培養(yǎng)24h后加樣。
[0013]樣品的制備及加樣：取槲皮素溶于乙醇，配成l〇mg/mL溶液備用；每瓶經(jīng)兩步活化 的菌液(30mL)加0.5mL樣品溶液，使每瓶菌液含槲皮素5mg。同條件培養(yǎng)120h后，中止反應(yīng)， 過(guò)濾菌體，發(fā)酵液用等量的乙酸乙酯萃取3~5次，合并萃取液、回收乙酸乙酯;得到萃取浸 膏，菌體用乙醇提取3次，合并提取液，回收乙醇，得到提取浸膏，將兩種浸膏合并，加少許乙 酸乙酯溶解后備薄層鑒定用。
[0014] 空白對(duì)照:空白對(duì)照設(shè)陽(yáng)性對(duì)照(底物+培養(yǎng)基）、陰性對(duì)照(培養(yǎng)基+菌）、溶劑對(duì)照 (培養(yǎng)基+菌+乙醇），培養(yǎng)和萃取條件同上。
[0015] 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的薄層鑒定：
[0016] 薄層條件：
[0017]薄層板:0.7 %的CMC-Na制成的硅膠G板。
[0018]展開劑:氯仿：甲醇：甲酸(85:15:0.5)上行展開。
[0019] 顯色劑:5%三氯化鐵乙醇溶液。
[0020]操作：
[0021]轉(zhuǎn)化萃取物和空白對(duì)照萃取物分別于薄層板點(diǎn)樣，充分展開后取出，置于通風(fēng)櫥 中晾干，噴5 %三氯化鐵顯色劑顯色，轉(zhuǎn)化結(jié)果見(jiàn)表1。
[0022] 表1微生物轉(zhuǎn)化槲皮素篩選結(jié)果
[0023]
[0024] 從篩選結(jié)果看，只有NRRL 1086可轉(zhuǎn)化，經(jīng)測(cè)算，轉(zhuǎn)化率可達(dá)80 %。因此，本發(fā)明選 用菌株NRRL 1086,以槲皮素為原料來(lái)制備異槲皮苷。
[0025]本發(fā)明公開了一種制備式I化合物的制備方法，用保藏號(hào)為NRRL 1086菌株對(duì)槲皮 素進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化獲得。
[0026]更優(yōu)選的方法是：以槲皮素為底物，利用保藏號(hào)為NRRL 1086的菌株，將底物和該 菌株在培養(yǎng)基中共培養(yǎng)12h，終止反應(yīng)，用有機(jī)溶劑萃取，濃縮萃取液，通過(guò)硅膠柱層析分離 即得。
[0027]其中有機(jī)溶劑選自甲醇、乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷、甲酸乙酯、乙酸丁酯中的一種 或幾種。更優(yōu)選乙酸乙酯。
[0028]硅膠柱層析分離用氯仿和甲醇進(jìn)行梯度洗脫。
[0029]培養(yǎng)基含10~30%的馬鈴薯煎煮液、KH2P〇4、MgS〇4、維生素 B1和選自葡萄糖、蔗糖、 麥芽糖、木糖、淀粉中一種或幾種碳源，培養(yǎng)基pH=5.0~7.0。其中按20 %馬鈴薯煎煮液100 毫升計(jì)，培養(yǎng)基中各組分優(yōu)選的含量為KH2P〇4含0.1~0.5克;MgS〇4含0.05~0.5克；葡萄糖 或蔗糖0.5-2.5克。
[0030] 最為優(yōu)選的制備方法是:將保藏號(hào)為G.deliquescens NRRL 1086的菌株由斜面接 種到液體培養(yǎng)基中，置28 °C，轉(zhuǎn)速為180r/m的搖床中培養(yǎng)24小時(shí)成為種子液，種子液轉(zhuǎn)接至 發(fā)酵液后繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，加入轉(zhuǎn)化底物;繼續(xù)培養(yǎng)12小時(shí)后終止催化反應(yīng)，過(guò)濾菌體，發(fā) 酵液用等量的乙酸乙酯萃取5次，合并萃取液、回收乙酸乙酯，得到萃取浸膏，浸膏經(jīng)硅膠拌 樣后柱層析分離；以氯仿-甲醇為洗脫系統(tǒng)。轉(zhuǎn)化產(chǎn)物經(jīng)甲醇重結(jié)晶，得到黃色粉末狀的轉(zhuǎn) 化產(chǎn)物。
[0031] 藥理試驗(yàn)證明，本發(fā)明的結(jié)構(gòu)式I化合物具有顯著的抗哮喘作用，以下是試驗(yàn)方法 及結(jié)果：
[0032]異槲皮苷抗哮喘活性的研究
[0033] 1、異槲皮苷對(duì)乙酰膽堿和組胺引起的豚鼠哮喘潛伏期的影響
[0034] 選取健康、雄性荷蘭種豚鼠，體重300±20g。將豚鼠放置于20cmX20cmX50cm的玻 璃箱內(nèi)，配制2 %乙酰膽堿和0.2 %磷酸組胺混合液，超聲霧化噴入15s，篩選出引喘潛伏期 低于120s的豚鼠。次日，將豚鼠隨機(jī)分成6組，每組10只，即空白對(duì)照組（生理鹽水，10ml/ kg)、模型對(duì)照組(生理鹽水，l〇 ml/kg)、陽(yáng)性對(duì)照組(地塞米松，5mg/kg)、以及異槲皮苷低劑 量組(20mg/kg)、中劑量組(40mg/kg)、高劑量組(80mg/kg)，灌胃給藥1次。給藥lh后，超聲霧 化噴以2%乙酰膽堿和0.2%磷酸組胺混合液，持續(xù)15s。測(cè)定引喘潛伏期（即從噴霧開始到 哮喘發(fā)作，呼吸困難，直至抽搐倒地的時(shí)間）。
[0035] 表2異槲皮苷對(duì)豚鼠引喘潛伏期的影響士s，n = 10)
[0036]
[0037] 注:*Ρ<〇·〇5,林 Ρ<0·01
[0038] 由表2所示，異槲皮苷低、中、高劑量組相比模型對(duì)照組，豚鼠的引喘潛伏期均明顯 延長(zhǎng)，其中高劑量組的引喘潛伏期最長(zhǎng)，平喘效果最好，且強(qiáng)于陽(yáng)性藥組。表現(xiàn)出異槲皮苷 的抗哮喘作用。
[0039] 2、異槲皮苷對(duì)豚鼠離體肺支氣管平滑肌張力的作用
[0040]選取健康、雄性荷蘭種豚鼠，體重300±20g。將豚鼠隨機(jī)分成6組，每組10只，即模 型對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組(異丙腎上腺素，300mg/l)、以及異槲皮苷低劑量組（100mg/l)、中劑 量組(200mg/l)、高劑量組(400mg/l)。預(yù)先準(zhǔn)備好肺支氣管灌流裝置，貯流瓶?jī)?nèi)充滿含氧的 樂(lè)氏營(yíng)養(yǎng)液。取豚鼠，木槌擊斃，頸動(dòng)脈放血，迅速打開胸腔，暴露心臟、肺，剪下一段氣管連 同心臟及左右肺取出胸腔外，將肺浸入37°C含氧樂(lè)氏營(yíng)養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，輕輕擠捏肺數(shù)次， 以排除肺內(nèi)的氣體，然后將氣管用線扎于灌流裝置的套管上，以樂(lè)氏液灌流，在肺表面可用 針頭散在穿7~9個(gè)孔，調(diào)節(jié)灌流速度為50滴/min。待灌流量恒定后，可將0.5ml藥物注入套 管頂端的橡皮管內(nèi)。觀察并比較給藥后3min內(nèi)液體流出滴數(shù)和流出量。
[0041]表3異槲皮苷對(duì)豚鼠離體肺支氣管平滑肌張力的作用（i±s，n = 10)
[0042]
[0043] 注:*Ρ<〇·〇5,林 Ρ<0·01
[0044] 表3顯示，異槲皮苷作用于豚鼠的離體支氣管平滑肌，可增加灌流液滴數(shù)和液體流 出量，提示異槲皮苷對(duì)支氣管平滑肌有一定的舒張作用。
[0045] 3、異槲皮苷對(duì)抗原引起的哮喘大鼠肺組織中白三烯Μ、D4的影響
[0046]取健康、清潔級(jí)SD大鼠，體重200±20g，雌雄各半。隨機(jī)分成6組，每組10只，即空白 對(duì)照組（生理鹽水，l〇ml/kg)、模型對(duì)照組（生理鹽水，10ml/kg)、陽(yáng)性對(duì)照組（地塞米松， 5mg/kg)、以及異槲皮苷低劑量組（20mg/kg)、中劑量組(40mg/kg)、高劑量組(80mg/kg)。采 用抗原卵清蛋白致敏模型，配制每毫升含卵清蛋白l〇mg、Al(OH) 3干粉100mg的生理鹽水混 懸液，除空白對(duì)照組外，將其它5組動(dòng)物分別在第1、2、3天腹腔注射致敏液lml，第8天重復(fù)致 敏1次。從第15天開始，將這5組動(dòng)物用超聲霧化1 %卵清蛋白進(jìn)行激發(fā)，每天1次，每次 30min。直至大鼠出現(xiàn)哮喘樣發(fā)作，共4周。霧化時(shí)見(jiàn)大鼠出現(xiàn)煩躁不安、打噴嚏、大小便失 禁、抓耳朵、紫紺等癥狀，表明造模成功。從第五周起，按分組要求分別灌胃給藥，每天1次， 持續(xù)30天。末次給藥后lh，用2%戊巴比妥鈉(40mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，取右肺制成10% 組織勾衆(zhòng)，制備好的勾衆(zhòng)放入離心機(jī)中3500r/min離心10min，提取上清液，首先用二辛可寧 酸蛋白定量試劑盒測(cè)定肺組織勻漿中蛋白濃度，采用ELISA法、按試劑盒說(shuō)明書測(cè)定勻漿中 白三烯B4(LTB4)、D4(LTD4)的含量，測(cè)定結(jié)果以每毫升勻漿液中蛋白含量(pg/mgprot)進(jìn)行 校正。
[0047] 表4異槲皮苷對(duì)哮喘大鼠肺組織中LTB4、LTD4含量影響G±s，n=10，pg/mgprot)
[0048]
[0049] 注:*Ρ<〇·〇5,林 Ρ<0·01
[0050]如表4所示，相對(duì)于空白組，模型組中LTB4、LTD4含量顯著升高，表明造模較為成功。 相比模型組，異槲皮苷低、中、高三個(gè)劑量組中LTB4、LTD4含量顯著降低，表明異槲皮苷可以 減少大鼠哮喘模型中的炎癥因子白三烯Μ、D4的表達(dá)。
[0051]綜上，異槲皮苷可顯著延長(zhǎng)哮喘發(fā)作潛伏期，擴(kuò)張支氣管平滑肌，從而發(fā)揮平喘作 用。同時(shí)，通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)異槲皮苷可以降低肺組織中炎癥因子白三烯B4、D4的含量，推測(cè)其 平喘作用可能與抗炎有關(guān)。
[0052] 本發(fā)明的異槲皮苷可與藥學(xué)上可接受的載體混合，用于制備治療用藥物組合物。 可制備成藥劑學(xué)上通用的劑型，如膠囊、片劑、丸劑、口服液、顆粒劑、酊劑、緩釋劑等胃腸道 給藥劑型及注射劑、透皮貼劑、外用制劑等胃腸外給藥劑型。
【具體實(shí)施方式】
[0053] 實(shí)施例1 [0054]異槲皮苷的制備
[0055] 菌種NRRL 1086由4 °C的固體斜面接種至液體PDA培養(yǎng)基(培養(yǎng)基按100毫升20 %馬 鈴薯煎煮液中含KH2P〇4 0.3克;MgS〇4 0.75克;葡萄糖10克;維生素 B10.01克配制，液體培養(yǎng) 基分裝至150mL的三角瓶，每瓶裝液30mL)，至搖床中培養(yǎng)24小時(shí)（28°C，180r/m)，即為種子 液;將種子液在無(wú)菌條件下轉(zhuǎn)移至液體Η)Α培養(yǎng)基(培養(yǎng)基組成同前）中，在搖床中繼續(xù)培養(yǎng) 24小時(shí)。每瓶加 lml槲皮素乙醇溶液(20mg/ml)，共轉(zhuǎn)化200mg，培養(yǎng)12小時(shí)后終止反應(yīng)。發(fā)酵 液用等量的乙酸乙酯萃取5次，合并萃取液、回收乙酸乙酯;得到萃取浸膏321mg，稱取100-200目硅膠0.8g與殘?jiān)鶆虬铇?，柱層?00~300目20g干法裝柱，氯仿-甲醇梯度洗脫，在 氯仿-甲醇= 95:5的洗脫餾分中，可得目標(biāo)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物異槲皮苷，經(jīng)甲醇重結(jié)晶，得到黃色粉 末267mg。
[0056] 其碳譜如上所述 [0057] 實(shí)施例2 [0058] 片劑
[0059]取實(shí)施例1制得的異槲皮苷100g與淀粉50g，糊精50g混合，用適量30%乙醇作濕潤(rùn) 劑，制成軟材，常規(guī)方法制粒，加入適量硬脂酸鎂混合，制成片劑。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 結(jié)構(gòu)式I的化合物或其藥學(xué)上可接受的溶劑化物：2. 權(quán)利要求1的化合物或其藥學(xué)上可接受的溶劑化物的制備方法，其特征是：用保藏號(hào) 為NRRL 1086菌株對(duì)搬皮素進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化獲得。3. 權(quán)利要求2的制備方法，其中生物轉(zhuǎn)化方法如下：W搬皮素為底物，利用保藏號(hào)為 NRRL 1086的菌株，將底物和該菌株在培養(yǎng)基中培養(yǎng)12h，終止反應(yīng)，發(fā)酵液用有機(jī)溶劑萃 取，濃縮萃取液，得浸膏，通過(guò)硅膠柱層析分離得到目標(biāo)化合物。4. 權(quán)利要求3的制備方法，其中有機(jī)溶劑包括：乙酸乙醋、氯仿、二氯甲燒、甲酸乙醋、乙 酸下醋、甲苯、己燒、正下醇等。5. 權(quán)利要求3的制備方法，培養(yǎng)基含10~30 %的馬鈴馨煎煮液、K出P〇4、MgS〇4、維生素 Bi 和選自葡萄糖、薦糖、麥芽糖、木糖、淀粉中一種或幾種的碳源，培養(yǎng)基PH=5.0~7.0。6. 權(quán)利要求3的制備方法，其中按20 %馬鈴馨煎煮液100毫升計(jì)，K出P〇4〇 . 1~0.5克； MgSCk0.0 5~0.5克;葡萄糖0.5-2.5克(或薦糖0.5-2.5克）。7. 權(quán)利要求2的制備方法，其中菌種在培養(yǎng)前先進(jìn)行活化，活化時(shí)間20~30h。8. -種藥物組合物，其中含有權(quán)利要求1的化合物或其藥學(xué)上可接受的溶劑化物及藥 學(xué)上可接受的載體。9. 權(quán)利要求1的化合物或其藥學(xué)上可接受的溶劑化物用于制備平喘藥物的用途。
【文檔編號(hào)】A61K31/7048GK105906676SQ201610296600
【公開日】2016年8月31日
【申請(qǐng)日】2016年5月3日
【發(fā)明人】余伯陽(yáng), 許家琦, 張劍, 樊妮, 王倩倩
【申請(qǐng)人】中國(guó)藥科大學(xué)