一種兩階段pH控制縮短乳酸菌高鹽發(fā)酵周期的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于兩階段pH控制策略縮短乳酸菌高鹽發(fā)酵周期的方法，屬于微生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明以嗜鹽四聯(lián)球菌（Tetragenococcus halophilus）CGMCC no. 3792為發(fā)酵菌株，所用發(fā)酵培養(yǎng)基為（w/v）：葡萄糖0.5%，大豆蛋白胨6.4%，胰蛋白胨8%，七水硫酸鎂0.025%，抗壞血酸0.05%，氯化鈉12%，用蒸餾水配制，pH為6.5，121℃滅菌20 min；在發(fā)酵第一階段（0~60小時(shí)）將pH控制在6.5，在發(fā)酵第二階段（60小時(shí)后）將pH控制在6.0。以本發(fā)明提供的操作方法簡便可靠，有效地縮短了12小時(shí)的發(fā)酵時(shí)間，并且生物量提高了17.3%，為乳酸菌在實(shí)際的發(fā)酵生產(chǎn)應(yīng)用中提供一種有效的方法。CGMCC No.379220100429
【專利說明】
一種兩階段pH控制縮短乳酸菌高鹽發(fā)酵周期的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種兩階段pH控制縮短乳酸菌高鹽發(fā)酵周期的方法，具體體現(xiàn)在不同的發(fā)酵階段采取不同的PH控制，屬于微生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]嗜鹽四聯(lián)球菌(Te tragenococcus屬于乳酸菌科中的四聯(lián)球菌屬，廣泛存在于醬油、果醬等高鹽或高糖環(huán)境中。嗜鹽四聯(lián)球菌是產(chǎn)生揮發(fā)性物質(zhì)的主要微生物之一，將其應(yīng)用于醬油、魚醬等調(diào)味品中，不僅能縮短發(fā)酵周期，而且能產(chǎn)生更多的揮發(fā)性物質(zhì)，從而促進(jìn)香味成分的生成，同時(shí)明顯改善調(diào)味品的口感和品質(zhì)。但是，在這些鹽漬食品中，嗜鹽四聯(lián)球菌不可避免地遭受高鹽脅迫，嚴(yán)重抑制了菌體的生長和代謝，使其生產(chǎn)效率及產(chǎn)品品質(zhì)受到嚴(yán)重的影響。因此，提高嗜鹽四聯(lián)球菌在高鹽發(fā)酵過程中的菌體密度具有重要意義。
[0003]高密度培養(yǎng)技術(shù)(High cell density cultivat1n)也稱高密度發(fā)酵技術(shù)，是指應(yīng)用一定的技術(shù)手段和裝置提高菌體的密度，使其較常規(guī)培養(yǎng)的菌體密度有顯著的提高。這種培養(yǎng)技術(shù)的優(yōu)勢在于減少設(shè)備費(fèi)用、降低生產(chǎn)成本，能使產(chǎn)品的市場競爭力得到極大的提高。但是，在高鹽發(fā)酵過程中，發(fā)酵液的滲透壓較高，使乳酸菌的遲滯期延長，從而對乳酸菌的生理代謝造成很大的抑制和毒害作用。同時(shí)，由于乳酸菌有較強(qiáng)的產(chǎn)酸能力，因此發(fā)酵過程中PH的變化也對乳酸菌生長產(chǎn)生重要影響。
[0004]由此可見，嗜鹽四聯(lián)球菌在發(fā)酵工業(yè)應(yīng)用中，所遭遇到的脅迫環(huán)境是多重和復(fù)雜的。交互保護(hù)是乳酸菌常見的一種應(yīng)激保護(hù)方式，當(dāng)細(xì)胞處于脅迫環(huán)境中時(shí)，由一種適應(yīng)性反應(yīng)所誘導(dǎo)的保護(hù)作用，可以保護(hù)細(xì)胞抵御更為惡劣的脅迫環(huán)境。在嗜鹽四聯(lián)球菌高鹽發(fā)酵過程中，通過在不同階段控制不同的pH，以期適應(yīng)高鹽脅迫環(huán)境，從而有利于獲得更高密度的菌體細(xì)胞。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種兩階段pH控制策略，用以縮短嗜鹽四聯(lián)球菌(Te tragenococcus Aa1pAiius)高鹽發(fā)酵周期及提高菌體密度。
[0006]所述的兩階段控制pH策略為在發(fā)酵第一階段(O?60小時(shí))將pH控制在6.5，在發(fā)酵第二階段(60小時(shí)后)將pH控制在6.0。
[0007]菌株:嗜鹽四聯(lián)球菌(reirage/jococct/s halophilus)CGWZC 3792，實(shí)驗(yàn)室從醬油醪中分離，經(jīng)形態(tài)、生理生化特性試驗(yàn)和16S rDNA測序鑒定，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(China General Microb1logical Culture Collect1nCenter, CGMCC)，保藏單位地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所;保藏日期為2010年4月29日，保藏編號(hào)為CGMCC n0.3792，并分類命名為嗜鹽四聯(lián)球菌(Tetragenococcus halophiIlls')。
[0008]—種兩階段pH控制策略縮短嗜鹽四聯(lián)球菌高鹽發(fā)酵周期的方法，包括以下步驟: (1)種子培養(yǎng)方法;取-80°c保藏的嗜鹽四聯(lián)球菌甘油管儲(chǔ)存液以5%(v/v)的接種量接種于種子培養(yǎng)基中，30°C靜置培養(yǎng)24小時(shí)。種子培養(yǎng)基為(w/v):葡萄糖0.5%，大豆蛋白胨2%，七水硫酸鎂0.025%，抗壞血酸0.05%，氯化鈉0%，ρΗ*6.5;
(2)二級(jí)種子擴(kuò)大培養(yǎng)方法;取上述活化種子液，以5%(ν/ν)的接種量接種于擴(kuò)大培養(yǎng)基中，30°C靜置培養(yǎng)24小時(shí)。擴(kuò)大培養(yǎng)基為(w/v):葡萄糖0.5%，胰蛋白胨0.5%，大豆蛋白胨0.5%，牛肉膏0.5%，酵母膏0.25%，七水硫酸鎂0.025%，抗壞血酸0.05%，β-甘油磷酸鈉1.9%，氯化鈉6%，pH為6.5;
(3)5L發(fā)酵罐培養(yǎng)方法;取上述二級(jí)種子擴(kuò)大培養(yǎng)液，以5%(v/v)的接種量接種于5 L發(fā)酵罐中30°C發(fā)酵，發(fā)酵罐裝液量為4 L，攪拌轉(zhuǎn)速為150 r/min。發(fā)酵培養(yǎng)基為(w/v):葡萄糖0.5%，大豆蛋白胨6.4%，胰蛋白胨8%，七水硫酸鎂0.025%，抗壞血酸0.05%，氯化鈉12%，pH為6.5。
[0009]菌體生物量的測定:定時(shí)取出不同發(fā)酵時(shí)間的菌懸液離心(10000 r/min, 5 min,4°C)收集菌體，用無菌水洗滌3次后稀釋適當(dāng)?shù)谋稊?shù)，搖勻，用TU-1901雙束光紫外可見分光光度計(jì)，于600 nm處比濁測定OD值。
[0010]本發(fā)明的有益效果:在高鹽發(fā)酵過程中，采用兩階段控制pH策略，可以有效地縮短發(fā)酵時(shí)間12小時(shí)，同時(shí)菌體生物量提高了 17.3%。本發(fā)明提供了一種兩階段pH控制策略縮短嗜鹽四聯(lián)球菌高鹽發(fā)酵周期的方法，簡單易行，可探索乳酸菌應(yīng)對不同環(huán)境脅迫時(shí)交互保護(hù)的作用機(jī)理以及為乳酸菌的工業(yè)化發(fā)酵提供了必要的理論指導(dǎo)。
【附圖說明】
[0011]圖1不同pH控制對嗜鹽四聯(lián)球菌生長的影響。
【具體實(shí)施方式】
[0012]實(shí)例1(對照組I):嗜鹽四聯(lián)球菌CGMCC 3792在恒定pH為6.5條件下發(fā)酵(圖1)
(1)種子培養(yǎng);取-80°C保藏的嗜鹽四聯(lián)球菌甘油管儲(chǔ)存液以5%(v/v)的接種量接種于種子培養(yǎng)基中，30°C靜置培養(yǎng)24小時(shí)。種子培養(yǎng)基為(w/v):葡萄糖0.5%，大_&蛋白胨2%，七水硫酸鎂0.025%，抗壞血酸0.05%，氯化鈉0%，ρΗ*6.5;
(2)二級(jí)種子擴(kuò)大培養(yǎng);取上述活化種子液，以5%(ν/ν)的接種量接種于擴(kuò)大培養(yǎng)基中，30 °(:靜置培養(yǎng)24小時(shí)。二級(jí)種子培養(yǎng)基為(w/v):葡萄糖0.5%，胰蛋白胨0.5%，大豆蛋白胨
0.5%，牛肉膏0.5%，酵母膏0.25%，七水硫酸鎂0.025%，抗壞血酸0.05%，β-甘油磷酸鈉1.9%，氯化鈉 6%，pH為6.5;
(3)5L發(fā)酵罐培養(yǎng);取上述種子擴(kuò)大培養(yǎng)液，以5%(v/v)的接種量接種于5 L發(fā)酵罐中30°C發(fā)酵，5 L發(fā)酵罐裝液量為4 L，攪拌轉(zhuǎn)速為150 r/min，控制pH為6.5。發(fā)酵培養(yǎng)78小時(shí)到達(dá)穩(wěn)定期，菌體OD6QQ值穩(wěn)定在2.60。
[0013]實(shí)例2(對照組2):嗜鹽四聯(lián)球菌CGMCC 3792在恒定pH為6.0條件下發(fā)酵(圖1)
其他條件同實(shí)例I。取二級(jí)種子培養(yǎng)液，以5%(v/v)的接種量接種于5 L發(fā)酵罐中30°C發(fā)酵，5 L發(fā)酵罐裝液量為4 L，攪拌轉(zhuǎn)速為150 r/min，控制pH為6.0。發(fā)酵培養(yǎng)96小時(shí)到達(dá)穩(wěn)定期，菌體OD600值穩(wěn)定在3.05ο
[0014]實(shí)例3(實(shí)驗(yàn)組):嗜鹽四聯(lián)球菌CGMCC3792在兩階段pH控制條件下發(fā)酵(圖1) 其他條件同實(shí)例I。取二級(jí)種子培養(yǎng)液，以5%(v/v)的接種量接種于5 L發(fā)酵罐中30°C發(fā)酵，5 L發(fā)酵罐裝液量為4 L，攪拌轉(zhuǎn)速為150 r/min，發(fā)酵前60小時(shí)控制pH為6.5，60小時(shí)后控制pH為6.0。發(fā)酵培養(yǎng)84小時(shí)到達(dá)穩(wěn)定期，OD6qq值穩(wěn)定在3.05。與恒定pH 6.5(對照組I)相比，菌體生物量提高了 17.3%;與恒定pH 6.0(對照組2)相比，進(jìn)入穩(wěn)定期的時(shí)間縮短了 12小時(shí)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種兩階段pH控制策略縮短乳酸菌高鹽發(fā)酵周期的方法，包含以下步驟: (1)種子培養(yǎng);取-80°C保藏的乳酸菌甘油管儲(chǔ)存液，以5%(v/v)的接種量接種于種子培養(yǎng)基中，30 °C靜置培養(yǎng)24小時(shí)； (2)二級(jí)種子擴(kuò)大培養(yǎng);取上述活化種子液，以5%(v/v)的接種量接種于擴(kuò)大培養(yǎng)基中，30°C靜置培養(yǎng)24小時(shí)； (3)5L發(fā)酵罐培養(yǎng);取上述二級(jí)種子，以5%(v/v)的接種量接種于5 L發(fā)酵罐中30°C培養(yǎng)，發(fā)酵罐裝液量為4 L，攪拌轉(zhuǎn)速為150 r/min。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述兩階段pH控制策略縮短乳酸菌高鹽發(fā)酵周期的方法，其特征在于:所述乳酸菌為嗜鹽四聯(lián)球菌(Tetragenococcus Aa1pAiius)，其保藏編號(hào)為CGMCC n0.3792ο3.根據(jù)權(quán)利要求1所述兩階段pH控制縮短乳酸菌高鹽發(fā)酵周期的方法，其特征在于:所述種子培養(yǎng)基為(w/v):葡萄糖0.5%，大豆蛋白胨2%，七水硫酸鎂0.025%，抗壞血酸0.05%，氯化鈉 0%，ρΗ*6.5。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述兩階段pH控制縮短乳酸菌高鹽發(fā)酵周期的方法，其特征在于:所述二級(jí)種子擴(kuò)大培養(yǎng)基為(w/v):葡萄糖0.5%，胰蛋白胨0.5%，大豆蛋白胨0.5%，牛肉膏0.5%，酵母膏0.25%，七水硫酸鎂0.025%，抗壞血酸0.05%，β-甘油磷酸鈉1.9%，氯化鈉6%，pH為6.5。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述兩階段pH控制縮短乳酸菌高鹽發(fā)酵周期的方法，其特征在于:所述發(fā)酵培養(yǎng)基為(w/v):葡萄糖0.5%，大豆蛋白胨6.4%，胰蛋白胨8%，七水硫酸鎂0.025%，抗壞血酸0.05%，氯化鈉12%，pH為6.5。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述兩階段pH控制縮短乳酸菌高鹽發(fā)酵周期的方法，其特征在于:所述兩階段PH控制策略為:在5 L發(fā)酵罐中，在發(fā)酵第一階段(O?60小時(shí))將pH控制為6.5，在發(fā)酵第二階段(60小時(shí)后)將pH控制為6.0。
【文檔編號(hào)】C12N1/20GK105907691SQ201610545728
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年7月13日
【發(fā)明人】吳重德, 何桂強(qiáng), 黃鈞, 周榮清
【申請人】四川大學(xué)