一種多能干細(xì)胞培養(yǎng)基的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種多能干細(xì)胞培養(yǎng)基，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和以下添加組分：L?抗壞血酸?2磷酸鎂、亞硒酸鈉、人胰島素、檸檬酸鐵、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子beta1。本發(fā)明成功地將檸檬酸鐵引入多能干細(xì)胞培養(yǎng)基系統(tǒng)，替代人脫鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白，可降低多能干細(xì)胞培養(yǎng)基的生產(chǎn)成本；降低了外源性致病風(fēng)險(xiǎn)；該多能干細(xì)胞培養(yǎng)基，在培養(yǎng)多能干細(xì)胞過程中，不僅能保證細(xì)胞的正常增殖，還能夠維持干細(xì)胞的多能性。
【專利說明】
一種多能干細(xì)胞培養(yǎng)基
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種多能干細(xì)胞培養(yǎng)基，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 多能干細(xì)胞(Pluripotency stem cell，PSC)具有自我更新能力和多能性，它能夠 向胚胎三個(gè)胚層(外胚層、中胚層、內(nèi)胚層）的任何組織和細(xì)胞進(jìn)行分化，因此PSC在再生醫(yī) 學(xué)、發(fā)育生物學(xué)等領(lǐng)域起到重要的作用。PSC包括胚胎干細(xì)胞(Embryonic stem cell，ESC) 和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotency stem cell, iPSC)。無論是ESC還是iPSC，他們 都具有類似的基因表達(dá)譜、自我更新能力、多能性、表觀遺傳譜，前者來自于囊胚時(shí)期的內(nèi) 細(xì)胞團(tuán)，后者來自于成體細(xì)胞導(dǎo)入重編程因子誘導(dǎo)并純化出來的多能干細(xì)胞。
[0003] 人的iPSC培養(yǎng)過程經(jīng)歷了使用飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)、無飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)以及無動(dòng)物源 性無飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)的三個(gè)階段。飼養(yǎng)層細(xì)胞通常來源于小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)，其批 間差、動(dòng)物源性、各類感染源性、成分不確定性等影響實(shí)驗(yàn)研究的判斷和進(jìn)一步深入地應(yīng)用 研究。
[0004] 2001 年Chunhui Xu使用MEF-conditioned medium在matrigel或者其他基質(zhì)蛋白 包被條件下進(jìn)行無 feeder hESC培養(yǎng)(NatBiotechnol · 2001 Oct; 19( 10): 971-4 ·)，發(fā)現(xiàn)MEF 分泌的許多因子參與iPSC的自我更新，后續(xù)發(fā)現(xiàn)TGFBl/ActivinA/Nodal/bFGF等存在條件 下可以維持iPSCs的自我更新能力。基于此Thomson實(shí)驗(yàn)室于2006年公開無 feeder無血清無 KSR成分明確的iPSCs培養(yǎng)基mTeSRl(Nat Methods.2006 Aug;3(8) :637-46)。后來， StemCell公司使用人血清白蛋白（HSA)替代mTeSRl的BSA，以及使用人源的細(xì)胞因子，開發(fā) 出TeSR?2，該培養(yǎng)基不含任何動(dòng)物源性物質(zhì)，適合臨床科研相關(guān)工作，后續(xù)許多各類其他公 司也相應(yīng)開發(fā)出各自特色的的IPSCs培養(yǎng)基。但是TeSR?2以及其他同類的培養(yǎng)基仍然包含 大量的細(xì)胞因子、蛋白質(zhì)，成分復(fù)雜，且使用效果差于mTeSRl，不能廣泛滿足基礎(chǔ)科研和臨 床科研的需求，亦使研究發(fā)育和分化的不確定性增加。
[0005] 2011年Thomson實(shí)驗(yàn)室確定了八種mTeSRl中的主要成分的培養(yǎng)基即E8培養(yǎng)基(Nat Methods. 2011 May; 8(5): 424-9.)。隨著全球相關(guān)領(lǐng)域廣泛使用E8，大家逐步發(fā)現(xiàn)E8有許多 不足之處：
[0006] 1.E8培養(yǎng)基中的人脫鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白，通常為基因工程產(chǎn)物，其價(jià)格昂貴等嚴(yán)重限制 了科學(xué)研究，因此急需尋找替代物；
[0007] 2.E8培養(yǎng)基中如果添加促進(jìn)重編程的小分子化合物或者β-巰基乙醇等細(xì)胞會(huì)表 現(xiàn)明顯的細(xì)胞毒性，不能在高效誘導(dǎo)重編程尤其是極限條件重編程過程中進(jìn)行應(yīng)用，影響 加入不同的各種小分子化合物的分化實(shí)驗(yàn)，也限制低密度條件下培養(yǎng)hiPSC;
[0008] 3.E8所包含的細(xì)胞因子濃度很高，所需成本仍然很高。因此研發(fā)具有大多數(shù)小分 子或巰基乙醇耐受性以及低密度hiPSC耐受性且成本低的高性能無 feeder hiPSC培養(yǎng)基 十分迫切。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種無動(dòng)物源性的多能干細(xì)胞 培養(yǎng)基。
[0010] 實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的可以通過采取如下技術(shù)方案達(dá)到：
[0011] -種多能干細(xì)胞培養(yǎng)基，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和以下添加組分:L-抗壞血酸-2磷酸鎂、 亞硒酸鈉、人胰島素、檸檬酸鐵、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子betal。
[0012] 作為優(yōu)選，所述添加組分還包括肝素鈉 、Dorsomorphin dihydrochloride和 NaHC03〇
[0013] 作為優(yōu)選，所述肝素鈉的濃度為1~400ng/mL;所述Dorsomorphin (1;[]17(11'〇(3]11〇1'丨(16的濃度為25~25〇11]\1;所述他!1(1)3的濃度為520~57(^8/111匕
[0014]作為優(yōu)選，所述多能干細(xì)胞培養(yǎng)基的Fe3+濃度為1.2~3.8mM。
[0015] 作為優(yōu)選，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM/F12培養(yǎng)基。
[0016]作為優(yōu)選，所述梓檬酸鐵的濃度為1~300ng/mL。
[0017] 作為優(yōu)選，所述多能干細(xì)胞培養(yǎng)基的葡萄糖濃度為16-18mmol/L。
[0018] 作為優(yōu)選，所述多能干細(xì)胞培養(yǎng)基的滲透壓為280~350mosmol/L。
[0019] 作為優(yōu)選，所述L-抗壞血酸-2磷酸鎂的濃度為60~70yg/mL;所述亞硒酸鈉的濃度 為10~20ng/mL;所述人胰島素的濃度為15~25yg/mL;所述堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的濃 度為1~100ng/mL ;所述轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-betal的濃度為0.1~2.0ng/mL。
[0020] 作為優(yōu)選，所述L-抗壞血酸-2磷酸鎂的濃度為64yg/mL;所述亞硒酸鈉的濃度為 13.6ng/mL;所述人胰島素的濃度為20yg/mL;所述堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的濃度為40ng/ mL;所述轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-betal的濃度為0.5ng/mL。
[0021 ]作為優(yōu)選，所述多能干細(xì)胞培養(yǎng)基還包括BSA或HSA。
[0022] 作為優(yōu)選，所述BSA的含量為0.05-4w. t. % ;HSA的含量為0.05-4w. t. %。
[0023] 相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果在于：
[0024] 1)本發(fā)明成功地將檸檬酸鐵引入多能干細(xì)胞培養(yǎng)基系統(tǒng)，替代人脫鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白， 降低多能干細(xì)胞培養(yǎng)基的生產(chǎn)成本；
[0025] 2)本發(fā)明提供的多能干細(xì)胞培養(yǎng)基無飼養(yǎng)層、無血清、無動(dòng)物源性蛋白，降低了外 源性致病風(fēng)險(xiǎn)；
[0026] 3)本發(fā)明提供的多能干細(xì)胞培養(yǎng)基，在培養(yǎng)多能干細(xì)胞過程中，不僅能保證細(xì)胞 的正常增殖，還能夠維持干細(xì)胞的多能性；
[0027] 4)本發(fā)明提供的多能干細(xì)胞培養(yǎng)基，在人胚胎干細(xì)胞H1長(zhǎng)達(dá)35代的培養(yǎng)過程中依 然能夠維持干細(xì)胞的快速增殖和形態(tài)不發(fā)生改變。
【附圖說明】
[0028] 圖1為實(shí)施例2中iPSC培養(yǎng)的試驗(yàn)時(shí)間與增殖倍數(shù)的函數(shù)關(guān)系圖；
[0029] 圖2為實(shí)施例2中H1培養(yǎng)的試驗(yàn)時(shí)間與增殖倍數(shù)的函數(shù)關(guān)系圖。
【具體實(shí)施方式】
[0030] 下面，結(jié)合附圖以及【具體實(shí)施方式】，對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步描述：
[0031] 以下實(shí)施方式中，如未特殊說明，所采用的試劑均可通過市售的途徑獲得。本發(fā)明 使用的人胚胎干細(xì)胞Hi和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞iPSC均來源于倫理委員會(huì)通過的廣州市搏克腫 瘤研究所實(shí)驗(yàn)室。所述人胰島素或人脫鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白可以是天然的或經(jīng)過基因工程產(chǎn)物獲 得，均可通過市售途徑獲得。
[0032] 以下【具體實(shí)施方式】中，如未特殊說明，所采用的檢測(cè)方法均為通用的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方 法。
[0033] 以下【具體實(shí)施方式】中，所列明的滲透壓為采用冰點(diǎn)滲透壓儀、在低于17.5°C測(cè)試 的。
[0034]以下【具體實(shí)施方式】中，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為購買自Gibco或Thermo Fisher公司的 DMEM/F12培養(yǎng)基，或購買自Gibco公司的KnockOut?DMEM培養(yǎng)基，其貨號(hào)為10829018;或購買 自Gibco公司的DMEM，Low Glucose，Pyruvate培養(yǎng)基，貨號(hào)為11885092。所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基也 可以由其它能滿足使該多能干細(xì)胞培養(yǎng)基的葡萄糖濃度為16-18mmol/L并含有干細(xì)胞生長(zhǎng) 所需的必須氨基酸的基礎(chǔ)培養(yǎng)基代替。
[0035]其中，可采用MTT法和AP染色法檢測(cè)各實(shí)施例的培養(yǎng)基對(duì)人多能干細(xì)胞的存活效 果的影響：
[0036] MTT法的具體操作如下：
[0037]消化、計(jì)數(shù)好細(xì)胞后，用培養(yǎng)基母液吹勻細(xì)胞，鋪到96孔板中，每個(gè)孔中種2000個(gè) 細(xì)胞，種5個(gè)復(fù)孔，然后分別補(bǔ)入對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基至終體積150uL，每天都要換相應(yīng)的培養(yǎng)基， 細(xì)胞放置37°C，5 % C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，于day 1和day5測(cè)MTT值。
[0038] AP染色法的具體操作如下：
[0039] 消化、計(jì)數(shù)好細(xì)胞后，用培養(yǎng)基母液吹勻細(xì)胞，鋪到96孔板中，每個(gè)孔中種1個(gè)細(xì) 胞，每組種2000個(gè)單細(xì)胞孔，然后分別補(bǔ)入對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基至終體積150ul，培養(yǎng)基中加入 0.5碰1：11丨32〇￥；^；[11(后續(xù)的培養(yǎng)基中都不添加1：11丨320￥；^；[11)。細(xì)胞放置37°0，5%(1)2培養(yǎng) 箱中培養(yǎng)。前2~3天，不換液，day4~day 10是隔一天換液，day 11~day 14,每天換液，day 15 AP染色檢測(cè)單克隆數(shù)量。
[0040] 本發(fā)明提供一種多能干細(xì)胞培養(yǎng)基，該培養(yǎng)包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和以下添加組分:L-抗壞血酸-2磷酸鎂、亞硒酸鈉、人胰島素、檸檬酸鐵、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(簡(jiǎn)稱bFGF) 和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子betal (簡(jiǎn)稱TGF-βΙ)，培養(yǎng)基組分配比范圍如下表所示;所述多能干細(xì)胞培 養(yǎng)基的滲透壓為280~350mosmol/L〇
[0041 ] 表1培養(yǎng)基組分配比范圍
[0042]

[0043] 在此基礎(chǔ)上，該培養(yǎng)基更優(yōu)化的配方如表2所示，還包括肝素鈉、Dorsomorphin dihydrochloride和碳酸氫鈉。為方便區(qū)分，下文中，將本多能干細(xì)胞培養(yǎng)基命名為hPLWI培 養(yǎng)基。
[0044] 該hPLWI培養(yǎng)基組分配比范圍如表2所示：
[0045] 表2 hPLWI培養(yǎng)基組分配比范圍
[0046]
[0047] 本發(fā)明還提供一種優(yōu)化的多能干細(xì)胞培養(yǎng)基，在上述hPLWI培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，還增 加一牛血清白蛋白（簡(jiǎn)稱BSA)或人血清蛋白（簡(jiǎn)稱HAS)組分，該BSA或HSA的組分配比范圍為 0.05w.t. %~4w.t. %，為方便區(qū)分，將該優(yōu)化的多能干細(xì)胞培養(yǎng)基命名為hPLWII培養(yǎng)基。 [0048]以下具體實(shí)施例中，該hPLWI培養(yǎng)基的配制方法包括以下步驟：
[0049] 1、稱取L-抗壞血酸-2磷酸鎂、亞硒酸鈉、人胰島素、檸檬酸鐵、堿性成纖維細(xì)胞生 長(zhǎng)因子和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子betal;
[0050] 2、將步驟1)的上述組分加入DMEM/F12培養(yǎng)基，攪拌均勻；
[0051 ] 3、向步驟2)的培養(yǎng)基中加入氯化鈉調(diào)節(jié)滲透壓至280~350mosmol/L;
[0052] 4、用DMEM/F12培養(yǎng)基定容，得到hPLWII培養(yǎng)基。
[0053] 所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基除了上述的DMEM/F12培養(yǎng)基外，還可以是其它基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基， 所述基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基應(yīng)滿足:使該多能干細(xì)胞培養(yǎng)基的葡萄糖濃度為16-18mmol/L;含有干 細(xì)胞生長(zhǎng)所需的必須氨基酸。
[0054]本發(fā)明中，該多能干細(xì)胞培養(yǎng)基的Fe3+優(yōu)選濃度為1.2~3.8mM。
[0055]以下具體實(shí)施例中，采用以下兩種培養(yǎng)基進(jìn)行比較實(shí)驗(yàn)：
[0056] l、Bi〇CI培養(yǎng)基，其包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和以下添加組分:L-抗壞血酸-2磷酸鎂、亞硒 酸鈉、人胰島素、人脫鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（簡(jiǎn)稱bFGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 betal(簡(jiǎn)稱TGF-βΙ)、肝素納、Dorsomorphin dihydrochloride和碳酸氛納；
[0057] 2、Bi〇CI S0培養(yǎng)基，其包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和以下添加組分:L-抗壞血酸-2磷酸鎂、亞 硒酸鈉、人胰島素、人脫鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(簡(jiǎn)稱bFGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 betal (簡(jiǎn)稱TGF-βΙ)、肝素納、Dorsomorphin dihydrochloride、碳酸氛納和BSA。
[0058] 實(shí)施例1:
[0059] -種多能干細(xì)胞培養(yǎng)基，該培養(yǎng)包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和以下添加組分:L_抗壞血酸-2 磷酸鎂、亞硒酸鈉、人胰島素、檸檬酸鐵、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(簡(jiǎn)稱bFGF)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng) 因子betal (簡(jiǎn)稱TGF-βΙ)，培養(yǎng)基組分配比范圍如下表所示；
[0060] 表3實(shí)施例培養(yǎng)基組分及含量
[0061]
[0062] MTT檢測(cè)的具體實(shí)驗(yàn)操作如下：
[0063] 1)前期培養(yǎng):用Matrigel包被iPSC，在BioCI培養(yǎng)基中培養(yǎng)3-15天；
[0064] 2)取樣：用96孔板，5個(gè)復(fù)孔為一組，取步驟1)中存活iPSC，分別種入具有新的 BioCI培養(yǎng)基、1-11號(hào)hPLWI培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基；種板量為3000細(xì)胞/孔，培養(yǎng)基用量為 200ul/孔；
[0065] 3)換液檢測(cè)：以種板時(shí)間計(jì)為DayO,于Dayl開始每天換液，于Dayl和Day5進(jìn)行MTT 檢測(cè)，每孔重復(fù)檢測(cè)3次。
[0066]其AP染色檢測(cè)的具體操作為：
[0067] 1)前期培養(yǎng):在Matrigel包被過的6孔板中種上30萬iPSC細(xì)胞/孔，用BioCI培養(yǎng)基 培養(yǎng)5天；
[0068] 2)取樣:用6孔板，3個(gè)復(fù)孔為一組，取步驟1)中存活iPSC，分別種入具有新的BioCI 培養(yǎng)基、1~11號(hào)hPLWI培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基;種板量為30萬細(xì)胞/孔；
[0069] 3)換液檢測(cè)：以種板時(shí)間計(jì)為DayO,于Dayl開始每天換液，4天傳一次，傳代前拍 照，傳5代，進(jìn)行AP染色檢測(cè)，每孔重復(fù)檢測(cè)3次。
[0070] MTT和AP檢測(cè)的結(jié)果下表如示：
[0071] 表4實(shí)施例1MTT檢測(cè)結(jié)果和AP檢測(cè)結(jié)果
[0072]
[0073]
[0074] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，實(shí)施例1提供的培養(yǎng)基能使iPSC正常地增殖。
[0075] 實(shí)施例2:
[0076]本實(shí)施例中，采用BioCI培養(yǎng)基和hPLWI培養(yǎng)基進(jìn)行試驗(yàn)，以比較檸檬酸鐵對(duì)細(xì)胞 增殖的影響。
[0077]本實(shí)施例中，使用BioCI培養(yǎng)基1份、對(duì)照培養(yǎng)基1份、hPLWI培養(yǎng)基11份(分別命名 為1-11號(hào)），其組分和滲透壓信息如下表所示：
[0078] 表5實(shí)施例2培養(yǎng)基的成分和滲透壓信息
[0079]
[0080]注:a)采用氯化鈉調(diào)節(jié)滲透壓。
[0081] 1-11號(hào)hPLWI培養(yǎng)基的檸檬酸鐵的含量和滲透壓信息如下表所示：
[0082] 表6 1-11號(hào)hPLWI培養(yǎng)基的信息
[0083]
[0084]
[0085] 其MTT檢測(cè)的具體實(shí)驗(yàn)操作如下：
[0086] 1)前期培養(yǎng):用Matrigel包被iPSC，在BioCI培養(yǎng)基中培養(yǎng)3-15天；
[0087] 2)取樣：用96孔板，5個(gè)復(fù)孔為一組，取步驟1)中存活iPSC，分別種入具有新的 BioCI培養(yǎng)基、1-11號(hào)hPLWI培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基；種板量為3000細(xì)胞/孔，培養(yǎng)基用量為 200ul/孔；
[0088] 3)換液檢測(cè)：以種板時(shí)間計(jì)為DayO，于Day 1開始每天換液，于Day 1和Day5進(jìn)行MTT 檢測(cè)，每孔重復(fù)檢測(cè)3次。
[0089] MTT檢測(cè)結(jié)果如下表所示：
[0090]表7實(shí)施例2培養(yǎng)基的MTT檢測(cè)結(jié)果
[0091]
[0092]
[0093]其AP染色檢測(cè)的具體操作為：
[0094] 1)前期培養(yǎng):在Matrigel包被過的6孔板中種上30萬iPSC細(xì)胞/孔，用BioCI培養(yǎng)基 培養(yǎng)5天；
[0095] 2)取樣:用6孔板，3個(gè)復(fù)孔為一組，取步驟1)中存活iPSC，分別種入具有新的BioCI 培養(yǎng)基、1~11號(hào)hPLWI培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基;種板量為30萬細(xì)胞/孔；
[0096] 3)換液檢測(cè)：以種板時(shí)間計(jì)為DayO,于Dayl開始每天換液，4天傳一次，傳代前拍 照，傳5代，進(jìn)行AP染色檢測(cè)，每孔重復(fù)檢測(cè)3次。
[0097] AP染色檢測(cè)結(jié)果如下表所示：
[0098]表8實(shí)施例2培養(yǎng)基的AP染色檢測(cè)結(jié)果
[0099]
[0100] 結(jié)合表7和表8進(jìn)行分析，從2~10號(hào)hPLWI培養(yǎng)基的MTT檢測(cè)結(jié)果和AP染色檢測(cè)結(jié) 果可知，1~300ng/mL范圍內(nèi)的檸檬酸鐵對(duì)細(xì)胞增殖有比較有利的影響；其中，6號(hào)hPLWI培 養(yǎng)基MTT值和AP值相對(duì)最高，說明該檸檬酸鐵濃度下的hPLWI培養(yǎng)基能有效促進(jìn)iPSC的增 殖；
[0101]由1號(hào)hPLWI培養(yǎng)基的MTT檢測(cè)結(jié)果和AP染色檢測(cè)結(jié)果可知，檸檬酸鐵濃度低于1~ 300ng/mL范圍，iPSC的增殖較慢；由11號(hào)hPLWI培養(yǎng)基的檢測(cè)結(jié)果可知，大于300ng/mL時(shí)，會(huì) 對(duì)iPSC增殖造成影響。
[0102]另外，在滲透壓為340mosmol/L恒定情況下，隨著梓檬酸鐵濃度的增加(0~40ng/ ml范圍內(nèi)），iPSC增殖能力隨之增強(qiáng)，當(dāng)檸檬酸鐵濃度為40ng/ml時(shí)，iPSC增殖能力最強(qiáng)。 [0103] 實(shí)施例3:
[0104]根據(jù)實(shí)施例2的結(jié)果，我們選擇最適的梓檬酸鐵濃度40ng/mL，分別取用Matrigel 包被、BioCI培養(yǎng)基培養(yǎng)過3~15天的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞iPSC和人胚胎干細(xì)胞HI進(jìn)行培養(yǎng)試 驗(yàn)，種入含下表所示培養(yǎng)基的板孔，分別進(jìn)行培養(yǎng)和AP染色檢測(cè)。
[0105]表9實(shí)施例3培養(yǎng)基的組分及含量信息
[0106]
[0108] 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞的AP染色檢測(cè)結(jié)果如下表所示，試驗(yàn)時(shí)間與增殖倍數(shù)的函數(shù)關(guān)系 如圖1所示，
[0109] 表10不同培養(yǎng)下iPSC的增殖情況
[0110]
[0111]
[0112] 由圖1和表10的結(jié)果比較我們可以得知，iPSC在BioCI培養(yǎng)基和hPLWI培養(yǎng)基中的 增殖速率基本相當(dāng)；同樣，iPSC在BioCISO培養(yǎng)基和hPLWII培養(yǎng)基中的增殖速率也基本相 當(dāng)；
[0113] iPSC在hPLWII培養(yǎng)基中的增殖速率顯著高于其在hPLWI培養(yǎng)基中增殖速率；同樣 地，iPSC在BioCISO培養(yǎng)基中的增殖速率顯著高于其在BioCI培養(yǎng)基中的增殖速率。
[0114] 人胚胎干細(xì)胞H1的AP染色檢測(cè)結(jié)果如下表所示，試驗(yàn)時(shí)間與增殖倍數(shù)函數(shù)關(guān)系如 圖2所示。
[0115] 圖1和表10的結(jié)果顯示:檸檬酸鐵替代人脫鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白是可行的；BSA對(duì)iPSC增殖 能力起到促進(jìn)作用。
[0116] 表11不同培養(yǎng)基下H1的增殖情況
[0117]
[0118]
[0119]結(jié)合表11和圖2可知，從BioCI培養(yǎng)基和hPLWI培養(yǎng)基的結(jié)果比較我們可以得知，在 傳第1-3代時(shí)，H1在BioCI培養(yǎng)基的增殖速率大于其在hPLWI的增殖速率;然而，在傳第4-5代 時(shí)，H1在hPLWI培養(yǎng)基上的增殖速率反超其在BioCI培養(yǎng)基上的增殖速率;H1在BioCISO培養(yǎng) 基和hPLWII培養(yǎng)基中的增殖速率基本相當(dāng)；
[0120]從hPLWI培養(yǎng)基和hPLWII培養(yǎng)基的結(jié)果比較我們可以得知，BSA組分能有效促進(jìn)H1 細(xì)胞的增殖;這種規(guī)律同樣適用于BioCI培養(yǎng)基。
[0121] 綜上所述，檸檬酸鐵作為人脫鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白的一種良好替代品，其不會(huì)對(duì)多能干細(xì) 胞或人胚胎干細(xì)胞的增殖造成影響；另外，BSA的加入也可有效促進(jìn)多能干細(xì)胞或人胚胎干 細(xì)胞的增殖。
[0122] hPLWII培養(yǎng)基中的BSA組分也可以由HSA替代。
[0123]對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，可根據(jù)以上描述的技術(shù)方案以及構(gòu)思，做出其它各 種相應(yīng)的改變以及變形，而所有的這些改變以及變形都應(yīng)該屬于本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范 圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種多能干細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和以下添加組分：L-抗壞血 酸-2磷酸鎂、亞硒酸鈉、人胰島素、檸檬酸鐵、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 betal〇2. 如權(quán)利要求1所述的多能干細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述添加組分還包括肝素鈉、 Dorsomorphin dihydrochloride和NaHC〇3〇3. 如權(quán)利要求2所述的多能干細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述肝素鈉的濃度為1~ 400ng/mL;所述Dorsomorphin dihydrochloride的濃度為25~250nM;所述NaHC〇3的濃度為 520~570yg/mL。4. 如權(quán)利要求1所述的多能干細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述多能干細(xì)胞培養(yǎng)基的Fe3+ 濃度為1.2~3.8mM。5. 如權(quán)利要求1所述的多能干細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM/F12培 養(yǎng)基。6. 如權(quán)利要求5所述的多能干細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述檸檬酸鐵的濃度為1~ 300ng/mL〇7. 如權(quán)利要求1所述的多能干細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述多能干細(xì)胞培養(yǎng)基的葡萄 糖濃度為16-18mmol/L。8. 如權(quán)利要求1所述的多能干細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述多能干細(xì)胞培養(yǎng)基的滲透 壓為 280 ~350mosmol/L〇9. 如權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述的多能干細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述L-抗壞血酸-2磷 酸鎂的濃度為60~70yg/mL;所述亞硒酸鈉的濃度為10~20ng/mL;所述人胰島素的濃度為 15~25yg/mL;所述堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的濃度為1~100ng/mL ;所述轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-betal 的濃度為0· 1 ~2.0ng/mL。10. 如權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述的多能干細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述L-抗壞血酸-2 磷酸鎂的濃度為64yg/mL;所述亞硒酸鈉的濃度為13.6ng/mL;所述人胰島素的濃度為20yg/ mL;所述堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的濃度為40ng/mL;所述轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-betal的濃度為 0·5ng/mL〇11. 如權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述的多能干細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述多能干細(xì)胞培 養(yǎng)基還包括BSA或HSA。12. 如權(quán)利要求11所述的多能干細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于，所述BSA的含量為0.05_ 4w · t · % ; HSA的含量為0 · 05-4w · t · %。
【文檔編號(hào)】C12N5/0735GK105907705SQ201610508983
【公開日】2016年8月31日
【申請(qǐng)日】2016年6月28日
【發(fā)明人】王淋立, 陳月花, 宋立兵, 關(guān)春燕
【申請(qǐng)人】廣州市搏克生物技術(shù)有限公司, 王淋立