一種原代小鼠或大鼠軟骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種原代小鼠或大鼠軟骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，在采集軟骨細(xì)胞的過(guò)程中具有打磨軟骨表面的步驟，最大限度地排除了后續(xù)滑膜細(xì)胞的污染；采取過(guò)程開(kāi)創(chuàng)性的采用了活檢針切取內(nèi)部軟骨組織，使得采樣直接針對(duì)目的細(xì)胞，不但直接有效，同時(shí)巧妙地避免了潛在的細(xì)菌和真菌污染；同時(shí)，本發(fā)明的原代小鼠或大鼠軟骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，使用的特殊制備的復(fù)合酶消化液，相比傳統(tǒng)單一的膠原酶預(yù)熱消化，不但避免了對(duì)組織過(guò)度消化過(guò)度吹打所導(dǎo)致的細(xì)胞活性低、得率差的問(wèn)題，而且消化的更均勻透徹。
【專利說(shuō)明】
_種原代小鼠或大鼠軟骨細(xì)胞的分禹培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種原代小鼠或大鼠軟骨細(xì)胞的分離培 養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 軟骨細(xì)胞位于軟骨中，主要作用是合成某些膠原蛋白以及非膠原的高分子細(xì)胞外 基質(zhì)，包括：II型膠原蛋白、蛋白多糖、鏈接蛋白、IX型膠原蛋白和XI型膠原蛋白。調(diào)控軟骨 細(xì)胞的增殖和分化，對(duì)于協(xié)調(diào)脊椎動(dòng)物的骨骼發(fā)育至關(guān)重要。軟骨細(xì)胞可以產(chǎn)生大量的肽 生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子，并與之發(fā)生反應(yīng)，例如:胰島素樣生長(zhǎng)因子一 1和白介素一 1。在研究 軟骨的再生和修復(fù)、細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子對(duì)軟骨的作用、特定基因?qū)﹃P(guān)節(jié)炎的調(diào)控作用及 關(guān)節(jié)炎的病理生理過(guò)程中，軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)是非常重要的體外模型。
[0003] 目前，國(guó)內(nèi)外已經(jīng)有大量的研究者進(jìn)行了小鼠/大鼠軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)和藥理學(xué)特 性方面的研究，既往的研究多采用0.25%胰酶37度水浴消化1個(gè)小時(shí)，再用II型膠原酶37度 消化5個(gè)小時(shí)左右。其缺點(diǎn)在于，絕大多數(shù)的酶在37度的條件下都會(huì)發(fā)生劇烈的消化作用， 因此，一方面可以加快消化的速度，但是另一方面，又會(huì)對(duì)細(xì)胞造成極大的傷害，尤其是胰 酶更是如此。從而導(dǎo)致的結(jié)果是，消化時(shí)間不好掌握，往往消化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，細(xì)胞碎片居多，雜 細(xì)胞比較多而軟骨細(xì)胞比較少，并且獲得的細(xì)胞活力差，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)及傳代，有活 力的軟骨細(xì)胞越來(lái)越少，細(xì)胞逐漸死亡。同時(shí)，軟骨細(xì)胞的采集過(guò)程中，其他細(xì)胞如滑膜細(xì) 胞的污染非常常見(jiàn)，加之上述的酶消化過(guò)程，很容易造成軟骨細(xì)胞數(shù)量不占優(yōu)勢(shì)，而其他耐 受性較高的雜細(xì)胞反而分離得到較多。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明為解決現(xiàn)有技術(shù)中的上述問(wèn)題提出的一種高純度、高活率、高活性同時(shí)低 污染的原代小鼠或大鼠軟骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法。
[0005] 為了實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)目的，本發(fā)明所采取的技術(shù)措施為：
[0006] -種原代小鼠或大鼠軟骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟：
[0007] 步驟1:軟骨組織的預(yù)處理
[0008] 清理離體的半月板，并利用含雙抗和兩性霉素 B的D-hanks溶液沖洗，然后打磨半 月板表面，再次使用含雙抗和兩性霉素 B的D-hanks溶液沖洗；
[0009] 步驟2:取軟骨細(xì)胞
[0010] 使用小型活檢針刺入步驟1處理后的半月板，切取半月板內(nèi)部軟骨細(xì)胞；
[0011] 步驟3:酶消化
[0012] 將步驟2獲得的軟骨細(xì)胞置于復(fù)合酶消化液中消化，其中復(fù)合酶消化液中包括質(zhì) 量比為1:1:1:1的I型膠原酶、II型膠原酶、IV型膠原酶和Dispase酶；
[0013] 步驟4:分離培養(yǎng)軟骨細(xì)胞
[0014]將步驟3消化完畢的軟骨細(xì)胞過(guò)70um篩網(wǎng)，進(jìn)行離心洗滌，然后進(jìn)行重懸并再次離 心，最后用無(wú)血清培養(yǎng)液再次重懸，分離得到軟骨細(xì)胞，使用含10 % -20 %胎牛血清、2 %雙 抗的培養(yǎng)基在37 °C 5 % C02的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。
[0015]為了進(jìn)一步優(yōu)化上述技術(shù)方案，本發(fā)明所采取的技術(shù)措施還包括：
[0016] 優(yōu)選地，上述步驟2中使用的小型活檢針為小型半自動(dòng)或全自動(dòng)活檢針。
[0017] 優(yōu)選地，上述步驟3中復(fù)合酶消化液中各個(gè)酶的初始濃度均為lmg/ml。
[0018] 優(yōu)選地，上述步驟3中酶消化過(guò)程為使用4°C復(fù)合酶消化液消化4-20h;或者使用37 °C預(yù)熱的復(fù)合酶消化液消化10min-2h。
[0019]優(yōu)選地，上述步驟4的培養(yǎng)基還包括5ug/ml的轉(zhuǎn)鐵蛋白和10ug/ml的胰島素。
[0020] 優(yōu)選地，上述步驟4的培養(yǎng)基選自DMEM培養(yǎng)基、Williams'medium E培養(yǎng)基或DMEM 或F12培養(yǎng)基;更優(yōu)選為DMEM培養(yǎng)基。
[0021] 優(yōu)選地，上述雙抗為青鏈霉素。
[0022] 另一方面，本發(fā)明還提供一種根據(jù)上述的原代小鼠或大鼠軟骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)方 法所培養(yǎng)的小鼠或大鼠軟骨細(xì)胞。
[0023] 本發(fā)明采用上述技術(shù)方案，與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下技術(shù)效果：
[0024] 首先，本發(fā)明在采集軟骨細(xì)胞的過(guò)程中，具有打磨軟骨表面的步驟，最大限度地排 除了后續(xù)滑膜細(xì)胞的污染;其次，采取過(guò)程開(kāi)創(chuàng)性的采用了活檢針切取內(nèi)部軟骨組織，使得 采樣直接針對(duì)目的細(xì)胞，不但直接有效，同時(shí)巧妙地避免了潛在的細(xì)菌和真菌污染；同時(shí)， 本發(fā)明的原代小鼠/大鼠軟骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，使用的特殊制備的復(fù)合酶消化液，復(fù)合 酶消化液由I型膠原酶、II型膠原酶、IV型膠原酶和Dispase酶組成，并使用4°C條件過(guò)夜消 化(4-20h)，相比傳統(tǒng)單一的膠原酶預(yù)熱消化(特殊情況下可用37°C消化），不但避免了對(duì)組 織過(guò)度消化過(guò)度吹打所導(dǎo)致的細(xì)胞活性低、得率差的問(wèn)題，而且消化的更均勻透徹。綜上所 述，本發(fā)明的的原代小鼠/大鼠軟骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，能夠獲得高純度、高活率、高活性 同時(shí)污染風(fēng)險(xiǎn)極低的原代小鼠/大鼠軟骨細(xì)胞，培養(yǎng)的細(xì)胞分化好、細(xì)胞活力高，具有較大 的推廣意義。
【附圖說(shuō)明】
[0025]圖1為本發(fā)明的分離培養(yǎng)方法得到的小鼠軟骨細(xì)胞顯微照片（10X);
[0026]圖2為本發(fā)明的分離培養(yǎng)方法得到的小鼠軟骨細(xì)胞顯微照片(20X)。
【具體實(shí)施方式】
[0027] 本發(fā)明提供了一種原代小鼠或大鼠軟骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，包括以下步驟：
[0028] -種原代小鼠或大鼠軟骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟：
[0029]步驟1:軟骨組織的預(yù)處理
[0030] 清理離體的半月板，并利用含雙抗和兩性霉素 B的D-hanks溶液沖洗，然后打磨半 月板表面，再次使用含雙抗和兩性霉素 B的D-hanks溶液沖洗；
[0031] 步驟2:取軟骨細(xì)胞
[0032] 使用小型活檢針刺入步驟1處理后的半月板，切取半月板內(nèi)部軟骨細(xì)胞；
[0033]步驟3:酶消化
[0034]將步驟2獲得的軟骨細(xì)胞置于復(fù)合酶消化液中消化，其中復(fù)合酶消化液中包括質(zhì) 量比為1:1:1:1的I型膠原酶、II型膠原酶、IV型膠原酶和Dispase酶；
[0035]步驟4:分離培養(yǎng)軟骨細(xì)胞
[0036]將步驟3消化完畢的軟骨細(xì)胞過(guò)70um篩網(wǎng)，進(jìn)行離心洗滌，然后進(jìn)行重懸并再次離 心，最后用無(wú)血清培養(yǎng)液再次重懸，分離得到軟骨細(xì)胞，使用含10 % -20 %胎牛血清、2 %雙 抗的培養(yǎng)基在37 °C 5 % C02的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。
[0037] 下面通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)和具體的介紹，以使更好的理解本發(fā)明， 但是下述實(shí)施例并不限制本發(fā)明范圍。
[0038] 實(shí)施例1
[0039] 本實(shí)施采用SD大鼠，應(yīng)用本發(fā)明的方法采集和培養(yǎng)軟骨細(xì)胞，具體步驟如下：
[0040] 1.大鼠關(guān)節(jié)軟骨組織的提取
[0041] 首先處死新生SD大鼠（冰凍10分鐘或者頸椎脫白），酒精浸泡5分鐘。剪取四肢，將 取下的四肢浸泡在含2 %青鏈霉素的PBS里，放在冰上保存。
[0042] 2.半月板的剝離
[0043]在解剖顯微鏡下，用眼科剪仔細(xì)剝除四肢的皮膚和肌肉，盡量完全去除，最大限度 地避免雜細(xì)胞的混入。將關(guān)節(jié)切開(kāi)，暴露關(guān)節(jié)面，可以看到關(guān)節(jié)腔里的半月板，將其取出收 集。
[0044] 3.軟骨組織的預(yù)處理
[0045] 清理離體的半月板，并利用含雙抗和兩性霉素 B的D-hanks溶液沖洗，然后打磨半 月板表面，再次使用含雙抗和兩性霉素 B的D-hanks溶液沖洗;充分清洗去除打磨后的軟骨 表面可能誤帶的滑膜組織。
[0046] 4.酶消化
[0047] 將處理后變白的軟骨組織剪碎，加入復(fù)合酶消化液(I型膠原酶+11型膠原酶+IV型 膠原酶+Dispase酶=1:1:1:1)，4種酶的初始濃度均為lmg/ml。在4度冰箱過(guò)夜，便于酶與組 織充分結(jié)合，使組織松散，細(xì)胞容易剝離。這樣可以避免消化過(guò)程中，對(duì)細(xì)胞的過(guò)度消化和 過(guò)度吹打，對(duì)細(xì)胞造成極大的傷害。第2天，將組織從冰箱中取出，稍微吹打幾次，放入37度 水浴30分鐘，再次輕微吹打不超過(guò)10次。根據(jù)情況，可再次放入37度水浴30分鐘，最后，輕微 吹打不超過(guò)10次，過(guò)7〇um篩網(wǎng)。
[0048] 5.離心純化
[0049] 取過(guò)篩后的細(xì)胞濾液，進(jìn)行重懸并再次離心，最后用無(wú)血清培養(yǎng)液再次重懸，分離 得到軟骨細(xì)胞，然后用〇. 2 %臺(tái)盼蘭計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)。
[0050] 6.培養(yǎng)基配制
[0051] 由于軟骨細(xì)胞的特殊性，在配制完全培養(yǎng)基時(shí)，需要加入細(xì)胞因子，即基礎(chǔ)培養(yǎng)基 為含10 %胎牛血清、1 %青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，使用前加入5ug/ml的轉(zhuǎn)鐵蛋白和10ug/ml 的胰島素。另外，為了促進(jìn)細(xì)胞的貼壁，在原代、傳代以及復(fù)蘇的第1天，將培養(yǎng)基中的血清 濃度提高到20%，第2天更換為10%。
[0052] 7.二維培養(yǎng)
[0053]將純化的大鼠軟骨細(xì)胞用上述培養(yǎng)基重懸，制得軟骨細(xì)胞重懸液，加入到T25培養(yǎng) 瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，接種密度為0.5*106/瓶。置于37度，5%C02的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。每3天更換 新的培養(yǎng)基，每天于顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，至細(xì)胞融合度達(dá)70%~80%，進(jìn)行傳代培 養(yǎng)。
[0054] 8.傳代培養(yǎng)
[0055] 當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)70 %~80 %時(shí)，每瓶細(xì)胞加0.25 %胰酶-EDTA 1ml，在37度培養(yǎng)箱 中孵育消化2分鐘。顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞間隙增大時(shí)，用含血清的培養(yǎng)基終止消化，并將細(xì) 胞吹打下來(lái)。400g離心5分鐘，獲得的細(xì)胞再加入含細(xì)胞因子且血清濃度為20%的完全培養(yǎng) 基，接種于T25培養(yǎng)瓶中，接種密度為0.5* 106/瓶。置于37度，5 % C02的培養(yǎng)箱中繼續(xù)擴(kuò)增培 養(yǎng)。第2天更換培養(yǎng)基為含細(xì)胞因子且血清濃度為10%的完全培養(yǎng)基。每3天更換新的培養(yǎng) 基，每天于顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。
[0056] 9.細(xì)胞形態(tài)觀察
[0057]分離得到的軟骨細(xì)胞經(jīng)過(guò)培養(yǎng)貼壁后，使用顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，如圖1和圖2所 示，可見(jiàn)細(xì)胞飽滿充盈、形態(tài)健康活力高。
[0058] 10.其他相關(guān)指標(biāo)測(cè)定
[0059] 培養(yǎng)期間測(cè)定細(xì)菌及真菌污染情況、細(xì)胞污染(滑膜細(xì)胞等)情況、統(tǒng)計(jì)細(xì)胞活率 等。
[0060] 對(duì)比實(shí)施例
[0061] 對(duì)比實(shí)施例采用傳統(tǒng)的組織塊消化法，分離獲得半月板后，剝離去除其他連帶組 織，使用含有雙抗的PBS沖洗，在無(wú)菌操作下剪碎，并使用0.25 %胰酶37 °C消化lh，然后再用 II型膠原酶37°C消化5h，使用緩沖液吹打組織，分散細(xì)胞，過(guò)篩網(wǎng)，進(jìn)行離心洗滌，然后進(jìn)行 重懸并再次離心，最后用無(wú)血清培養(yǎng)液再次重懸，分離得到小鼠軟骨細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，加 入到T25培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，接種密度為0.5*10 6/瓶，置于37度，5 %C02的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng) 并觀察和測(cè)定相關(guān)指標(biāo)。
[0062] 上述的實(shí)施例和對(duì)比例實(shí)驗(yàn)，
【申請(qǐng)人】進(jìn)行了多次實(shí)驗(yàn)，并進(jìn)行了相關(guān)指標(biāo)的比較 和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。如表1所示：
[0063] 表 1
[0064]
[0065] 同時(shí)
【申請(qǐng)人】使用小鼠進(jìn)行了若干次實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果同小鼠相同，證明本發(fā)明的方 法對(duì)大鼠和小鼠的軟骨細(xì)胞分離培養(yǎng)的良好效果真實(shí)有效。
[0066] 綜上所述，本發(fā)明的原代小鼠或大鼠軟骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，采用特制的復(fù)合 酶進(jìn)行長(zhǎng)期消化，使得獲得細(xì)胞總量大，分離度高，活率高；由于采集使用了打磨的方法并 利用了活檢針，本發(fā)明的方法獲得的軟骨細(xì)胞細(xì)菌、真菌和其他細(xì)胞的污染概率極低，同時(shí) 還能夠進(jìn)行傳代培養(yǎng)，為以軟骨細(xì)胞培養(yǎng)為基礎(chǔ)的相關(guān)研究提供了良好的細(xì)胞培養(yǎng)解決方 案。
[0067] 以上對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)描述，但其只是作為范例，本發(fā)明并不限 制于以上描述的具體實(shí)施例。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，任何對(duì)本發(fā)明進(jìn)行的等同修改和 替代也都在本發(fā)明的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和 修改，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種原代小鼠或大鼠軟骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟： 步驟1:軟骨組織的預(yù)處理 清理離體的半月板，并利用含雙抗和兩性霉素 B的D-hanks溶液沖洗，然后打磨半月板 表面，再次使用含雙抗和兩性霉素 B的D-hanks溶液沖洗； 步驟2:取軟骨細(xì)胞 使用小型活檢針刺入步驟1處理后的半月板，切取半月板內(nèi)部軟骨細(xì)胞； 步驟3:酶消化 將步驟2獲得的軟骨細(xì)胞置于復(fù)合酶消化液中消化，其中復(fù)合酶消化液中包括質(zhì)量比 為1: 1: 1:1的I型膠原酶、II型膠原酶、IV型膠原酶和Dispase酶； 步驟4:分離培養(yǎng)軟骨細(xì)胞 將步驟3消化完畢的軟骨細(xì)胞過(guò)70um篩網(wǎng)，進(jìn)行離心洗滌，然后進(jìn)行重懸并再次離心， 最后用無(wú)血清培養(yǎng)液再次重懸，分離得到軟骨細(xì)胞，使用含10 % -20 %胎牛血清、2 %雙抗的 培養(yǎng)基在37 °C 5 % CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種原代小鼠或大鼠軟骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于， 所述步驟2中使用的小型活檢針為小型半自動(dòng)或全自動(dòng)活檢針。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種原代小鼠或大鼠軟骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于， 所述步驟3中復(fù)合酶消化液中各個(gè)酶的初始濃度均為lmg/ml。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種原代小鼠或大鼠軟骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于， 所述步驟3中酶消化過(guò)程為使用4 °C復(fù)合酶消化液消化4-20h。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種原代小鼠或大鼠軟骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于， 所述步驟3中酶消化過(guò)程為使用37°C預(yù)熱的復(fù)合酶消化液消化10min-2h。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種原代小鼠或大鼠軟骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于， 所述步驟4的培養(yǎng)基還包括5ug/ml的轉(zhuǎn)鐵蛋白和10ug/ml的胰島素。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種原代小鼠或大鼠軟骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于， 所述步驟4的培養(yǎng)基選自DMEM培養(yǎng)基、Wi 11 iams 'medium E培養(yǎng)基或DMEM/F12培養(yǎng)基。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種原代小鼠或大鼠軟骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于， 所述步驟4的培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)基。9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種原代小鼠或大鼠軟骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，其特征在于， 所述雙抗為青鏈霉素。10. -種根據(jù)權(quán)利要求1-9任意一項(xiàng)所述的原代小鼠或大鼠軟骨細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法 所培養(yǎng)的小鼠或大鼠軟骨細(xì)胞。
【文檔編號(hào)】C12N5/077GK105907707SQ201610218208
【公開(kāi)日】2016年8月31日
【申請(qǐng)日】2016年4月8日
【發(fā)明人】王曉冰, 楊國(guó)峰
【申請(qǐng)人】王曉冰, 楊國(guó)峰