Anti ROBO1 CAR-T細(xì)胞及其制備和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種嵌合抗原受體修飾T細(xì)胞的改造方法，將SCFV(Anti ROBO1?FN3)? CD8??4?1BB?CD3ζ分子在T細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，該方法制備的CART細(xì)胞可特異性識別和結(jié)合ROBO1蛋白高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞，可以應(yīng)用于相應(yīng)腫瘤疾病的預(yù)防和治療。
【專利說明】
Anti R0B01 CAR-T細(xì)胞及其制備和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ] 本發(fā)明涉及細(xì)胞藥物腫瘤治療領(lǐng)域，特別是涉及一種Anti R0B01 CAR-T細(xì)胞及其制備和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]人體的T淋巴細(xì)胞是通過其表面的T細(xì)胞受體來識別革E細(xì)胞的，這一識別具有特異性，即某一個T淋巴細(xì)胞只識別具有特定抗原的靶細(xì)胞，而且這種特定的抗原是在細(xì)胞內(nèi)加工后，在特殊分子的作用下呈遞給T淋巴細(xì)胞的。這種起抗原呈遞作用的分子或者存在于抗原呈遞細(xì)胞表面或者存在于靶細(xì)胞表面。至少有兩方面的因素導(dǎo)致體內(nèi)的T淋巴細(xì)胞不能很好地識別癌細(xì)胞:(I)癌細(xì)胞下調(diào)抗原呈遞分子的表達(dá)，(2)被呈遞的抗原與T細(xì)胞受體親和力很弱。雖然癌癥患者體內(nèi)存在癌細(xì)胞高度特異性的T淋巴細(xì)胞，但是數(shù)量太少起不到治療癌癥的作用?；谶@種情況，科學(xué)家提出了構(gòu)建嵌合T細(xì)胞受體(現(xiàn)在一般稱為嵌合抗原受體)的概念。嵌合抗原受體(Chimeric Antigen Receptor，CAR)主要由兩部分構(gòu)成，一端位于細(xì)胞外能夠特異性識別癌細(xì)胞表面的某一抗原，另一端位于胞內(nèi)含有信號激活元件(如T細(xì)胞受體的Zeta鏈)，起傳遞信號激活T細(xì)胞的作用。這樣表達(dá)CAR的T淋巴細(xì)胞(CAR-T細(xì)胞)就能避免T細(xì)胞受體識別靶細(xì)胞的限制，從而起到靶向癌細(xì)胞的的殺傷作用。
[0003]目前，CAR-T治療的臨床試驗正在迅速增長，其中大部分是對B細(xì)胞惡性腫瘤治療的評估。大多數(shù)B細(xì)胞惡性腫瘤和正常B細(xì)胞表達(dá)CD19抗原，但是其他類型的細(xì)胞沒有CD19，因此CD19是一個很好的治療靶點。不同的臨床試驗所采用的CD19 CAR-T細(xì)胞在組成上有一定差別，臨床設(shè)計上也不一樣，不過都報道了顯著的效果，復(fù)發(fā)性或難治性淋巴細(xì)胞白血病的治療能達(dá)到60-90%的反應(yīng)率，一部分患者達(dá)到持續(xù)的緩解，最長的達(dá)到2年。雖然目前還不知道CD19 CAR-T治療能達(dá)到多長時間的持續(xù)緩解，但是可以肯定的是這種免疫治療已經(jīng)給一些患者帶來了以前所達(dá)不到的效果。
[0004]除了血液系統(tǒng)腫瘤外，研究者們一直在努力將CAR-T治療擴(kuò)展到實體瘤。臨床試驗顯示，GD2特異性的CAR-T對神經(jīng)母細(xì)胞瘤有一定的療效，而aFR特異性的CAR-T細(xì)胞對卵巢癌，CAIX特異性的CAR-T細(xì)胞對腎細(xì)胞癌和PSMA特異性的CAR-T細(xì)胞對前列腺癌沒有顯示出治療效果。賓州大學(xué)的Carl H June等在2015年美國臨床腫瘤學(xué)年會上報告了用間皮素特異性的CAR-T細(xì)胞治療難治的和轉(zhuǎn)移的胰腺導(dǎo)管腺癌的結(jié)果，結(jié)果顯示患者對CAR-T細(xì)胞具有很好的耐受性，沒有出現(xiàn)細(xì)胞因子綜合征，周血中能短時期內(nèi)檢測到CART細(xì)胞，有2名患者病情得到穩(wěn)定。因此，CAR-T治療實體瘤還處于早期階段，還有許多問題需要解決。
[0005]組織病理學(xué)檢測顯示Robol在多種癌癥中過表達(dá)，如肝細(xì)胞癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、前列腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等。Ito等的研究顯示Robol在肝細(xì)胞癌中大量表達(dá)，而在正常組織中只有少量表達(dá)，且84.7%的肝癌組織樣本為陽性表達(dá)，因此Robol可以作為一種新的肝細(xì)胞腫瘤相關(guān)抗原，是一種潛在的治療和診斷靶標(biāo)。GRONE等的檢測結(jié)果顯示，80%的結(jié)腸癌患者的癌組織高度表達(dá)Robol mRNA，45%的患者是正常組織4倍，15%的患者是正常組織的12倍，因此Robol可以為結(jié)腸癌的治療提供了一個潛在靶點。通過比較胰腺導(dǎo)管癌和其周圍良性組織，He等發(fā)現(xiàn)Robol在癌組織中表達(dá)上調(diào)，而這種表達(dá)上調(diào)可能與胰腺癌細(xì)胞的淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)。Huang等的研究也表明Robo I與結(jié)腸癌的迀移有關(guān)。
[0006]ROBOl分子胞外段由IG1-1G5和FN3結(jié)構(gòu)域組成，而FN3結(jié)構(gòu)域距離細(xì)胞膜的距離最近，因此以ROBOl分子為靶點，選擇FN3區(qū)域作為抗原是比較好的選擇，以此構(gòu)建的CAR-T細(xì)胞與表達(dá)ROBOl分子的腫瘤細(xì)胞接觸時，距離會被拉的最近，殺傷效果也會更優(yōu)異，具體結(jié)構(gòu)見圖1。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明主要解決的技術(shù)問題是提供一種Anti R0B01 CAR-T細(xì)胞及其制備和應(yīng)用，是修飾和改造T細(xì)胞的方法，使改造后的T細(xì)胞能夠特異性識別和殺傷腫瘤，該方法制備的T細(xì)胞具備更高效的腫瘤殺傷活性。
[0008]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的一個技術(shù)方案是:提供一種以R0B01FN3結(jié)構(gòu)域為靶點的CAR-T細(xì)胞，所述CAR-T細(xì)胞是在T細(xì)胞內(nèi)表達(dá)SCFV- CD8 ? -4_1BB-CD3G融合蛋白。
[0009]在本發(fā)明一個較佳實施例中，所述CAR-T細(xì)胞的制備方法包括步驟為:
(1)合成和擴(kuò)增SCFV-CD8 ? -4-1ΒΒ-0)3ζ融合蛋白基因，將所述SCFV- CD8 ? -4-1ΒΒ-CD3G融合蛋白基因克隆到慢病毒表達(dá)載體上；
(2)利用慢病毒包裝質(zhì)粒和步驟(I)得到的慢病毒表達(dá)載體質(zhì)粒感染293T細(xì)胞，包裝和制備慢病毒；
(3)分離人外周血T淋巴細(xì)胞，培養(yǎng)擴(kuò)增，利用步驟(2)得到的慢病毒感染T淋巴細(xì)胞，使所述T淋巴細(xì)胞表達(dá)SCFV-⑶8 ? -4-1BB-⑶3ζ融合蛋白，得到CAR-T細(xì)胞。
[0010]在本發(fā)明一個較佳實施例中，所述T淋巴細(xì)胞的表面表達(dá)所述SCFV序列的分子，所述T細(xì)胞的胞內(nèi)由所述4-lBB-CD3G分子傳遞T細(xì)胞活化信號。
[0011]在本發(fā)明一個較佳實施例中，所述SCFV- CD8TM-4-lBB-CD3G融合蛋白中所述SCFV的氨基酸序列為如SEQ ID N0:5所示；所述SCFV CD8 ?-4_1BB-CD3G融合蛋白中所述CD8 ?的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0012]在本發(fā)明一個較佳實施例中，所述SCFV- CD8TM-4-lBB-CD3G融合蛋白中所述4-1BB的氨基酸序列如SEQ ID ^):2所示；所述30?￥-0)8 ? -4_1BB-CD3G融合蛋白中的所述4-1BB能替換為CD28，所述CD28的分子序列如SEQ ID N0:3所示。
[0013]在本發(fā)明一個較佳實施例中，所述SCFV- CD8TM-4_1BB-CD3G融合蛋白中所述0)3ζ的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示;所述T細(xì)胞來源于人外周血T淋巴細(xì)胞中。
[0014]在本發(fā)明一個較佳實施例中，所述SCFV-⑶8?-4-1ΒΒ-⑶3ζ融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。
[0015]在本發(fā)明一個較佳實施例中，其特征在于，所述CAR-T細(xì)胞在制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用。
[0016]在本發(fā)明一個較佳實施例中，所述CAR-T細(xì)胞在制備治療高表達(dá)R0B01分子的腫瘤藥物中的應(yīng)用。
[0017]本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明的Anti R0B01 CAR-T細(xì)胞及其制備和應(yīng)用，將R0B01抗體用于CART細(xì)胞的構(gòu)建，并提出以R0B01分子為靶抗原，利用Anti R0B01 CART細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞，并作為細(xì)胞藥物用于腫瘤類疾病的治療，可以用于ROBOl分子高表達(dá)腫瘤的治療。
【附圖說明】
[0018]為了更清楚地說明本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案，下面將對實施例描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其它的附圖，其中:
圖1是本發(fā)明的R0B01分子的結(jié)構(gòu)示意圖；
圖2是本發(fā)明的慢病毒質(zhì)粒載體PRRLSIN-SCFV(anti R0B01-FN3)圖；
圖3是本發(fā)明的高表達(dá)R0B01的工程細(xì)胞株MCF7/R0B01流式檢測結(jié)果圖；
圖4是本發(fā)明的CAR-T體外殺傷實驗結(jié)果圖；
圖5是本發(fā)明的不同效靶比條件下CAR-T細(xì)胞體外殺傷效果圖。
【具體實施方式】
[0019]下面將對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅是本發(fā)明的一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其它實施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0020]實施例一:
慢病毒表達(dá)載體制備:
基因合成SCFV(Anti R0B01-FN3)- CD8-4_1BB-CD3G融合基因序列，基因序列如SEQID NO: 7所示，通過酶切轉(zhuǎn)化連接到PRRSLIN載體中，基因上游為EP-1a啟動子。載體轉(zhuǎn)化Stbl3大腸桿菌菌株，氨芐青霉素篩選，獲得陽性克隆，提取質(zhì)粒，酶切鑒定克隆，獲得PRRLSIN-SCFV(anti ROBO1-FN3)慢病毒轉(zhuǎn)染載體，見圖 2。
[0021]實施例二:
慢病毒制備:
(I)轉(zhuǎn)染前24小時，以每皿約8 X 16將293T細(xì)胞接種至15cm培養(yǎng)皿中。確保轉(zhuǎn)染時細(xì)胞在80%左右的匯合度且均勻分布于培養(yǎng)皿中。
[0022](2)準(zhǔn)備溶液A和溶液B
溶液A:6.25 ml 2 XHEPES buffer緩沖液(5個大皿一起包裝的量，效果最好)。
[0023]溶液B:分以加入以下質(zhì)粒的混合物:112.5 ug pRRLSIN-EF- ROBOlCtargetplasmid)；39.5 ug pMD2.G (VSV-G envelop)；73 ug pCMVR8.74 (gag, pol, tat, rev)；625 μ? 2M|丐離子溶液。溶液A總體積:6.25ml。
[0024]充分混勻溶液B，輕輕渦旋溶液A的同時，逐滴加入溶液A，靜置5-15分鐘。輕輕渦旋上述A和B的混合溶液，逐滴加入含293T細(xì)胞的培養(yǎng)皿中，輕輕前后晃動培養(yǎng)皿使DNA與鈣離子的混合物均勻分布。(不要旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿)放置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16-18小時。更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，分別在48小時和72小時后收集含病毒的上清液。熒光顯微鏡觀察。95%以上的細(xì)胞都應(yīng)該顯示綠色熒光。500g，25°C離心10分鐘。PES膜(0.45μπι)過濾。以70%乙醇消毒貝克曼庫爾特Ultra-clear SW28 centrifuge tubes，并置于紫外燈下消毒30分鐘。將已過濾的含慢病毒的上清液轉(zhuǎn)移至離心管中。在離心管底部小心鋪上一層20%蔗糖(每8ml上清液加Iml蔗糖)。以PBS平衡離心管，25000rpm (82，700g)，4°C離心2小時。小心取出離心管，倒掉上清液，倒置離心管去掉殘余液體。加入ΙΟΟμΙ PBS，密封離心管，在4°C放置2小時，每20分鐘輕輕渦旋一次，500g離心I分鐘(25°C)，收集病毒上清。冰上冷卻后，置于-80°C保存。
[0025]實施例三:
Anti R0B01-FN3-CART細(xì)胞制備:
取0.5ml血進(jìn)行快速的病原微生物檢測，排除HBV、HCV、HDV和HEV、HIV_l/2、梅毒螺旋體及寄生蟲等微生物感染;無菌條件下，用肝素瓶采血50ml (肝素抗凝)，立即(4°C，24小時內(nèi))送至細(xì)胞制備實驗室，保證此過程無病原微生物污染。得到患者血液后，在GMP制備室，用酒精棉球擦拭肝素瓶表面進(jìn)行消毒后放入生物安全柜。預(yù)先打開2個50ml離心管，將血液轉(zhuǎn)入兩個50ml離心管中，旋緊。將上述裝好血液的兩個50ml離心管放入離心機(jī)離心。400 g(2000rpm)，lOmin，室溫離心后收集上層血楽，留下沉淀層。收集的自體血楽經(jīng)56°C、30分鐘滅活。4°C放置15分鐘后，900g，30min，4°C離心，取上清備用。將上述富集的血細(xì)胞用生理鹽水稀釋至30ml/管，打開2個新的50ml離心管，每個離心管分別加入15ml人淋巴細(xì)胞分離液。用移液管把稀釋后的血細(xì)胞液緩緩加入到盛有人淋巴分離液的離心管中，旋緊。注意血液要加到淋巴分離液的上層，勿打破人淋巴分離液的界面。將加好的血細(xì)胞液放入離心機(jī)，調(diào)至最小的升降速率，400 g(2000rpm)，20min，常溫離心。收集兩管的中層白細(xì)胞層于一支15ml無菌離心管中，加入5ml生理鹽水，洗兩次(400g，1min離心)，得外周血單核細(xì)胞(PBMC)。配置完全生長培養(yǎng)基，V-VIV015添加自體AB(FBS)濃度為5%，IL-2濃度為40ng/ml，將分離得到的PBMC用培養(yǎng)基稀釋成2 X1Vml，取50ul流式檢測PBMC中T細(xì)胞的純度。O天，配置buffer I，PBS添加1%的FBS，將beads振蕩30s或手動上下?lián)u勾5min，根據(jù)beads與T細(xì)胞比例3比I的比例取出CD3/CD28 beads置于1.5ml EP管中，添加ImlBufferl清洗beads，之后使用磁鐵從EP管外吸beads Imin，棄洗液，重復(fù)兩次，再使用培養(yǎng)基將beads重懸到原體積，將細(xì)胞和beads混合后按2 X 16 PBMC/ML加到合適的培養(yǎng)瓶中。第二天將細(xì)胞密度調(diào)整至3-5 X 106/ml，按virus vector: cell = l: 5比例添加virus vector，同時添加polybrene 4ug/ml和40ng/ml IL—2。^之后，補(bǔ)加新鮮的完全培養(yǎng)基將細(xì)胞密度調(diào)整至I X 106/ml繼續(xù)培養(yǎng)。將所有的細(xì)胞離心，加入新鮮的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。每隔2-3天進(jìn)行半量換液，維持細(xì)胞密度在0.5-1\10%1。10-12天，細(xì)胞數(shù)量達(dá)到109級別，40(^，51^11離心得免疫細(xì)胞，再用預(yù)冷的PBS洗滌兩遍(400g，5min)。用血球計數(shù)板計數(shù)，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞類群，CART細(xì)胞比例。每天觀察培養(yǎng)基的顏色變化、細(xì)胞密度、細(xì)胞形態(tài)并作相應(yīng)記錄。逐步擴(kuò)大培養(yǎng)過程中，加入總體積所需的白細(xì)胞介素2。
[0026]實施例四:
工程細(xì)胞株的構(gòu)建及檢測:
(1)用于構(gòu)建高表達(dá)RobolFN3工程細(xì)胞株慢病毒的制備(具體制備方法見實施例二中的方法)；
(2)MCF細(xì)胞的侵染:侵染前一天，接種50萬個MCF7細(xì)胞于6孔板中，待第二天細(xì)胞長到80%時，加入包裝好的500ul的R0B01病毒于6孔板中，同時設(shè)置對照細(xì)胞(不添加病毒)，12-16小時后換液，侵染3天后，流式分選Robol的陽性細(xì)胞； (3)工程細(xì)胞株的檢測:取分選的Robol的陽性細(xì)胞2萬個，400g，5min，再用預(yù)冷的I3BS洗滌兩遍，加入2.5ul的Robo I的抗體(B1 legend)避光孵育20min，離心，再用預(yù)冷的PBS洗滌I遍，10ul PBS重懸細(xì)胞，上流式檢測Robol的表達(dá)(見圖3)，實驗結(jié)果證明工程細(xì)胞株構(gòu)建成功，可作為靶細(xì)胞用于后續(xù)殺傷實驗。
[0027]實施例五:
Anti R0B01-FN3-CART細(xì)胞體外活性檢測
LDH釋放法檢測Anti R0B01-FN3-CART細(xì)胞對工程細(xì)胞株MCF-1/R0B01和高表達(dá)Robol的肝癌細(xì)胞系SMCC7721細(xì)胞的殺傷效應(yīng)，ELISA方法檢測LDH釋放。
[0028](I)用含5%小牛血清的RPM1-1640培養(yǎng)液將靶細(xì)胞調(diào)整到5X104/ml。
[0029](2)在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入靶細(xì)胞，每孔加10(^1。3個效應(yīng)細(xì)胞自然釋放對照孔不加靶細(xì)胞，只加ΙΟΟμΙ培養(yǎng)液。
[0030](3)向各孔加ΙΟΟμΙ效應(yīng)細(xì)胞，效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞的比例50:1; 25:1; 10:1; 5:1;1:1。自然釋放孔不加效應(yīng)細(xì)胞只加ΙΟΟμΙ培養(yǎng)液，效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞共孵育6小時，每個實驗置三個復(fù)孔。
[0031](4)最大釋放孔中(陽性對照)加ΙΟμΙ Lysis Solut1n (10 X )，孵育45min_60min，每個實驗置三個復(fù)孔。
[0032](5)取上述3和4中待測樣品和對照樣品各50 ul，加入新鮮的96孔酶標(biāo)板中，再加入assay buffer和substrate mix，避光30mino
[0033](6)加入50 ul stop solut1n。
[0034](7)490nm或492nm處測吸光度值，在I小時內(nèi)測完。
[0035](8)殺傷率=實驗組LDH(0D)/Max LDH 釋放組(OD)。
[0036](9)計算公式:殺傷效率=(experimental - effector spontaneous - targetspontaneous)/ (target maximum - target spontaneous)X100%。
[0037]實驗結(jié)果顯示，制備的Anti R0B01-FN3-CART細(xì)胞能夠顯著殺傷高表達(dá)ROBOl的靶細(xì)胞株MCF-7/R0B01和SMCC7721，不同比例的R0B01 CAR-T與target cells共孵育4小時后，ELISA實驗結(jié)果顯示，隨著E:T比例的增加，細(xì)胞殺傷效率也逐漸增加(見圖5)，顯微成像顯示腫瘤細(xì)胞發(fā)生明顯死亡(圖4)。
[0038]以上所述僅為本發(fā)明的實施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本發(fā)明說明書內(nèi)容所作的等效結(jié)構(gòu)或等效流程變換，或直接或間接運用在其它相關(guān)的技術(shù)領(lǐng)域，均同理包括在本發(fā)明的專利保護(hù)范圍內(nèi)。
[0039]
序列表:
CD8 ?的氨基酸序列SEQ ID NO:1為:1YIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCo
[0040]4-1BB的序列SEQ ID NO:2為:
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELo
[0041]CD28的序列SEQ ID NO:3為:
RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSo
[0042]0)3ζ的分子序列SEQ ID NO:4為:RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSE
IGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR。
[0043]SCFV(Anti R0B01-FN3)的序列SEQ ID N0:5為:
IQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNFLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDFSLT
ISKLEQEDIATYFCQQGNTLPLTFGAGTKLELKGGGGSGGGGSGGGGSLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFTDYYMNWVKLSHGKSLEWIGDIVPNNGDTTYNQNFRGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCARFSNYVYPFDYffGQGTTITVSo
[0044]SCFV(Anti R0B01-FN3)- CD8 ?-4_1BB-CD3G融合蛋白氨基酸的序列SEQ ID NO:6為:
MALPVTALLLPLALLLHAARPIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNFLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDFSLTISKLEQEDIATYFCQQGNTLPLTFGAGTKLELKGGGGSGGGGSGGGGSLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFTDYYMNWVKLSHGKSLEWI⑶IVPNNGDTTYNQNFRGKATLTVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCARFSNYVYPFDYWGQGTTITVSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIffAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SCFV(Anti R0B01-FN3)- CD8 ?-4-1ΒΒ_0)3ζ融合蛋白核苷酸的序列SEQ ID Ν0:7為:
ATGGCCCTGCCTGTGACAGCCCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCATGCCGCTAGACCCatccagatga
cacagactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatcagttgcagggcaagtcaggacattagc
aattttttaaactggtatcagcagaaaccagatggaactgttaaactcctgatctactacacatcaagattacattc
tggagtcccatcaaggttcagtggcagtgggtctggaacagatttttctctcaccattagcaaactggagcaagaag
atattgccacttacttttgccaacagggtaatacgcttccacttacgttcggcgctgggacaaagttggaacttaaa
GGTGGTGGTGGTTCTGGCGGCGGCGGCTCCGGAGGAGGAGGATCGctgcaacagtctggacctgagttggtgaagcc
tggggcttcagtgaagatttcctgcaaggcttctggatacacattcactgactactacatgaattgggtgaagctta
gccatggaaagagccttgagtggattggagatattgttcctaacaatggtgatactacttacaaccagaatttcaga
ggcaaggccacattgactgtagacaagtcctccagcacagcctacatggagctccgcagcctgacatctgaggactc
tgcagtctattactgtgcaagattcagtaattacgtttacccttttgactactggggccaaggcaccactatcacag
tctccACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCA
GAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGC
GCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAAACGGGGCAGAAAGAAAC
TCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTT
CCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGG
CCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGG
ACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATG
GCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCT
CAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCo
【主權(quán)項】
1.一種AntiROBOl CAR-T細(xì)胞，其特征在于，所述CAR-T細(xì)胞是在T細(xì)胞內(nèi)表達(dá)SCFV-CD8 ? -4-1ΒΒ-0)3ζ融合蛋白。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的AntiR0B01 CAR-T細(xì)胞，其特征在于，所述CAR-T細(xì)胞的制備方法包括步驟為: (1)合成和擴(kuò)增SCFV-CD8 ? -4_1BB-CD3G融合蛋白基因，將所述SCFV- CD8 ? -4-1BB-CD3G融合蛋白基因克隆到慢病毒表達(dá)載體上； (2)利用慢病毒包裝質(zhì)粒和步驟(I)得到的慢病毒表達(dá)載體質(zhì)粒感染293T細(xì)胞，包裝和制備慢病毒； (3)分離人外周血T淋巴細(xì)胞，培養(yǎng)擴(kuò)增，利用步驟(2)得到的慢病毒感染T淋巴細(xì)胞，使所述T淋巴細(xì)胞表達(dá)SCFV-⑶8 ? -4-1BB-⑶3ζ融合蛋白，得到CAR-T細(xì)胞。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的AntiR0B01 CAR-T細(xì)胞，其特征在于，所述T淋巴細(xì)胞的表面表達(dá)所述SCFV序列的分子，所述T細(xì)胞的胞內(nèi)由所述4-lBB-CD3G分子傳遞T細(xì)胞活化信號。4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的AntiR0B01 CAR-T細(xì)胞，其特征在于，所述SCFV- CD8 ? -4-1ΒΒ-0)3ζ融合蛋白中所述SCFV的氨基酸序列為如SEQ ID NO: 5所示;所述SCFV- CD8 ? -4-1ΒΒ-0)3ζ融合蛋白中所述CD8?的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的AntiR0B01 CAR-T細(xì)胞，其特征在于，所述SCFV- CD8 ? -4-1ΒΒ-0)3ζ融合蛋白中所述4-1ΒΒ的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示;所述SCFV- CD8 ?-4-1ΒΒ-0)3ζ融合蛋白中的所述4-1ΒΒ能替換為CD28，所述CD28的分子序列如SEQ ID Ν0:3所不O6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的AntiR0B01 CAR-T細(xì)胞，所述SCFV- CD8 ?-4_1BB-CD3G融合蛋白中所述⑶3ζ的氨基酸序列如SEQ ID Ν0:4所示;所述T細(xì)胞來源于人外周血T淋巴細(xì)胞中。7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的AntiR0B01 CAR-T細(xì)胞，其特征在于，所述SCFV- CD8 ? -4-1ΒΒ-0)3ζ融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。8.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的AntiR0B01 CAR-T細(xì)胞，其特征在于，所述CAR-T細(xì)胞在制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的AntiR0B01 CAR-T細(xì)胞，其特征在于，所述CAR-T細(xì)胞在制備治療高表達(dá)R0B01分子的腫瘤藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/62GK105907719SQ201610237593
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年4月18日
【發(fā)明人】李華順, 董寧, 王保壘, 任寶永
【申請人】李華順