一種羧基磁珠固定化谷氨酸脫羧酶及其制備方法和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種羧基磁珠固定化谷氨酸脫羧酶及其制備方法和應(yīng)用，所述羧基磁珠固定化谷氨酸脫羧酶，以羧基磁珠為載體，所述谷氨酸脫羧酶通過氨基和羧基偶聯(lián)固定在羧基磁珠表面，所述谷氨酸脫羧酶的編碼基因的堿基序列如SEQ ID NO.1所示。所述制備方法包括以下步驟：(1)提供谷氨酸脫羧酶和羧基磁珠；(2)將谷氨酸脫羧酶與經(jīng)活化的羧基磁珠混合，反應(yīng)完成后，分離得到所述羧基磁珠固定化谷氨酸脫羧酶。本發(fā)明羧基磁珠固定化谷氨酸脫羧酶具有易分離、可反復(fù)回收利用、熱穩(wěn)定性高、操作穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)；與游離酶相比，羧基磁珠固定化谷氨酸脫羧酶半失活溫度提高了2.1℃；重復(fù)催化10次后，仍保持90.42％的活性。
【專利說明】
一種羧基磁珠固定化谷氨酸脫羧酶及其制備方法和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種羧基磁珠固定化谷氨酸脫羧酶及 其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 谷氨酸脫駿酶(glutamate decarboxylase，簡(jiǎn)稱GAD;EC4.1.1.15)，是一類磷酸P比 哆醛依賴性酶，能以磷酸吡哆醛(PLP)為輔酶專一性地催化L-谷氨酸脫羧合成γ -氨基丁酸 (γ -aminobutyrate，GABA)，是生物催化法制備GABA的關(guān)鍵酶。GABA是一種天然存在的非蛋 白質(zhì)氨基酸，具有降血壓、鎮(zhèn)靜安神、改善睡眠和記憶力等多種重要的生理功能，在食品、醫(yī) 藥、畜牧業(yè)、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域都具有廣闊的應(yīng)用前景。作為一種新型的功能性因子，GABA正越來 越引起人們的注意，它既可以開發(fā)成為一種具有顯著藥理作用的藥物，又可以開發(fā)成為一 種具有保健作用的食品，因而在醫(yī)藥和食品領(lǐng)域均具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
[0003] 目前，制備GABA的方法主要是化學(xué)合成法和生物合成法兩大類。
[0004] 化學(xué)合成GABA雖然反應(yīng)迅速，但是具有反應(yīng)條件苛刻、安全性差、能耗大、成本高、 副反應(yīng)多以及環(huán)境污染嚴(yán)重等缺點(diǎn)。與傳統(tǒng)的化學(xué)催化劑相比，作為天然催化劑的酶具有 催化效率高和底物特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，在食品、醫(yī)藥、輕工等工業(yè)生產(chǎn)上具有巨大的應(yīng)用潛力 和良好的發(fā)展前景。
[0005] 在工業(yè)生產(chǎn)過程中，良好的熱穩(wěn)定性是理想的生物催化劑所應(yīng)具備的特征之一， 同時(shí)酶的重復(fù)利用率也是節(jié)約成本的關(guān)鍵，作為生物催化法制備GABA的關(guān)鍵酶，提高谷氨 酸脫羧酶穩(wěn)定性及重復(fù)利用性在GABA的工業(yè)生產(chǎn)上具有重要的戰(zhàn)略意義。
[0006] 固定化酶指經(jīng)物理或化學(xué)方法處理后，使酶變成不易隨水流失，即運(yùn)動(dòng)受限制，而 又能發(fā)揮催化作用的酶制劑。與游離酶相比，固定化酶的優(yōu)點(diǎn)有:可多次重復(fù)使用，且酶的 穩(wěn)定性高;反應(yīng)后，固定化酶易與底物和產(chǎn)物分離;反應(yīng)條件易于控制，有利于自動(dòng)化生產(chǎn)。
[0007] 超順磁性納米微球（Superparamagnetism nanomicrosphere，簡(jiǎn)稱磁珠 SMNs)的主 要特點(diǎn)是在外加磁場(chǎng)的作用下可以被磁化而顯示出磁性，能夠被迅速分離出來。當(dāng)外加磁 場(chǎng)撤離后它沒有剩磁，因而又可重新分散到液體中，其生物相溶性和懸浮穩(wěn)定性較好。
[0008] 羧基化磁珠表面生物分子的修飾是利用碳二亞胺類中的1-乙基_(3-二甲基氨基 丙基）（EDC)縮合的方法，生物活性分子可通過磁珠表面的官能基團(tuán)結(jié)合到SMNs上，應(yīng)用于 分離、檢測(cè)和臨床診斷等領(lǐng)域中，是醫(yī)學(xué)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)等研究中的重要載體工具。
[0009] 現(xiàn)有技術(shù)中，關(guān)于固定化酶的研究較多，但固定化的谷氨酸脫羧酶在熱穩(wěn)定性、操 作穩(wěn)定性方面仍有待提尚，例如：
[0010] 1、喬春楠等以海藻酸鈉法固定化谷氨酸脫羧酶，獲得的固定化酶連續(xù)催化5次后， 剩余酶活僅為50 % (喬春楠，劉萍，孫君社.海藻酸鈉法固定化谷氨酸脫羧酶的研究.中國(guó)生 化藥物雜志· 2008，29(1): 16-18)。
[0011] 2、公布號(hào)為CN102120995A的發(fā)明專利申請(qǐng)文獻(xiàn)公開了一種固定化谷氨酸脫羧酶 及其制備方法，該固定化谷氨酸脫羧酶的制備以棉絨布為載體固定化乳酸菌谷氨酸脫羧 酶，得到的固定化酶連續(xù)進(jìn)行10次催化反應(yīng)后，酶活回收率達(dá)75%。
[0012] 3、朱菲采用pvA-sA凝膠為載體固定化谷氨酸脫羧酶，得到的固定化酶連續(xù)催化7 次，剩余活力為87% (朱菲.固定化谷氨酸脫羧酶的制備與酶學(xué)性質(zhì)研究[D].杭州:浙江大 學(xué)，2011)。
[0013] 4、LeeSeungwoon等用Eupergit 250C and calcium alginate固定化谷氨酸酸脫 羧酶，得到的固定化酶連續(xù)催化10次后，固定化酶保留了58.1 %的活性（Seungwoon Lee， Jungoh Ahn，Yeon_Gu Kim，Joon_Ki Jung,Hongweon Lee and Eun Gyo Lee. Gamma-Aminobutyric Acid Production Using Immobilized Glutamate Decarboxylase Followed by Downstream Processing with Cation Exchange Chromatography[J] .International Journal of Molecular Sciences，2013，14:1728-1739)〇
[0014] 5、Han Lei、Wei Wang等以羧基磁珠為載體，固定化木瓜蛋白酶，得到的固定化酶 連續(xù)催化十次后，酶的剩余活力為70%(他111^；[，16丨131^，1^1^-1^01611，乂丨30-&31^1^， Bin Yi，Le Deng.The preparation and catalytically active characterization of papain immobilized on magnetic composite microspheres[J].Enzyme and Microbial Technology,2004,35:15-21)〇

【發(fā)明內(nèi)容】

[0015] 本發(fā)明提供了一種熱穩(wěn)定性和活力回收率高的羧基磁珠固定化谷氨酸脫羧酶。
[0016] -種羧基磁珠固定化谷氨酸脫羧酶，以羧基磁珠為載體，所述谷氨酸脫羧酶通過 氨基和羧基偶聯(lián)固定在羧基磁珠表面，所述谷氨酸脫羧酶的編碼基因的堿基序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0017] 本發(fā)明還提供了所述羧基磁珠固定化谷氨酸脫羧酶的制備方法，包括以下步驟：
[0018] (1)提供谷氨酸脫羧酶和羧基磁珠；
[0019] (2)將谷氨酸脫羧酶與經(jīng)活化的羧基磁珠混合，反應(yīng)完成后，分離得到所述羧基磁 珠固定化谷氨酸脫羧酶。
[0020] 作為優(yōu)選，所述谷氨酸脫羧酶通過如下方法制備得到：
[0021] (a)構(gòu)建含目的基因的表達(dá)載體，將所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌，獲得含目的基 因的工程菌；
[0022] (b)誘導(dǎo)培養(yǎng)所述工程菌，收集菌體，破碎菌體細(xì)胞后，得到粗酶液；
[0023] (c)純化。
[0024] 作為優(yōu)選，所述表達(dá)載體為pET-28a( + );宿主細(xì)胞為E.coli BL21(DE3)。
[0025] 所述羧基磁珠的合成方法包括以下步驟：
[0026] (A)在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，向含F(xiàn)e3+和Fe2+的水溶液中加堿和分散劑，調(diào)節(jié)溶液pH至堿性， 制得包被的Fe3〇4納米磁性粒子；
[0027] (B)加入氧化劑進(jìn)行氧化反應(yīng)，反應(yīng)完成后，分離得到所述羧基磁珠。
[0028] 具體地，所述分散劑為油酸，其既具有表面改性作用，又具有分散作用。上述羧基 磁珠為功能化的具有單層羧基的親水性磁性納米粒子。
[0029] 作為優(yōu)選，所述溶液pH調(diào)至9.5~10.5;更為優(yōu)選，所述pH調(diào)至10。
[0030]作為優(yōu)選，所述氧化劑為KMn〇4。
[0031] 作為優(yōu)選，F(xiàn)e3+與Fe2+的摩爾比為2 · 0~2 · 5:1。
[0032] 作為優(yōu)選，氧化反應(yīng)的溫度為20~30°C，時(shí)間為7~9h。
[0033] 作為優(yōu)選，所述羧基磁珠與谷氨酸脫羧酶的質(zhì)量比為1:0.05~0.1。
[0034] 固定化的時(shí)間和溫度對(duì)谷氨酸脫羧酶的固定量有影響。作為優(yōu)選，步驟(2)中所述 反應(yīng)的溫度為20~30°C，時(shí)間為10~13h。更優(yōu)選，所述反應(yīng)的溫度為25°C，時(shí)間為12h。
[0035] 本發(fā)明還提供了所述羧基磁珠固定化谷氨酸脫羧酶在合成γ-氨基丁酸中的應(yīng) 用。
[0036] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：
[0037] (1)本發(fā)明以羧基磁珠作為載體，固定化如SEQ ID NO. 1所示的谷氨酸脫羧酶，獲 得的羧基磁珠固定化谷氨酸脫羧酶具有易分離、可反復(fù)回收利用、熱穩(wěn)定性高、操作穩(wěn)定性 尚等優(yōu)點(diǎn)；
[0038] (2)與游離酶相比，本發(fā)明羧基磁珠固定化谷氨酸脫羧酶的半失活溫度提高了2.1 °C ;重復(fù)催化10次后，仍保持90.42 %的活性；
[0039] (3)本發(fā)明羧基磁珠固定化谷氨酸脫羧酶的制備方法簡(jiǎn)單，易于實(shí)現(xiàn)；
[0040] (4)本發(fā)明羧基磁珠固定化谷氨酸脫羧酶可以利用磁鐵直接從反應(yīng)體系中完全分 離、操作方便簡(jiǎn)單且可反復(fù)回收利用。
【附圖說明】
[0041 ]圖1為實(shí)施例1中羧基磁珠的SEM圖。
[0042] 圖2為實(shí)施例1中游離酶的熱穩(wěn)定性曲線。
[0043] 圖3為實(shí)施例1中固定化酶的熱穩(wěn)定性曲線。
[0044]圖4為實(shí)施例1中固定化酶的操作穩(wěn)定性曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0045] 實(shí)施例1
[0046] -、含目的基因的工程菌的制備
[0047] 利用質(zhì)粒pET_28a( + )構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28a( + )-gad;以pET_28a( + )為載體， GAD1407堿基序列（如SEQ ID NO.1所示)為目的片段，經(jīng)過優(yōu)化酶切、回收純化和連接，構(gòu)建 表達(dá)質(zhì)粒，將連接反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)，得到表達(dá)谷氨酸脫羧酶GAD的工程菌 E·co1i BL21(DE3)-pET-28a(+)-GAD1407。
[0048]二、谷氨酸脫羧酶的分離與純化
[0049] 將保存的工程菌培養(yǎng)于5ml含有50yg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37°C、 200rpm搖床中振蕩培養(yǎng)過夜。以2%的接種量接種到含有5(^8/11^卡那霉素1^液體培養(yǎng)基 中，在37 °C、200rpm搖床中振蕩培養(yǎng)，當(dāng)菌體OD600達(dá)到0.6~0.8時(shí)，加入適量體積的IPTG(終 濃度為〇. 5mmol/L)，在25°C、150rpm搖床中誘導(dǎo)培養(yǎng)過夜。
[0050]誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)束后，在4°C、4000g的條件下離心10min，棄去上清液，收集菌體沉淀， 菌體用pH 7.4的PBS緩沖液洗滌兩次。除盡培養(yǎng)基后，用原發(fā)酵液體積1/10的pH 7.4的PBS 緩沖液重懸細(xì)胞，在冰浴中超聲破胞90次(500W，工作3s，間隙6s)，在4°C、12000g的條件下， 將破胞液離心30min，收集上清液，即得到含有谷氨酸脫羧酶的粗酶液。
[0051 ] 采用Ni-NTA親和層析，對(duì)所得的粗酶液進(jìn)行分離純化，經(jīng)上樣（Loading)、清洗 (Washing)和洗脫(Elution)，收集洗脫液，超濾除去咪唑后留待固定化用。
[0052]所用緩沖液的配制如下：
[0053] PBS 緩沖液：
[0054] 磷酸二氫鉀 2mmol/L;
[0055] 磷酸氫二鈉 10mm〇l/L;
[0056] KC1 2.7mmol/L;
[0057] NaCl 137mmol/L;
[0058] HC1 調(diào)節(jié)pH 7.4。
[0059] 清洗緩沖液(wash buffer):
[0060] Tris-HCl(pH 7.8) 20mmol/L；
[0061] NaCl 500mmol/L；
[0062] 咪唑 40mmol/L。
[0063] 洗脫緩沖液（elution buffer):
[0064] Tris-HCl(pH 7.8) 20mmol/L；
[0065] NaCl 500mmol/L；
[0066] 咪唑 400mmol/L。
[0067] 三、羧基磁珠的合成方法
[0068] 稱取FeCl3 · 6H20 4.05g、FeCl2 · 4H20 1.65g溶解于72mL水中，用恒壓漏斗逐滴加 入10mL濃氨水至pH=10左右，80°C下反應(yīng)30min，將溫度調(diào)至70°C，繼續(xù)反應(yīng)30min后，用恒 壓漏斗逐滴加入2.33g油酸（約2.5mL)，70°C下反應(yīng)lh。整個(gè)合成反應(yīng)過程均在犯保護(hù)下攪 拌進(jìn)行。
[0069] 反應(yīng)結(jié)束后，在混合物中加入適量無水乙醇進(jìn)行磁分離。用無水乙醇洗去多余油 酸后，用去離子水洗至中性。磁分離后向沉淀物中加入80mL KMn〇4(濃度為10mg/mL)，超聲 震蕩下反應(yīng)8h，反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行磁分離，用乙醇和水交替洗滌沉淀，制得羧基磁珠。
[0070]采用共沉淀法合成上述羧基磁珠，制備工藝簡(jiǎn)單、成本低廉。對(duì)該羧基磁珠做SEM 測(cè)試，將制得的羧基磁珠表面進(jìn)行噴金處理，用HitachiS-4700m(II)型掃描電鏡觀察和分 析樣品表面形貌特征，加速電壓15kV，結(jié)果如圖1所示，從圖1中我們可以看出，制得的羧基 磁珠粒子比表面大，吸附量高，純度高，對(duì)傳質(zhì)影響較小;粒徑均一，理化性質(zhì)穩(wěn)定。
[0071 ]四、羧基磁珠固定化谷氨酸脫羧酶的方法 [0072] 1、磁珠的活化
[0073] 取lmg羧基磁珠(約100yL磁懸液)于離心管中，在樣品混合儀上震蕩5-10min，然后 將離心管放置于磁分離架上，待磁珠完全被吸附，把上清液抽掉(小心不要抽掉磁珠），加入 lmL 15mM 2-(N-嗎啉）乙磺酸一水合物(MES)(pH6.0)溶液洗滌磁珠，重復(fù)洗滌一次之后，再 加入100yL 15mM MES(pH6.0)溶液重懸磁珠，再加入100yL(10mg/mL)碳二亞胺(EDC)(使用 預(yù)冷的15mM MES(pH6.0)溶液，并且現(xiàn)配現(xiàn)用），最后混合均勻，25 °C條件下，在混合儀上活 化30min。
[0074] 2、磁珠的包被
[0075] 使用lmL 15mM的MES(pH6.0)溶液洗滌活化后的磁珠一遍，進(jìn)行磁分離，棄上清液， 接著加入500yL谷氨酸脫羧酶酶液，室溫反應(yīng)過夜。
[0076]五、谷氨酸脫羧酶熱穩(wěn)定性的考察 [0077] 1、游離酶穩(wěn)定性的考察
[0078]將20yL游離酶(GAD1407)分別在不同溫度（20°C、40°C、45°C、50°C、55 °C、60°C、65 °C、70°C)恒溫水浴條件下保存lOmin;保溫結(jié)束后，迅速放置在冰上冷卻，然后分別測(cè)定不 同的處理?xiàng)l件下的酶活性。
[0079]酶活測(cè)定方法為：取400yL底物溶液(pH 4.8、0.2mol/L檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖 液，含0.01 mmol/L PLP、100mmol/L底物L(fēng)-MSG)加入到1.5mL離心管中，置于37°C金屬浴中預(yù) 熱，然后加入20yL純酶迅速混勻，在37°C的條件下反應(yīng)40min，反應(yīng)結(jié)束后，取樣品O.lmL加 入0.2mol/L pH 9.8的NaHC03 0.9mL以終止反應(yīng)，離心，然后取0.5mL，再加入等量DNS-C1丙 酮(8g/L)溶液，避光，置于30°C下衍生lh，衍生后的樣品經(jīng)0.22μπι微孔濾膜過濾后，采用高 效液相色譜法(HPLC法)測(cè)定反應(yīng)生成的GABA的含量，以測(cè)定酶的活力。
[0080] 2、羧基磁珠固定化后酶穩(wěn)定性的考察
[0081] 向固定化后的谷氨酸脫羧酶磁珠中，加入32(^1^?85溶液(1〇11^，？!17.4)在震蕩儀 (1400r/min、5min、室溫）中分散處理，得到均勾分散的羧基磁珠固定化后的酶溶液;各自取 20yL加入到離心管中，分別在40~70°C水浴中保溫10min(每個(gè)溫度梯度設(shè)置一個(gè)平行，同 時(shí)做一個(gè)空白對(duì)照）；保溫結(jié)束后，迅速放置冰上，冷卻5分鐘后，置于磁力架上，除去上清 液;再分別加入取400μL底物溶液在震蕩儀（1400r/min、室溫)上震蕩40min，反應(yīng)結(jié)束后，取 上清液0. lmL加入0.2mol/L pH 9.8的NaHC030.9mL以終止反應(yīng)，離心；然后取0.5mL上清液， 再加入等量DNS-C1丙酮(8g/L)溶液，避光，置于30°C下衍生lh;衍生后的樣品經(jīng)0.22μπι微孔 濾膜過濾后，采用高效液相色譜法(HPLC法)測(cè)定反應(yīng)生成的GABA的含量，以測(cè)定固定化后 每個(gè)溫度處理下的酶活力。
[0082]最后，以溫度為橫坐標(biāo)，以熱處理后與處理前的比活力的比值為縱坐標(biāo)作圖，計(jì)算 半失活溫度(T501())，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下圖2、圖3所示。游離酶和固定化酶的T501()分別為60.6Γ、 62.7°C ;相比游離酶，固定化酶半失活溫度提高了2.1°C。
[0083] 3、HPLC操作條件
[0084] 色譜分離柱為Hypersil 0DS2C18(250mmX4.6mm)(伊利特公司），紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為 254nm，進(jìn)樣量為10yL，控制柱溫25 °C，流動(dòng)相A為甲醇，流動(dòng)相B為：四氫呋喃：甲醇： 0 · 05mo 1/L醋酸鈉(pH6 · 2) (5:75:420，V/V/V)。
[0085] 梯度洗脫程序，見表1:
[0086] 表1 HPLC梯度洗脫程序
[0087]
[0088] 六、谷氨酸脫羧酶的操作穩(wěn)定性考察
[0089] 酶的操作穩(wěn)定性的測(cè)定方法:將固定化酶于適宜反應(yīng)條件下進(jìn)行催化反應(yīng)，并測(cè) 定酶活力，反應(yīng)結(jié)束后，回收固定化酶并用PBS溶液沖洗，再重新置于新取的底物溶液，重復(fù) 使用10次，測(cè)其剩余酶活。以第一次酶活力為100%，用相對(duì)活力來表示酶活力的變化趨勢(shì)。 結(jié)果如圖3所不。
[0090]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，重復(fù)使用10次后，羧基磁珠固定化谷氨酸脫羧酶仍保持90.42%活 性。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種羧基磁珠固定化谷氨酸脫羧酶，以羧基磁珠為載體，所述谷氨酸脫羧酶通過氨 基和羧基偶聯(lián)固定在羧基磁珠表面，其特征在于，所述谷氨酸脫羧酶的編碼基因的堿基序 列如SEQ ID NO. 1所示。2. 如權(quán)利要求1所述羧基磁珠固定化谷氨酸脫羧酶的制備方法，包括以下步驟： (1) 提供谷氨酸脫羧酶和羧基磁珠； (2) 將谷氨酸脫羧酶與經(jīng)活化的羧基磁珠混合，反應(yīng)完成后，分離得到所述羧基磁珠固 定化谷氨酸脫羧酶。3. 如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述谷氨酸脫羧酶通過如下方法制備得 到： (a) 構(gòu)建含目的基因的表達(dá)載體，將所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌，獲得含目的基因的 工程菌； (b) 誘導(dǎo)培養(yǎng)所述工程菌，收集菌體，破碎菌體細(xì)胞后，得到粗酶液； (c) 純化。4. 如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述表達(dá)載體為pET-28a( + );宿主細(xì)胞 為E.coli BL21(DE3)。5. 如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述羧基磁珠的合成方法包括以下步 驟： (A) 在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，向含F(xiàn)e3+和Fe2+的水溶液中加堿和分散劑，調(diào)節(jié)溶液pH至堿性，制得 包被的Fe3〇4納米磁性粒子； (B) 加入氧化劑進(jìn)行氧化反應(yīng)，反應(yīng)完成后，分離得到所述羧基磁珠。6. 如權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，F(xiàn)e3+與Fe2+的摩爾比為2.0~2.5:1。7. 如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述羧基磁珠與谷氨酸脫羧酶的質(zhì)量比 為 1:0.05 ~0.1〇8. 如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟（2)中，所述反應(yīng)的溫度為20~30 °C，時(shí)間為10~13h。9. 如權(quán)利要求1所述羧基磁珠固定化谷氨酸脫羧酶在合成γ-氨基丁酸中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12R1/19GK105907742SQ201610455225
【公開日】2016年8月31日
【申請(qǐng)日】2016年6月21日
【發(fā)明人】黃 俊, 梅樂和, 李佳男, 胡升, 謝湉, 謝東芳, 方卉
【申請(qǐng)人】浙江科技學(xué)院