一種真核生物樣本的mRNA和小RNA建庫(kù)的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)一種真核生物樣本的mRNA和小RNA建庫(kù)的方法。該方法包括以下步驟：S1，利用磁珠從總RNA中純化mRNA，得到mRNA和清液；S2，將清液用乙醇沉淀的方法回收得到RNA；以及S3，利用S1中得到的mRNA構(gòu)建mRNA文庫(kù)和利用S2中得到的RNA構(gòu)建小RNA文庫(kù)。本發(fā)明充分利用同一份真核生物總RNA的mRNA和小RNA而進(jìn)行mRNA文庫(kù)和小RNA文庫(kù)的構(gòu)建，在很大程度上解決了樣本量限制的問(wèn)題。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
一種真核生物樣本的mRNA和小RNA建庫(kù)的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及生物學(xué)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種真核生物樣本的mRNA和小RNA建庫(kù)的 方法。
【背景技術(shù)】
[0002]利用二代測(cè)序的方法分析生物體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄情況已經(jīng)成為一種普遍的研究手段。對(duì) 于真核生物mRNA，因其3'端有polyA結(jié)構(gòu)，可以使用Dymbeads?mRNA DIRECT?純化試劑盒從 總RNA中富集到mRNA，其原理是磁珠上錨定的PolyT可以通過(guò)氫鍵和PolyA結(jié)合，從而特異性 的富集mRNA，得到的mRNA可使用NBBNext?ultra RNA文庫(kù)構(gòu)建試劑盒建庫(kù)。而對(duì)于真核生 物的小RNA(小RNA)，可以利用其5'磷酸基團(tuán)和3'羥基的特殊結(jié)構(gòu)在兩端直接連接接頭進(jìn)行 建庫(kù)，然后通過(guò)PAGE電泳回收目標(biāo)片段文庫(kù)，具體而言，可以使用NEBNext Multiplex小RNA 文庫(kù)構(gòu)建試劑盒建庫(kù)。
[0003] 其中，Dynabciu^mRNA DIRECT?純化試劑盒純化mRNA包括以下步驟：（1)磁珠的純 化；（2)總RNA的變性；（3)mRNA和磁珠的結(jié)合；（4)磁珠的洗滌；（5)mRNA的洗脫；（6)mRNA的再 結(jié)合;（7 )mRNA的洗滌和洗脫。
[0004] 用NEBNeXt?ultra RNA文庫(kù)構(gòu)建試劑盒構(gòu)建轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)的流程如下：（l)RNA片段 化；（2)第一鏈cDNA合成；（3)第二鏈cDNA合成；（4)雙鏈cDNA純化；（5)末端修復(fù)和加 A; (6)接 頭的連接；（7)帶接頭cDNA的純化；（8)片段選擇加接頭的DNA; (9)USER酶消化和PCR富集； (10)PCR產(chǎn)物純化。
[0005] 用NEBNext Multiplex小RNA文庫(kù)構(gòu)建試劑盒構(gòu)建小RNA文庫(kù)的流程如下：（1)3'端 接頭的連接；（2)反轉(zhuǎn)錄引物的雜交；（3) 5 '端接頭的連接；（4)反轉(zhuǎn)錄；（5)PCR富集文庫(kù)；（6) PAGE電泳回收目標(biāo)片段文庫(kù)。
[0006] 目前，二代測(cè)序中無(wú)論是構(gòu)建mRNA文庫(kù)還是構(gòu)建小RNA文庫(kù)都是獨(dú)自使用總RNA為 起始來(lái)進(jìn)行的，對(duì)mRNA和小RNA的聯(lián)合分析需要同時(shí)構(gòu)建兩種文庫(kù)，而在實(shí)際的研究過(guò)程中 常常出現(xiàn)因樣本量的限制（如一些臨床樣本和珍稀真核生物樣本等)而不能獲得足夠的總 RNA用于同時(shí)構(gòu)建兩種文庫(kù)，進(jìn)而導(dǎo)致研究不能進(jìn)一步開(kāi)展。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明旨在提供一種真核生物樣本的mRNA和小RNA建庫(kù)的方法，以解決現(xiàn)有技術(shù) 二代測(cè)序中針對(duì)真核生物因樣本起始量低的限制而不能同時(shí)構(gòu)建mRNA文庫(kù)和小RNA文庫(kù)進(jìn) 行后期的聯(lián)合分析的技術(shù)問(wèn)題。
[0008] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種真核生物樣本的mRNA和 小RNA建庫(kù)的方法。該方法包括以下步驟:S1，利用磁珠從總RNA中純化mRNA，得到mRNA和清 液;S2，將清液用乙醇沉淀的方法回收得到RNA;以及S3，利用S1中得到的mRNA構(gòu)建mRNA文庫(kù) 和利用S2中得到的RNA構(gòu)建小RNA文庫(kù)。
[0009] 進(jìn)一步地，S1具體包括磁珠的純化、總RNA的變性、mRNA和磁珠的結(jié)合、磁珠的洗 滌、mRNA的洗脫、mRNA與磁珠的再結(jié)合、mRNA的洗滌和洗脫。
[0010] 進(jìn)一步地，構(gòu)建mRNA文庫(kù)具體包括RNA片段化、第一鏈cDNA合成、第二鏈cDNA合成、 雙鏈cDNA純化、末端修復(fù)和加 A、接頭的連接、帶接頭cDNA的純化、片段選擇加接頭的DNA、 USER酶消化和PCR富集以及PCR產(chǎn)物純化。
[0011] 進(jìn)一步地，構(gòu)建小RNA文庫(kù)具體包括3'端接頭的連接、反轉(zhuǎn)錄引物的雜交、5'端接 頭的連接、反轉(zhuǎn)錄、PCR富集文庫(kù)、電泳回收目標(biāo)片段文庫(kù)。
[0012] 進(jìn)一步地，S2具體包括:將清液轉(zhuǎn)移到另一個(gè)離心管，使用無(wú) RNA酶水調(diào)整到180μ1 加入18μ1的3Μ的醋酸鈉，2μ1 10mg/ml的糖原，渦旋混合后加入三倍體積的冰預(yù)冷的無(wú)水乙 醇6〇〇μ1，再渦旋混合，在-20°C放置至少1個(gè)小時(shí)或者-80°C放置30min以上，12000rpm離心 30min，棄上清液，加入預(yù)冷的70 %乙醇，12000rpm離心5min，棄上清液，晾干RNA沉淀，用6μ1 無(wú) RNA酶水溶解RNA沉淀，用于小RNA文庫(kù)的構(gòu)建。
[0013] 進(jìn)一步地，加入預(yù)冷的70%乙醇，12000rpm離心5min，棄上清液的步驟重復(fù)2次。 [0014]應(yīng)用本發(fā)明的技術(shù)方案，在利用磁珠從總RNA中純化mRNA的過(guò)程中，當(dāng)mRNA通過(guò) PolyT的作用結(jié)合到磁珠上后，將分離到的清液用乙醇沉淀的方法回收其中的RNA，因該部 分RNA中含有小RNA，故可以用于小RNA文庫(kù)的構(gòu)建，而磁珠上富集的mRNA則用于mRNA文庫(kù)的 構(gòu)建。本發(fā)明充分利用同一份真核生物總RNA的mRNA和小RNA而進(jìn)行mRNA文庫(kù)和小RNA文庫(kù) 的構(gòu)建，在很大程度上解決了樣本量限制的問(wèn)題。
【附圖說(shuō)明】
[0015] 構(gòu)成本申請(qǐng)的一部分的說(shuō)明書(shū)附圖用來(lái)提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，本發(fā)明的示 意性實(shí)施例及其說(shuō)明用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的不當(dāng)限定。在附圖中：
[0016] 圖1示出了根據(jù)本發(fā)明一種典型實(shí)施方式的真核生物樣本的mRNA和小RNA建庫(kù)的 流程示意圖；
[0017]圖2示出了實(shí)施例1的mRNA文庫(kù)檢測(cè)圖；以及
[0018] 圖3示出了實(shí)施例1的小RNA文庫(kù)檢測(cè)圖。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 需要說(shuō)明的是，在不沖突的情況下，本申請(qǐng)中的實(shí)施例及實(shí)施例中的特征可以相 互組合。下面將參考附圖并結(jié)合實(shí)施例來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。
[0020] 根據(jù)本發(fā)明一種典型的實(shí)施方式，提供一種真核生物樣本的mRNA和小RNA建庫(kù)的 方法。該方法包括以下步驟:S1，利用磁珠從總RNA中純化mRNA，得到mRNA和清液;S2，將清液 用乙醇沉淀的方法回收得到RNA;以及S3，利用S1中得到的mRNA構(gòu)建mRNA文庫(kù)和利用S2中得 到的RNA構(gòu)建小RNA文庫(kù)。
[0021] 應(yīng)用本發(fā)明的技術(shù)方案，在利用磁珠從總RNA中純化mRNA的過(guò)程中，當(dāng)mRNA通過(guò) PolyT的作用結(jié)合到磁珠上后，將分離到的清液用乙醇沉淀的方法回收其中的RNA，因該部 分RNA中含有小RNA，故可以用于小RNA文庫(kù)的構(gòu)建，而磁珠上富集的mRNA則用于mRNA文庫(kù)的 構(gòu)建。本發(fā)明充分利用同一份真核生物總RNA的mRNA和小RNA而進(jìn)行mRNA文庫(kù)和小RNA文庫(kù) 的構(gòu)建，在很大程度上解決了樣本量限制的問(wèn)題。
[0022]優(yōu)選的，S1具體包括磁珠的純化、總RNA的變性、mRNA和磁珠的結(jié)合、磁珠的洗滌、 mRNA的洗脫、mRNA與磁珠的再結(jié)合、mRNA的洗滌和洗脫。
[0023] 優(yōu)選的，構(gòu)建mRNA文庫(kù)具體包括RNA片段化、第一鏈cDNA合成、第二鏈cDNA合成、雙 鏈cDNA純化、末端修復(fù)和加 A、接頭的連接、帶接頭cDNA的純化、片段選擇加接頭的DNA、USER 酶消化和PCR富集以及PCR產(chǎn)物純化。
[0024]優(yōu)選的，構(gòu)建小RNA文庫(kù)具體包括3'端接頭的連接、反轉(zhuǎn)錄引物的雜交、5'端接頭 的連接、反轉(zhuǎn)錄、PCR富集文庫(kù)、電泳回收目標(biāo)片段文庫(kù)。
[0025]優(yōu)選的，S2具體包括:將清液轉(zhuǎn)移到另一個(gè)離心管，使用無(wú) RNA酶水調(diào)整到180μ1加 入18μ1的3Μ的醋酸鈉，2μ1 10mg/ml的糖原，渦旋混合后加入三倍體積的冰預(yù)冷的無(wú)水乙醇 600μ1，再渦旋混合，在-20°C放置至少1個(gè)小時(shí)或者_(dá)80°C放置30min以上，12000rpm離心 30min，棄上清液，加入預(yù)冷的70 %乙醇，12000rpm離心5min，棄上清液，晾干RNA沉淀，用6μ1 無(wú) RNA酶水溶解RNA沉淀，用于小RNA文庫(kù)的構(gòu)建。
[0026]根據(jù)本發(fā)明一種典型的實(shí)施方式，一種真核生物樣本的mRNA和小RNA建庫(kù)的方法， 即利用同一份真核生物總RNA構(gòu)建mRNA文庫(kù)和小RNA文庫(kù)，參照?qǐng)D1的流程示意圖，具體實(shí)施 步驟如下：
[0027] 總RNA中的mRNA富集以及含小RNA的其余RNA的乙醇沉淀純化：
[0028] 1 ·充分混勾Dynabeads oligo(dT)磁珠，然后取30μ1到1 · 5ml離心管中，置于磁力 架上，靜置3min，用槍頭小心吸取丟棄上清液。
[0029] 2.加入100μΙ結(jié)合緩沖液充分吹打混勻，瞬時(shí)離心，在磁力架上，靜置3min，用槍頭 小心吸取丟棄上清液。
[0030] 3.重復(fù)步驟2-次。
[0031] 4.再加入50μ1結(jié)合緩沖液，充分吹打混勻。
[0032] 5.取lyg總RNA樣品補(bǔ)無(wú) RNA酶水至50μ1。
[0033] 6 ·將樣品加入到上述Dynabeads ο 1 igo (dT)磁珠中，充分吹打混勻，65 °C孵育 5min，孵育結(jié)束后立刻置于冰上2min。
[0034] 7.混勻儀上室溫孵育10min，瞬時(shí)離心，在磁力架上靜置3min。
[0035] (1)將清液轉(zhuǎn)移到另一個(gè)1.5ml離心管，使用無(wú) RNA酶水調(diào)整到180μ1
[0036] (2)加入18μ1的3Μ的醋酸鈉(RNA專(zhuān)用），2μ1的糖原（10mg/ml)，輕微的渦旋混合 [0037] (3)加入三倍體積的冰預(yù)冷的無(wú)水乙醇(600μ1)，輕微的渦旋混合
[0038] (4)在-20°C放置至少1個(gè)小時(shí)(或者_(dá)80°C放置30min以上）
[0039] (5)12000rpm離心30min，小心吸取丟棄上清液
[0040] (6)用預(yù)冷新鮮配置的70%乙醇，12000rpm離心5min，小心吸取丟棄上清液 [0041] (7)重復(fù)步驟(6)-次
[0042] (8)簡(jiǎn)短離心去除管壁殘留上清，小心吸取上清，置于室溫，晾干RNA沉淀用6μ1無(wú) RNA酶水溶解RNA沉淀，用于后續(xù)小RNA文庫(kù)的構(gòu)建。
[0043] 8.加入200μ1洗滌緩沖液到磁珠中，充分吹打混勻，置于磁力架上，靜置3min。用槍 頭小心吸取丟棄上清液。
[0044] 9.重復(fù)步驟8-次。
[0045] 10.加入50μ1 10mM Tris-HCl，充分吹打混勻，80°C孵育孵育2min。
[0046] 11.在上步加入50μ1結(jié)合緩沖液，槍頭吹打混勻，混勻儀上孵育5min，瞬時(shí)離心，在 磁力架上，靜置3min，用槍頭小心吸取丟棄上清液。
[0047] 12.加入200μ1洗滌緩沖液，充分吹打混勻，瞬時(shí)離心，置于磁力架上，靜置3min。用 槍頭小心吸取丟棄上清液。
[0048] 13.重復(fù)步驟12-次。
[0049] 14.加入 15·5μ1 10mM Tris-HCL，充分吹打混勻，80°C孵育2min。
[0050] 15.立即置于磁力架上，靜置3min。用槍頭小心吸取14μ1上清液到PCR管中用于后 續(xù)mRNA文庫(kù)的構(gòu)建。
[0051 ] 用NEBNextiSultra RNA文庫(kù)構(gòu)建試劑盒構(gòu)建mRNA文庫(kù)：
[0052] 一、RNA 片段化
[0053] (1)上述純化的mRNA 14μ1按照表1RNA片段化體系加入試劑：
[0054] 表 1
[0055]
[0056] 充分混勻，瞬時(shí)離心。
[0057] (2) 94 °C孵育15m i η。立刻放置冰上。用于一鏈合成。
[0058]二、第一鏈 cDNA 合成
[0059] (1)上述反應(yīng)體系19μ1按照表2第一鏈cDNA合成體系加入試劑：
[0060] 表 2
[0061]
[0062] (2)輕柔的充分混勻，瞬時(shí)離心。放入PCR儀內(nèi)，按照表2的第一鏈cDNA合成PCR體系 進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)后立刻置于冰上。
[0063] 三、第二鏈cDNA合成
[0064] (1)上述第一鏈cDNA 20μ1，按照表3第二鏈cDNA合成反應(yīng)體系加入反應(yīng)試劑。
[0065] 表 3
[0066]
[0067] (2)16Γ 孵育 lh。
[0068] 四、雙鏈cDNA純化
[0069] (1)渦旋混勻AMPure XP磁珠;并室溫孵育30min備用。
[0070] (2)按樣品數(shù)準(zhǔn)備好干凈的1 ·5ml離心管，加入90μ1 (1 ·8X)重懸好的AMPure XP磁 珠，并將對(duì)應(yīng)的編號(hào)寫(xiě)好。將上一步的雙鏈cDNA加入準(zhǔn)備好的AMPure XP磁珠內(nèi)，并用槍頭 混勻。室溫孵育5min。
[0071] (3)如管壁上有液體可瞬時(shí)離心，置于磁力架上，靜置5min。待溶液清亮后，用槍頭 小心吸取丟棄上清液。
[0072] (4)加入200μ1 80%乙醇漂洗，于磁力架上靜置30s。用槍頭小心吸取丟棄上清液。
[0073] (5)重復(fù)步驟4 一次。最后使用10μ1槍頭吸凈離心管底部殘留的液體。
[0074] (6)室溫干燥讓乙醇盡量揮發(fā)干凈(干而不裂開(kāi)）。
[0075] (7)加入58μ1無(wú) RNA酶Η20,槍頭吹吸混勻，瞬時(shí)離心，置于磁力架上，靜置5min。準(zhǔn) 備PCR管，并將編號(hào)寫(xiě)好。用槍頭小心吸取56μ1上清液到準(zhǔn)備好的PCR管內(nèi)。
[0076] 五、末端修復(fù)和加 A
[0077] (1)上述純化好的雙鏈cDNA中按照表4末端修復(fù)和加 A反應(yīng)體系加入試劑：
[0078] 表 4
[0079]
[0080]~(2)輕柔混勻。瞬時(shí)離心，PCR儀上按照表5程序進(jìn)行反應(yīng): '
[0081] 表 5
[0082]
[0083]后立刻放置冰上，立即進(jìn)入下一步接頭連接反應(yīng)。
[0084]六、接頭的連接
[0085] (1)按照表6接頭連接反應(yīng)體系配制反應(yīng)體系。
[0086] 表 6
[0087]
[0088] (2)輕柔混勻，瞬時(shí)離心。15min at 2(TC。
[0089] 七、片段選擇加接頭的DNA
[0090] (1)渦旋混勻AMPure XP磁珠。
[0091] (2)準(zhǔn)備干凈的1.5ml離心管，寫(xiě)好對(duì)應(yīng)編號(hào)，加入16.5μ1無(wú) RNA酶H20(使上步反應(yīng) 終體積為1〇〇μ1)，再加入57μ1重懸的AMPure XP磁珠。
[0092] (3)將連接好接頭的DNA產(chǎn)物(83.5μ1)加入上步準(zhǔn)備好的1.5ml離心管中，槍頭混 勻，室溫孵育5min。
[0093] (4)瞬時(shí)離心。置于磁力架上，靜置5min。待溶液清亮后，用槍頭小心吸取上清液到 另一個(gè)干凈的1.5ml離心管中，12,000rpm離心3min后置于磁力架上。準(zhǔn)備干凈的離心管并 將對(duì)應(yīng)的編號(hào)寫(xiě)好。將上清液轉(zhuǎn)入對(duì)應(yīng)的離心管中。
[0094] (5)加入25μ1重懸好的AMPure XP磁珠，并用槍頭混勻。室溫孵育5min。
[0095] (6)磁力架上靜置5min。待溶液清亮后，用槍頭小心吸取丟棄上清液。
[0096] (7)加入200μ1 80%乙醇漂洗，于磁力架上靜置30s。用槍頭小心吸取丟棄上清液。
[0097] (8)重復(fù)步驟7-次。最后使用10μ1槍頭吸取離心管底部殘留的液體。
[0098] (9)室溫干燥X min讓乙醇盡量揮發(fā)干凈。
[0099] (10)加入52μ1無(wú) RNA酶H20，槍頭吹吸混勻，瞬時(shí)離心，置于磁力架上，靜置5min。
[0100] (11)準(zhǔn)備干凈的離心管，寫(xiě)好對(duì)應(yīng)編號(hào)，加入50μ1渦旋混勻好的AMPure XP磁珠。 吸取上步50μ1上清至對(duì)應(yīng)AMPure XP磁珠管內(nèi)，槍頭混勻，靜置5min。于磁力架上靜置5min， 小心吸取丟棄上清液。
[0101] (12)加入200μ1 80%乙醇漂洗，于磁力架上靜置30s。用槍頭小心吸取丟棄上清 液。
[0102] (13)重復(fù)步驟12-次。最后使用10μ1槍頭吸取離心管底部殘留的液體。
[0103] (14)室溫干燥X min讓乙醇盡量揮發(fā)干凈。
[0104] (15)加入22·5μ1無(wú) RNA酶H20,槍頭吹吸混勻，瞬時(shí)離心，置于磁力架上，靜置5min。 待溶液清亮后，用1 〇μ1槍頭小心吸取2 ΙμL上清至干凈的PCR管內(nèi)。
[0105] (16)取ΙμL進(jìn)行Qubit定量。將濃度低于0.2ngAil的標(biāo)注。用后的Qubit管置于黑暗 處備用。
[0106] 八、USER酶消化和PCR富集
[0107] (1)在上述產(chǎn)物中按照表7USER酶消化和PCR富集反應(yīng)體系加入反應(yīng)體系。
[0108] 表7
[0109]

'[0110]~(2)輕柔混勻，PCR儀上按照表8程序進(jìn)行反應(yīng):' '[0111] 表8
[0112]
[0113]
[01 Μ] *注：當(dāng)?shù)谄卟降腝ubit濃度低于0.2ng/yl的，擴(kuò)增循環(huán)增至11或12個(gè)。
[0115] 九、PCR產(chǎn)物純化
[0116] (1)渦旋混勻AMPure XP磁珠。
[0117] (2)按樣品數(shù)準(zhǔn)備好干凈的1.5ml離心管，加入50μ1重懸好的AMPure XP磁珠，并將 對(duì)應(yīng)的編號(hào)寫(xiě)好。將上一步PCR產(chǎn)物加入準(zhǔn)備好的磁珠內(nèi)，并用槍頭混勻。室溫孵育5min。
[0118] (3)置于磁力架上，靜置5min。待溶液清亮后，用槍頭小心吸取丟棄上清液。
[0119] (4)加入200μ1 80%乙醇漂洗，置于磁力架上，靜置30s。用槍頭小心吸取丟棄上清 液。
[0120] (5)重復(fù)步驟4 一次。最后使用10μ1槍頭吸取離心管底部殘留的液體。
[0121] (6)敞開(kāi)蓋子讓乙醇盡量揮發(fā)干凈，至磁珠干燥。
[0122] (7)加入52μ1無(wú) RNA酶Η20，渦旋混勻，瞬時(shí)離心，置于磁力架上，靜置5min。
[0123] (8)準(zhǔn)備干凈的離心管，寫(xiě)好對(duì)應(yīng)編號(hào)，加入50μ1渦旋混勻好的AMPure XP磁珠。吸 取上步50μ1上清至對(duì)應(yīng)AMPure XP磁珠管內(nèi)，槍頭混勻，靜置5min。置于磁力架上，靜置 5min。于磁力架上小心吸取丟棄上清液。
[0124] (9)加入200μ1 80%乙醇漂洗，于磁力架上靜置30s。用槍頭小心吸取丟棄上清液。
[0125] (10)重復(fù)步驟9 一次。最后使用10μ1槍頭吸取離心管底部殘留的液體。
[0126] (11)室溫干燥讓乙醇盡量揮發(fā)干凈。
[0127] (12)加入22.5μ1無(wú) RNA酶Η20,槍頭吹吸混勻，瞬時(shí)離心，置于磁力架上，靜置5min。 待溶液清亮后，用1〇μ1槍頭槍頭小心吸取21μ1上清至干凈的離心管內(nèi)；當(dāng)?shù)谄卟降腝ubit濃 度低于0.2ng/yl的，最后文庫(kù)溶于12μ1無(wú) RNA酶H20中，吸出10μ1上清至干凈的離心管內(nèi)。
[0128] (13)取ΙμL進(jìn)行Qubit定量。準(zhǔn)備干凈的0.5ml離心管，取ΙμL文庫(kù)按照Qubit濃度稀 釋至1.5-2ng/yl，用于文庫(kù)的檢測(cè)。
[0129] 用NEBNext Multiplex小RNA文庫(kù)構(gòu)建試劑盒構(gòu)建小RNA文庫(kù)：
[0130] -、連接3'接頭
[0131] 1.將上述乙醇沉淀的6μ1 RNA(含小RNA)放入新的PCR管中，加入ΙμL的3'SR接頭， 混勻，在PCR儀中70 °C變性2min之后立刻放在冰上。
[0132] 2.向上管7μ1溶液中按照表9接頭連接體系加入試劑并混勻：
[0133] 表9
[0134]
[0135] 3.25 °C培養(yǎng)1小時(shí)，之后立刻放在冰上。
[0136] 二、雜交反轉(zhuǎn)錄引物
[0137] 1.向上面反應(yīng)體系中按照表10反轉(zhuǎn)錄引物雜交體系加入試劑并混勻：
[0138] 表1〇
[0139]
[0140]~2.按照表11程序進(jìn)行PCR反應(yīng): '
'
[0141] 表11
[0142]
[0143] 三、連接5'接頭
[0144] 1.取ΙμL 5'接頭(存放在-80°C)至新的PCR管中，70°C變性2min，之后立刻放在冰 上。
[0145] 2.向上管反應(yīng)體系中按照表12的5'接頭連接體系加入下列反應(yīng)試劑，充分混勻：
[0146] 表12
[0149] 3 · 25 °C培養(yǎng)1小時(shí)，之后立刻放在冰上。[0150]四、反轉(zhuǎn)錄
[0147]
[0148]
[0151] 1.向上步反應(yīng)體系中按照表13反轉(zhuǎn)錄體系加入下列反應(yīng)試劑，充分混勻：
[0152] 表13
[0153]
[0154] 2.50°(：培養(yǎng)1小時(shí)，立即進(jìn)行?〇?反應(yīng)。
[0155] 五、PCR 擴(kuò)增
[0156] 1.向上步反應(yīng)體系中按照表14PCR擴(kuò)增體系加入下列反應(yīng)試劑，充分混勻：
[0157] 表14
[0158]
[0159] 2.混勻后按表15程序進(jìn)行PCR反應(yīng)。[0160] 表15
[0161]
[0162]
[0163] 六、PAGE膠電泳純化文庫(kù)
[0164] 1.按表16非變性PAGE膠配制體系配制10%的非變性PAGE。
[0165] 表16
[0166]

[0167] 2.電泳：
[0168] (1)點(diǎn)Marker，一般每塊膠點(diǎn)兩個(gè)Marker，各5μ1，一個(gè)是20bp的Marker，另一個(gè)是 試劑盒自帶Marker(Quick_Load pBR322 DNA-MspI Digest)。
[0169] (2)點(diǎn)樣品，從100μΙ的PCR產(chǎn)物中取50μ1加入10μ1的6X上樣緩沖液，混勻后分三 個(gè)點(diǎn)樣孔上樣，剩余的50μ1放入_80°C保存。
[0170] (3)電泳，100V，大約1小時(shí)50分鐘左右。
[0171] (4)電泳跑完，將PAGE膠放在染膠水里染膠（染膠水：3ylGelR ed+30ml超純水， lOmin)〇
[0172] 3.切膠
[0173] 凝膠成像之后拍照，滅菌手術(shù)刀片切膠，切膠范圍137 - 160bp內(nèi)的條帶，切膠之后 再拍照。
[0174] 4.用21號(hào)注射器針頭在0.5ml離心管底部打孔，然后把這個(gè)離心管套進(jìn)2ml的離心 管里。
[0175] 5.將切下來(lái)的膠塊放進(jìn)0.5ml離心管，4°C 13000rpm離心10min。確保凝膠全部通過(guò) 小孔，收集到2ml離心管里。
[0176] 6.扔掉0.5ml的離心管，加 250μ1洗脫緩沖液到盛有碎膠的2ml離心管中（切膠范圍 比較寬時(shí)，加 300μ1洗脫緩沖液）。
[0177] 7.室溫轉(zhuǎn)動(dòng)洗脫DNA過(guò)夜。（或在金屬浴中，50°C1000rpm震蕩2h后再室溫轉(zhuǎn)動(dòng)效果 更好）。
[0178] 8.轉(zhuǎn)移洗脫液和碎膠到Spin-X濾網(wǎng)上，室溫13000rpm離心10min。
[0179] 9.沉淀收集DNA，加入ΙμL糖原(20ugAU)(或者2μ1線性丙烯酰胺），25μ1 3M NaAc， 75(^1-20°(：100%乙醇。-80°(：至少沉淀301^11，4°(：13000印111離心301^11。小心吸去上清液，留 下離心管底部沉淀。
[0180] 10.加入1000yl-20°C保存的80%乙醇洗滌(現(xiàn)用現(xiàn)配），13000rpm離心10min后去 上清。
[0181] 11.重復(fù)用80 %乙醇洗一次，13000rpm離心10min后去上清，干燥沉淀之后，加入8μ 1 ΤΕ溶解沉淀。
[0182] 12 .取ΙμL進(jìn)行Qubit定量，記下文庫(kù)濃度，寫(xiě)上文庫(kù)編號(hào)，準(zhǔn)備干凈的0.5ml離心 管，寫(xiě)好對(duì)應(yīng)的文庫(kù)編號(hào)，取ΙμL文庫(kù)按照Qubit濃度稀釋至lng/μL。如果文庫(kù)濃度低于lng/ μL則不用稀釋。對(duì)文庫(kù)質(zhì)量進(jìn)行caliper/2100和QPCR檢測(cè)。
[0183] 本發(fā)明經(jīng)過(guò)廣泛的研究和實(shí)驗(yàn)，證明可以有效的應(yīng)用于二代測(cè)序領(lǐng)域，成功構(gòu)建 真核生物mRNA文庫(kù)和小RNA文庫(kù)用于后期的聯(lián)合分析研究。
[0184] 下面將結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的有益效果。
[0185] 實(shí)施例1
[0186] 以一個(gè)鳥(niǎo)類(lèi)總RNA樣本為例，樣本總量750ng，按照本發(fā)明上述典型的實(shí)施方式中 所述的流程進(jìn)行文庫(kù)的構(gòu)建，構(gòu)建的文庫(kù)通過(guò)perkinelmer的caliper或者Agilent的2100 生物分析系統(tǒng)對(duì)文庫(kù)的插入片段大小進(jìn)行檢測(cè)，用q-PCR儀對(duì)文庫(kù)的摩爾濃度進(jìn)行檢測(cè)。
[0187] mRNA文庫(kù)檢測(cè)結(jié)果如圖2所示，文庫(kù)峰型單一，無(wú)雜峰、接頭及引物二聚體，符合 PE125雙端測(cè)序要求。小RNA文庫(kù)檢測(cè)結(jié)果如圖3所示，峰型單一，主峰在147bp，無(wú)雜峰、接頭 及引物二聚體，符合SE50單端測(cè)序要求。q-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示兩個(gè)文庫(kù)的摩爾濃度均大于 2nM，均符合上機(jī)測(cè)序的要求。
[0188] 已有研究表明小RNA在真核生物的轉(zhuǎn)錄中起著重要的調(diào)控作用，同時(shí)構(gòu)建mRNA文 庫(kù)和小RNA文庫(kù)進(jìn)行二代測(cè)序，聯(lián)合分析可以更加有效的揭示其中的調(diào)控機(jī)制。在本發(fā)明 中，我們通過(guò)磁珠富集和乙醇沉淀的方法將同一份真核生物總RNA樣品分為mRNA和其余RNA 兩部分，分別用于構(gòu)建mRNA文庫(kù)和小RNA文庫(kù)，使樣品的利用率達(dá)到了最高，解決了在很多 研究項(xiàng)目中因樣本量不足而導(dǎo)致的研究無(wú)法開(kāi)展的問(wèn)題。
[0189] 另外，本方法操作簡(jiǎn)單，快速準(zhǔn)確，能夠廣泛用于二代測(cè)序領(lǐng)域。
[0190] 以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對(duì)于本領(lǐng)域的技 術(shù)人員來(lái)說(shuō)，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修 改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種真核生物樣本的mRNA和小RNA建庫(kù)的方法，其特征在于，包括以下步驟： Sl，利用磁珠從總RNA中純化mRNA，得到mRNA和清液； S2,將所述清液用乙醇沉淀的方法回收得到RNA;以及 S3，利用所述Sl中得到的mRNA構(gòu)建mRNA文庫(kù)和利用所述S2中得到的RNA構(gòu)建小RNA文 庫(kù)。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述Sl具體包括磁珠的純化、總RNA的變 性、mRNA和磁珠的結(jié)合、磁珠的洗滌、mRNA的洗脫、mRNA與磁珠的再結(jié)合、mRNA的洗滌和洗 脫。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述構(gòu)建mRNA文庫(kù)具體包括RNA片段化、第 一鏈cDNA合成、第二鏈cDNA合成、雙鏈cDNA純化、末端修復(fù)和加 A、接頭的連接、帶接頭cDNA 的純化、片段選擇加接頭的DNA、USER酶消化和PCR富集以及PCR產(chǎn)物純化。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述構(gòu)建小RNA文庫(kù)具體包括3'端接頭的 連接、反轉(zhuǎn)錄引物的雜交、5'端接頭的連接、反轉(zhuǎn)錄、PCR富集文庫(kù)、電泳回收目標(biāo)片段文庫(kù)。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述S2具體包括： 將所述清液轉(zhuǎn)移到另一個(gè)離心管，使用無(wú) RNA酶水調(diào)整到180μ1加入18μ1的3M的醋酸 鈉，2μ1 10mg/ml的糖原，渦旋混合后加入三倍體積的冰預(yù)冷的無(wú)水乙醇600μ1，再渦旋混 合，在-20 °C放置至少1個(gè)小時(shí)或者-80 °C放置30min以上，12000rpm離心30min，棄上清液，加 入預(yù)冷的70 %乙醇，12000rpm離心5min，棄上清液，晾干RNA沉淀，用6μ1無(wú) RNA酶水溶解所述 RNA沉淀，用于小RNA文庫(kù)的構(gòu)建。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述加入預(yù)冷的70%乙醇，12000rpm離心 5min，棄上清液的步驟重復(fù)2次。
【文檔編號(hào)】C40B50/06GK105907747SQ201610222093
【公開(kāi)日】2016年8月31日
【申請(qǐng)日】2016年4月11日
【發(fā)明人】白靈, 鄧臘梅, 左海洋, 王英男, 師文霞
【申請(qǐng)人】北京諾禾致源生物信息科技有限公司