辣椒抗炭疽病分子標(biāo)記及應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及分子標(biāo)記領(lǐng)域，具體涉及辣椒抗炭疽病分子標(biāo)記及應(yīng)用。其與側(cè)翼SNP標(biāo)記UN02856_633的遺傳距離為3.468cM。本發(fā)明提供的分子標(biāo)記實(shí)現(xiàn)了在苗期對辣椒植株綠果期抗炭疽病鑒定，大大縮短了育種時(shí)間，節(jié)約了人力物力。
【專利說明】
辣椒抗炭疽病分子標(biāo)記及應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及分子標(biāo)記領(lǐng)域，具體涉及辣椒抗炭疽病分子標(biāo)記及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 辣椒(Capsicum spp)又名海椒、番椒、辣子、辣前等，屬前科（solanaceae)辣椒屬 (Capsicum)，我國是世界辣椒種植面積最大的國家，辣椒炭疽病在辣椒上發(fā)生較為普遍，是 危害辣椒果實(shí)的一種主要病害，辣椒炭疽病危害時(shí)間長、經(jīng)濟(jì)損失大，在高溫多雨的氣候條 件下尤為嚴(yán)重。在我國，引起辣椒炭疽病的病原菌主要有4個(gè)種：尖孢炭疽菌 Colletotrichum acutatum(Simmonds)、紅色炭疽菌C. gloeosporioides(Penz · )Penz .and Sacc.、黑點(diǎn)炭疽菌C.capsici(Syd. )Butler and Bisby和黑色炭疽菌C.coccodes(Wallr.) S.Hughes。
[0003] 辣椒炭疽病防治中化學(xué)防治容易污染環(huán)境、物理防治高耗能且效果不明顯，因此 培育抗病品種是防治炭疽病的一種有效方法，利用傳統(tǒng)的育種方法一般易受環(huán)境影響且時(shí) 間長、效率低，開發(fā)與抗病基因連鎖的分子標(biāo)記，利用分子標(biāo)記輔助選擇育種是近年發(fā)展起 來的高效育種手段。有研究表明，辣椒對炭疽病的抗性在綠果期和紅果期不同，可能受到多 個(gè)基因的影響。Lin等(2007)研究了辣椒"0038-9155"（由PBC932衍生)對尖孢炭疽菌的抗性 遺傳，結(jié)果表明，在綠熟果期的抗性由兩個(gè)互補(bǔ)的顯性基因共同控制，在紅熟果期的抗性由 兩個(gè)重疊的隱性基因控制，且這兩個(gè)時(shí)期的抗性基因是相互獨(dú)立的。PBC80 (C. baccatum)在 綠熟果期對尖孢炭疽菌抗性由一對隱性基因 c〇4控制，而紅熟果期的抗性則由一對顯性基 因 Co5控制(Mahasuk et al.，2009b)。利用中國辣椒'PBC932 '對尖孢炭疽菌（菌株Co 11-153)的抗性進(jìn)行了初步遺傳定位，進(jìn)一步明確了其遺傳規(guī)律。研究表明，PBC932對炭疽病的 抗性呈現(xiàn)顯性遺傳，控制綠熟果期和紅熟果期抗性的主效QTL都初步定位到了 5號染色體接 近末端的InDel和HpmsE116兩個(gè)分子標(biāo)記之間，相距9.4cM，且綠果期和紅果期的抗性主效 基因連鎖但不位于同一基因座。通過初步定位與抗病性連鎖的主效QTL，可為進(jìn)一步精細(xì)定 位從而開發(fā)出用于分子標(biāo)記輔助選擇的緊密連鎖標(biāo)記奠定重要基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種與辣椒綠果期抗炭疽病基因 AnRGQ5緊密連鎖的分子標(biāo) 記。
[0005] 本發(fā)明的另一目的是提供一種利用分子標(biāo)記鑒定辣椒炭疽病抗感的方法。
[0006] 根據(jù)本發(fā)明的可用于輔助抗炭疽病AnRGQ5基因選擇的分子標(biāo)記通過以下步驟獲 得。
[0007] 本發(fā)明以辣椒抗病品種TOC932和感病品種77013及其構(gòu)建的BC4S1群體為試驗(yàn)材 料，研究輔助選擇辣椒綠果期抗炭疽病主效基因 AnRGQ5的分子標(biāo)記。利用SNP標(biāo)記篩選與 AnRGQ5基因連鎖的分子標(biāo)記，利用初定位到5號染色體末端與其連鎖的兩側(cè)SSR和InDe 1標(biāo) 記，將其標(biāo)記序列對比到辣椒CM334和ZunLa基因組數(shù)據(jù)庫5號染色體上（http:// passport. pepper.snu.ac.kr/?t = PGEN0ME/；http://peppersequence . Genomics .cn/ page/species/index. jsp)，獲取兩標(biāo)記的物理位置，篩選出在兩標(biāo)記之間在親本中有多態(tài) 性的KasPar標(biāo)記，共篩選出64個(gè)KasPar引物，經(jīng)過初篩，其中8個(gè)在雙親及群體中表現(xiàn)多態(tài) 性。通過與BC4S1群體抗炭疽病果實(shí)表面病斑大小的表型對應(yīng)，發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)與側(cè)翼SNP標(biāo)記 UN02856_633的距離最近，遺傳距離為3.468cM，物理位置約為221.3Mb。利用該分子標(biāo)記在 新的群體中進(jìn)行抗炭疽病鑒定，可以有效地用來輔助育種工作。
[0008] KasPar標(biāo)記UN02856_633在抗病材料PBC932中分型為Y型，發(fā)出HEX熒光，在感病材 料77013中分型為X型，發(fā)出FAM熒光，在F1中同時(shí)發(fā)出兩種熒光。
[0009] 本發(fā)明的用于特異性篩選辣椒綠果期抗炭疽病的KasPar引物，其信息如下所示。
[0010]
[0011] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是不通過抗病性鑒定，只是在苗期對辣椒植株的DNA檢測，就可以判 斷辣椒對于炭疽病的抗性，可以廣泛應(yīng)用到分子標(biāo)記輔助育種。
[0012] 本發(fā)明提供了分子標(biāo)記UN02856_633在辣椒炭疽病抗性鑒定中的應(yīng)用。
[0013]本發(fā)明提供了分子標(biāo)記UN02856_633在辣椒分子標(biāo)記輔助育種中的應(yīng)用。
[0014] 本發(fā)明提供的分子標(biāo)記實(shí)現(xiàn)了在苗期對辣椒植株綠果期抗炭疽病鑒定，大大縮短 了育種時(shí)間，節(jié)約了人力物力。通過利用本發(fā)明提供的特異性引物采用KasPar系統(tǒng)檢測待 測辣椒基因組DNA:KasPar標(biāo)記UN02856_633,在辣椒感病親本中分型結(jié)果是X型，發(fā)出藍(lán)色 熒光，在抗病親本中分型為Y型，發(fā)出綠色熒光;F1中分型結(jié)果為雜合型，發(fā)出兩種熒光。通 過這個(gè)KasPar分子標(biāo)記可對辣椒綠果期炭疽病抗性進(jìn)行鑒定，提高了育種效率。相比較國 內(nèi)外已發(fā)現(xiàn)的其它分子標(biāo)記，本發(fā)明的SNP分子標(biāo)記UN02856_633與辣椒綠果期抗炭疽病基 因 AnRGQ5更加緊密連鎖，遺傳距離分別為3.468cM，在辣椒抗炭疽病育種中有重要意義。
【附圖說明】
[0015] 圖1顯示初定位的SSR標(biāo)記和InDel標(biāo)記在BC4S1群體部分單株擴(kuò)增結(jié)果。（a)InDel 標(biāo)記，（b)SSR標(biāo)記。注:M:50bp marker;a:與抗病親本條帶相同；b:與感病親本條帶相同;h: 含有感病和抗病親本條帶。
[0016] 圖2顯示SSR標(biāo)記、InDel標(biāo)記和KasPar標(biāo)記與主效基因 AnRG〇5的連鎖關(guān)系。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 以下實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。在不背離 本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明 的范圍。
[0018] 若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
[0019] 本發(fā)明以辣椒抗病品種PBC932為父本、感病品種77013為母本及其以77013作為回 交親本回交四代再自交一代構(gòu)建的BC4S1群體為試驗(yàn)材料。
[0020]實(shí)施例1辣椒綠果期抗炭疽病品種鑒定以及與AnRGQ5基因緊密連鎖的分子標(biāo)記 UN02856_633 的獲得
[0021] 1、辣椒抗性鑒定遺傳群體構(gòu)建
[0022]以含有尖孢炭疽病抗性主效基因 AnRGQ5的辣椒品系PBC932(C.chinenSe)及感病自 交系材料77013(Capsicum annuum L.)為雙親，雜交獲得F1后與父本77013連續(xù)回交四代， 再自交一代獲得的BC4S1作為作圖群體，共528個(gè)單株。
[0023] 2、基因組DNA的提取
[0024] 取嫩葉，用CTAB法提取BC4S1所有單株、親本及F1的基因組DNA，用Biospec-nano微 量分光光度計(jì)測定濃度和質(zhì)量，將濃度稀釋至5ngAU。
[0025] 3、BC4S1群體抗性鑒定
[0026] 植株果實(shí)綠熟期時(shí)對果實(shí)進(jìn)行抗尖孢炭疽菌(菌株Coll-153)接種鑒定，接種方法 采用針刺法，將采收的綠熟期果實(shí)洗凈消毒后晾干，用微量注射器刺破果皮并注入lyL濃度 為5X105/ml的孢子懸浮液，每個(gè)果實(shí)根據(jù)果實(shí)大小接種2-3個(gè)點(diǎn)，將接種后的果實(shí)置于鋪 有滅菌的濕潤濾紙上并將接種點(diǎn)朝上，用保溫膜密封于26°C培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)2d，后揭開保 溫膜蓋上蓋子保濕5d，濕度要持續(xù)保持在90%以上，然后測量病斑直徑、調(diào)查發(fā)病率?？剐?鑒定指標(biāo)為總體病斑直徑(〇)，總體病斑直徑(〇)=所有病斑直徑總和/接種點(diǎn)數(shù)。病斑直徑 的測量標(biāo)準(zhǔn)為沒有發(fā)病的接種點(diǎn)病斑直徑記為〇_，發(fā)病的接種點(diǎn)病斑直徑為病斑橫、縱徑 的平均值。通過將群體的病斑數(shù)據(jù)與兩個(gè)親本的病斑數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析等比較，抗病性劃 分標(biāo)準(zhǔn):免疫(I) :G0(綠熟果總體病斑直徑）=0;高抗(HR):0〈G0<5;抗病(R):5〈G0< 10;中 抗(]\?):10〈60彡15;感?。?):15〈60彡20 ;高感（批）：60>20。？80932、77013、？1及隊(duì)451最終 鑒定株數(shù)分別為：14、14、8、528株。根據(jù)抗感標(biāo)準(zhǔn)，抗病親本TOC932及F1表現(xiàn)為抗病，77013 全部表現(xiàn)為感病。
[0027] 4、KasPar 標(biāo)記開發(fā)
[0028] 利用初定位的SSR和InDel標(biāo)記對BC4S1群體進(jìn)行基因型分析。
[0029] 表2 SSR和InDel引物信息
[0030]
[0031]以這2對引物擴(kuò)增BC4S1群體共528個(gè)樣品（結(jié)果如圖1)，篩選出交換單株。兩個(gè)標(biāo) 記均為共顯性的，感病個(gè)體為和抗病個(gè)體表現(xiàn)為長度不同的一條帶。
[0032]利用SNP標(biāo)記篩選與AnRGQ5基因連鎖的分子標(biāo)記，利用初定位到5號染色體末端與 其連鎖的兩側(cè)SSR和InDel標(biāo)記，將其標(biāo)記序列對比到辣椒CM334和ZunLa基因組數(shù)據(jù)庫5號 染色體上（http://passport.pepper.snu.ac.kr/?t = PGENOME / ;http:// peppersequence .Genomics · cn/page/species/index. jsp)，獲取兩標(biāo)記的物理位置。篩選 在兩標(biāo)記之間在親本中有多態(tài)性的KasPar標(biāo)記，共篩選出64個(gè)KasPar引物，經(jīng)過初篩，其中 8個(gè)在雙親及群體中表現(xiàn)多態(tài)性。通過與BC4S1群體抗炭疽病果實(shí)表面病斑大小的表型對 應(yīng)，發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)與側(cè)翼SNP標(biāo)記UN02856_633的距離最近，遺傳距離為3.468cM，物理位置約 為221.3Mb。利用該分子標(biāo)記在新的群體中進(jìn)行抗炭疽病鑒定，可以有效地用來輔助育種工 作。
[0033]每對KasPar標(biāo)記含有3條引物序列:六1、六2、(：。其中六1^2僅僅是末端的5即位點(diǎn)存 在差異，在A1、A2的5 '端分別加有共同的接頭序列：5 ' GAAGGTGACCAAGTTCATGCT3 '、5 ' GAAGGTCGGAGTCAACGGATT3'。此兩段接頭序列與Master Mix里帶有熒光的序列互補(bǔ)，配對后 會(huì)激發(fā)熒光，C為反向互補(bǔ)序列，所用引物均在生工合成。
[0034] 5、多態(tài)性KasPar連鎖標(biāo)記篩選
[0035]以親本DNA為模板，對KasPar引物進(jìn)行多態(tài)性篩選，共篩選到8個(gè)具有多態(tài)性的標(biāo) 記，再以篩選到的多態(tài)性標(biāo)記對BC4S1群體進(jìn)行分析，這8個(gè)引物均與綠果期主效基因 AnRG05 連鎖。其中標(biāo)記UN02856_633是與辣椒抗炭疽病AnRGQ5基因連鎖最緊密的位于基因側(cè)翼的分 子標(biāo)記。
[0036] KasPar引物預(yù)混體系（lOOyL):位點(diǎn)特異引物A1 12yL，位點(diǎn)特意引物A2 12yL，共 用引物C 30yL，ddH20 46yL。
[0037] PCR擴(kuò)增體系（4yL):DNA(5ngAiL)2yL，2XKASPar Mix 2yL，引物混合液0.055yL。
[0038] 反應(yīng)程序在384孔ABI PCR儀及Roche 480 Π 熒光定量儀384模塊下進(jìn)行。
[0039] 實(shí)施例2分子標(biāo)記UN02856_633的應(yīng)用
[0040] 利用已開發(fā)的分子標(biāo)記UN02856_633在以辣椒TOC932和77013為親本，以77013為 回交父本構(gòu)建的BC4S1群體中進(jìn)行抗性鑒定，共鑒定317個(gè)單株，抗感表型比符合3:1分離 比，利用分子標(biāo)記UN02856_633進(jìn)行鑒定，分子數(shù)據(jù)與表型鑒定數(shù)據(jù)吻合。
[00411分子標(biāo)記UN02856_633鑒定辣椒尖孢炭疽菌抗性的方法為：
[0042] (1)提取待檢測BC4S1群體單株的DNA;
[0043] (2)對BC4S1群體接種尖孢炭疽菌；
[0044] (3)以提取的DNA為模板，利用標(biāo)記UN02856_633以及KasPar系統(tǒng)對群體進(jìn)行基因 型分型；
[0045] (4)KasPar系統(tǒng)檢測分型結(jié)果;根據(jù)發(fā)出的不同熒光判斷基因型。（熒光值的讀取 在Roche 480Π 焚光定量儀，按照37°Clmin，Read fluorescence Is進(jìn)行，再按照Endpt Geno分析讀取焚光值）。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 與辣椒綠果期抗炭疽病基因 AnRGQ5緊密連鎖的分子標(biāo)記，其特征在于，與側(cè)翼SNP標(biāo) 記UN02856_633的遺傳距離為3.468cM。2. 與辣椒綠果期抗炭疽病基因 AnRGQ5緊密連鎖的分子標(biāo)記的特異性檢測引物，其特征 在于，所述引物包括： 前引物A1:5 ' AGAGAAGCCCAAAGAGCCCGAAAAA3 ' ； 前引物A2:5 ' AGAGAAGCCCAAAGAGCCCGAAAAG3 ' ； 后引物C: 5 ' TTTRGGCTTTGGAGGCTCCTTGGGC3 '。3. 權(quán)利要求1所述的與辣椒綠果期抗炭疽病基因 AnRGQ5緊密連鎖的分子標(biāo)記在鑒定辣 椒抗炭疽病方特性方面的應(yīng)用。4. 權(quán)利要求1所述的與辣椒綠果期抗炭疽病基因 AnRGQ5緊密連鎖的分子標(biāo)記的特異性 檢測引物在鑒定辣椒抗炭疽病方特性方面的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/11GK105907754SQ201610405982
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年6月10日
【發(fā)明人】王立浩, 張寶璽, 張正海, 曹亞從, 劉儀蔚
【申請人】中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所