一種水稻金屬硫蛋白基因OsMT2bL啟動子及其應(yīng)用【專利摘要】本發(fā)明涉及一種水稻金屬硫蛋白OsMT2bL基因啟動子及其應(yīng)用。該啟動子通過采用PCR技術(shù)從“水稻黎榆B(OryzasativaL.ssp.japonicaC.V.LiyuB)”基因組中克隆得到一個植物MT?2類基因Metallothionein2b?Like(OsMT2bL)的啟動子序列，全長2063bp，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。該啟動子驅(qū)動GUS基因的表達(dá)活性比CaMV35S基因啟動子高出3倍以上。本發(fā)明水稻金屬硫蛋白OsMT2bL基因啟動子pMT2bL可應(yīng)用于植物轉(zhuǎn)基因工程及作物分子改良育種領(lǐng)域?！緦＠f明】一種水稻金屬硫蛋白基因0sMT2bL啟動子及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域：
[00011本發(fā)明屬植物基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地涉及水稻金屬硫蛋白0sMT2bL基因啟動子及其應(yīng)用，尤其是在植物組織中啟動表達(dá)目的基因的用途。【
背景技術(shù)：
】[0002]水稻(OryzasativaL.)作為一種重要的模式植物，其遺傳發(fā)育模式的基因表達(dá)調(diào)控一直是研究的熱點(diǎn)。金屬硫蛋白（metallothionein，MT)是一類富含半胱氨酸的蛋白，具有結(jié)合金屬離子的能力，參與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)金屬的代謝平衡和解毒。由于植物MT基因具有組織表達(dá)特異性、發(fā)育階段特異性以及高效的可誘導(dǎo)性，人們對植物MT基因的表達(dá)調(diào)控及其功能的研究越來越重視。金屬硫蛋白廣泛存在于生物體內(nèi)，具有結(jié)合金屬離子的能力，參與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)金屬的代謝平衡和解毒，不同的MT基因的啟動子可以受到不同的金屬離子調(diào)控其活性水平。最新研究發(fā)現(xiàn)(YuanJ.，etal.，Characteristicandexpressionanalysisofametallothioneingene,0sMT2b,down-regulatedbycytokininsuggestsfunctionsinrootdevelopmentandseedembryogerminationofrice,PlantPhysiology,2008,146(4):1637-1650；ffuC.S.etal.,Thepromoterandthe57-untranslatedregionofricemetallothionein0sMT2bgenearecapableofdirectinghigh-levelgeneexpressioningerminatedriceembryos，PlantCellReports，2014,33(5):793-806)，水稻0sMT2b基因啟動子的不同區(qū)間在調(diào)控0sMT2b基因在不同組織中的表達(dá)發(fā)揮重要作用；而且該基因還參與了植物體內(nèi)細(xì)胞分裂素的調(diào)控，因此0sMT2b基因啟動子具有組織特異性表達(dá)的特性，其活性很有可能還受到植物激素的調(diào)控。[0003]金屬硫蛋白MT基因啟動子屬于誘導(dǎo)型啟動子，可以被二價金屬離子誘導(dǎo)，如絡(luò)、鋅等。Robinson在大腸桿菌中進(jìn)行了擬南芥MT2的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)MT2具有結(jié)合Zn2+的能力(RobinsonN.B.,etal.,Ventilation-perfusionrelationshipsafterhemorrhageandresuscitation:aninertgasanalysis,JournalofAppliedPhysiology?1983?54[4]:1131-1140);Zhou等人研究水稻OsMT-la基因發(fā)現(xiàn)該基因可以被出〇2、？?1\5即、乙烯利、脫落酸等誘導(dǎo)表達(dá)（ZhouG.K.，etal.，CharacterizationofariceclassIImetallothioneingene:tissueexpressionpatternsandinductioninresponsetoabioticfactors，JournalofPlant卩1178；!_〇1〇87,2005，162(6):686-696)。有研究者從水稻胚乳cDNA文庫中克隆了一個編碼80個氨基酸的ricMT基因（LiuJ.，etal.，AnalysisofrandomlyisolatedcDNAsfromdevelopingendospermofrice(0ryzasativaL.)：evaluationofexpressedsequencetags,andexpressionlevelsofmRNAs，PlantMolecularBiology?1995?29(4)：685-689；YuL.H.etal.,AnovelMTgeneofriceplantsisstronglyexpressedinthenodeportionofthestem,Gene,1998,206(1):29-35)，RNA雜交表明其在水稻莖部高效特異表達(dá)，其表達(dá)量是葉片中的100多倍，推測ricMT基因的5'-上游存在一個高效特異表達(dá)的啟動子;計算機(jī)同源分析顯示，ricMT基因5'-上游區(qū)域的TATA-box(TATAAA)位于2935bp處，CAAT-box(CCAAT)位于2754bp處;特別值得注意的是，在該基因2739bp處(ATG上游300bp左右)存在著一段與動物典型的金屬應(yīng)答元件(1^七31-代8口〇118；!_￥661611^1^，]\11^)高度同源的序列（16060606)(余蒸華等，水稻金屬硫蛋白核基因的克隆及其序列特征，科學(xué)通報，1999,44(15):1645-1648)。[0004]MT基因的啟動子部分含有多個金屬應(yīng)答元件(metal-responsiveelement，MRE)和激素應(yīng)答元件（glucolorticoidresponsiveelement，GER)DMER的通用序列為TGCRCNCX(其中1?=6/^;)(=6/(：;~=六八/6/〇。比如，果蠅11'基因中的]^1?序列為了60六(：1^;水稻]?1'基因中的MER序列為TGCGCGCG。已經(jīng)有直接證據(jù)表明MT-like基因的表達(dá)需要順式作用元件的參與調(diào)控。Fcmiham-Sketon等人研究PsMTA基因啟動子表明，-583到-285區(qū)域負(fù)責(zé)調(diào)控β-葡萄糖醛酸酶(GUS)在根中的表達(dá)，在這段300bp左右的序列中存在三個拷貝的乙烯應(yīng)答元件(EREs;ATTCAA)(Fordham-SkeltonA.P.?etal.，GUSexpressioninArabidopsisdirectedby57-regionsofthepeametallothionein-1ikegenePsMTA,Plantmolecularbiology，1997,34(4):659-668)。有趣的是，研究者們發(fā)現(xiàn)，到目前為止，所有被鑒定出來的植物MT-like基因中至少存在一個ERE，還包括大麥B22E基因（KlemsdalS.S.，etal.,Primarystructureofanovelbarleygenedifferentiallyexpressedinimmaturealeuronelayers，MolecularandGeneralGeneticsMGG,1991,228(1-2):9-16)和番前LeMTB基因（WhitelawC.A.，etal.，TheisolationandcharacterisationoftypeIImetallothionein-1ikegenesfromtomato(LycopersiconesculentumL.),PlantMolecularBiology，1997，33(3):503-511hMT-like基因啟動子中的一個根特異表達(dá)元件（root-specificelement，RSE)分別在碗豆（Fordham-SkeltonA.P.，etal.，GUSexpressioninArabidopsisdirectedby57-regionsofthepeametallothionein-likegenePsMTA，Plantmolecularbiology，1997,34(4):659-668)、玉米（DeFramondA.J.,Ameta11othionein-1ikegenefrommaize(Zeamays)C1oningandcharacterization，F(xiàn)EBSletters，1991，290(1):103-106)和棕櫚中被鑒定（AbdullahS.N.A.,etal·，Isolationandcharacterisationoftwodivergenttype3metallothioneinsfromoilpalm,Elaeisguineensis.PlantPhysiologyandBiochemistry，2002，40(3):255-263)〇[0005]雖然，已經(jīng)有多種植物的MT基因5'-上游區(qū)域被克隆出來，但是目前對于植物MT基因啟動子的研究主要還停留在MT基因的組織表達(dá)水平檢測方面（GuoW.J.，etal.，CharacterizationoftheArabidopsismetallothioneingenefami1：tissue-specificexpressionandinductionduringsenescenceandinresponsetocopper,NewPhytologist,2003,159(2):369-381；ChatthaiM.,etal.,FunctionalanalysisofaDouglas-firmetallothionein-likegenepromoter:transientassaysinzygoticandsomaticembryosandstabletransformationintransgenictobacco，Planta，2004,220(l):118_128;FukuzawaH.，etal·，Thericemetallothioneingenepromoterdoesnotdirectforeigngeneexpressioninseedendosperm,Plantcellreports，2004,23(4):231-235;LiiS.，etal·，TheGUSreporter-aidedanalysisofthepromoteractivitiesofaricemetallothioneingenerevealsdifferentregulatoryregionsresponsiblefortissue-specificandinducibleexpressionintransgenicArabidopsis，TransgenicResearch，2007，16(2):177-191)。對轉(zhuǎn)基因（OsMT2b::GUS)水稻植株組織化學(xué)分析表明，種子發(fā)芽階段，OsMT2b基因啟動子在幼苗分生組織、種子的胚中表現(xiàn)出較高活性;對啟動子序列研究發(fā)現(xiàn)，OsMT2b基因啟動子5'-上游區(qū)域-351到-121之間含有G-box和TA-box的一致序列，主要調(diào)控啟動子在水稻胚中的高活性表達(dá)（WuC.S.，etal.，Thepromoterandthe5~untranslatedregionofricemetallothionein0sMT2bgenearecapableofdirectinghigh-levelgeneexpressioningerminatedriceembryos,PlantCellReports，2014,33(5):793-806)。因此，0sMT2b基因啟動子在根的發(fā)育以及種子胚的發(fā)育和生長階段起著重要的調(diào)控作用。[0006]Yuan等人報道了OryzasativaMETALL0THI0NEIN2b(0sMT2bL)和OryzasativaMETALL0THI0NEIN2bLIKE(0sMT2bL)兩個基因。氨基酸序列比對分析發(fā)現(xiàn)，0sMT2bL和0sMT2b氨基酸序列僅僅在第21個氨基酸位置不同，0sMT2b第21個氨基酸為絲氨酸(Ser)，而0sMT2bL第21個氨基酸為甘氨酸(Gly);多重序列比對分析表明，0sMT2bL、0sMT2b以及其他MT-2型蛋白包含兩個富含半胱氨酸(Cys)的結(jié)構(gòu)域，中間被40個氨基酸殘基隔開;N-末端結(jié)構(gòu)域存在高度保守序列(MSCCGGNCGCGS)，C-末端結(jié)構(gòu)域包含三個Cys-X-Cys結(jié)構(gòu)基元(YuanJ.，etal.,Characteristicandexpressionanalysisofametallothioneingene，0sMT2b,down-regulatedbycytokininsuggestsfunctionsinrootdevelopmentandseedembryogerminationofrice，PlantPhysiology，2008,146(4):1637-1650)。到目前為止，關(guān)于水稻金屬硫蛋白基因0sMT2bL啟動子pMT2bL克隆和相關(guān)特性的鑒定還未見報道。[0007]目前，基因工程中被廣泛使用的啟動子主要有來自花椰菜花葉病毒的CaMV35S組成型啟動子和來自植物的Actl、Ubi-l等組成型啟動子。由于組成型啟動子驅(qū)動基因在植物不同組織器官中均有不同程度的表達(dá)，而很多時候，人們并不希望外源基因在轉(zhuǎn)基因植物的整個生長發(fā)育期的整個植株中表達(dá)，外源蛋白不僅增加植物代謝負(fù)擔(dān)，而且有些外源蛋白對植物本身具有毒害作用，不利于植物的正常生長（KasugaM.，etal.，Improvingplantdrought,salt,andfreezingtolerancebygenetransferofasinglestress-inducibletranscriptionfactor,NatureBiotechnology，1999，17(3):287-291)。因此，研究和利用組織器官特異性啟動子和誘導(dǎo)型啟動子具有非常重要的意義?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0008]本發(fā)明的目的在于提供水稻金屬硫蛋白基因0sMT2bL啟動子pMT2bL及其應(yīng)用。[0009]本發(fā)明的技術(shù)方案如下：[0010]1.一種水稻金屬硫蛋白0sMT2bL基因啟動子pMT2bL，其核苷酸序列如SEQIDN0:1所示。[0011]2.-種水稻金屬硫蛋白0sMT2bL基因啟動子pMT2bL，其特征在于，所述水稻金屬硫蛋白0sMT2bL基因啟動子pMT2bL為：[0012](a)技術(shù)方案1所述的一種水稻金屬硫蛋白0sMT2bL基因啟動子pMT2bL所示的核苷酸序列中取代一個或一個以上核苷酸后所獲得的且具有啟動子功能的核苷酸序列；[0013]或者(b)技術(shù)方案1所述的一種水稻金屬硫蛋白0sMT2bL基因啟動子pMT2bL所示的核苷酸序列中添加一個或一個以上核苷酸后所獲得的且具有啟動子功能的核苷酸序列；[0014]或者(C)技術(shù)方案1所述的一種水稻金屬硫蛋白0sMT2bL基因啟動子pMT2bL所示的核苷酸序列缺失一個或一個以上核苷酸后所獲得的且具有啟動子功能的核苷酸序列；[0015]或者(d)技術(shù)方案1所述的一種水稻金屬硫蛋白0sMT2bL基因啟動子pMT2bL所示的核苷酸序列具有至少90%同源性，且具有啟動子功能的核苷酸序列；[0016]或者(e)技術(shù)方案1所述的一種水稻金屬硫蛋白0sMT2bL基因啟動子pMT2bL所示的核苷酸序列雜交且具有啟動子功能的核苷酸序列。[0017]3.技術(shù)方案1或2所述的一種水稻金屬硫蛋白0sMT2bL基因啟動子pMT2bL在改良植物生長特性的應(yīng)用。[0018]4.技術(shù)方案3所述的一種水稻金屬硫蛋白0sMT2bL基因啟動子pMT2bL在改良植物生長特性的應(yīng)用指在水稻營養(yǎng)生長與生殖生長階段，用于改良作物感光或感溫特性。[0019]5.技術(shù)方案1或2所述的一種水稻金屬硫蛋白0sMT2bL基因啟動子pMT2bL在植物基因工程中的應(yīng)用。[0020]6.技術(shù)方案5所述的一種水稻金屬硫蛋白0sMT2bL基因啟動子pMT2bL在植物基因工程中的應(yīng)用指用于開發(fā)單子葉植物中高啟動效率的啟動子用于基因表達(dá)研究。[0021]7.技術(shù)方案1或2所述的一種水稻金屬硫蛋白0sMT2bL基因啟動子pMT2bL在作物分子改良育種中的應(yīng)用。[0022]8.技術(shù)方案7所述的一種水稻金屬硫蛋白0sMT2bL基因啟動子pMT2bL在作物分子改良育種中的應(yīng)用指用于轉(zhuǎn)基因水稻育種研究中，功能基因的高效表達(dá)應(yīng)用。[0023]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果：[0024]經(jīng)⑶S報告基因分析實驗證明：本發(fā)明水稻金屬硫蛋白基因0sMT2bL啟動子pMT2bL的表達(dá)活性是CaMV35S基因啟動子的3倍還多，而且在水稻的營養(yǎng)生長和生殖生長階段的組織器官中高效表達(dá)。因此，本發(fā)明水稻金屬硫蛋白0sMT2bL基因啟動子pMT2bL的克隆及驗證，在理論上將為研究水稻金屬硫蛋白0sMT2bL基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)理提供良好的實驗基礎(chǔ)；在應(yīng)用方面為利用本發(fā)明水稻金屬硫蛋白基因0sMT2bL啟動子pMT2bL構(gòu)建表達(dá)載體高效表達(dá)外源基因創(chuàng)造了條件；另外，也為研究本發(fā)明水稻金屬硫蛋白基因0sMT2bL啟動子pMT2bL可能具有的特異表達(dá)性和誘導(dǎo)表達(dá)性的研究創(chuàng)造了實驗基礎(chǔ)，具有重要的理論意義和潛在的應(yīng)用價值。[0025]序列表中SEQIDN0:1所示的是水稻金屬硫蛋白基因0sMT2bL啟動子pMT2bL的核苷酸序列。[0026]SEQID從):2所示的是引物階2131^+的堿基序列。[0027]SEQID從):3所示的是引物階2131^-1?的堿基序列。[0028]SEQID從):4所示的是引物113+的堿基序列。[0029]SEQID從):5所示的是引物113-郎勺堿基序列。[0030]SEQID從):6所示的是(；1^表達(dá)載體特異性引物即61]869-31?的堿基序列。[0031]SEQID從):7所示的是引物》^3+的堿基序列。[0032]SEQID從):8所示的是引物》^3-1?的堿基序列。[0033]SEQID從):9所示的是引物(；1]5]\^3+的堿基序列。[0034]SEQID從):10所示的是引物(；1]5]\^3-1?的堿基序列。【附圖說明】[0035]圖1是基于水稻雌性不育突變體（fst)基因芯片數(shù)據(jù)對水稻基因Ubiquitinl(UBIl)、0sCcl(CYC)、0sRAcl(ACTl)、G0S2和0sMT2bL在不同發(fā)育時期表達(dá)水平的分析結(jié)果圖。圖1中橫坐標(biāo)表示不同的三個發(fā)育時期，ME1表示減數(shù)分裂期，JBF指穎花即將開放的時期，5DAP表示開花后5天;縱坐標(biāo)表示基因的表達(dá)量;圖1中，一·-表示UBI1，一》^表示CYC，[0036]表示ACT1，表示G0S2，一表示MT2bL。[0037]圖2是PCR擴(kuò)增水稻金屬硫蛋白基因0sMT2bL啟動子pMT2bL電泳結(jié)果圖。圖中Μ表示DNAMarker;pMT2bL表示水稻金屬硫蛋白基因0sMT2bL的啟動子pMT2bL。[0038]圖3是水稻金屬硫蛋白基因0sMT2bL及其啟動子pMT2bL的結(jié)構(gòu)示意圖。[0039]圖4是克隆載體上標(biāo)記基因的PCR檢測結(jié)果，其中：a圖是農(nóng)桿菌陽性克隆潮霉素抗性基因位點(diǎn)的PCR檢測結(jié)果圖。a圖中CK1為空白對照ddH20;CK2為陽性對照GUS載體質(zhì)粒DNA;泳道1至泳道12為不同的農(nóng)桿菌陽性單克隆，泳道1為農(nóng)桿菌陽性單克隆-1，泳道2為農(nóng)桿菌陽性單克隆-2，泳道3為農(nóng)桿菌陽性單克隆-3，泳道4為農(nóng)桿菌陽性單克隆-4，泳道5為農(nóng)桿菌陽性單克隆-5,泳道6是為農(nóng)桿菌陽性單克隆-6,泳道7為農(nóng)桿菌陽性單克隆-7,泳道8為農(nóng)桿菌陽性單克隆_8,泳道9為農(nóng)桿菌陽性單克隆-9,泳道10為農(nóng)桿菌陽性單克隆-10，泳道11為農(nóng)桿菌陽性單克隆-11，泳道12為農(nóng)桿菌陽性單克隆-12;M為DNAMarkerj圖是轉(zhuǎn)基因To植株GUS報告基因位點(diǎn)的PCR檢測結(jié)果圖。b圖中CK1和CK2為陽性對照，分別為DTG4065和GUS表達(dá)載體質(zhì)粒DNA;CK3和CK4為空白對照，分別為LiyuB和ddH20;泳道1至4為轉(zhuǎn)基因植株AT45(pCYC::GUS);泳道5至8為轉(zhuǎn)基因植株AT49(pACTl::⑶S);泳道9至12為轉(zhuǎn)基因植株AT50(pMT2bL::GUS));Μ為DNAMarker。c圖是轉(zhuǎn)基因T!代植GUS報告基因位點(diǎn)的PCR檢測結(jié)果圖。圖中CK1和CK2為陽性對照，分別為DTG4065和GUS表達(dá)載體質(zhì)粒DNA;CK3和CK4為空白對照，分別為LiyuB和ddH20;泳道1至3為轉(zhuǎn)基因植株DTG4065(pCaMV35S::GUS);泳道4至5為轉(zhuǎn)基因植株AT44(pUbi1::GUS);泳道6至7為轉(zhuǎn)基因植株AT45(pCYC::GUS);泳道8至9為轉(zhuǎn)基因植株AT49(pACTl::GUS);泳道10至13為轉(zhuǎn)基因植株AT50(pMT2bL::⑶S);M為DNAMarker〇[0040]圖5-圖10中，箭頭所指部分為GUS組織化學(xué)染色較深部分，染色越深表明啟動子在該部位活性越強(qiáng)，啟動效率越高。[0041]圖5為To代轉(zhuǎn)基因植株減速分裂期(ME1)葉片的GUS組織化學(xué)染色結(jié)果。圖中從左至右，左邊第一幅圖是1^7此為空白對照；然后依次為轉(zhuǎn)基因植株0164049(?0&1^355::GUS)、AT50(pMT2bL::⑶S)和AT47(pG0S2::⑶S)的葉片，其中轉(zhuǎn)基因植株DTG4049和AT47做為陽性對照植株;標(biāo)尺大小為1ΟΟμπι。[0042]圖6為To代轉(zhuǎn)基因植株減速分裂期(ΜΕ1)潁花的GUS組織化學(xué)染色結(jié)果。圖中a和b為陽性對照植株DTG4049(pCaMV35S::⑶S);f和g為陽性對照植株AT47(pG0S2::⑶S);c和d為轉(zhuǎn)基因植株AT50(pMT2bL::⑶S);e為轉(zhuǎn)基因植株AT50開花后10天（10DAP)的未成熟種子。圖中b、d和g為水稻潁花去掉一半穎殼后的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。標(biāo)尺大小為100μπι。[0043]圖了為!^代轉(zhuǎn)基因植株種子幼苗期幼苗胚芽(a~g)的GUS組織化學(xué)染色結(jié)果。a為空白對照LiyuB;b至g分別為轉(zhuǎn)基因植株DTG4065(pCaMV35S::GUS)、AT50(pMT2bL::GUS)、AT44(pUbil::⑶S、AT45(pCYC::GUS)、AT47(pG0S2::⑶S)和AT49(pACTl::⑶S)的幼苗胚芽；標(biāo)尺大小為100μπι。[0044]圖8為1^代轉(zhuǎn)基因植株種子幼苗期幼苗胚芽鞘(h~η)的⑶S組織化學(xué)染色結(jié)果。h為空白對照LiyuB;i至η分別為轉(zhuǎn)基因植株DTG4065(pCaMV35S::⑶S)、AT50(pMT2bL::⑶S)、AT44(pUbil::⑶S)、AT45(pCYC::GUS)、AT47(pG0S2::⑶S)和AT49(pACTl::⑶S)的幼苗胚芽鞘;標(biāo)尺大小為100μπι。[0045]圖9為1^代轉(zhuǎn)基因植株種子幼苗期幼苗的胚和胚乳(〇~u)的GUS組織化學(xué)染色結(jié)果，〇為空白對照LiyuB;p至u分別為轉(zhuǎn)基因植株DTG4065(pCaMV35S::GUS)、AT50(pMT2bL::⑶S)、AT44(pUbil::GUS)、AT45(pCYC::GUS)、AT47(pG0S2::⑶S)和AT49(pACTl::⑶S)的幼苗的胚和胚乳;標(biāo)尺大小為100μπι。[0046]圖lOSh代轉(zhuǎn)基因植株種子幼苗期幼苗根尖(al~gl)的GUS組織化學(xué)染色結(jié)果，al為空白對照LiyuB;bl至gl分別為轉(zhuǎn)基因植株DTG4065(pCaMV35S::GUS)、AT50(pMT2bL::⑶S)、AT44(pUbil::GUS)、AT45(pCYC::GUS)、AT47(pG0S2::⑶S)和AT49(pACTl::⑶S)的幼苗的根尖;標(biāo)尺大小為1ΟΟμπι。[0047]圖11為!^代轉(zhuǎn)基因植株幼苗葉片中GUS蛋白表達(dá)活性的熒光定量檢測結(jié)果。橫坐標(biāo)表示不同的啟動子，橫坐標(biāo)從左至右的啟動子依次是空白對照LiyuB，陽性對照DTG4065，轉(zhuǎn)基因植株AT44，AT45，AT49，AT47，AT50;LiyuB為空白對照，GUS蛋白表達(dá)活性為0;DTG4065(pCaMV35S::GUS)作為陽性對照，定義其GUS蛋白表達(dá)量為100。縱坐標(biāo)表示GUS蛋白的活性。[0048]圖12為融合表達(dá)載體pMT2bL::⑶S結(jié)構(gòu)圖及其限制內(nèi)切酶位點(diǎn)。（KmR:卡那霉素抗性基因；pVSlrep，pVSlsta分別是pVSl質(zhì)粒復(fù)制增強(qiáng)子序列和復(fù)制起始區(qū)；Spel和Hindlll之間的區(qū)域為0sMT2bL基因啟動子;GusPlus為⑶S報告基因?！揪唧w實施方式】[0049]以下結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)描述。以下各實施例所用的載體、引物、試劑、水稻等材料均為市售，各實施例無特殊說明為常規(guī)方法。[0050]實施例1:水稻金屬硫蛋白0sMT2bL基因啟動子pMT2bL的克隆及序列分析[005111.根據(jù)基因芯片分析水稻不同發(fā)育時期基因表達(dá)量結(jié)果（圖1)，參考改進(jìn)的CTAB法（（Murrayetal.，1980)提取水稻黎輸B(0ryzasativaL.ssp.japonicaC.V.LiyuB)的基因組DNA。在GenBank數(shù)據(jù)庫（http://www.ncbi·nlm.nih·gov/genbank/)上，查詢基因0sMT2bL全長序列（GenBank:EF533993·1)，并在NetGene2網(wǎng)站（http://www·cbs·dtu·dk/861^；[068/如七661162/)上，對08]\^2131^基因5'-1]11?上游序列進(jìn)行預(yù)測，用。1'；[11161'-131已8七(http://www·ncbi·nlm.nih·Gov/tools/primer-blast/Index·)設(shè)計引物（0sMT2bLP_F/R)擴(kuò)增0sMT2bL基因5'-UTR上游區(qū)域序列，并在正反向引物序列5'端引入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。結(jié)果如圖2、圖3所示，圖2表明目的序列PCR擴(kuò)增片段大小為2000bp左右。所述引物MT2bLP-F/R由引物MT2bLP-F和引物MT2bLP-R組成，所述引物MT2bLP-F的堿基序列如SEQIDN0:2所示，所述引物MT2bLP-R的堿基序列如SEQIDN0:3所示。PCR體系（25yL)及反應(yīng)程序為：10XLAPCRBuffer2.50yL，2.5mmol/LdNTPmixture2.00yL，MT2bLP-F0.20yL，MT2bLP-R0·20yL，Anti-Taq0·20yL，LATaq(5U/yL)0·20yL，DNA模板（水稻LiyuB基因組DNA)0·50yL，ddH20補(bǔ)充到25.00yL;94°C預(yù)變性5min，從94°C變性308,60°(：退火308,72°(：延伸31^11運(yùn)行35個循環(huán)，72°C延伸15min后4°C保存。PCR產(chǎn)物回收純化后經(jīng)連接反應(yīng)連接到y(tǒng)&TA克隆載體，使用PDRAW321.1.107軟件構(gòu)建質(zhì)粒酶切圖譜，根據(jù)圖譜所示酶切位點(diǎn)選擇限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切(37°C適溫酶切消化質(zhì)粒2~4hr)，l%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切片段大小，篩選正向插入片段陽性克隆。圖3為水稻金屬硫蛋白OsMT2bL基因及其啟動子pMT2bL的結(jié)構(gòu)簡圖。[0052]2.使用通用引物M13-F/R對y&TA正向陽性克隆載體質(zhì)粒進(jìn)行雙向測序，在Blast(http://blast.ncbi.111111.11；[11.80￥/13]^1:.〇8；〇中進(jìn)行序列比對，確定克隆得到的0嫩片段為水稻金屬硫蛋白基因0sMT2bL上游的啟動子區(qū)域，全長為2063bp。在PLACE和PlantCARE數(shù)據(jù)庫對本發(fā)明水稻金屬硫蛋白基因0sMT2bL的啟動子pMT2bL區(qū)域的順式作用元件進(jìn)行分析預(yù)測。上述克隆的本發(fā)明水稻金屬硫蛋白基因0sMT2bL的啟動子pMT2bL的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。上述引物M13-F/R由引物M13-F和引物M13-R組成，所述引物M13-F的堿基序列如SEQIDN0:4所示。所述引物M13-R的堿基序列如SEQIDN0:5所示。[0053]實施例2本發(fā)明水稻金屬硫蛋白0sMT2bL基因啟動子pMT2bL的⑶S融合表達(dá)載體的構(gòu)建[0054]使用限制性內(nèi)切酶SpeI和HindllI酶切經(jīng)藍(lán)白斑篩選得到的y&TA克隆陽性載體質(zhì)粒，回收酶切目的片段(2063bp);另外，同樣用Spel和Hindlll酶切pCAMBIA1305雙元表達(dá)載體后回收表達(dá)載體片段（l〇926bp，圖2);最后，通過連接反應(yīng)將二者融合成融合表達(dá)載體，艮PpMT2bL::GUS融合表達(dá)載體，使用pDRAW32軟件(pDRAW321.1.107)構(gòu)建質(zhì)粒酶切圖譜如圖12所示。根據(jù)酶切圖譜對構(gòu)建的載體進(jìn)行酶切檢測，且以GUS表達(dá)載體特異性引物HPGUseq-3R對pMT2bL::GUS融合表達(dá)載體進(jìn)行測序。GUS表達(dá)載體特異性引物HP⑶seq-3R的堿基序列如SEQIDN0:6所示。[0055]實施例3水稻遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株的獲得[0056]將水稻金屬硫蛋白0sMT2bL基因啟動子pMT2bL的⑶S融合表達(dá)載體質(zhì)粒導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105感受態(tài)細(xì)胞，根瘤農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞由本實驗室用購買的Transgene公司的EHA105菌株，參考魏綺超的方法(魏?奇超等，根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及保存方法研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37(14):6342-6343)自行制備，-80°C冰箱保存。并對導(dǎo)入融合表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌進(jìn)行菌落PCR檢測，引物為融合表達(dá)載體的特異引物HmMAS-F/R，PCR體系（15yL)及反應(yīng)程序為：10XBuffer(NH4)2S〇4)1.50yL,2.5mmol/LdNTPmixture1.20yL,25mMMgCl20.90yL,MT2bLP-F0.12yL,MT2bLP-R0·12yL，Taq(5U/yL)0·12，DNA模板（單克隆菌落)0·1OyL，ddH20補(bǔ)充到15·OOyL,94°C預(yù)變性5min，從94°C變性20s，60°C退火20s，72°C延伸20s運(yùn)行30個循環(huán)，72°C延伸lOmin后4°C保存。檢測結(jié)果如圖4-a，表明PCR擴(kuò)增片段大小為392bp左右，能擴(kuò)增出該條帶的菌落為轉(zhuǎn)基因陽性克隆。經(jīng)過菌落PCR檢測后的根癌農(nóng)桿菌恒溫震蕩培養(yǎng)(28°C，150r/min)后，介導(dǎo)轉(zhuǎn)化水稻黎榆B(0ryzasativaL.ssp.japonicaC.V.LiyuB)胚性愈傷組織，具體方法參照Hiei等（1994)。成熟的黎榆B(LiyuB)種子去殼后，經(jīng)70%乙醇消毒3min，50%次氯酸鈉(加入0.05%的Tween-20)消毒lOmin后，再用50%次氯酸鈉消毒3〇111；[11;然后用滅菌的(1(1!120漂洗數(shù)次，直至次氯酸鈉溶液的味道消失，充分晾干種子后接種到N6D愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)30天，挑取色澤鮮亮、呈圓形或橢圓形顆粒狀的胚性愈傷組織接種于新的N6D愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，預(yù)培養(yǎng)2~3天后，用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化。所述特異引物HmMAS-F/R由引物HmMAS-F和引物HmMAS-R組成，引物HmMAS-F的堿基序列如SEQIDN0:7所示，引物HmMAS-R的堿基序列如SEQIDN0:8所示。[0057]利用融合表達(dá)載體上報告基因⑶S的特異性引物(GUSMAS-F/R)對轉(zhuǎn)基因再生株系進(jìn)行葉片PCR鑒定，篩選轉(zhuǎn)基因陽性植株(如圖4-b和圖4-c)。圖4-b表明PCR擴(kuò)增片段大小為382bp左右，能擴(kuò)增出該條帶的轉(zhuǎn)基因To植株為陽性。圖4-c也表明PCR擴(kuò)增片段大小為382bp左右，能擴(kuò)增出該條帶的轉(zhuǎn)基因T!植株為陽性。PCR體系（15yL)及反應(yīng)程序為：10XBuffer((NH4)2S〇4)l.50yL,2.5mmol/LdNTPmixture1.20yL,25mMMgCl20.90yL,GUSMAS-F0·12yL，⑶SMAS-R0·12yL，Taq(5U/yL)0·12yL，DNA模板(轉(zhuǎn)基因植株葉片）0·1μL，ddH20補(bǔ)充到15.00yL，94°C預(yù)變性5min，從94°C變性20s，60°C退火20s，72°C延伸20s運(yùn)行30個循環(huán)，72°C延伸lOmin后4°C保存。所述特異性引物⑶SMAS-F/R由引物GUSMAS-F和引物⑶SMAS-R組成，引物⑶SMAS-F的堿基序列如SEQIDN0:9所示，引物⑶SMAS-R的堿基序列如SEQIDNO:10所示。[0058]實施例4本發(fā)明水稻金屬硫蛋白0sMT2bL基因啟動子pMT2bLGUS表達(dá)活性的檢測[0059]1.轉(zhuǎn)基因水稻植株的GUS組織化學(xué)染色[0060]剪取實施案例3獲得的轉(zhuǎn)基因To植株減速分裂期的葉片、潁花(Floret)和開花后10天的未成熟種子進(jìn)行GUS染色，結(jié)果如圖5和圖6。圖5表明除野生型LiyuB空白對照外，其他轉(zhuǎn)基因植株葉片組織均有不同程度的GUS顯色（圖5從左往右依次為LiyuB，DTG4049，八丁5〇4了47)，〇81?'21^基因啟動子?1?'2此高水平的61^表達(dá)活性則在幾乎整個葉片中檢測到，在葉片橫向創(chuàng)口處也表現(xiàn)出較強(qiáng)的GUS表達(dá)活性，且GUS表達(dá)活性明顯高于pCaMV35S啟動子表達(dá)活性。圖6表明對轉(zhuǎn)基因To植株減速分裂期的潁花（Floret)進(jìn)行GUS染色，pCaMV35S(圖6-a，b)、pMT2bL(圖6-c，d，e)和pG0S2(圖6-f，g)三個啟動子在潁殼均檢測到GUS基因的高表達(dá)活性;對轉(zhuǎn)基因植株AT50(pMT2bL::GUS)開花后10天的未成熟種子進(jìn)行GUS染色表明，pMT2bL啟動子在開花后種子的發(fā)育階段也有高水平的表達(dá)活性。[0061]另外，對實施案例3獲得的h代種子幼苗期的植株進(jìn)行GUS染色，結(jié)果如圖7至10。圖7至10表明本發(fā)明水稻金屬硫蛋白基因0sMT2bL啟動子pMT2bL與空白對照和陽性對照相比較，分別在水稻幼苗的胚芽（圖7-a~g)、胚芽鞘（圖8-h~n)、胚和胚乳（圖9-〇~u)以及根尖（圖10-&1~81)部位均有高水平的表達(dá)活性。GUS染色方法參照RichardA.Jefferson(1987)方法（Jeffersonetal.，1987)〇[0062]2.轉(zhuǎn)基因水稻植株的⑶S熒光定量檢測[0063]用黎榆B(0ryzasativaL.ssp.Japonica，LiyuB)作為空白對照，純合轉(zhuǎn)基因植株DTG4065(pCaMV35S::⑶S)作為陽性對照，且將其⑶S的表達(dá)量定義為100。收集實施案例3獲得的轉(zhuǎn)基因Τι代幼苗期植株的新鮮葉片50mg，加入250yL事先預(yù)冷的GUSExtractionBuffer后，立即將葉片研磨至衆(zhòng)液；12000rpm，4°C離心10min，收集200yL上清液于新的離心管中，再次離心后，收集150yL植物總蛋白提取液(上清液)于新的離心管中，4°C保存。取50μL蛋白提取液加入到37°C預(yù)熱的500yLAssayBuffer中，37°C水浴30min后，立即加入900yL的反應(yīng)終止溶液(0.2MNa2C03)終止反應(yīng)進(jìn)行。然后測定波長為455nm下的吸光度，記錄數(shù)據(jù)并統(tǒng)計分析，結(jié)果如圖11。圖11表明啟動子pUbil、pCYC、pACTl、pG0S2、pMT2bL驅(qū)動⑶S基因表達(dá)蛋白活性的平均值分別為539、357.5、449、301.5和313。本發(fā)明水稻金屬硫蛋白基因0sMT2bL啟動子pMT2bL在轉(zhuǎn)基因1^代幼苗葉片中⑶S基因的表達(dá)活性比CaMV35S基因啟動子的3倍還多。GUS焚光定量測定詳細(xì)參照SeanR.Gallagher(1992)、RichardA·Jefferson(1987)提出的方法?！局鳈?quán)項】1.一種水稻金屬硫蛋白0sMT2bL基因啟動子pMT2bL，其核苷酸序列如SEQIDN0:l所不。2.-種水稻金屬硫蛋白OsMT2bL基因啟動子pMT2bL，其特征在于，所述的水稻金屬硫蛋白OsMT2bL基因啟動子pMT2bL包含：(a)權(quán)利要求1所述的一種水稻金屬硫蛋白OsMT2bL基因啟動子pMT2bL所示的核苷酸序列中取代一個或一個以上核苷酸后所獲得的且具有啟動子功能的核苷酸序列；或者(b)權(quán)利要求1所述的一種水稻金屬硫蛋白OsMT2bL基因啟動子pMT2bL所示的核苷酸序列中添加一個或一個以上核苷酸后所獲得的且具有啟動子功能的核苷酸序列；或者(c)權(quán)利要求1所述的一種水稻金屬硫蛋白OsMT2bL基因啟動子pMT2bL所示的核苷酸序列缺失一個或一個以上核苷酸后所獲得的且具有啟動子功能的核苷酸序列；或者(d)權(quán)利要求1所述的一種水稻金屬硫蛋白OsMT2bL基因啟動子pMT2bL所示的核苷酸序列具有至少90%同源性，且具有啟動子功能的核苷酸序列；或者(e)權(quán)利要求1所述的一種水稻金屬硫蛋白OsMT2bL基因啟動子pMT2bL所示的核苷酸序列雜交且具有啟動子功能的核苷酸序列。3.權(quán)利要求1或2所述的一種水稻金屬硫蛋白OsMT2bL基因啟動子pMT2bL在改良植物生長特性的應(yīng)用。4.權(quán)利要求3所述的的一種水稻金屬硫蛋白OsMT2bL基因啟動子pMT2bL在改良植物生長特性的應(yīng)用指在水稻營養(yǎng)生長與生殖生長階段，用于改良作物感光或感溫特性。5.權(quán)利要求1或2所述的一種水稻金屬硫蛋白OsMT2bL基因啟動子pMT2bL在植物基因工程中的應(yīng)用。6.權(quán)利要求5所述的一種水稻金屬硫蛋白OsMT2bL基因啟動子pMT2bL在植物基因工程中的應(yīng)用指用于開發(fā)單子葉植物中高啟動效率的啟動子用于基因表達(dá)研究。7.權(quán)利要求1或2所述的一種水稻金屬硫蛋白OsMT2bL基因啟動子pMT2bL在作物分子改良育種中的應(yīng)用。8.權(quán)利要求7所述的一種水稻金屬硫蛋白OsMT2bL基因啟動子pMT2bL在作物分子改良育種中的應(yīng)用指用于轉(zhuǎn)基因水稻育種研究中，功能基因的高效表達(dá)應(yīng)用?！疚臋n編號】C12N15/113GK105907761SQ201610546803【公開日】2016年8月31日【申請日】2016年7月12日【發(fā)明人】李東宣,陳麗娟,李偉,吳超,張小玲,朱騫,郭效瓊,董陳文華,李成云【申請人】云南農(nóng)業(yè)大學(xué)