一種優(yōu)化的β-防御素AvBD2基因及其應(yīng)用
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種優(yōu)化的AvBD2基因及其應(yīng)用，所述AvBD2基因具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，所述AvBD2基因可轉(zhuǎn)化至遺傳工程菌種并進(jìn)行蛋白表達(dá)，獲得的重組表達(dá)蛋白與干酪乳桿菌混合，制成一種新型復(fù)合微生態(tài)制劑。該復(fù)合微生態(tài)制劑對(duì)畜禽的生產(chǎn)性能、免疫性能、腸道pH、腸道微生物等方面都有改善，有利于促進(jìn)畜禽的生長(zhǎng)，提高免疫力，增加飼料的消化率；在體外抑菌試驗(yàn)中，該復(fù)合微生態(tài)制劑對(duì)腸道致病菌具有較好的抑菌活性；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，在不添加任何抗生素藥物的情況下，顯著提高了畜禽的平均日增重和免疫性能，改善了畜禽腸道的菌群環(huán)境，促進(jìn)畜禽的生長(zhǎng)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
一種優(yōu)化的β-防御素 AvBD2基因及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及的是基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及的是一種優(yōu)化的β-防御素 AvBD2基 因及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 自20世紀(jì)50年代起，抗生素的亞治療劑量就被添加到飼料中來(lái)促進(jìn)動(dòng)物的生長(zhǎng)。 大量抗生素在養(yǎng)殖業(yè)中的濫用，已經(jīng)導(dǎo)致耐藥性細(xì)菌不斷出現(xiàn)，一些感染性病原體甚至嚴(yán) 重威脅到人類(lèi)健康和畜牧業(yè)的發(fā)展。隨著人們關(guān)注度的不斷提高和抗藥性病原的傳播，歐 洲已經(jīng)開(kāi)始禁止在動(dòng)物飼料中使用抗生素來(lái)促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)。因此，尋找一種天然的無(wú)污染 的能夠替代抗生素的新型飼料添加劑迫在眉睫，它既擁有抗菌功能，又能促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，以 降低飼養(yǎng)成本。
[0003] 防御素屬于抗菌肽家族的一個(gè)亞族，是廣泛分布于動(dòng)植物界的一類(lèi)富含半胱氨酸 的陽(yáng)離子小肽。防御素具有廣譜抗微生物活性，對(duì)細(xì)菌、真菌、螺旋體、病毒等均有抗性，且 病源微生物不易產(chǎn)生耐藥性，是宿主抵抗外來(lái)致病性微生物侵襲的重要防線(xiàn)，同時(shí)由于其 在動(dòng)物體的多種不同組織器官中持續(xù)性表達(dá)，也被認(rèn)為是動(dòng)物先天性免疫系統(tǒng)的一部分， 具有重要的生理學(xué)功能。其主要特征是6個(gè)半胱氨酸殘基形成的3對(duì)二硫鍵，成熟肽大約有 38-42個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量約為3_4kDa。根據(jù)空間結(jié)構(gòu)的不同，防御素可以分為3大類(lèi):α-防 御素、防御素和Θ-防御素。禽防御素屬于β-防御素類(lèi)，3對(duì)二硫鍵分別為Cys-1~Cys-5、 〇78-2~〇78-4和〇78-3~〇78-6配對(duì)連接形成，富含精氨酸，具有親水性和親脂性、特征性0_ 片層結(jié)構(gòu)。迄今為止，已在禽體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了 14種β-防御素，這些禽防御素基因被分別命名為 AvBD 1~14。其中禽β-防御素2 (AvBD2)廣泛分布于禽的各類(lèi)器官組織中，尤其在粘液囊、食 道、嗉囊、肝臟和胃等消化系統(tǒng)各器官組織中表達(dá)量較高。消化道為動(dòng)物機(jī)體與食源性病原 接觸部位，也是其侵入部位。AvBD2具有良好的生物安全性，且具有較強(qiáng)的抗菌活性，能夠抑 制或者殺死病原菌，這對(duì)禽消化道健康，尤其對(duì)防止上消化道感染等機(jī)體局部防御和炎癥 中起著重要作用。在畜禽生產(chǎn)中可用于防治疾病，促進(jìn)動(dòng)物健康養(yǎng)殖，具有潛在的應(yīng)用和開(kāi) 發(fā)價(jià)值，而分子重組技術(shù)是蛋白類(lèi)或肽類(lèi)產(chǎn)品開(kāi)發(fā)應(yīng)用的有效途徑。
[0004] 巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)表達(dá)系統(tǒng)既具有原核表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)量高、 可大規(guī)模培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)，又具有真核表達(dá)系統(tǒng)的蛋白翻譯后修飾、加工及折疊的優(yōu)勢(shì)，且外源 基因的遺傳穩(wěn)定性較好，是目前廣泛應(yīng)用的真核表達(dá)系統(tǒng)之一。畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)具有很 高的生物安全性，獲得包括美國(guó)Π )Α在內(nèi)的廣泛認(rèn)可。畢赤酵母自身分泌很少量的蛋白，易 于異源蛋白的分離純化，且其分泌的蛋白存在翻譯后加工修飾，使之更接近于天然蛋白的 構(gòu)象和活性，因此更適合真核生物基因的表達(dá)。又因其表達(dá)水平穩(wěn)定、發(fā)酵工藝成熟等優(yōu) 點(diǎn)，而成為目前最受歡迎的異源蛋白基因表達(dá)系統(tǒng)之一。醇氧化酶A0X1啟動(dòng)子(pAOXl)是 P.pastoris表達(dá)中應(yīng)用較多的啟動(dòng)子，其甲醇誘導(dǎo)性很強(qiáng)。但發(fā)酵過(guò)程中需要用有毒揮發(fā) 性的甲醇作為誘導(dǎo)劑，需要碳源的轉(zhuǎn)換，因而操作不方便，且外源蛋白的生產(chǎn)周期較長(zhǎng)。甘 油醛-3-磷酸脫氫酶啟動(dòng)子(pGAP)是P.pastoris的組成型強(qiáng)啟動(dòng)子，已用來(lái)表達(dá)許多異源 蛋白，并獲得了與pAOXl相似的產(chǎn)量。此外，GAP啟動(dòng)子有許多優(yōu)勢(shì):重組菌發(fā)酵過(guò)程簡(jiǎn)單，安 全性高且不需要大量甲醇的儲(chǔ)存與運(yùn)輸，更適合大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)，具有連續(xù)培養(yǎng)的潛能，且 降低了目的蛋白的生產(chǎn)成本。
[0005] 酵母單細(xì)胞蛋白作為飼料具有明顯的優(yōu)勢(shì)，如酵母干物質(zhì)中蛋白質(zhì)含量約50%-60% ;酵母菌中含有豐富的酶類(lèi)，含有β-葡聚糖（57.0%)、甘露聚糖（6.6%)、糖蛋白 (22.0%)和幾丁質(zhì)等活性成分;蛋白質(zhì)中含有動(dòng)物機(jī)體所必須的各種氨基酸，特別是植物 飼料中缺乏的賴(lài)氨酸、蛋氨酸和色氨酸含量較多，生物學(xué)價(jià)值大大優(yōu)于植物蛋白質(zhì)，單細(xì)胞 蛋白的消化率高達(dá)85%~90%;既對(duì)動(dòng)物具有促生長(zhǎng)作用，又可提高機(jī)體免疫，對(duì)動(dòng)物而 言，酵母飼料是一種理想的生物活性蛋白質(zhì)飼料。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種優(yōu)化的β-防御素 AvBD2基因 及其應(yīng)用，以提供一種優(yōu)化的AvBD2基因序列，用于代替抗生素制備新型無(wú)污染的禽用生物 飼料添加劑。
[0007] 本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0008] 本發(fā)明提供了一種優(yōu)化的β-防御素 AvBD2基因，所述AvBD2基因具有如SEQ ID N0: 1所示的核苷酸序列。
[0009] 本發(fā)明還提供了一種上述AvBD2基因在作為畜禽生物飼料添加劑中的應(yīng)用。
[0010]本發(fā)明還提供了 一種含有上述AvBD2基因的重組表達(dá)載體。
[0011]優(yōu)選地，所述重組表達(dá)載體為整合有AvBD2基因序列的且不含氨芐Amp抗性的pGHK α表達(dá)載體。
[0012] 本發(fā)明還提供了一種含有上述AvBD2基因的遺傳工程菌，所述遺傳工程菌含有上 述重組表達(dá)載體，或者，所述遺傳工程菌的基因組中整合有外源的上述AvBD2基因序列。
[0013] 優(yōu)選地，所述遺傳工程菌為含有上述AvBD2基因的畢赤酵母GS115菌株。
[0014] 本發(fā)明還提供了一種利用上述遺傳工程菌制備獲得的重組表達(dá)蛋白，其特征在 于，所述重組表達(dá)蛋白的制備方法為：
[0015] (1)將所述遺傳工程菌進(jìn)行發(fā)酵，獲得發(fā)酵液；
[0016] (2)取發(fā)酵液的上清，濃縮，獲得所述重組表達(dá)蛋白。
[0017] 本發(fā)明還提供了一種含有上述重組表達(dá)蛋白的微生態(tài)制劑，所述微生態(tài)制劑為由 干酪乳桿菌與所述重組表達(dá)蛋白按照體積比1:10混合，其中，所述干酪乳桿菌的濃度為6 X 109CFU/mL，所述重組表達(dá)蛋白的濃度為2.6mg/mL_ 5.2mg/mL。
[0018] 本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明提供了一種優(yōu)化的β-防御素 AvBD2基 因及其應(yīng)用，利用該優(yōu)化的β-防御素 AvBD2基因可用于代替抗生素制備新型無(wú)污染的禽用 生物飼料添加劑，即復(fù)合微生態(tài)制劑。該復(fù)合微生態(tài)制劑可直接飼喂畜禽，對(duì)畜禽的生產(chǎn)性 能、免疫性能、腸道PH、腸道微生物等方面都有改善，有利于促進(jìn)畜禽的生長(zhǎng)，提高免疫力， 增加飼料的消化率。另外，利用AvBD2基因制備的復(fù)合微生態(tài)制劑在體外抑菌試驗(yàn)中，對(duì)腸 道致病菌具有較好的抑菌活性，在體內(nèi)的動(dòng)物飼喂實(shí)驗(yàn)中，在不添加任何抗生素藥物的情 況下，顯著提高了畜禽的平均日增重和免疫性能，改善了畜禽腸道的菌群環(huán)境，促進(jìn)畜禽的 生長(zhǎng)。
【附圖說(shuō)明】
[0019] 圖1為干酪乳桿菌的的生長(zhǎng)曲線(xiàn)；
[0020] 圖2為重組菌株AvBD2體外抑菌檢測(cè)；
[0021]圖3為不同日齡肉雞盲腸內(nèi)容物ERIC-PCR檢測(cè)結(jié)果；
[0022]圖4為不同日齡肉雞回腸內(nèi)容物ERIC-PCR檢測(cè)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0023]下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說(shuō)明，本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行 實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過(guò)程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施 例。
[0024] 實(shí)施例1
[0025] 1、材料
[0026] 1.UYH)培養(yǎng)基:包括10g/L的酵母粉，20g/L的蛋白胨B和20g/L的D~無(wú)水葡萄糖， 115°C下滅菌15分鐘。
[0027] 1.2、MRS培養(yǎng)基：包括10 . Og/L的蛋白胨，8 . Og/L的牛肉粉，4 . Og/L的酵母粉， 20.0 g/L的葡萄糖，2. Og/L的磷酸氫二鉀，2. Og/L的檸檬酸氫二胺，5. Og/L的乙酸鈉，0.2g/L 的硫酸鎂，〇. 〇4g/L的硫酸錳和1.0g/L的吐溫~80，25 °C下調(diào)節(jié)pH值至5.7±0.2，118°(：下滅 菌15分鐘。
[0028] 1.3、LB培養(yǎng)基:包括10.0g/L的胰蛋白胨，5.0g/L的酵母浸粉和10.0g/L氯化鈉，25 °C下調(diào)節(jié)pH值至7.0 ±0.1，121 °C下滅菌15分鐘。
[0029] 1.4、MD培養(yǎng)基：量取雙蒸水800mL，121°C高壓滅菌20min，冷卻至50~60°C，加入 100mL 10XD、100mL 10XYNB、2mL 500XB。固體培養(yǎng)基加入15g瓊脂，制備好的平板置于4 °C保存?zhèn)溆谩?br>[0030] 以上培養(yǎng)基中加入2g/L的瓊脂，配制成固體培養(yǎng)基。
[0031] 2、步驟
[0032] 2.1、干酪乳桿菌的培養(yǎng)
[0033]無(wú)菌條件下，取干酪乳桿菌凍干菌種，在MRS固體培養(yǎng)基上涂布，37 °C下靜置厭氧 培養(yǎng)20h，挑取單菌落，在MRS固體培養(yǎng)基上進(jìn)一步劃線(xiàn)純化，37°C培養(yǎng)20h后，挑取單菌落， 接種到1 〇〇mL的MRS液體培養(yǎng)基中，37 °C下厭氧靜置培養(yǎng)，分別于Oh、2h、4h、6h、8h、10h、12h、 14h、16h、18h、20h、22h、24h、26h、28h、30h、32h、34h、36h、38h、40h 取培養(yǎng)菌液，在吸光度 600nm下測(cè)定0D值，得到干酪乳桿菌的的生長(zhǎng)曲線(xiàn)，所述生長(zhǎng)曲線(xiàn)如圖1所示，從圖1中可以 看出，干酪乳桿菌在24~48h時(shí)處于指數(shù)生長(zhǎng)后期至穩(wěn)定期后期，取指數(shù)生長(zhǎng)后期至穩(wěn)定期 后期的干酪乳桿菌菌液，接種到MRS培養(yǎng)基中，37 °C厭氧靜置培養(yǎng)15-24h，獲得干酪乳桿菌 培養(yǎng)液，菌液濃度是6 X 108-8 X 108CFU/mL。
[0034] 2.2、GS115/AvBD2的制備
[0035] A、人工合成如SEQ ID N0:1所示的核酸序列，獲得優(yōu)化后的AvBD2基因片段，所述 優(yōu)化后的AvBD2基因的5'端含有EcoRI酶切位點(diǎn)，在EcoRI酶切位點(diǎn)后面含有6個(gè)編碼組氨酸 的密碼子，在優(yōu)化后的AvBD2基因的3'端含有Notl酶切位點(diǎn)，基因全長(zhǎng)為143bp。
[0036] B、將上述優(yōu)化后的AvBD2基因插入組成型表達(dá)載體pGHKa的EcoRI和Notl位點(diǎn)之 間，獲得pGHKa-AvBD2重組質(zhì)粒，將pGHKa-AvBD2重組質(zhì)粒用SacI和Bgl Π 雙酶切線(xiàn)性化，去 除Amp抗性基因，并且經(jīng)過(guò)CIAP去除磷酸化后，電轉(zhuǎn)化至高效畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞中。 [0037] C、利用MD平板初篩和菌落PCR鑒定篩選出陽(yáng)性重組菌株GS115/AvBD2,并經(jīng)G418抗 性篩選高拷貝重組菌株。通過(guò)定點(diǎn)測(cè)定菌株濃度確定重組菌株的最佳培養(yǎng)時(shí)間。如圖2所 示，為重組菌株GS115/AvBD2菌株克隆形態(tài)圖。
[0038] 2.3、重組表達(dá)蛋白的制備
[0039]在相同條件下，對(duì)不同拷貝數(shù)的上述陽(yáng)性重組菌株GS115/AvBD2分別進(jìn)行培養(yǎng)表 達(dá)外源蛋白具體為：挑取pGHKa-AvBD2鑒定正確的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，分別接種到5mLYPD培養(yǎng)液 中，于28°C200r/min過(guò)夜振蕩培養(yǎng)。將過(guò)夜培養(yǎng)物以10%的比列接種到50mL發(fā)酵培養(yǎng)基瓶 中，于28°C 200r/min培養(yǎng)48h。并4°C、12000g離心10min，收集上清液，即獲得了重組ΑνΚ)2表 達(dá)蛋白。測(cè)定培養(yǎng)液中蛋白質(zhì)濃度，選擇出高表達(dá)菌株，再利用高表達(dá)菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)， 獲得發(fā)酵液，此時(shí)蛋白表達(dá)產(chǎn)物直接分泌到胞外，將發(fā)酵液離心，取上清，即為所述重組表 達(dá)蛋白。
[0040] 2.4、復(fù)合微生態(tài)制劑的制備
[0041] 取步驟2.1的指數(shù)生長(zhǎng)后期至穩(wěn)定期后期的干酪乳桿菌菌液，與步驟2.3的重組表 達(dá)蛋白按照體積比的重組AvBD2酵母工程菌按照體積比1:10混合，獲得兩種菌液的復(fù)合微 生態(tài)制劑。
[0042] 3、效果鑒定
[0043] 3.1
[0044]重組AvBD2的體外抑菌試驗(yàn)：挑取指示菌單菌落，接種到5mL LB培養(yǎng)液中，37°C振 蕩過(guò)夜培養(yǎng)，取l〇yL菌液與45°C的LB培養(yǎng)基混勻，鋪到平板內(nèi)，厚度約3mm，在平板上均勻的 打下4個(gè)孔?？變?nèi)加入50yL待測(cè)樣品，37°C培養(yǎng)6~12h，觀察孔周?chē)志η闆r。以加入30yL 氨節(jié)青霉素(Amp，100yg/mL)或者卡那霉素（Kana，50yg/mL)為陽(yáng)性對(duì)照，以同樣處理的 GS115/pGHKa的表達(dá)上清濃縮液和PBS為陰性對(duì)照。結(jié)果分析：采用瓊脂擴(kuò)散法檢測(cè)重組 AvBD2對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、巴氏桿菌、綠膿假單胞菌和產(chǎn)氣腸桿菌是否 有抑菌活性，結(jié)果如圖3所示。樣品孔與抗生素對(duì)照孔周?chē)霈F(xiàn)抑菌圈，而以同樣處理的 GS115/pGHKa的表達(dá)上清濃縮液和PBS加樣孔周?chē)闯霈F(xiàn)抑菌圈。
[0045] 3.2菌液的制備與試驗(yàn)動(dòng)物的分組
[0046] 干酪乳桿菌按2%的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中，30°C靜置培養(yǎng)42h;重組 AvBD2畢赤酵母組按10 %的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，28 °C、200r/min搖床震蕩培養(yǎng)48h; 菌體培養(yǎng)結(jié)束后，調(diào)節(jié)菌液濃度至6 X 108CFU/mL。
[0047] 將60只白羽肉雞隨機(jī)分為兩組，每組30只。分別為C和T組，C組為空白對(duì)照組，T組 為比例為1:10的干酪乳桿菌和重組AvBD2畢赤酵母組的復(fù)合制劑組，試驗(yàn)周期為42d。
[0048] 3.3對(duì)肉雞平均日增重的影響
[0049]第一周在飲水中按1:20的比例加入6 X108CFU/mL的乳酸菌、畢赤酵母，第二周開(kāi) 始在飲水中按1:10的比例加入6X 108CFU/mL的乳酸菌、畢赤酵母，自由采食，自由飲水。 [0050]分別于第1、7、14、21和42日齡對(duì)雞進(jìn)行稱(chēng)重，稱(chēng)重前12h停料、不停水，第二天清晨 8:00進(jìn)行空腹稱(chēng)重，計(jì)算平均日增重。
[0051 ]計(jì)算公式：
[0052] 平均日增重ADG(g)=(試驗(yàn)?zāi)┢谄骄w重一初期平均體重）+試驗(yàn)天數(shù)
[0053] 檢測(cè)復(fù)合微生態(tài)制劑對(duì)肉雞的平均日增重的影響，獲得如下表1所示的結(jié)果：
[0054]表1:復(fù)合微生態(tài)制劑對(duì)肉雞的平均日增重的影響
[0055]
[0056]注:對(duì)于表格的同一列，字母相同表示無(wú)顯著差異，字母不同表示有顯著性差異， 小寫(xiě)字母表示差異顯著，大寫(xiě)字母表示差異極顯著 [0057] 3.4對(duì)肉雞免疫器官指標(biāo)的影響
[0058]試驗(yàn)第7(1、21(1、42(1，每組抽取5只雞稱(chēng)取體重后頸靜脈放血屠宰，分別采摘胸腺、 法氏囊和脾臟并稱(chēng)重，計(jì)算免疫器官指數(shù)。
[0059] 計(jì)算公式:免疫器官指數(shù)=免疫器官鮮重(g)+宰前活重(kg)
[0060] 檢測(cè)復(fù)合微生態(tài)制劑對(duì)不同日齡肉雞免疫器官指數(shù)的影響，獲得如下表2所示的 結(jié)果：
[0061] 表2:復(fù)合微生態(tài)制劑對(duì)不同日齡肉雞免疫器官指數(shù)的影響
[0062]
[0063] 注:C組為空白對(duì)照組，T組為實(shí)驗(yàn)組。
[0064]由表1可知，7日齡時(shí)，T組肉雞的脾臟指數(shù)顯著高于C組(P〈0.05); 21日齡和42日齡 時(shí)，兩組組肉雞的脾臟指數(shù)未表現(xiàn)出差異(P>〇. 05)。T組肉雞的胸腺指數(shù)和法氏囊指數(shù)在三 個(gè)日齡均高于C組，且胸腺指數(shù)在7日齡和42日齡差異極顯著(P〈0.01)，而法氏囊指數(shù)在21 日齡差異極顯著(P〈〇.01)。以上結(jié)果說(shuō)明，復(fù)合微生態(tài)制劑雖然在提高肉雞脾臟指數(shù)方面 效果不明顯，但在提高肉雞的胸腺和法氏囊指數(shù)方面有明顯的效果。
[0065] 3.5ERIC-PCR法檢測(cè)復(fù)合制劑對(duì)肉雞盲腸和回腸菌群的影響：
[0066]取肉雞盲腸內(nèi)容物和回腸內(nèi)容物，利用ERIC-PCR檢測(cè)盲腸內(nèi)容物和回腸內(nèi)容物中 細(xì)菌基因組重復(fù)序列，獲得如圖3和4的電泳圖，具體實(shí)驗(yàn)為：
[0067]以各組肉雞糞樣作為總DNA模板，進(jìn)行ERIC-PCR指紋圖譜分析腸道菌群結(jié)構(gòu)。參照 ERIC - PCR文獻(xiàn)合成引物（上游引物ERIC -1: ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC和下游引物ERIC - 2: AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG)，用于腸道桿菌ERIC序列的PCR擴(kuò)增。
[0068] 3.5.1樣品的采集
[0069] 試驗(yàn)第7(1、21(1、42(1，每組抽取5只雞，進(jìn)行頸靜脈放血處死，迅速剖腹取盲腸及回 腸中端內(nèi)容物。
[0070] 3.5.2樣品的預(yù)處理
[0071]⑴于無(wú)菌條件下，將取出的盲腸及回腸內(nèi)容物分別混勻，各取出約2g糞樣，分別加 入10mL滅菌TE緩沖液，漩渦震蕩清洗，靜置3min。
[0072] ⑵取上清液于干凈的10mL離心管中，4°C，400rpm離心10min，取上清。
[0073]⑶將上清轉(zhuǎn)入干凈的10mL離心管中，加入適量的TE緩沖液，漩渦震蕩3min，充分懸 浮清洗菌體，600rpm離心3min，取上清。
[0074] ⑷將上清8000rpm離心15min，棄上清，加入適量TE緩沖液重懸菌體。
[0075] (5)8000rpm離心15min，棄上清，將沉淀轉(zhuǎn)入滅菌的2mL離心管中。
[0076] (6)加入700yL，-20°C預(yù)冷的丙酮，充分漩渦震蕩清洗沉淀，8000rpm離心15min，棄 上清取沉淀(此步驟重復(fù)兩次）。
[0077] (7)重復(fù)(6)步驟用純水清洗沉淀，8000rpm離心15min，棄上清取沉淀。
[0078] 3.5.3細(xì)菌總DNA的提取
[0079]用細(xì)菌基因組DNA小量試劑盒提取，具體操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行：
[0080] ⑴取上述預(yù)處理后的樣品，12000Xg離心30s，棄上清，用150yL已加入RNase A的 Buffer S重懸沉淀。
[0081 ] ⑵加入20yL溶菌酶貯存液，混勻后靜置5min。
[0082] ⑶加入30yL 0.25M的EDTA(pH為8.0)，混勻后冰浴5min。
[0083] ⑷加入450yL Buffer G-A，漩渦震蕩 15s后65Γ水浴lOmin。
[0084] (5)加入400yL Buffer G-B和950yL Buffer DV(4°C預(yù)冷），混勻后 12000 Xg離心 2min〇
[0085] (6)盡可能棄凈上相，保留相間沉淀和下相，加入950yL，4°C預(yù)冷Buffer DV，混勻后 12000 X g離心 2min。
[0086] ⑵丟棄上相，將下相轉(zhuǎn)移至濾器中，12000 X g離心lmin后棄濾器，加400yL Buffer BV到濾液中，混勻。
[0087] (8)將制備管置于2mL離心管中，將步驟(7)中的混合液移入制備管，12000 Xg離心 lmin〇
[0088] (9)棄濾液，加入500yL Buffer W1，12000Xg離心lmin。
[0089] (10)棄濾液，加入700yL Buffer W2,12000Xg離心lmin。
[0090] (11)重復(fù)步驟(10)-次。
[0091] (12)棄濾液，12 OOOXg離心lmin。
[0092] (13)將制備管于另一干凈的1.5mL離心管中，加入100yL預(yù)熱到65°C的Eluent到 silica膜中央，靜置lmin后12 000Xg離心lmin洗脫DNA。
[0093] 3.5.4ERIC-PCR 擴(kuò)增
[0094] 根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室以往的研究經(jīng)驗(yàn)，拍照，分析不同溫度下所得條帶數(shù)目與亮度，以選 擇最佳退火溫度。
[0095] 3 · 5 · 5ERIC-PCR 的穩(wěn)定性檢測(cè)
[0096]以同一乳酸菌、大腸桿菌的DNA樣品為模板，以相同的反應(yīng)體系，以最適退火溫度 下，于不同時(shí)間分別進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，PCR產(chǎn)物于2%的瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)，用以驗(yàn)證 所建立ERIC-PCR反應(yīng)體系的穩(wěn)定性。
[0097] 3.5.6盲腸和回腸腸道菌群總DNA的ERIC-PCR指紋圖譜分析
[0098]分別以已經(jīng)提好的盲腸和回腸的腸道菌總DNA為模板，設(shè)置ERIC-PCR反應(yīng)體系如 下：
[nnool
[0100] PCR反應(yīng)程序如下：
[0101]
[0102] 擴(kuò)增產(chǎn)物于2.0%瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)并用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照。使用分析 軟件NTSYS2.1對(duì)各試驗(yàn)組在不同日齡時(shí)的盲腸和回腸兩個(gè)腸段的ERIC-PCR指紋圖譜進(jìn)行 條帶計(jì)數(shù)，用Dice方法計(jì)算相似性指數(shù)Cs，用UPGMA(unweighted pair group mean average)對(duì)腸道菌群的多樣性進(jìn)行聚類(lèi)分析。Dice方法所得相關(guān)系數(shù)因不受ERIC-PCR指紋 圖譜中條帶強(qiáng)弱的影響，是一種相對(duì)客觀的評(píng)價(jià)。
[0103] 由圖3可知，各組肉雞盲腸樣品的條帶多集中于100bp-1000bp之間。肉雞在7日齡 時(shí)就有較為豐富的條帶，表明此時(shí)已有菌株在盲腸內(nèi)定植。T組肉雞腸道的條帶數(shù)顯著高于 C組，說(shuō)明這T組腸道菌群的多樣性豐富且種群密度較高。7、14、21日齡時(shí)，同一組不同日齡 間的圖譜主帶位置及特征性條帶數(shù)量均變化不一，顯示了肉雞腸道優(yōu)勢(shì)菌群的不穩(wěn)定性， 但條帶的數(shù)量呈上升趨勢(shì)，表明微生物群落的多樣性在逐漸提高。28日齡后，各實(shí)驗(yàn)組圖譜 的主帶變化不明顯，說(shuō)明微生物群落中優(yōu)勢(shì)菌群相對(duì)穩(wěn)定。
[0104] 由圖4可知，各組肉雞回腸樣品的條帶多集中于250bp-2000bp之間。肉雞在各日齡 段，T組肉雞腸道就有較為豐富的條帶數(shù)顯著高于C組，表明此時(shí)已有菌株定植，T組腸道菌 群的多樣性豐富且種群密度較高。隨著日齡增加，同一組不同日齡間的圖譜特征性條帶的 數(shù)量及亮度呈上升趨勢(shì)，表明微生物群落的多樣性和種群密度在逐漸提高。28日齡后，各組 腸道菌群組成相似性很高，說(shuō)明該時(shí)間段肉雞腸道微生物群落中的優(yōu)勢(shì)菌群已相對(duì)穩(wěn)定。
[0105] 由圖3和4可知，在整個(gè)試驗(yàn)周期內(nèi)，各組肉雞回腸圖譜的條帶數(shù)量、亮度以及主條 帶的位置、特征性條帶數(shù)量和位置等均與盲腸存在明顯差異，條帶數(shù)量明顯較盲腸少，說(shuō) 明肉雞的盲腸和回腸中的菌群的種類(lèi)和優(yōu)勢(shì)菌群不同，且回腸中的微生物群落豐度和種群 密度較盲腸低。AvBD2重組酵母對(duì)改善腸道環(huán)境，提高腸道菌群豐富度有明顯的作用。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種優(yōu)化的β-防御素 AVBD2基因，其特征在于，所述AVBD2基因具有如SEQIDN0:l所 示的核苷酸序列。2. -種如權(quán)利要求1所述的AvK)2基因在作為畜禽生物飼料添加劑中的應(yīng)用。3. -種含有如權(quán)利要求1所述的ΑνΚ)2基因的重組表達(dá)載體。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組表達(dá)載體，其特征在于，所述重組表達(dá)載體為整合有 AvBD2基因序列的且不含氨芐Amp抗性的pGHKa表達(dá)載體。5. -種遺傳工程菌，其特征在于，所述遺傳工程菌含有如權(quán)利要求4所述的重組表達(dá)載 體，或者，所述遺傳工程菌的基因組中整合有外源的如權(quán)利要求1所述的AvBD2基因序列。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種遺傳工程菌，其特征在于，所述遺傳工程菌為含有所述 AvBD2基因的畢赤酵母GSl 15菌株。7. -種利用如權(quán)利要求6所述的遺傳工程菌制備獲得的重組表達(dá)蛋白，其特征在于，所 述重組表達(dá)蛋白的制備方法為： (1)將所述遺傳工程菌進(jìn)行發(fā)酵，獲得發(fā)酵液； (2 )取發(fā)酵液的上清，濃縮，獲得所述重組表達(dá)蛋白。8. -種含有如權(quán)利要求7所述的重組表達(dá)蛋白的微生態(tài)制劑，所述微生態(tài)制劑為由干 酪乳桿菌與所述重組表達(dá)蛋白按照體積比1:10混合，其中，所述干酪乳桿菌的濃度為6 X I O9CFlVmL，所述重組表達(dá)蛋白的濃度為2.6mg/mL_5.2 mg/mL。
【文檔編號(hào)】C12N15/12GK105907765SQ201610349166
【公開(kāi)日】2016年8月31日
【申請(qǐng)日】2016年5月19日
【發(fā)明人】祁克宗, 涂健, 魏海婷, 石水琴, 張明, 呂小龍, 汪雪雁, 薛秀恒, 蔣雯, 袁林
【申請(qǐng)人】安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)